Osa Ⅰ Europiumi nanoosakeste külgvoolu immuunanalüüsi väljatöötamine NGAL tuvastamiseks uriinis ja ägeda neerukahjustuse diagnoosimiseks
May 09, 2023
Abstraktne
1. Taust
AKI on seotud 2019. aasta koroonaviirushaiguse (COVID-19) patsientide tõsiste kahjulike tagajärgede ja suremusega, seega on varajane diagnoosimine ja sekkumine hädavajalik. Neutrofiilide želatinaasiga seotud lipokaliin (NGAL) on üks paljutõotavamaid biomarkereid ägeda neerukahjustuse (AKI) tuvastamiseks, kuid praegused tuvastamismeetodid on ebapiisavad, mistõttu on NGAL-i tuvastamiseks varajaseks diagnoosimiseks vaja kiiremaid, mugavamaid ja täpsemaid meetodeid. AKI-st. Siin lõime euroopiumi nanoosakestel (EU-NPS) põhineva kiire, usaldusväärse ja täpse lateraalvoolu immuunanalüüsi (LFIA) NGAL-i tuvastamiseks inimese uriiniproovides.
2. Meetodid
Kasutati topelt-antikehaga immunofluorestsentsanalüüsi, milles kasutati euroopiumiga legeeritud nanoosakesi, ja NGAL-i monoklonaalsete antikehade (MAb) konjugaat genereeriti märgistena, optimeerides elektrilise liitmise parameetreid. Selle meetodi kliinilise kasutamise efektiivsuse hindamiseks kasutati 83 uriiniproovi.
3. Tulemused
NGAL-i kvantitatiivne tuvastamisvahemik AKI-s oli {{0}} ng/mL ja tuvastamise sensibiliseerimine oli 0,36 ng/mL. Testisisese ja intertesti variatsioonikoefitsient (CV) oli vastavalt 2.57-4.98 protsenti ja 4.11-7.83 protsenti. Samal ajal oli korrelatsioonikordaja euroopiumi nanoosakestel põhinevate lateraalse fluorestsents-immunoanalüüside (EU-NPS-LFIA) ja ARCHITECTi analüsaatori vahel märkimisväärne (R2=0.9829, n=83, p < 0,01).
4. Järeldused
Seega on loodud NGAL-i kiirem ja lihtsam toimimise kvantitatiivne analüüs AKI jaoks, mis on väga oluline ja tähendusrikas varajase AKI diagnoosimiseks, mis viitab sellele, et analüüs võib anda varajase hoiatuse haiguse tulemusest.
Märksõnad
neutrofiilide želatinaasiga seotud lipokaliin (NGAL), monoklonaalne antikeha, külgvoolu immunoanalüüs, äge neerukahjustus (AKI),Cistanche'i mõjud.
Klõpsake siin, et teada saadamillised on Cistanche eelised
Sissejuhatus
Koroonaviirushaigus 2019 (COVID-19) on tõsiste katastroofidega laialt levinud kogu maailmas [1]. Ägeda neerukahjustuse (AKI) haigestumuse ja suremuse määr kriitiliste haiguste tavaliste tüsistuste korral on suurem ning see moodustab ligikaudu 5-7 protsenti haiglaravil viibivatest patsientidest maailmas[2]. - Mitmed uuringud on hinnanud AKI arengut suuremaks. tugevalt seotud COVID-19 halvemate tulemuste ja suremuse määradega, kirjeldades AKI esinemissagedust, mis jääb COVID{11}} patsientide seas vahemikku 0,5–36,6 protsenti[3]. AKI varajane avastamine ja täpne ravi võib rakendada paremaid ennetusstrateegiaid ja ära hoida neerufunktsiooni halvenemist ja neerupuudulikkust, pidurdades tõhusalt COVID{13}} hospitaliseeritud patsientide progresseerumist[4]. Nende hulgas on neutrofiilide želatinaasiga seotud lipokaliini (NGAL) tunnistatud üheks paljutõotavaks biomarkeri kandidaadiks AKI tuvastamiseks. NGAL on 25 kDa glükoproteiin, mis on seotud neutrofiilide želatinaasiga ja esineb tavaliselt madalamal tasemel inimese kudedes, nagu maos, käärsooles ja neerus, kuid selle ekspressioon suureneb seerumis ja uriinis järsult, kui neer oli isheemilise või nefrotoksilise vigastusega. [5].
Külgvoolu immunoanalüüse (LFIA) on peetud soovitud sõeltestideks nende lihtsuse, in situ analüüsi ja töö lihtsuse tõttu[6]. Fluorestseeruvate mikroosakestega LFIA-d on juba kasutatud erinevate mikroobsete patogeenide ja mitmete põletikumarkerite tuvastamiseks[7, 8]. LFIA tundlikkuse parandamiseks on üldiselt kasutatud mitmeid uudseid nanoosakesi, sealhulgas süsiniku nanoosakesi, kvantpunkte, fluorestseeruvaid värvaineid, magnetilisi nanomärgiseid ja euroopiumi nanoosakesi (EU-NPS)[9]. EU-NPS kui kandjad võivad parandada 100-kordse tundlikkuse kontrasti kolloidse kulla nanoosakestega, mis on märgistatud LFIA-s[10]. EU-NPS on pika fluorestsentsi elueaga ja saadaval ka osakeste keskmise suurusega vahemikus 75–100 nm. Suur Stokesi nihe, mis on tavaliselt üle 200 nm, aitab vältida ergastusvalguse mõõtmisest tingitud hajutatud valguse häireid. EU-NPS-il on lai ergastusriba, mistõttu on kasulik suurendada ergastusenergiat, teravat emissioonipiiki, madalat tausta ja kõrget eraldusvõimet, mida on hiljuti kasutatud meditsiinilise diagnostika sandwich-tüüpi immuunanalüüsides[11].
Siin lõime uue meetodi EU-NPS-iga kui LFIA märgistega NGAL-i kiireks, tundlikuks ja varaseks mõõtmiseks uriinis, mis põhineb kahel monoklonaalsel antikehal (MAb) 1G1 ja 2F4, mille meie labor avastas. Meetod on topelt-antikeha kihiline immunofluorestsentsanalüüs, kasutades EU-NPS ja MAb konjugaati märgistena. mAb 1G1 konjugeeriti EU-NPS-iga ja mAb 2F4 kasutati EU-NPS-1G1-antigeenikompleksi hõivamiseks T-liinil. Meie tulemused näitasid, et EU-NPS-LFIA-d saab kasutada NGAL varaseks tuvastamiseks uriinis ja see võimaldab parandada AKI patsientide ravi.
Cistanche tubulosa
meetodid
1. NGAL-i ekspressioon ja puhastamine
Inimese NGAL geenijärjestuse Genbankist (NP{0}}.2) sünteesis Pekingi Genoomika Instituut (BGI) ja lisati mõlemasse otsa restriktsiooniensüümid HindIII ja XhoI. Plasmiide lõigati HindIII ja XhoI-ga ning seejärel klooniti pSecTag2A vektorisse. Konstrueeritud plasmiidid sekveneeriti, et kinnitada mutatsioonita, ja seejärel transformeeriti LipofectamineTM2000 abil Hiina hamstri munasarja (CHO) rakkudesse. 8 päeva pärast koguti rakkude supernatant pärast 0, 45 μm filtri filtreerimist. Ekspresseeritud NGAL-6×His valk puhastati niklinitrilotriäädikhappe (Ni-NTA) kolonnis ning erinevad fraktsioonid koguti ja hinnati naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesiga (SDS-PAGE). Bitsinhoniinhappe (BCA) Protein Quantification Kit mõõtis valgu kontsentratsiooni.
Puhastatud rekombinantne valk allutati 12% SDS-PAGE-le, seejärel adsorbeeriti polüvinülideenfluoriidi (PVDF) membraanile. Pärast membraani blokeerimist tris-puhvris 1% Tween-20 (TBST) lahusega, mis sisaldas 5% lõssi toatemperatuuril (RT) 2 tundi, inkubeeriti HRP-konjugeeritud anti-6×Tema märgisega. antikeha (1:5000) pimedas 1 tund toatemperatuuril, visualiseeriti bensidiiniga pärast pesemist TBST-ga ja visualiseeriti Bio-Rad Western blot tuvastussüsteemiga (DNR Bio-Imaging Systems Ltd., Iisrael).
2. MAb-de genereerimine ja puhastamine
Esimesel immuniseerimisel immuniseeriti emaseid BALB/c hiiri (6 nädala vanused, kokku 10) 50 µg NGAL-6 × Tema rekombinantse valguga, mis oli emulgeeritud võrdses annuses Freundi täieliku adjuvandiga. ja lisaimmuniseerimine viidi läbi valguga, mis oli emulgeeritud mittetäielikus Freundi adjuvandis. Kaks hüpodermilist süsti hiirte seljale ja järgnevad intraperitoneaalsed süstid 21-päevase intervalliga. Seerumiproovid koguti nädal pärast kolmandat süstimist ja antiseerumi tiiter määrati kaudse ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsiga (ELISA)[12]. Kolm päeva enne liitmist sooritasid hiired kordusimmuniseerimise 50 µg NGAL-6×His-ga, mis oli lahjendatud 0,9% NaCl-ga.
Isoleeritud immuunsüsteemi hiirte põrnarakud ja SP2/0 müeloomirakud, mis on segatud vahekorras 3:1, sulanduvad plaatinaelektroodiga LF498-3 liitmiskambris (BEX Co., Ltd, Jaapan), nagu kirjeldatud. kirjanduses[13]. Lühidalt, segatud rakku pesti kaks korda 10 ml elektrofusioonipuhvriga (0,3 M mannitool, 0,1 mM CaCl2, 0,1 mM MgCl2, pH). 7.2) ja resuspendeeriti kontsentratsiooniga 2 × 107 rakku/ml. Liit viidi lõpule, kasutades vahelduvvoolu pinget 50 V sagedusel 0,8 MHz 20 sekundi jooksul, alalisvoolu impulsi pinget 450 V 2 kordust 0,5 sekundi jooksul ja järelliitmine oli 50 V sagedusel 0,8 MHz. 7 s. Lõpuks viidi elektriga töödeldud rakususpensioon sulatuskambrist 4,5 ml eelsoojendatud RPMI 1640-sse (20 protsenti veise loote seerumit) 30 minutiks 37 kraadi juures, seejärel kultiveeriti 96-süvendiga plaatidel ja inkubeeriti 5 protsendiga. CO2 37 kraadi juures. 24 tunni pärast lisati igasse süvendisse hüpoksantiinaminopteriini tümidiini (HAT). Rakukultuuri supernatante skriiniti ELISA-ga pärast 9-päevast liitmist ja arvutati hübridoomi kloonide arv. BALB/c hiired, kellele süstiti eelnevalt parafiinõli, inokuleeriti 1 × 106 NGAL hübridoomirakkudega, astsiit puhastati Protein A kolonniga.
3. MAb-de identifitseerimine
Antikehade immunoglobuliinide alamklasse analüüsiti, kasutades antikeha alamklassi identifitseerimiskomplekti. Kaudne ELISA skriiniti spetsiifilisi MAb-sid, kasutades puhastatud rekombinantset NGAL{{0}}×His valku ja PCT- 6×His valku. Antigeeni ja antikehade vaheline interaktsioon määrati BIAcore T200 süsteemiga (GE Healthcare, Stockholm, Rootsi) HBS-EP puhvris (0,005 protsenti surfaktant P20, 10 mM Hepes, pH 7,4, 3 mM EDTA, 150 ui. mM NaCl). NGAL-i antigeen adsorbeeriti CM5 biosensori kiipidele, saavutades 400–480 vastuseühikut (RU) amiini sidestuskomplekti abil. Antikehad (2F4 ja 1G1) lahjendati HBS-EP puhvris, juhiti aeglaselt üle kiibi kiirusega 50 µL/min vastavalt 5 minutiks ja seejärel süstiti kiibile HBS-EP puhvrit, et jälgida dissotsiatsioonifaasi 4 minuti jooksul. . Andurikiibid regenereeriti pärast dissotsiatsioonifaasi glütsiini lahusega (pH 3,0). Iga üle kiibi läbinud analüüdi puhul võivad antigeeni voolukanali spetsiifilised vastused lahutada mittespetsiifilised vastused kontrollvoolukanalist. Sobitatud küllastuse sidumiskõverad kanti graafikule analüüdi kontsentratsioonide põhjal tasakaalulise sidumisreaktsiooni jaoks, et arvutada KD.
Puhastatud anti-NGAL MAb-sid analüüsiti 12% SDS-PAGE-s mitteredutseerivates ja redutseerivates tingimustes. Lühidalt, proov segati 5 x mitteredutseeriva puhvriga või 5 x valgu laadimispuhvriga ja laaditi 12-protsendilisele SDS-PAGE-le. NGAL-vastaste MAb-de spetsiifilisus määrati Western Blot meetodil. NGAL-valgud viidi läbi 12-protsendilise SDS-PAGE-ga, seejärel adsorbeeriti PVDF-membraanile, mis aktiveeriti metanoolis 15-sekundilise leotamise teel, ja seejärel allutati elektroforeesi tingimustele 100 V juures 2 tundi. Pärast blokeerimist Tris-HCl puhvris 1% Tween-20 lahusega (TBST), mis sisaldas 5% lõssi toatemperatuuril 2 tundi, inkubeeriti membraani 4 kraadi juures primaarsete antikehadena hiire anti-NGAL MAb-dega. Järgmisel päeval pesti membraani TBST-ga ja inkubeeriti hiirevastase konjugeeritud HRP IgG-ga pimedas 1,5 tundi toatemperatuuril. Lõpuks visualiseeriti membraan tugevdatud kemoluminestsentsi (ECL) Western blot tuvastamissüsteemiga.
4. Konkureerivad ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsid (ELISA)
Kahe monoklonaalse antikeha võime suhtes cELISA abil testiti NGAL-i ainulaadseid epitoope. MAb konjugeeriti HRP-ga, kasutades HRP Antibody Labeling Kit (Shanghai YSRIBIO industrial co., LTD), mille töökontsentratsiooni testiti otsese ELISA abil. {{0}}süvend Mikrotiiterplaadid kaeti 2 µg/ml NGAL antigeeniga üleöö temperatuuril 4 kraadi, seejärel seoti märgistamata MAb (0,2 µg/süvend, 2 µg/süvend) konkureerivalt optimaalse lahjendussuhtega HRP märgistati MAb ja inkubeeriti 1 tund 37 kraadi juures. Ensümaatiline reaktsioon ilmnes vesinikperoksiidiga substraadiga 3,3',5,5'-tetrametüülbensidiini (TMB) ja peatati 2 M väävelhappega kõigis süvendites. Neelduvus (OD450 nm) määrati Bio-Rad mikroplaadilugejaga (Bio-Rad Laboratories, Inc). MAb-de blokeerivad toimed arvutati järgmise võrrandi abil: 100×[1-OD450 nm(HRP-MAb pluss MAb)/OD450 nm HRP-MAb]. Kaks MAb-d tundsid ära erinevad epitoobid, kui blokeerivaid toimeid täheldati enam kui 40 protsendil.
Cistanche ekstrakt
5. EU-NPS konjugatsioon
Anti-NGAL monoklonaalsed antikehad 1G1 ja 2F4 konjugeeriti kovalentselt EU-NPS-iga Bangs Laboratories'i standardprotseduuriga. Lühidalt öeldes lisati 100 µL EUNPS-i 900 µL-le 0.05 M MES (pH 7.{{ 32}}) ja hajutati ultraheliga, vibreeriti 15 minutit toatemperatuuril {{40}},08 M N-hüdroksüsulfosuktsiinimiidi (NHS) ja 0,05 M 1-({{19) }}Dimetüülaminopropüül)-3-etüülkarbodiimiidvesinikkloriid (EDC). Aktiveeritud EUNPS pesti sidestuspuhvriga (0,05 mM H3BO3, 0,04 mM Na2B4O7, pH 7,5) ja pandi reageerima 0,3 mg antikehaga 2,5 tundi toatemperatuuril. Euroopiumiga konjugeeritud ühendit inkubeeriti 1000 µl blokeerivas puhvris (10 protsenti BSA, 20 protsenti Tween{39}}, 0,05 M Tris-HCl) 1 tund, lisati 1000 µL põhilahustele (10 protsenti BSA, 20 protsenti trehaloosi). protsenti tween-20, 0,05 M Tris-HCl) säilitamiseks 4 kraadi juures.
6. LFIA areng
LFIA ribad koosnesid nitrotselluloosmembraanist, konjugaatpadjast, proovipadjast ja absorbeerivast padjast. Klaaskiudmembraane leotati blokeerivas puhvris (20 protsenti trehaloosi, 10 protsenti BSA-d, 20 protsenti tween-20, 0,05 M Tris, 3,2 mM EDTA.Na2, pH 8,6) 1,5 tundi. 1 mg/ml MAb-de (2F4 või 1G1) kontsentratsioon kaeti nitrotselluloosmembraani testliinile (TL) ja samale NC-membraanile kaeti 1 mg/ml kitse hiirevastane IgG 4 mm kaugusel. moodustades kvaliteedikontrolli joone (CL), määrati jaoturi instrumendi pihustusmahuks 1 µL/cm. Membraani ja klaaskiudmatti kuivatati enne testimist 48 tundi 45 kraadi juures. Erinevad EU-NPS-1G1 ja EU-NPS-2F4 konjugaadiosakesed kaeti konjugaadipadjale ja fluorestsentssignaali mõõdeti immunofluorestsentsanalüsaatoriga (Guangzhou Labsim Biotech Co., Ltd).
7. Uriiniproovide võtmine ja patsiendid
Jilini meditsiiniülikooli sidushaiglast koguti kokku 83 inimese uriiniproovi AKI patsientidelt. Eksperimendis järgiti rangelt eetilisi juhiseid ja need esitas Jilini meditsiiniülikooli sidushaigla (nr.{1}}LW029). Kõik katsealused said uriiniproovide uurimiseks suulise ja kirjaliku teadliku nõusoleku hiina keeles. Kõik katsed viidi läbi Helsingi eetiliste põhimõtete deklaratsiooni alusel. 62-aastaste patsientide keskmine vanus oli 20–80 aastat, kes ei olnud COVID-iga nakatunud-19, ja AKI 1.–3. staadium klassifitseeriti Neeruhaiguse globaalseid tulemusi parandavate AKI kriteeriumide alusel[14]. Uriiniproovid koguti NGAL analüüsi jaoks kuni 12 tundi enne AKI diagnoosimist ja sagedaste intervallidega pärast operatsiooni erinevatel ajahetkedel (12, 24, 48 tundi). Võimalike segavate tegurite minimeerimiseks analüüsiti kliinilise keemia laboris kiiresti uriiniproove, sealhulgas uriini biokeemiat (valkude üldkontsentratsioon < 1 g/dl, uurea < 12 g/dl, glükoos < 1 g/dl, uriini kreatiniin < 1 g/dl , albumiin < 2,5 g/dl, pH 4.5-9.0) ja viidi läbi kahes eksemplaris. 30 minuti jooksul pärast proovide kogumist tsentrifuugiti neid 15 minutit kiirusel 3000 p / min 4 kraadi juures. Vähemalt 100 µl supernatanti jaotati steriilsetesse anumatesse ja säilitati edasiste analüüside jaoks -80 kraadi juures, et vältida korduvaid külmutamis-sulatamise tsükleid.
NGAL taseme mõõtmiseks kasutati ARCHITECT uriini NGAL reaktiivi komplekti (Lisnamuck, Longford, Co. Longford, Iirimaa), kasutades mittekonkureerivat sandwich-vormingut koos kemoluminestsentssignaali tuvastamisega. Kuseteede NGAL-i tuvastas seenevastane antikeha, mis oli kovalentselt seotud paramagnetiliste osakestega mikroosakeste reagendis, ja teise akridiiniumiga seotud NGAL-vastase antikeha konjugaat. Tootja juhiseid järgides viidi kalibreerimisanalüüs läbi vahemikus 0- 1500 ng/mL ja mõõdeti NGAL-i kontsentratsioon.
8. Kliiniliste proovide testimine ja analüüs
NGAL standardantigeeni seeriakontsentratsioonid (10, 50, 100, 200, 400, 800, 1500, 2000 ja 3000 ng/ml) valmistati biokonjugaadi spetsiifiliste reaktsioonide tugevdamiseks FBS-i abil, iga kontsentratsioon tehti kolm korda. Pärast kliiniliste proovide lisamist proovipadjadele registreeris lugeja fluorestsentsi intensiivsuse tulemused T-joonel (HT) ja C-joonel (HC). Kvantitatiivne tuvastamine viidi lõpule HT/HC suhtega, et tõhusalt kõrvaldada ribade (T ja C) erinevused ja matemaatilise proovi standardmaatriksi efektid[15]. Standardkõver joonistati iga NGAL-i ja HT/HC suhte kontsentratsiooni suhtes.
9. Statistiline analüüs
Passing-Babloki regressioonianalüüs ja BlandAltmani graafik viidi läbi MedCalc ja SPSS 17.{2}} tarkvara dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil. Kõik andmed esitati keskmiste väärtustena standardhälbega (keskmine ± SD).
Cistanche pillid
Viited
1. Zheng X, Zhao Y, Yang L: äge neerukahjustus COVID-i ajal-19: Hiina kogemus. Nefroloogia seminarid 2020, 40(5):430–442.
2. Mandelbaum T, Scott D, Lee J, Mark R, Malhotra A, Waikar S, Howell M, Talmor D: Ägeda neerukahjustusega kriitiliselt haigete patsientide tulemus, kasutades ägeda neerukahjustuse võrgustiku kriteeriume. Critical care medicine 2011, 39(12): 2659–2664.
3. Al-Hwiesh A, Mohammed A, Elnokeety M, Al-Hwiesh A, Al-Audah N, Esam S, Abdul-Rahman I: kolme COVID-i põhjustatud ägeda neerukahjustusega patsiendi edukas ravimine-19 peritoneaaldialüüsiga : Juhtumiaruanne ja kirjanduse ülevaade. Peritoneaaldialüüsi rahvusvaheline 2020, 40(5):496–498.
4. Shabaka A, Rovirosa-Bigot S, Guerrero Márquez C, Alonso Riaño M, Fernández-Juárez G: COVID{3}}seotud fokaalse segmentaalse glomeruloskleroosi sekundaarne äge neerukahjustus ja nefrootiline sündroom. Nefroloogia 2021.
5. Gabbard W, Milbrandt E, Kellum J: NGAL: esilekerkiv vahend AKI raskusastme ennustamiseks on kliinilise analüüsiga hõlpsasti tuvastatav. Critical Care 2010, 14(4): 318.
6. Zuk R, Ginsberg V, Houts T, Rabbie J, Merrick H, Ullman E, Fischer M, Sizto C, Stiso S, Litman D: Enzyme immunochromatography – kvantitatiivne immunoanalüüs, mis ei vaja instrumente. Clinical Chemistry 1985, 31(7): 1144–1150.
7. Juntunen E, Myyryläinen T, Salminen T, Soukka T, Pettersson K: Fluorestseeruvate euroopium(III) nanoosakeste ja kolloidse kullareporterite jõudlus külgvoolu bioafiinsuse testis. Analüütiline biokeemia 2012, 428(1):31–38.
8. Swanson C, D'Andrea A: Külgvoolu test lähi-infrapunavärviga multipleksi tuvastamiseks. Clinical Chemistry 2013, 59(4):641–648.
9. Chen Y, Fu Q, Xie J, Wang H, Tang Y: Kõrge tundlikkusega kvantpunktipõhise fluorestsentskustutava külgvoolu analüüsi väljatöötamine zearalenooni tuvastamiseks. Analüütiline bioanalüütiline keemia 2019, 411(10): 2169–2175.
10. Zhang F, Zou M, Chen Y, Li J, Wang Y, Qi X, Xue Q: Lantaniidiga märgistatud immunokromatograafilised ribad Pantoea stewartii subsp. Stewart. Biosensors bioelectronics 2014, 51:29–35.
11. Nankoberanyi S, Mbogo G, LeClair N, Conrad M, Tumwebaze P, Tukwasibwe S, Kamya M, Tappero J, Nsobya S, Rosenthal P: ligaasi tuvastamise reaktsiooni fluorestseeruva mikrosfääri testi valideerimine Plasmodium falphimormors'i resistentsuse kandjate tuvastamiseks Ugandas. Malaria Journal 2014, 13:95.
12. Xu H, Dong Y, Guo J, Jiang X, Liu J, Xu S, Wang H: Monoklonaalsete antikehade tootmine ja kaudse konkureeriva ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi väljatöötamine T-2 toksiini skriinimiseks piimas. Toxicon 2018, 156:1–6.
Moli Yin1, Yuanwang Nie2, Hao Liu2, Lei Liu1, Lu Tang1, Yuan Dong2, Chuanmin Hu1 ja Huiyan Wang1
1 Jilini Antikehatehnoloogia Koostöö Innovatsioonikeskus, Jilini Meditsiiniülikool, 132013 Jilin, PR Hiina.
2 Laboratooriumi akadeemia, Jilini meditsiiniülikool, 132013 Jilin, PR Hiina.
