ESIMENE OSA Fenüületanooli glükosiidid kaitsevad ECE{0}} demetülatsiooni pärssimise ja PI3K/PKB/eNOS-i raja tõhustamise kaudu kõhuaordi ahenemisest põhjustatud müokardi hüpertroofiat
Mar 06, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Qiong-Ling Fan, 1 Jia-Wei Wang, 1 Shi-Lei Zhang jt.
Fenüületanõli glükosiidid (CPhG)on farmakoloogilise tegevuse põhiline materiaalne alusCistanche tubulosaja neil on mitmesuguseid farmakoloogilisi toimeid. Siiski on ebaselge, kas CPhG-d(Fenüületanõli glükosiidid cistanche'ist) omavad leevendavat toimet rõhu ülekoormusest põhjustatud müokardi hüpertroofiat. Selles uuringus määrati isastele SD-rottidele, kes kaalusid (200 ± 20) g, südame hüpertroofia mudelid kõhuaordi koarktatsiooni (AAC) abil. Pärast operatsiooni manustati rottidele 6 nädalat vastavat ravimit (CPhG(Fenüületanõli glükosiidid cistanche'ist) 125, 250 ja 500 mg/kg/päevas ning valsartaani 8,3 mg/kg/päevas). Tuvastati ehhokardiograafia, südame kaaluindeks (HWI), kardiomüotsüütide (CSCA) ristlõikepindala, fibroosipiirkond, plasma endoteliin 1 (ET-1) ja põletikueelsete tegurite tase. Meie tulemused näitasid, et erinevad CPhG-d(Fenüületanõli glükosiidid) vähendatud annus: vasaku vatsakese tagumise seina paksus (LVPWT), vasaku vatsakese lõpp-diastoolne läbimõõt (LVED), HWI, CSCA, fibroosipiirkond, ET-1, põletikueelsed tegurid, arteriaalne natriureetiline peptiid (ANP), aju natriureetiline peptiid (BNP) ), endoteliini konverteeriva ensüümi 1 (ECE-1) mRNA tasemed, tsüklooksügenaas 2 (COX-2), suure liikuvusega rühmakasti 1 (HMGB-1) valgu tasemed ja ECE{{8} } demetülatsiooni tase, suurendades samal ajal vasaku vatsakese väljutusfraktsioone (LVEF), vasaku vatsakese fraktsionaalset lühenemist (LVFS), fosforüülitud fosfatidüülinositooli 3- kinaasi (p-PI3K), fosforüülitud proteiinkinaasi B (p-PKB) ja fosforüülitud endoteeli süntetaas (p-eNOS). -e CPhG-de indeksid(Fenüületanõli glükosiidid cistanche'ist) 250 ja 500 mg/kg rühm erines oluliselt AAC rühmast; võrreldes valsartaani rühmaga (AV), ei erinenud CPhG-de 500 mg/kg rühma indeksid oluliselt. Kokkuvõtteks võib öelda, et CPhG-d(Fenüületanõli glükosiidid cistanche'ist) leevendas AAC-ga müokardi hüpertroofiat rottidel, mis võib olla seotud ECE{0}} demetülatsiooni inhibeerimise ja PI3K/PKB/eNOS võimendusega.
2. Materjalid ja meetodid
2.1.Loomad.
70 isast SPF SD rotti kaaluga 200 ± 20 g (10 rühma kohta) saadi Xinjiangi meditsiiniülikooli (Urumqi, Hiina) katseloomade keskusest. Loomakasvatuslitsentsi number oli SYXK(XIN)2016-0003 ja sertifikaadi number SCXK(XIN)2016-002. -e uuringu kiitis heaks Xinjiangi meditsiiniülikooli esimese sidushaigla loomaeetika komitee (kinnitusnumber 20180223-183). Meie katseloomade keskuses hoiti neid plastpuurides vaba juurdepääsuga veele ja toidule ning neid hoiti 12-tunnises valguse/pimeduse tsüklis temperatuuril 22 ± 2 kraadi ja õhuniiskusega 45–55 protsenti.
2.2. Materjalid.
CPhG-d(Fenüületanõli glükosiidid cistanche'ist) , mille ehhiaatsia sisaldus oli üle 40 protsendi ja akteosiidi üle 16 protsendi, osteti ettevõttelt Hetian Di Chen Medical Biotechnology Co., Ltd. Valsartaan osteti ettevõttelt Beijing Novartis Pharma Co., Ltd. Naatriumkarboksümetüültselluloos (CMC-Na) tarnis Xian Zhengtian Pharmaceutical Accessories Co., Ltd. Ja CPhG-d lahustati 0,5% CMC-Na-s.
Fenüületanõli glükosiidid cistanche'ist
2.3. Kõhu aordi koarktatsioon (AAC).
Pärast 2,5-protsendilise pentobarbitaalnaatriumiga (2,5 ml/kg) anesteseerimist (Merck, Darmstadt City, Hessen, Saksamaa) rotid raseeriti ja hoiti soojas soojenduspatjadel. -et roti kõhuõõs avati steriilses keskkonnas 2 cm keset kõhtu, kõhu sisikond lükati paremale küljele ja kõhuaort avanes täielikult 0,5 cm parema neeruarteri kohal. Number 8 nõel ligeeriti traadiga number 2 paralleelselt õmmeldava kõhuõõnde [18]. Näidisrühma rottide kõhuaordid eraldati ilma ligeerimiseta ja operatsiooni jaoks ei olnud kontrollrühma. - päev pärast operatsiooni toideti CPhG-ga AC 125 mg/kg, AC 250 mg/kg ja AC 500 mg/kg(Fenüületanõli glükosiidid cistanche'ist)sondi abil; AV rühma toideti sondiga valsartaaniga; ja kontrollrühma, AAC rühma ja võltsrühma ei toidetud CPhG-de ega valsartaaniga üks kord päevas 42 järjestikuse päeva jooksul. Ravimi annus määrati varasemate viidete ja esialgsete katsete põhjal [8].
2.4. Ehhokardiograafia.
Kuus nädalat pärast AAC-d anesteseeriti rotid 2,5-protsendilise pentobarbitaalnaatriumiga ja viidi läbi ehhokardiograafia (Philips HD11 XE, Amsterdam, Holland). Lõplike näitajatena keskmiste arvutamiseks mõõdeti LVPWT, LVED, LVEF ja LVFS neli korda.
2.5. Südamekaalu indeks (HWI).
Pärast ehhokardiograafiat hukati rotid kõhuaordist vere kogumisega. - Rottide südamed eemaldati rinnast ja kaaluti pärast 3 korda tavalise soolalahusega (4 kraadi) pesemist ja puhta filterpaberiga nõrutamist. -e HWI arvutati järgmise valemi abil: HWI � südame kaal kehamass. (1)
2.6. Hematoksüliin-eosiini ja Massoni värvimine.
- vasaku vatsakese müokard fikseeriti 4-protsendilise paraformaldehüüdiga, mis oli sisestatud parafiini, lõigati läbilõike paksusega 4 μm, kuivatati ahjus 60 kraadi juures 2 tundi ja värviti seejärel hematoksüliin-eosiini või Massoniga (Solaibio, Peking, Hiina). Müokardi struktuuri vaadeldi ümberpööratud faasikontrastmikroskoobiga (Leica, Frankfurt, Saksamaa). CSAC-i ja fibroosipiirkonna arvutamiseks kasutati Image J tarkvara.
2.7. Ensüümiga seotud immuunsorbentanalüüs (ELISA).
Rottidelt ekstraheeriti kõhuaordi veri ja pandi 2 tunniks toatemperatuuril antikoagulanttuubi ja seejärel tsentrifuugiti kiirusel 3000 p/min. Supernatant absorbeeriti pipettide abil (Eppendorf, Hamburg, Saksamaa) ja säilitati testimiseks 80 kraadi juures. Plasma ET-1, interleukiin 1 (IL-1), interleukiin 6 (IL-6), tuumorinekroosifaktori tõenditel põhinev täiendav ja alternatiivne meditsiin
(TNF-) (Bioss, Peking, Hiina) ja tsüklooksügenaas 1 (COX-1) (Cusabio, Wuhan, Hiina) tase rottidel tuvastati ELISA komplekti juhiste järgi.
2.8. Metülatsioonispetsiifiline PCR.
DNA ekstraheeriti rottide vasaku vatsakese müokardi koest DNA ekstraheerimiskomplektiga (Tiangen Biotech, Peking, Hiina). -e neeldumisväärtus (A väärtus) oli võrdne OD260/OD280 (1,8–1,9). 20 ul genoomset DNA-d (500 pg{9}} ug) modifitseeriti väävelhappega Methylation-Gold Kit (ZYMO, Orange County, CA, USA) abil. -e MSP reaktsioonisüsteem oli 25 μL, sealhulgas 3,0 μL sulfitiga modifitseeritud DNA matriitsi, 2,5 μL 10 × puhvrit, 2,5 μL 2,5 mm dNTP-sid, 1,0 μL 10 μm praimerit, 0,1 μl DNA HotstartaqRA DNA Hotstary) ja 14,9 μL ddH2O. Kokku oli 45 tsüklit: denatureerimine 95 kraadi juures, lõõmutamine 55 kraadi juures ja pikendamine 72 kraadi juures 30 sekundiks. Pärast PCR-i eraldati 5 µl toodet 2-protsendilise agaroosgeeli elektroforeesiga. -e DNA-d töödeldi M. Sssl metüültransferaasiga (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) kasutati metüülimise positiivse kontrollina ja normaalse kontrollrühma DNA-d kasutati demetüleerimise positiivse kontrollina. Lõpuks agaroosgeeli pildistati ja analüüsiti Bio-Rad geelikuvamissüsteemiga. -e demetüleerimise tase arvutati järgmise valemi abil:
Kõik Methprimeris (Applied Biosystems, MA, USA) loodud ja Sangon Biotechi (Shanghai, Hiina) sünteesitud praimerid on loetletud tabelis 1.
2.10. Western Blot.
Valgud ekstraheeriti vasaku vatsakese müokardist Ripa Bufffferiga (Scientific) ja lisati proteaasi inhibiitor. Valgu kontsentratsioon määrati BCA meetodil (Solarbio, Peking, Hiina). Valke võeti 50 ug ja denatureeriti 100 °C juures 5 minutit. Valgud eraldati naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesiga (SDS-PAGE, Beyotime, Shanghai, Hiina) ja seejärel kanti elektroforeetilise seadmega (Bio-Rad, CA, USA) polüvinülideenfluoriidi (PVDF) membraanile. Pärast 3-protsendilise BSA-ga blokeerimist 2 tundi toatemperatuuril inkubeeriti membraane PI3K-vastase antikeha, fosfo-PI3K-vastase antikeha, eNOS-i vastase antikeha, fosfo-eNOS-i vastase antikehaga (1:1000, Bioss, Peking, Hiina). anti-COX-2 antikeha, anti-HMGB-1 antikeha (1: 1000, Proteintech, Chicago, IL, USA) ja anti-ECE-1 antikeha (1: 2000, Signalway Antibody) , College Park, MD, USA), primaarsed antikehad üleöö 4 kraadi juures. Järgmisel päeval, pärast TBST-ga 3 korda pesemist, inkubeeriti membraane toatemperatuuril HRP-märgistatud kitse küülikuvastase IgG-ga (1: 25000, 1 h, Zhongshanjinqiao, Shanghai, Hiina). Pärast 3-kordset TBST-ga pesemist visualiseeriti membraanid Pierce™ ECL Western Blotting Substrate abil ja pildistati FluorChem E Imaging Systemiga (Protein Simple, USA), mis normaliseeriti sisekontrollina -aktiiniks.
Fenüületanõli glükosiidide eelised tsitanche'ist
cistanche kasu
3. Tulemused
3.1. CPhG-d(Fenüületanõli glükosiidid cistanche'ist) Paranenud südamefunktsioon rottidel pärast AAC-d.
-e rottidele tehti sondi alates päevast pärast AAC-d. Positiivsele kontrollrühmale (AV) manustati sondiga valsartaani 8,3 mg/kg/päevas ja CPhG-de rühmale (AC) sonditi vastavalt CPhG-sid 125, 250 ja 500 mg/kg/päevas. Pärast kuuenädalast pidevat manustamist on rottidele tehtud ehhokardiograafia 2,5% naatriumpentobarbitaali anesteesia all. Kaks rotti surid pärast AAC-d: üks mudelrühmast suri kolmandal päeval pärast AAC-i kopsuturse tõttu; veel üks AC 500 mg/kg puhul suri päev pärast operatsiooni, mille põhjuseks kahtlustati kirurgilist stressi. Nagu on näidatud joonisel 2, vähenesid LVED, LVEF ja LVFS AAC rühmas võrreldes võltsrühmaga märkimisväärselt, kuid LVPWT AAC rühmas suurenesid märkimisväärselt. Võrreldes AAC rühmaga suurenes LVED, LVEF ja LVFS ning LVPWT vähenes erineval määral igas AC annuse rühmas; LVPWT puhul ei leitud olulist muutust AC 125 mg/kg rühmas, kuid leiti AC 250 ja 500 mg/kg rühmades. Võrreldes AV rühmaga, täheldati LVPWT ja LVED vahel AC 125 mg/kg rühmas olulist erinevust, samas kui LVPWT, LVED, LVFS ja LVFS AC 250 ja 500 mg/kg rühmas mitte.
3.2. CPhG-d(Fenüületanõli glükosiidid cistanche'ist) HWI, CSAC ja fibroosi ala vähenemine rottidel pärast AAC-d.
-et kaalusime HWI arvutamiseks iga roti südant ja võtsime müokardi koe HE ja Massoni värvimiseks, et jälgida kardiomüotsüütide ristlõikepindala (CSAC) ja fibroosi pindala muutusi. Nagu on näidatud joonistel 3(a), 3(d) ja 3(e), vähenesid võltsrühmaga võrreldes südame kaal (HW) ja HWI AAC rühmas oluliselt; võrreldes AAC rühmaga vähenesid HW ja HWI AC250 ja 500 mg/kg rühmades oluliselt; võrreldes AV rühmaga suurenesid HW ja HWI märkimisväärselt AC 125 mg/kg rühmas, kuid mitte AC 250 ja 500 mg/kg rühmades. Joonistel 3(b) ja 3(f) näitasid Massoni värvimistulemused võltsrühmaga võrreldes, et fibroosi pindala AAC rühmas oli oluliselt suurenenud. Fibroosipiirkonna puhul leiti märkimisväärne vähenemine AC 125, 250 ja 500 mg/kg rühmades võrreldes AAC rühmaga, samas kui märkimisväärne suurenemine AC 125 ja 250 mg/kg rühmades ning AC 500 mg/kg oluline vähenemine. kg rühm leiti võrreldes AV rühmaga. Joonistel 3(c) ja 3(g) näitasid HE värvimistulemused, et CSAC AAC rühmas oli oluliselt suurenenud võrreldes võltsrühmaga; võrreldes AAC rühmaga vähenes CSAC 250 ja 500 mg/kg rühmades oluliselt; Võrreldes AV rühma omaga, suurenes CSAC märkimisväärselt AC 125 ja 250 mg/kg rühmades ning olulist erinevust AC 500 mg/kg rühmas ei leitud.
3.3. CPhG-d(Fenüületanõli glükosiidid cistanche'ist) Müokardi hüpertroofia geenide vähenenud mRNA tasemed rottide müokardi koes pärast AAC-d.
ANP, BNP ja müosiini raske ahel (-MHC) on olulised südame hüpertroofia tegurid [19, 20]. Tuvastasime nende kolme südame hüpertroofia geeni suhtelised ekspressioonitasemed müokardi kudedes. Nagu on näidatud joonisel 4, suurenesid ANP, BNP ja -MHC mRNA suhtelised ekspressioonitasemed AAC rühmas võltsrühmaga võrreldes märkimisväärselt; siiski, võrreldes AAC rühmaga, kolme müokardi hüpertroofia geeni suhtelised ekspressioonitasemed AC 250 tõenduspõhises täiendavas ja alternatiivses meditsiinis 5.
