Cistanche: ehhinakosiid pärsib pankrease adenokartsinoomi rakkude kasvu, kutsudes esile apoptoosi mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi raja kaudu

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

WEI WANG, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG ja XINFENG LI

Abstraktne.

Traditsioonilisest Hiina meditsiinist saadud looduslike toodete kliiniline kasutamine on pälvinud tähelepanu vähi kemoteraapias.ehhinakosiid(ECH), üks fenüületanoide, mis on eraldatud vartestCistanche(Hiina taimne ravim) omab kudesid kaitsvat ja apoptootilist toimet kesknärvisüsteemile. Siiski jääb suures osas tabamatuks, kas ECH-l on kasvajat supresseeriv toime. Käesolevas uuringus näidati, et ECH võib märkimisväärselt pärssida pankrease adenokartsinoomi rakkude proliferatsiooni, indutseerides reaktiivsete hapnikuliikide tootmist ja mitokondriaalse membraani potentsiaali häirimist ning vallandades seega apoptoosi. Lisaks selgitati, et ECH(ehhinakosiid)pärsib kasvajarakkude kasvu MAPK aktiivsuse moduleerimise kaudu. Kokkuvõttes näitab see uuring ECH (ehhinakosiid) vähi arengu ennetamisel ja tähendab, et ECH kasutamine võib olla potentsiaalne vähi kemoterapeutiline strateegia.

Sissejuhatus

P53 tuumori supressori rada tuumorisupressori ARF indutseerimise kaudu leevendab onkogeense E3-ligaasi hiire topeltminuti (MDM)2- vahendatud p53 degradatsiooni (3). See on automaatselt reguleeritav enesekaitsemehhanism, mis hoiab ära rakkude pahaloomulise transformatsiooni. Nimelt võib p53 represseerida Myc aktiivsust, aktiveerides transkriptsiooniliselt näiteks miR-145, mis sihibMinu CmRNA translatsiooni vaigistamiseks (4, 5), moodustades seega negatiivse tagasiside regulatsioonisilmuse.

Kõige lihtsam ja tõhusam vähiravi strateegia on vähirakkude hävitamine. Tavaliselt kasutatavad vähivastased ravimid, nagu tsisplatiin (6), aktinomütsiin D (7) ja adriamütsiin (8), pärsivad kasvaja kasvu, soodustades apoptoosi. Hiljuti on üha rohkem tõendeid näidanud, et mitmed looduslikud tooted ja derivaadid taimedest, eriti traditsioonilises hiina meditsiinis (TCM) kasutatavatest ravimtaimedest, omavad kasvajat pärssivat funktsiooni, kutsudes esile vähirakkude apoptoosi ja neil on potentsiaal kliiniliseks kasutamiseks. vähiravis (9). Näiteks looduslik antrakinooni emodiin eraldatakse paljudest vähirakkude tüüpidest (10, 11). Kamptotetsiin, mis on saadud hiina "õnnepuust",Camptotheca teravama, on väärtuslik looduslik toode, mis pärsib DNA ligeerimist pärast topo I-vahendatud ahela katkestusi (12). Teises retrospektiivses populatsioonipõhises kohortuuringus, milles osales kokku 729 kaugelearenenud rinnavähiga patsienti, tehti ettepanek, et TCM-ravi võib aidata kaasa vähiravile. Sellest kohordist 115 patsienti olid TCM-i kasutajad, samas kui 614 patsienti ei kasutanud TCM-i. Mitme muutujaga analüüs näitas, et võrreldes mittekasutajatega oli TCM-i kasutamine seotud märkimisväärselt vähenenud igasuguse suremuse riskiga (13). Kõik eelnimetatud leiud näitasid, et TCM on oluline täiendav ja alternatiivne meditsiin, mida saab kasutada vähiravis.

ägeda kopsukahjustusega hiired (16, 17). Samuti ECH(ehhinakosiid)on näidatud, et sellel on kaitsev toime närvikoele ja see parandab Parkinsoni tõve hiiremudelites käitumishäireid (18). Eelkõige on leitud, et ECH soodustab rakkude proliferatsiooni ja pärsib apoptoosi hiire sooleepiteeli MODE-K rakkudes (19). Seni on aga vähem tähelepanu pööratud ECH võimalikule rollile vähi ennetamisel.

Selles uuringus uuriti, kas ECH-ravi mõjutab kasvajarakkude kasvu ja proliferatsiooni ning kas ECH(ehhinakosiid)indutseerib apoptoosi, suurendab reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tootmist ja vähendab mitokondriaalse membraani potentsiaali (MMP) ning pärsib järelikult kasvajarakkude kasvu. Lisaks oli käesoleva uuringu eesmärk tuvastada ECH-vahendatud rakkude kasvu pärssimise eest vastutavad molekulaarsed mehhanismid.

Materjalid ja meetodid

Kamber rida, reaktiiv, ja antikehad.SW1990 pankrease adenokartsinoomi rakke (ATCC, Manassas, VA, USA) kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud Eagle söötmes, millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit, 50 U/ml penitsilliini ja 0,1 mg/ml streptomütsiini temperatuuril 37 ˚C. 5 protsenti CO2 niisutatud atmosfäär. ECH(ehhinakosiid)osteti firmalt Jrdun Biotechnology Corp. (Shanghai, Hiina). AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38 ja GAPDH vastased antikehad osteti ettevõttest Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); anti-Bax ja anti-Bcl-2 osteti ettevõttelt Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA); ja anti-Caspase{10}} osteti ettevõttelt Abcam (Shanghai, Hiina).

Kamber elujõulisusanalüüs. Kasvajarakkude kasvu kiiruse hindamiseks kasutati vastavalt tootja juhistele rakkude loenduskomplekti {{0}} (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA). Rakususpensioonid külvati 0, 12, 24, 48 või 72 tunni jooksul 96 -süvendiga kultiveerimisplaatidele 5,000 rakku süvendi kohta ECH-töötlusega. Rakkude kasvu pärssimine määrati, lisades igasse süvendisse WST-8 reaktiivi CCK-8 komplektist lõppkontsentratsiooniga 10 protsenti ja proovide neeldumist mõõdeti 450 nm juures, kasutades mikroplaadilugejat (Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA).

Hoechst 33342 värvimine.Rakke (60-protsendiline liitumine) töödeldi Hoechst 33342-ga (Beyotime Biotechnology Institute, Haimen, Hiina) lõppkontsentratsiooniga 1µg/ml, inkubeeriti 37 ˚C inkubaatoris 15 minutit, pesti kaks korda fosfaatpuhverdatud soolalahusega, fikseeriti 4% paraformaldehüüdis 30 minutit toatemperatuuril ja paigaldati objektiklaasidele. Rakutuumade morfoloogilisi muutusi täheldati fluorestsentsmikroskoobi all (Olympus BX51, Melville, NY, USA). Normaalsed tuumad olid ümmargused ja värvitud helesiniseks, samas kui apoptootilised tuumad olid kahanenud ja värvitud helesiniseks.

Fluorestsents-aktiveeritud kamber sorteerimine (FACS) analüüsid.Apoptoosi hindamiseks kasutati vastavalt tootja juhistele fluorestseiini isotiotsüanaadi (FITC)-Annexin V apoptoosi tuvastamise komplekti (BD Biosciences, Shanghai, Hiina). Lühidalt, 5 x 1{4}}4 rakku pesti jääkülma PBS-ga, resuspendeeriti 0,1 ml sidumispuhvris (Beyotime Institute of Biotechnology) ja värviti 10 ml FITC-konjugeeritud anneksiin V-ga (10 mg/ml) ja 10 ml. ml propiidiumjodiidi (PI) (50 mg/ml). Pärast 15-minutilist inkubeerimist toatemperatuuril pimedas ja 400 ml sidumispuhvri lisamist analüüsiti rakke voolutsütomeetriga (C6; BD Biosciences, Shanghai, Hiina).

Mõõtmine kohta reaktiivne hapnikku liigid (ROS).ROS-i tootmise hindamiseks kasutati vastavalt tootja juhistele komplekti Reactive Oxygen Species Assay (Vigorous Biotechnology, Peking, Hiina). Lühidalt, rakud (80% konfluentsus) koguti ja pesti PBS-iga enne värvimist dihüdroetiidiumi (DHE) lahusega (Beyotime Biotechnology Institute). Seejärel analüüsiti rakke voolutsütomeetriliste analüüsidega.

Mõõtmine kohta mitokondriaalne membraan potentsiaal (MMP).

MMP muutuste tuvastamiseks kasutati tetrametüülrodamiini metüülestri (TMRM) analüüsikomplekti (ImmunoChemistry Technologies, Bloomington, MN, USA). Lühidalt, rakud (80% konfluentsus) koguti, pesti PBS-ga ja värviti TMRM-iga 15–20 minutit 37 °C inkubaatoris. Seejärel pesti rakke üks kord PBS-ga ja viidi läbi voolutsütomeetrilised analüüsid.

Immunoblotanalüüsanalüüsid. Rakud (80 protsenti konfluentsust) koguti ja lüüsiti RIPA puhvris (Jrdun Biotechnology), mis koosnes 50 mM Tris-HCl-st, pH 7,4; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1% naatriumdeoksükoolhapet ja 0,1% SDS-i ning värskelt lisatud proteasoomi inhibiitoreid. Immunoblotanalüüsiks kasutati võrdses koguses selget rakulüsaati, nagu eelnevalt kirjeldatud (20).

Statistiline analüüs.Kvantitatiivsed andmed on väljendatud keskmisena ± standardhälve. Statistilisi erinevusi hinnati paaritu Studenti t-testiga, kasutades statistilist SPSS 15.0 tarkvara. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Tulemused

ECH (ehhinakosiid)surub alla kasvaja kamberkasvu. Kuigi on teatatud, et ECH(ehhinakosiid)omab kaitsvat rolli, inhibeerides apoptoosi ja põletikulisi signaale somaatilistes rakkudes, nagu neuronaalsed ja sooleepiteelirakud (16-19), jääb arusaamatuks, kas ECH kontrollib vähirakkude kasvu ja proliferatsiooni. Selle testimiseks viidi läbi rakkude ellujäämise test, töödeldes II astme pankrease adenokartsinoomist pärinevaid SW1990 rakke ECH tiitritud annustega, nagu on näidatud joonisel 1. Eelkõige näidati, et ECH aeglustab oluliselt kasvajarakkude proliferatsiooni annuses. -st sõltuval viisil 5-päevase kultuuriperioodi jooksul (joonis 1).ECH käivitajadapoptoos. Kuna apoptoosi kadumine on üks peamisi põhjuslikke mehhanisme, mis on pankrease vähirakkude kontrollimatu proliferatsiooni aluseks (21), viidi käesolevas uuringus läbi rida katseid, et teha kindlaks, kas ECH vallandab apoptoosi. Esiteks, kasvajarakkude tuumade värvimisel Hoechst 33342-ga näidati, et ECH põhjustab annusest sõltuval viisil apoptoosi (joonis 2A). Lisaks viidi FACS analüüsid läbi anneksiin V/PI värvimise abil, et veelgi kinnitada ty ECH apoptootilist toimet (joonis 2B). Apoptootiliste rakkude keskmine protsent oli normaalsetes kultiveerimistingimustes 1,1 protsenti, samas kui see protsent suurenes oluliselt 10,6, 21,4 ja 51,3 protsendini vastusena ECH-ravile annusest sõltuval viisil (joonis 2C). Need tulemused koos joonisel fig 1 näidatud rakkude elujõulisuse analüüsiga näitavad, et ECH-ravi pärsib kasvajarakkude proliferatsiooni, käivitades apoptoosi.

Etiidiumi genereerimiseks, mis interkaleerub DNA-ga, kasutati selles uuringus ROS-i tootmise hindamiseks. Leiti, et nagu teised vähivastased ravimid, stimuleerib ECH annusest sõltuval viisil ka ROS-i tootmist, mida näitab kõrgenenud fluorestsentsi intensiivsus ECH-ravi korral (joonis 3).

ECH (ehhinakosiid)vähendab MMP.On näidatud, et mitokondriaalne düsfunktsioon on seotud apoptoosi esilekutsumisega. On näidatud, et mitokondriaalse läbilaskvuse üleminekupooride avanemine kutsub esile transmembraanse potentsiaali depolarisatsiooni ja pro-apoptootiliste tegurite vabanemise (23). Seetõttu testiti, kas ECH võib põhjustada MMP kadu kasvajarakkudes, tehes TMRM testi, mis on hästi väljakujunenud lähenemisviis, kuna TMRM fluorestsentsi intensiivsus on võrdeline membraani potentsiaaliga. Näidati, et ECH-ravi vähendab oluliselt MMP-d annusest sõltuval viisil (joonis 4).ECH juhtnupud kasvaja kamber kasvu kaudu mitogeen-aktiveeritud valkUuriti ECH-vahendatud kasvajarakkude surma molekulaarset alust, mitmete elutähtsate signaaliradade, nagu MAPK ja AKT (24,25), aktiivsust, mis kontrollivad rakkude ellujäämist ja surma. MAPK-d on evolutsiooniliselt konserveerunud, proliinile suunatud Ser/Thr proteiinkinaasid, sealhulgas rakuvälised signaaliga reguleeritud kinaasid (ERK), c-Jun NH2-terminaalne kinaas (JNK) ja p38 perekonna liikmed, mis aktiveeritakse kolme astme kinaasi signaaliülekande kaskaadid (26, 27). Selles uuringus hinnati MAPK-de ja AKT-de ekspressiooni, samuti nende aktiveeritud fosforüülitud vorme ning selgus, et ECH pärsib märkimisväärselt JNK ja ERK1/2 aktiivsust, kuid suurendab p38 aktiivsust (joonis 5). Eelkõige näidati, et ECH-ravi ei mõjuta AKT aktiivsust, mis on samuti kriitilise tähtsusega rakkude proliferatsiooni jaoks (joonis 5). Lisaks näidati, et ECH-ravi tõstab Baxi ja kaspaasi-3 ekspressiooni, vähendades samal ajal Bcl-2 ekspressiooni (joonis 5), mis on kooskõlas joonisega 2. Seega näitavad tulemused, et ECH käivitab kasvajarakkude apoptoosi MAPK raja kaudu.

Arutelu

Meie teadmiste kohaselt on see esimene uuring, mis näitab, et ECH-l on kasvajat supresseeriv funktsioon, käivitades apoptoosi (joonis 2), soodustades ROS-i tootmist (joonis 3) ja indutseerides mitokondriaalse membraani potentsiaali depolarisatsiooni (joonis 4). , mis põhjustab järelikult kasvajarakkude kasvu pärssimist (joonis 1). Lisaks näidati, et ECH-vahendatud kasvajarakkude surma molekulaarne alus toimus MAPK signaaliradade reguleerimise kaudu (joonis 5). Need leiud näitavad ECH uudset funktsiooni tuumorigeneesi ennetamisel ja viitavad seega sellele, et see võib olla vähiravi kandidaataine.

Enamik vähivastaseid ravimeid võib indutseerida kasvajarakkude apoptoosi, vananemist ja/või rakutsükli peatamist, mis põhjustab kasvajarakkude kasvu ja proliferatsiooni pärssimist. Rakutsükli seiskumine on raku reaktsioon kergetele stressisignaalidele, mis võimaldavad rakkudel parandada kahjustatud DNA-d enne replikatiivse DNA sünteesi või mitoosi käivitamist, samas kui apoptoos ja vananemine (püsiv rakutsükli seiskumine) toimuvad vastusena stressisignaalidele, mis kõrvaldavad parandamatud või pahaloomulised rakud ( 28,29). Seetõttu hinnati selles uuringus ainult ECH apoptootilist toimet kasvajarakkudele, kuna vähirakkude tapmine on vähivastase aine tugevuse hindamise peamine kriteerium. Eelkõige näidati, et ECH indutseerib ekspressiooniBax(joonis 5), pro-apoptootiline geen, mida transkriptsiooniliselt aktiveerib kasvaja supressor p53 (30). Seega tasub testida, kas ECH suudab aktiveerida p53 signaaliraja. Kui jah, võib ECH olla võimeline esile kutsuma ka p53-sõltuva rakutsükli peatamise, vananemise, apoptoosi või autofagia. Selles uuringus selgitati ECH kasvajat pärssivat funktsiooni SW1990 pankrease adenokartsinoomi rakuliinis. Siiski on vaja täiendavaid uuringuid, et jälgida rohkem kõhunäärmevähi rakuliine. On näidatud, et onkogeense valgu RAS ja kasvaja supressori p53 mutatsioonid on seotud pankreasevähi tekkega (31); IARC p53 andmebaasi (//p53.iarc.fr/CellLines.aspx) kohaselt ei sisalda SW1990 rakuliin siiski p53 mutatsiooni. Seetõttu on oluline uurida, kas ECH võib mõjutada teiste erinevate p53 mutatsioonidega pankreasevähi rakuliinide kasvu ja proliferatsiooni. Lisaks oleks huvitav kindlaks teha, kas ECH on võimeline soodustama apoptoosi ja pärssida teist tüüpi kasvajate kasvu.

On näidatud, et ECH-ravi põhjustatud ROS-i tõus ja MMP vähenemine on apoptoosi esilekutsumisel olulised (22). Lisaks on leitud, et ROS võib indutseerida mitokondriaalsete pooride oksüdatsiooni, mis aitab kaasa tsütokroomi vabanemiselec, apoptoosi vaheühend MMP katkemise tõttu (22). Seega tuleb veel kindlaks teha, kas ECH häirib MMP-d kaudselt ROS-i esilekutsumise kaudu. Lisaks on näidatud, et ROS-i esilekutsutud oksüdatiivne stress on seotud paljude rakukasvu kontrollivate signaalide, sealhulgas p53, NF-κB, HIF-ide ja PI3K moduleerimisega (32). Tuleb veel kindlaks teha, kas ja kui jah, siis kuidas ECH reguleerib neid olulisi signalisatsiooniteid. Eelkõige põhjustab oksüdatiivne stress mitmesuguseid neurodegeneratiivseid haigusi, mis on tingitud suurest hapnikutarbimisest, nõrkadest antioksüdatiivsetest süsteemidest ja kesknärvisüsteemi terminaalsetest diferentseerumisomadustest (33). Siiski on mitmed uuringud näidanud, et ECH-l on närvikoele kaitsev ja apoptootiline toime. Sellega seoses on mõistlik oletada, et ECH võib vähendada ROS-i tootmist terminaalselt diferentseerunud närvirakkudes. Seetõttu tuleb veel kindlaks teha, kas ROS-i tootmise reguleerimine ECH-ga sõltub rakkude diferentseerumise staatusest. Seega näitavad praegused tulemused koos teiste uuringutega, et ECH, laialdaselt kasutatav TCM, võib olla oluline kemoterapeutiline strateegia mitte ainult neurodegeneratiivsete haiguste, vaid ka pahaloomuliste kartsinoomide raviks.

Viimasel ajal on TCM-i kasutamine vähiravis pälvinud üha rohkem tähelepanu. TCM-is kasutatavate ravimtaimedest valmistatud looduslike saaduste potentsiaali on teadlaskond tunnustanud isegi läänemaailmas (9). Nende looduslike toodete toimemehhanismide selgitamiseks on vaja teha jõupingutusi, mis võib lõpuks viia tõhusate ja ohutute vähiravi ravimite väljatöötamiseni.

Kokkuvõtteks võib öelda, et käesolev uuring näitas ECH kasvaja inhibeerivat funktsiooni ja täpsustab ka ECH-vahendatud kasvaja supressiooni molekulaarset alust, mis viitab ECH võimalikule kliinilisele kasutamisele vähiravis.

Tänuavaldused

Seda uuringut rahastas ja toetas FMU teadusuuringute võtmeprogramm (grant nr 09ZD014). Autorid soovivad tänada Biomedworldi (Shanghai, Hiina) abi eest käsikirja redigeerimisel.

Viited

1. Hanahan D ja Weinberg RA: vähi tunnused: järgmine põlvkond. Lahter 144: 646-674, 2011.

2. Alderton GK: Transkriptsioon: MYC transkriptsioonilised mõjud. Nat Rev Cancer 14: 513, 2014.

3. Zindy F, Eischen CM, Randle DH, Kamijo T, Cleveland JL, Sherr CJ ja Roussel MF: Myc signaaliülekanne ARF kasvaja supressori kaudu reguleerib p53-sõltuvat apoptoosi ja immortalisatsiooni. Genes Dev 12: 2424-2433, 1998.

4. Sachdeva M, Zhu S, Wu F, Wu H, Walia V, Kumar S, Elble R, Watabe K ja Mo YY: p53 represseerib c-Myc kasvaja supressori miR-145 induktsiooni kaudu. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3207-3212, 2009.

5. Liao JM, Cao B, Zhou X ja Lu H: uus ülevaade p53 funktsioonidest selle siht-mikroRNA-de kaudu. J Mol Cell Biol 6: 206-213, 2014.

6. Zamble DB ja Lippard SJ: Tsisplatiin ja DNA parandamine vähi keemiaravis. Trends Biochem Sci 20: 435-439, 1995.

7. Kleeff J, Kornmann M, Sawhney H ja Korc M: aktinomütsiin D kutsub esile apoptoosi ja pärsib kõhunäärmevähirakkude kasvu. Int J Cancer 86: 399-407, 2000.

8. Tacar O, Sriamornsak P ja Dass CR: doksorubitsiin: värskendus vähivastase molekulaarse toime, toksilisuse ja uute ravimite kohaletoimetamise süsteemide kohta. J Pharm Pharmacol 65: 157-170, 2013.

9. Efferth T, Li PC, Konkimalla VS ja Kaina B: traditsioonilisest hiina meditsiinist ratsionaalse vähiravini. Trends Mol Med 13: 353-361, 2007.