Ⅱ osa Europiumi nanoosakeste külgvoolu immuunanalüüsi väljatöötamine NGAL tuvastamiseks uriinis ja ägeda neerukahjustuse diagnoosimiseks

Tulemused

1. Rekombinantse NGAL valgu ekspressioon ja puhastamine

pSecTag2A-NGAL rekombinantne plasmiid transfekteeriti CHO rakkudesse. NGAL-6×His valku ekspresseeritakse peamiselt raku supernatandis ja seejärel puhastatakse Ni Sepharose'iga. Puhastatud rekombinantne NGAL-valk saadi umbes 95-protsendilise puhtusega ja analüüsiti SDS-PAGE-ga ligikaudse molekulmassiga 23,7 kDa (joonis 1 A). Western blot kinnitas ka rekombinantse valgu NGAL ekspressiooni ja puhastamist (joonis 1B).

2. MAb-de genereerimine

Esiteks võrdlesime alalispinge mõju rakumembraani perforatsioonile erinevate elektrivälja intensiivsuste korral ja elektrilise fusiooniskeemi optimeerimiseks oli impulsi amplituud vastavalt 400 V, 450 V, 500 ja 550 V. Varasemate aruannete kohaselt mõjutab rakkude kontsentratsioon fusioonitõhusust märkimisväärselt[16]. Eraldatud põrnarakkude ja SP2/0 müeloomirakkude segasuspensioon viidi fusioonikambrisse erinevatel kontsentratsioonidel ligikaudu 2 × 106, 2 × 107 ja 2 × 108 rakku / ml. Liitmise efektiivsus oli kõrgeim 450 V alalisvoolu juures ja optimaalne rakukontsentratsioon oli 2 × 107 rakku/ml (joonis 2).

3. MAb-de iseloomustus

MAb-d puhastati Protein A kolonnis. Puhastatud MAb-d eraldati 12% SDS-PAGE abil ja redutseerivates tingimustes täheldati kahte molekulmassiga 55 kDa ja 25 kDa riba. Mitteredutseerivates tingimustes täheldati selgeid ribasid suurusega 170 kDa, mis on 2F4 ja 1G1 intaktne valk (joonis 3 A). Western blot näitas, et kõik MAb-d seonduvad spetsiifiliselt inimese NGAL-valguga (joonis 3B). Pärast rakkude elektrofusiooni ja subkloonimist tuvastati hübridoomide supernatandid kaudse ELISA-ga NGAL-6×His ja PCT- 6×His abil, et tagada antikehade spetsiifiline seondumine NGAL-iga. Kaks väga positiivset hübridoomi (1G1, 2F4), millel oli spetsiifiline NGAL-i sidumine, kuid ilma ristreaktsioonita PCT-6×His, valiti edukalt MAb-de tootmiseks ja puhastamiseks (joonis 3 C). Kahe MAb afiinsuse tuvastamiseks analüüsiti erineva kontsentratsiooniga antikehade ja NGAL valgu vahelist koostoimet BIAcore T200 süsteemiga. Kineetiline diagramm näitas, et 2F4 ja 1G1 afiinsus olid vastavalt 4,5 × 10-7 ja 6,0 × 10-7 (joonis 3D). Nende kahe MAb isotüübid, mis tuvastati kaubanduslike komplektidega, olid IgG1. 2F4 ja 1G1-HRP sidumise blokeerimismäär oli cELISA tuvastamise järgi 63 protsenti, mis näitab, et nad tundsid ära erinevad epitoobid.

4. EU-NPS-LFIA protseduurid

Tuginedes EU-NPS-ile kui märgistele ja sandwich-tüüpi immuunanalüüsile, loodi LFIA NGAL-i tuvastamiseks. MAb 2F4 kaeti nitrotselluloosmembraanile ja paaristati EU-NPS-1G1-ga, mis põhines antikehade sidumisel lateraalvoolu immunokromatograafia platvormil. Nagu skemaatiliselt illustreeritud (joonis 4), kaeti nitrotselluloosmembraani TL ja CL MAb-de 2F4 ja kitse hiirevastase IgG-ga. EU-NPS-1G1 oli märgistatud konjugaadipadjal. NGAL-antigeeni sisaldav proov migreerus konjugaadipadja poole, et ühineda EU-NPS-1G1-ga ja moodustada antigeen-antikeha kompleksid. Seejärel hõivas kompleksid mAb 2F4 T-liinis, migreerides moodustades sandwich-komplekse. Liigne kompleks kombineeriti kitse hiirevastase IgG-ga. Testribasid mõõdeti fluorestsentsdetektoriga 15 minuti pärast.

5. Tulemuslikkuse hindamine

Antikehapaare (2F4- märgistatud1G1) detektorina ja püüdvate antikehadena kasutati fluorestsents-immunokromatograafia loomiseks ning EU-NPS-LFIA analüütilist jõudlust hinnati standardkõvera loomise teel. Suhtelist fluorestsentsi intensiivsuse suhet (HT/HC) suurendati NGAL-i kontsentratsiooniga. EU-NPS-1G1 näitas reaktsiooni mAb 2F4 suhtes (joonis 5 A). Suure annuse konksu mõju ei tuvastatud, kui antigeeni kontsentratsioon jõudis 3000 ng/mL-ni. Regressioonivõrrand esitati järgmiselt: y=0,0012 x pluss 0,0059 (R2=0.99), kus y tähistab HT/HC suhet ja x tähistab NGAL-i kontsentratsioone (joonis fig. 5B). Avastamispiir (LOD) oli 0,36 ng/mL (3-kordne tühiproovi standardhälve, n=20), mis on arvutatud Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) juhise EP17-A2 järgi, NGAL kontsentratsioon oli lineaarne seos vahemikus 1-1500 ng/mL[17].

6. Täpsus

Immunoloogilise meetodi täpsuse ja reprodutseeritavuse hindamiseks viidi läbi intratesti ja intertestide taastumiskatsed. Erinevad kontsentratsioonid (50, 200 ja 800 ng/ml) NGAL standardainet lisati negatiivsetele uriiniproovidele. Testisisene täpsus arvutati kolme kordusega iga kõrgendatud kontsentratsiooni juures ühe päeva jooksul ja analüüsidevaheline täpsus arvutati kolme kordusega iga kõrgendatud kontsentratsiooni juures iga kolme päeva järel viieteistkümne päeva jooksul järjest[18]. Tulemused on näidatud tabelis 1, arvutatud analüüsisisene variatsioonikordaja (CV) jäi vahemikku 2,57–4,98 protsenti (n=10), mis on madalam kui 10 protsenti. Testidevaheline CV jäi vahemikku 4,11–7,83 protsenti (n=15), mis on samuti alla 10 protsendi.

Analüüsisisest ja analüüsidevahelist täpsust kontrolliti kahe hindamisseadmega (Guangzhou Wondfo Biotech Co., Ltd ja Guangzhou Labsim Biotech Co., Ltd) ning tulemus on lõpuks ühtlane. Need tulemused selgitasid, et arendatud LFIA täpsus oli kõrgel tasemel ja reprodutseeritavus vastuvõetaval tasemel.

Ostmiseks klõpsake siinCistanche toidulisandid

7. Spetsiifilisus

Testribade spetsiifilisust hinnati endogeensete ainete, sealhulgas kreatiniini, glükoosi ja karbamiidi lämmastiku lisamisega normaalsetes ja erinevates kontsentratsioonides uriiniproovides. Nagu on näidatud tabelis 2, näitasid tulemused, et kõik suhtelised kõrvalekalded (RD) olid vahemikus ± 10 protsenti, mis viitab sellele, et antigeeni-antikeha interaktsioon oli stabiilne ja testribade spetsiifilisus oli NGAL-i suhtes vastuvõetav.

8. Kliiniliste proovide testid

Et hinnata EU-NPS-LFIA põhjal NGALi rakenduspädevust kliiniliste proovide määramisel, kokku 83 uriiniproovi, mis sisaldasid 26 madala väärtusega proovi (11–70 ng/mL), mediaan 19 väärtusega proove (110–800 ng/mL), 38 kõrge väärtusega proovi (800–1740 ng/mL), mõõdeti ARCHITECT uriini NGAL analüüsiga. Regressioonikõvera korrelatsioonikordaja (R2 ) tulemused olid 0,9829 (p < 0,01), mis näitab, et kahel tuvastamismeetodil oli oluline lineaarne seos (kus x tähistab ARCHITECTi analüsaatoriga saadud NGAL-i kontsentratsioone, y on mõõdetud väärtused välja töötatud testribad) (joonis 6). Seega oli NGAL-i määramiseks välja töötatud EU-NPS-LFIA kliinilistes testides väga täpne.

Arutelu

Meie uuringus töötati välja EU-NPS-LFIA NGAL tuvastamiseks inimese uriinis ja AKI diagnoosimiseks. Praegust AKI diagnoosi kinnitab seerumi kreatiniini (sCr) kontsentratsioon, mis on püsiv, välja arvatud juhul, kui vähemalt 50 protsenti kahjustatud neerufunktsioonist[19]. AKI tekkis 89 protsendil rasketest COVID-i{5}} patsientidest ja enamikul patsientidest oli oliguuria, mis ilmnes varem kui plasma kreatiniinisisaldus[20]. Biomarkerid suurendasid vastuvõtul kõrgenenud taset, mis on seotud suurenenud suremusega. NGAL on üks neist biomarkeritest, mille tasemed võivad positiivselt korreleerida COVID{7}} hospitaliseeritud patsientide suremuse riskiga[21]. AKI-s on mitmed uuringud avastanud, et NGAL kontsentratsioon uriinis on märkimisväärselt seotud sCr kontsentratsiooniga [22]. Viimastel aastatel on NGAL-i tuvastamiseks välja töötatud erinevaid elektrokeemilisi ja immunoloogilisi meetodeid, elektrokeemilise määramise juhtumeid, tahkefaasilise lähedusligatsiooni testi ja ensüümivaba elektrokeemilist immunoanalüüsi [23, 24]. Need tehnikad nõuavad aga täpset varustust, eripersonali ja tulemuste professionaalset tõlgendamist. Seetõttu on selle häire jälgimiseks kriitilise tähtsusega tõhusa ja mugava NGAL-i kontsentratsiooni tuvastamise analüüsi väljatöötamine uriinis. Polüetüleenglükooli (PEG) liitmise madal efektiivsus tavapärastes meetodites põhjustab raskusi funktsionaalsete antikehade hankimisel, optimeerisime elektrilise liitmise parameetreid, mis võimaldasid suurendada fusioonitõhusust elujõuliste hübridoomide valmistamiseks ja saime kaks anti-NGAL MAb. MAb-d ei ole mitte ainult kõrge afiinsusega, vaid on suunatud ka erinevatele epitoopidele, mida kasutatakse kvaliteetse diagnostilise analüüsi loomiseks.

Herba Cistanche

Viimastel aastatel on teatatud paljudest uuringutest, mille kohaselt on välja töötatud mitmed NGAL-i kiirdiagnostilised immunoanalüüsid, sealhulgas fotoelektrokeemiline immunosensor ja kolm elektrokeemilist immunosensorit, tahke faasi lähedusligeerimise test ja külgvoolu test[25]. Ühes uuringus valmistati immunosensor NGAL-i püüdmisantikehade abil, mis on immobiliseeritud sõelprinditud-modifitseeritud süsinikelektroodile ja märgistatud NGA-vastase sekundaarse antikeha lisamisega PB-NP-ga kaunistatud g-C3N4 nanolehtedele, moodustades SPCE-l võileiva[24]. Teises uuringus töötati välja NGAL-i vastane antikeha, mis immobiliseeriti siiditrükiga elektroodile (SPCE), mida oli modifitseeritud elektropihustusgrafeeni/polüaniliini (G/PANI) peale kantud elektropolümeriseeritud aniliiniga[25]. Kaks aruannet näitasid, et LOD varieerus laialdaselt vahemikus 0,6 pg/mL kuni 21,1 ng/mL, olenevalt N-elemendiga g-C3N4 nanolehtedest, mis suurendasid nanohübriidide elektrokatalüütilist efektiivsust kui grafeeni nanolehtedel, ja NGAL-i LOD-st. analüüs varieerub sõltuvalt immunosensorist, konjugeeritud kompleksist ja antikehadest[26]. Nende uuringute kohaselt valgustasime, et LFIA tundlikkust saab parandada, tuginedes preambuli osas mainitud erinevatele fluorestsents-nanoosakestele. LFIA-s fluorestsentssondidena märgistatud ülitundlikke nanoosakesi on viimastel aastakümnetel pidevalt uuritud, kulla nanoosakesi kasutatakse kõige laialdasemalt, kuid traditsioonilistel märgistel põhinevate külgvoolutestide rakendamine piirdub nende halva tuvastamise ja nõrgema signaaliga. 27]. Praegu on NGAL-i arendamiseks saadaval antikehi, mida on kasutatud NGAL-i tuvastamiseks erinevatel platvormidel, kuid need ei ole saadaval LFIA-s, mis põhinevad EU-NPS-i siltidel, mida katsetati NGAL-i tuvastamisel lisaks UCP-tehnoloogial põhinevale külgvooluanalüüsile [28]. , 29].

Fluorestsents-immunoanalüüsidel on eelised erinevates tuvastamisväljades, eriti küpsetes kvantpunktides, nende tundlikkust mõjutasid MAb-d ja fluorestseeruvad materjalid ning EU-NPS ja spetsiifilised MAb-d võivad fluorestsentssondide kasutamisel oluliselt parandada[30 ]. EU-NPS-i rakendati fluorestsents-LFIA ribadele, mis olid küpsenud tuvastamisväljas ja suurendasid LFIA mitmeid eeliseid testi tundlikkuse, spetsiifilisuse ja stabiilsuse osas[31]. Tänu EU-NPS-i suurepärastele omadustele oli NGAL-i avastamispiir selle meetodi puhul 0,36 ng/mL, samas kui keskmine NGAL-i tase uriinis oli tervetel inimestel ligikaudu 7,0 ng/ml[32]. . NGAL-i EU-NPS-LFIA arendused ja rakendamine on alles algfaasis, selle analüüsiga on vaja testida seerumi- ja uriiniproovide NGAL-i COVID-19 patsientidega, mille ravi parandamine tulevikus töötab. .

Järeldused

Uuringus saime edukalt kaks hiire anti-NGAL MAb-d (2F4, 1G1) ja märgistati EU-NPS-iga, et luua külgvoolu immuuntehnika. Leiti, et EU-NPSLFIA tuvastas NGAL-i laias vahemikus 1- 3000 ng/mL 15 minuti jooksul, tuvastamise tundlikkus jõudis 0,36 ng/mL-ni. Neid NGAL-vastaseid MAb-sid saab usaldusväärselt kasutada NGAL-i tuvastamise fluorestsents-LFIA-s uriiniproovides, nii et see peaks olema rakendatav AKI diagnoosimisel.

Cistanche tubulosa

Cistanche ekstrakti efektiivsus ägeda neerukahjustuse korral

Äge neerukahjustus (AKI), tuntud ka kui äge neerupuudulikkus, on tavaline meditsiiniline seisund, mis on seotud neerufunktsiooni järsu langusega. AKI võib põhjustada märkimisväärset haigestumust ja suremust, eriti kui seda ei ravita. Seetõttu on patsiendi tulemuste parandamiseks oluline varajane diagnoosimine ja kiire ravi.

Taimest Cistanche deserticola saadud tsistanche ekstrakti on traditsioonilises hiina meditsiinis kasutatud erinevate terviseseisundite raviks. Hiljutised uuringud on näidanud, et Cistanche ekstrakt võib AKI ravis paljutõotav olla.

Uuringud on tuvastanud potentsiaalsed mehhanismid, mille abil Cistanche ekstrakt avaldab AKI-le terapeutilist toimet. Nende hulka kuuluvad põletiku mahasurumine, oksüdatiivse stressi vähendamine, apoptootiliste radade allareguleerimine ja kudede regenereerimise soodustamine. Lisaks on näidatud, et Cistanche ekstrakt takistab neerufibroosi progresseerumist, mis võib tekkida AKI tagajärjel.

Loomkatsed näitavad, et Cistanche ekstrakti manustamine avaldab AKI mudelites neerufunktsiooni kaitsvat toimet, mille tulemuseks on glomerulaarfiltratsiooni kiiruse paranemine, torurakkude kahjustuste vähenemine ning vere uurea lämmastiku ja seerumi kreatiniini taseme langus. Täiendavad uuringud kliinilises praktikas inimestel näitavad uriinierituse ja glomerulaarfiltratsiooni kiiruse (GFR) suurenemist, hoides ära seerumi uurea lämmastiku ja kreatiini taseme edasise suurenemise südameoperatsiooniga seotud AKI-ga patsientidel.

Siiski on veel mitmeid küsimusi ideaalsete annuste, pikaajaliste ohutusprofiilide ja preparaatide standardimise kohta. Cistanche ekstraheerimise optimaalse annuse ja manustamisrežiimi hindamiseks on vaja täiendavaid kvaliteetseid randomiseeritud kontrollitud uuringuid.

Üldiselt näitavad tõendid, et Cistanche ekstrakt võib olla AKI jaoks tõhus ravi, kuigi täpsemate soovituste saamiseks on vaja täiendavaid ulatuslikke uuringuid ja katseid. Kokkuvõtteks võib öelda, et vaatamata mõningatele piirangutele näitab Cistanche ekstrakt potentsiaali AKI raskuse vähendamisel. Varajane avastamine ja õigeaegne ravi võivad parandada patsiendi tulemusi ja elukvaliteeti. Patsiendid peavad enne alternatiivsete ravimeetodite kasutamist konsulteerima tervishoiuteenuse osutajatega, et tagada ohutus ja vältida kõrvaltoimeid.

Cistanche'i mõjud

Viited

15. Huang X, Aguilar Z, Xu H, Lai W, Xiong Y: Membraanil põhinev külgvoolu immunokromatograafiline riba nanoosakestega kui reporterid tuvastamiseks: ülevaade. Biosensors bioelectronics 2016, 75:166–180.

16. Weeratna R, Comanita L, Davis H: CPG ODN võimaldab BALB/c hiirtel kasutada väiksemat antigeeni annust B-hepatiidi pinnaantigeeni vastu. Immunology rakubioloogia 2003, 81(1):59–62.

17. Tong Q, Chen B, Zhang R, Zuo C: Kliinilise ensüümi analüüsi standardiseerimine, kasutades külmutatud inimese seerumi kogumeid Rahvusvahelise Kliinilise Keemia ja Laboratoorse Meditsiini Föderatsiooni poolt määratud väärtustega. Scandinavian Journal of kliiniliste laboratoorsete uuringute 2018, 78:74–80.

18. Huang D, Ying H, Jiang D, Liu F, Tian Y, Du C, Zhang L, Pu X: Interleukiini -6 kiire ja tundlik tuvastamine seerumis ajalahutusega lateraalvoolu immuunanalüüsi abil. Analüütiline biokeemia 2020, 588:113468.

19. Shapiro N, Trzeciak S, Hollander J, Birkhahn R, Otero R, Osborn T, Moretti E, Nguyen H, Gunnerson K, Milzman D jt: Plasma neutrofiilide želatinaasiga seotud lipokaliini diagnostiline täpsus ägeda neeruhaiguse prognoosimisel vigastus erakorralise meditsiini osakonna patsientidel, kellel kahtlustatakse sepsist. Annals of erakorralise meditsiini 2010, 56(1):52–59.e51.

20. Luther T, Bülow-Anderberg S, Larsson A, Rubertsson S, Lipcsey M, Frithiof R, Hultström M: COVID-19 intensiivravi patsientidel areneb valdavalt oliguurne äge neerukahjustus. Acta anesthesiologist Scandinavica 2021, 65(3): 364–372.

21. Abers M, Delmonte O, Ricotta E, Fintzi J, Fink D, de Jesus A, Zarember K, Alehashemi S, Oikonomou V, Desai J: immuunpõhist biomarkeri signatuuri seostatakse COVID-i suremusega-19 patsiendid. JCI ülevaade 2021, 6(1).

22. Wagener G, Jan M, Kim M, Mori K, Barasch J, Sladen R, Lee H: seos uriini neutrofiilide želatinaasiga seotud lipokaliini suurenemise ja ägeda neerufunktsiooni häire vahel pärast täiskasvanute südameoperatsiooni. Anesthesiology 2006, 105(3):485–491.

23. Kannan P, Tiong H, Kim D: Neutrofiilide želatinaasiga seotud lipokaliini ülitundlik elektrokeemiline määramine ägeda neerukahjustuse korral. Biosensors bioelectronics 2012, 31(1):32–36.

24. Zhang F, Zhong H, Lin Y, Chen M, Wang Q, Lin Y, Huang: Preisi sinisest ja grafiitsest CN-nanolehtedest koosnev nanohübriid signaali genereeriva märgisena ensüümivabas elektrokeemilises immunoanalüüsis neutrofiilide želatinaasi jaoks. seotud lipokaliiniga. Mikrochimica acta 2018, 185(7):327.

25. Yukird J, Wongtangprasert T, Rangkupan R, Chailapakul O, Pisitkun T, Rodthongkum N: grafeeni/polüaniliini nanokomposiidil põhinev märgistuseta immunosensor neutrofiilide želatinaasiga seotud lipokaliini tuvastamiseks. Biosensors bioelectronics 2017, 87:249–255.

26. Gong Y, Li M, Wang Y: Süsiniknitriid energia muundamisel ja salvestamisel: hiljutised edusammud ja väljavaated. ChemSusChem 2015, 8(6):931–946.

27. Chen A, Yang S: Antikehade asendamine aptameeridega külgvoolu immuunanalüüsis. Biosensors bioelectronics 2015, 71:230–242.

28. Li H, Mu Y, Yan J, Cui D, Ou W, Wan Y, Liu S: märgistuseta fotoelektrokeemiline immunosensor neutrofiilide želatinaasiga seotud lipokaliini jaoks, mis põhineb nanokehade kasutamisel. Analüütiline keemia 2015, 87(3): 2007–2015.

29. Lei L, Zhu J, Xia G, Feng H, Zhang H, Han Y: kiire ja kasutajasõbralik test neutrofiilide želatinaasiga seotud lipokaliini (NGAL) tuvastamiseks, kasutades üleskonverteerivaid nanoosakesi. Talanta 2017, 162:339–344.

30. Yeo S, Bao D, Seo G, Bui C, Kim D, Anh N, Tien T, Linh N, Sohn H, Chong C jt: Linnugripi H7 alatüübi viiruse vastaste monoklonaalsete antikehade kiire diagnostilise rakenduse täiustamine kasutades Euroopiumi nanoosakesed. Scientific Reports 2017, 7(1):7933.

31. Chen E, Xu Y, Ma B, Cui H, Sun C, Zhang M: MonascusCarboxylFunctionalized, euroopium nanoosakestel põhinev fluorestsents-immunokromatograafiline test tsitriniini tundlikuks tuvastamiseks fermenteeritud toidus. Toksiinid 2019, 11(10).

32. Bolignano D, Coppolino G, Campo S, Aloisi C, Nicocia G, Frisina N, Buemi M: neutrofiilide želatinaasiga seotud lipokaliin patsientidel, kellel on autosomaalne domineeriv polütsüstiline neeruhaigus. American Journal of Nephrology 2007, 27(4):373–378.

Moli Yin 1 , Yuanwang Nie 2 , Hao Liu 2 , Lei Liu 1 , Lu Tang 1 , Yuan Dong 2 , Chuanmin Hu 1 ja Huiyan Wang 1

1 Jilini Antikehatehnoloogia Koostöö Innovatsioonikeskus, Jilini Meditsiiniülikool, 132013 Jilin, PR Hiina.

2 Laboratooriumi akadeemia, Jilini meditsiiniülikool, 132013 Jilin, PR Hiina.