Ⅰ osa: Cistanche Tubulosa fenüületanoidglükosiidid kutsuvad esile hepatotsellulaarsete kartsinoomirakkude apoptoosi mitokondritest sõltuvate ja MAPK radade kaudu ning suurendavad kasvajavastast toimet tsisplatiiniga kombineerides

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan, Changshuang Fu, Yi Yang, Aipire Adila, Fangfang Zhou, Xianxian Wei, Weilan Zhang, Jie Lv, Yijie Li, Lijie Xia, Jinyao Li

Abstraktne

Cistanche tubulosaon Hiina taimne ravim ja sellel on erinevad bioloogilised funktsioonid. Varasemad uuringud on seda näidanudCistanche tubulosa fenüületanoidglükosiidid (CTPG)avaldavad kasvajavastast toimet erinevatele kasvajarakkudele. CTPG kasvajavastane toime HepG2 ja BEL{1}} hepatotsellulaarse kartsinoomi (HCC) rakkudele on aga endiselt raskesti mõistetav. Meie uuring näitas, et CTPG inhibeeris oluliselt HepG2 ja BEL-7404 rakkude kasvu rakutsükli seiskumise ja apoptoosi indutseerimise kaudu, mida seostati MAPK radade aktiveerumisega, mida iseloomustab p38, JNK, ülesreguleeritud fosforüülimine. ja ERK1/2 ning mitokondriaalsest sõltuvast rajast, mida iseloomustab mitokondriaalse membraani potentsiaali vähenemine. Seejärel suurendas CTPG-ravi tsütokroom c vabanemist ning kaspaaside -3, -7, -9 ja PARP lõhustumist. Lisaks pärssis CTPG märkimisväärselt HepG2 migratsiooni, vähendades maatriksi metalloproteinaasi-2 ja veresoonte endoteeli kasvufaktorite taset. Huvitaval kombel ei suurendanud CTPG mitte ainult splenotsüütide proliferatsiooni, vaid vähendas ka tsisplatiini poolt indutseeritud splenotsüütide apoptoosi. H22 kasvaja hiiremudelis inhibeeris CTPG koos tsisplatiiniga veelgi H22 rakkude kasvu ja vähendas tsisplatiini kõrvaltoimeid. Kokkuvõttes inhibeeris CTPG HCC kasvu otsese kasvajavastase toime ja kaudse immuunsüsteemi tugevdava toime kaudu ning parandas tsisplatiini kasvajavastast efektiivsust.

Märksõnad

Cistanche tubulosafenüületanoidglükosiidid, apoptoos, MAPK rada, mitokondriaalsest sõltuv rada, tsisplatiin, immuunsüsteemi tugevdamine.

Sissejuhatus

Prognoositi, et maksavähk oli 2018. aastal maailmas kõige sagedamini diagnoositud vähk ja neljas peamine vähisurma põhjus, Kagu-Aasias (Mongoolias, Kambodžas ja Vietnamis) igal aastal ligikaudu 841 000 uut haigusjuhtu ja 782 000 surmajuhtumit. .1 Hiinas oli maksavähk 2015. aastal vähiga seotud surmajuhtumite kolmas põhjus.2 Üle 90 protsendi esmastest maksavähkidest on hepatotsellulaarne kartsinoom (HCC) kogu maailmas. Praegu on HCC ravi peamised meetodid hepatektoomia, maksa siirdamine ja perkutaanne ablatsioon. Kahjuks on need ravimeetodid tõhusad 30 protsendil varajase maksavähi diagnoosiga patsientidest, samas kui kaugelearenenud maksavähi diagnoosiga patsiendid (mis moodustab 40 protsenti) peavad oma elulemusaja pikendamiseks toetuma palliatiivsele ravile.3,4 Sorafeniib kombinatsioonis maksavähiga. arteriaalne kemoemboolia on Aasia ja Vaikse ookeani piirkonnas enamiku kaugelearenenud HCC-ga patsientide jaoks oluline ja levinud palliatiivne ravi.5 Sorafeniib, mille FDA kiitis heaks 2006. aastal kaugelearenenud maksavähi raviks, on hulgi kinaasi inhibiitor, mis pärsib kasvajarakkude proliferatsiooni ja veresoonte teket. tootmist ja soodustab kasvajarakkude apoptoosi. Sorafeniib pikendab oluliselt patsiendi ellujäämisaega 3–5 kuu võrra, kuid sellel on tõsised kõrvaltoimed ja see on tihedalt seotud ravimiresistentsuse tekkega.6 Seetõttu on kiireloomuline HCC jaoks uute ravimite või strateegiate väljatöötamine.

Traditsioonilist hiina meditsiini (TCM) üksi või koos teiste strateegiatega on kasutatud HCC raviks ja see on näidanud kliinilist kasu, sealhulgas elulemuse pikenemine, elukvaliteedi paranemine, kõrvaltoimete vähenemine ja nii edasi.7,8Cistancheon TCM, mis sisaldab fenüületanoidglükosiide (PhG), iridoide, ligniini ja polüsahhariide, millel on erinevad bioloogilised funktsioonid, nagu oksüdatsiooni-, põletiku-, vananemis-, mälu- ja immuunsüsteemi tugevdamise funktsioonid.9 PhG-d on peetud peamised aktiivsed komponendidCistancheja neil on mitu funktsiooni, sealhulgas oksüdatsioonivastane, põletikuvastane, apoptoosivastane, hepato- ja neuroprotektsioon.10-12 Meie rühm teatas, etCistanche tubulosa fenüületanoidglükosiidid(CTPG) võivad in vitro või in vivo väliste või sisemiste signaaliradade kaudu pärssida melanoomi B16-F10 rakkude, söögitoru kartsinoomi Eca-109 rakkude ja HCC H22 rakkude kasvu; lisaks oli CTPG-l immunostimuleeriv toime.13-15

Selles uuringus uurisime CTPG kasvajavastast toimet ja mehhanismi HepG2 ja BEL{1}} rakkudele in vitro, analüüsisime CTPG immunomoduleerivat funktsiooni in vitro ja in vivo ning täiendavalt hindasime CTPG terapeutilist toimet kombineerituna keemiaraviga. ravimi tsisplatiin HCC H22 kasvaja hiirtel in vivo. Leidsime, et CTPG võib pärssida HepG2 ja BEL-7404 rakkude kasvu mitokondritest sõltuva apoptoosi ja MAPK signaaliraja kaudu. CTPG inhibeeris märkimisväärselt HepG2 rakkude migratsiooni, vähendades maatriksi metalloproteinaasi-2 (MMP-2) ​​ja vaskulaarse endoteeli kasvufaktori (VEGF) taset. Lisaks soodustas CTPG immuunrakkude proliferatsiooni ja aktiveerumist ning suurendas hiirte immuunsust. Oluline on see, et CTPG kombineerituna tsisplatiiniga võib veelgi inhibeerida H22 rakkude kasvu in vivo ja vähendada tsisplatiini kõrvaltoimeid.

Materjalid ja meetodid

Loomad

Umbes 6–8 nädala vanused isased BALB/c, Kunmingi hiired ja emased C57BL/6 hiired osteti Xinjiangi Meditsiiniülikooli Loomalabori keskusest (Urumqi, Xinjiang, Hiina) ja paigutati Xinjiangi ülikooli loomarajatisse toatemperatuuriga. (RT) 25±3 kraadi ja 12/12 tundi hele-pimeduse perioodi.

Rakuliinid ja rakukultuur

Hiire H22 rakud osteti ettevõttelt Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Hiina) ning inimese HCC HepG2 ja BEL{2}} rakud saadi Xinjiangi bioloogiliste ressursside ja geenitehnoloogia võtmelaborist. , Xinjiangi ülikool (Urumqi, Xinjiang, Hiina) ja kultiveeritud RPMI 1640 söötmes (Gibco, USA) või Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM) (Gibco), mis sisaldab 10 protsenti kuumusega inaktiveeritud veise loote seerumit (MRC, Hiina), 1 protsenti L. - glutamiin (100 mM), 100 U/ml penitsilliini ja 100 ug/ml streptomütsiini temperatuuril 37 kraadi niisutatud atmosfääris 5% CO2-ga.

Suure jõudlusega vedelikkromatograafia (HPLC)

Peamised CTPG ühendid (Upbio Tech Co., Ltd., Shanghai, Hiina) kvalifitseeriti ja kvantifitseeriti HPLC abil, nagu eelnevalt kirjeldatud.13 Kasutati ZORBAX SB-C18 kolonni (250 × 4,6 mm; 5 μm). ja liikuv faas koosnes 0,2% sipelghappe lahusest ja metanoolist gradiendiga 23% kuni 31%. Kokku süstiti 10 μL proovi ja see tuvastati lainepikkusel 330 nm. CTPG komponentide analüüsimiseks kasutati ehhinakosiidi ja akteosiidi standardeid (Yuanye, Shanghai, Hiina).

Rakkude elujõulisuse analüüs

CTPG kasvajavastast toimet HepG2 ja BEL{1}} rakkudele hinnati MTT abil (3-(4, 5-dimetüül-2-tiasolüül)-2, {{7 }}difenüül-2-H-tetrasooliumbromiid). HepG2 ja BEL-7404 rakud plaaditi 96-süvendiplaatidele (5 × 104 rakku süvendi kohta) ja töödeldi 0, 200, 400 ja 600 ug/mL CTPG-d vastavalt 24 ja 48 tunni jooksul pärast 24-tunnist inkubeerimist 37 kraadi juures. Positiivse kontrollina kasutati umbes 35 ug/ml tsisplatiini (Yuanye). Seejärel lisati igasse süvendisse 100 µl MTT (0,5 mg/ml, lahjendatud söötmega ilma FBS söötmeta) ja kultiveeriti 3 tundi 37 kraadi juures ja 5% CO2 juures. Pärast inkubeerimist tsentrifuugiti plaate kiirusel 1200 p/min 7 minutit, sööde eemaldati ja igasse süvendisse lisati 200 ug/ml DMSO-d, et lahustada moodustunud formatsaani kristallid. OD490 väärtused mõõdeti 96-kaevu mikroplaadi lugejaga (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). CTPG mõju hindamiseks splenotsüütidele eraldati rakud C57BL/6 hiirtelt ja plaaditi 96-süvendiga plaatidele tihedusega 1 × 105 rakku süvendi kohta. Splenotsüüte töödeldi 0, 200, 400 ja 600 ug/ml vastavalt 24, 48 ja 72 tundi. Rakkude elujõulisus arvutati järgmise valemiga: Rakkude elujõulisus (protsent)=(OD-töödeldud/OD-ravimata) × 100 protsenti.

Ki tuvastamine-67

Ki{{0}} tuvastati vastavalt meie eelmisele uuringule.16 Lühidalt, BEL-7404 rakke töödeldi erinevate kontsentratsioonidega (0, 200, 400 ja 600 ug/ml) CTPG-ga. või tsisplatiin (35 ug/ml). 24 tunni pärast rakud koguti ja pesti PBS-ga, seejärel fikseeriti ja permeabiliseeriti Foxp3 värvimispuhvri komplektiga (eBioscience, USA) vastavalt tootja juhistele. Intratsellulaarne värvimine viidi läbi, kasutades FITC konjugeeritud Ki{10}} antikeha (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 15 minuti jooksul toatemperatuuril. Proove analüüsiti voolutsütomeetria abil (BD FACSCalibur, CA, USA).

Rakkude apoptoosi ja rakutsükli analüüs

HepG2 ja BEL-7404 rakud külvati tihedusega 2,5 × 105 rakku tassi kohta ja inkubeeriti 37 kraadi juures üleöö. Rakud trüpsiiniti ja koguti tsentrifuugimise teel pärast töötlemist erineva kontsentratsiooniga CTPG-ga või eeltöödeldud kaspaasi inhibiitoriga (Z-VAD-FMK) või kaspaasi -3 inhibiitoriga (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, Hiina) 2 tundi enne CTPG-ravi. 24 tunni pärast tuvastati voolutsütomeetria abil apoptoos. Lühidalt öeldes pesti kogutud rakke külma PBS-ga (Gibco) ja resuspendeeriti anneksiini siduvas puhvris koos 2,5 µl anneksiin V-FITC ja 5 µl PI-PE värvimislahusega (Solarbio, Peking, Hiina) ning seejärel inkubeeriti rakke toatemperatuuril. pimedas 15 minutit. Rakutsükli jaotuse analüüsimiseks koguti rakud pärast CTPG-ga töötlemist ja fikseeriti külmas 70% etanoolis 4 kraadi juures 30 minutit. Rakke värviti PI-ga (BD Biosciences) pimedas 30 minutit. Proove analüüsiti voolutsütoomimeetriga (BD FACSCalibur). Raku apoptoosi ja tsükliga seotud valkude ekspressioonitasemed tuvastati Western blot abil.

Western Blot

Western blot viidi läbi vastavalt meie eelmisele uuringule.17 HCC-d töödeldi CTPG-ga 24 tundi. Pärast kahekordset jääkülma PBS-ga pesemist koguti kõik kleepunud ja ujuvad rakud ning lüüsiti RIPA lüüsipuhvris (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) 2 0 minutit jääl. Pärast tsentrifuugimist kiirusel 12000 p/min 4 kraadi 10 minutit, määrati valgu kontsentratsioon, kasutades Bicinchoninic Acid Assay komplekti (Thermo Fisher Scientific, USA) vastavalt tootja juhistele. Sama kontsentratsioon valke eraldati 12% SDS-PAGE-ga ja kanti üle PVDF membraanidele. Pärast pesemist PBST puhvriga (PBS koos 0,05% Tween{11}}) blokeeriti membraanid 5% rasvavaba piimaga temperatuuril 37 kraadi 1 tund ja inkubeeriti seejärel primaarsete antikehadega (Cell Signaling Technology, MA, USA ) õigete lahjendustega üleöö temperatuuril 4 kraadi . Pärast 3-kordset pesemist PBST-ga inkubeeriti membraani vastavate HRP-ga konjugeeritud sekundaarsete antikehadega (eBioscience) 2 tundi 37 kraadi juures. Sihtvalgud tuvastati ECL-analüüsi komplekti (Beyotime) abil. Halltoonides skaneerimise andmed saadi Image J abil.

Mitokondriaalse membraani potentsiaali (Δψm) analüüs

Δψm määrati membraani läbilaskva JC-1 värviga (Beyotime). Lühidalt, HepG2 ja BEL{3}} rakke töödeldi 24 tunni jooksul erineva kontsentratsiooniga CTPG-ga (0, 200, 400 ja 600 ug/ml). Kõik rakud koguti ja pesti JC-1 pesupuhvriga. Rakke värviti JC-1 fluorestsentssondiga vastavalt tootja juhistele 20 minutit toatemperatuuril. Pärast kahekordset pesemist PBS-iga analüüsiti kõiki proove voolutsütomeetria abil (BD FACSCalibur).

Hoechst 33342 värvimine

Hoechst 33342 värvimine viidi läbi vastavalt meie eelmisele uuringule.16 Tuumade morfoloogilisi muutusi uuriti membraani läbilaskva DNA-d siduva värvainega Hoechst 33342 (Beyotime). Lühidalt öeldes inokuleeriti rakud 6-süvendiga plaadile kontsentratsiooniga 1 × 105 rakku süvendi kohta 2 ml söötmes. 70–80 protsendilise konfluentsuse saavutamisel töödeldi rakke 24 tunni jooksul 200, 400 ja 600 ug/ml CTPG või tsisplatiiniga. Rakke pesti PBS-ga ja fikseeriti 4% jääkülma paraformaldehüüdiga 4 kraadi juures 10 minutit. Pärast PBS-ga pesemist värviti rakke Hoechst 33342-ga 4 kraadi juures 10 minutit. Proove vaadeldi fluorestsents-pöördmikroskoobiga (Nikon Eclipse Ti-E, Jaapan).

Migratsioonianalüüs

HCC rakkude migratsioon tuvastati haava paranemise testi kaudu. Lühidalt, HepG2 rakud (2 × 104 süvendi kohta) külvati 24-süvendiga plaadile. Pärast 80 protsendi liitumist kriimustati iga süvendi keskosa üks kord 20 µl pipetiotsaga. Pärast PBS-ga pesemist töödeldi rakke tsisplatiiniga (35 ug/ml) või erinevate kontsentratsioonidega (0, 200, 400 ja 600 ug/ml) CTPG-ga 37 kraadi juures. 24 tunni pärast tehti igast proovist mikroskoobi all pildid (Nikon Eclipse Ti-E). Rakkude migratsiooni keskmisi kaugusi analüüsiti pildi J abil. Haavade paranemise protsent arvutati võrrandi abil: haava paranemine ( protsenti )=(1-kriimustusala näidatud ajapunktis/kriimustusala 0 tunni juures) × 100 protsenti . Rakkumigratsiooniga seotud valkude MMP-2 ja VEGF ekspressioonitasemed tuvastati Western blot meetodil.

Splenotsüütide proliferatsioon ja apoptoos

Proliferatsioonianalüüsiks eraldati splenotsüüdid 3 C57BL/6 hiirelt ja värviti CFSE-ga (eBioscience). CFSE-märgistatud rakud inokuleeriti 24-süvendiplaatidele tihedusega 2 × 106 rakku 1 ml söötmes süvendi kohta ja töödeldi erinevate kontsentratsioonidega CTPG-ga (200, 400 ja 600 ug/ml) või kombineeriti 35 ug-ga. /mL tsisplatiini 72 tunni jooksul. Voolutsütomeetria analüüs viidi läbi pärast värvimist CD3-APC ja CD19-PE-ga (BD Biosciences). Apoptoosi analüüsiks inokuleeriti splenotsüüdid 24-süvendiplaatidele tihedusega 2 × 106 rakku 1 ml söötmes süvendi kohta ja töödeldi erineva kontsentratsiooniga CTPG-ga (200, 400 ja 600 ug/ml) või kombineeriti tsisplatiini 24 tunni jooksul. Voolutsütomeetria analüüs viidi läbi pärast värvimist 2,5 μL anneksiin V-FITC ja 5 μL PI-PE lahusega.

CTPG ohutuse hindamine ja immunostimuleerivad tegevused in vivo

CTPG in vivo immunostimuleeriva toime hindamiseks jaotati 6 kuni 8 nädala vanused Kunmingi isased hiired juhuslikult 7 rühma (5 hiirt rühma kohta). Subkutaanset süstimist (sc, 200, 400 mg/kg), intraperitoneaalset süstimist (ip, 200, 400 mg/kg) ja intragastraalset (ig, 200, 400 mg/kg) manustati iga 2 päeva järel kokku 7 korda. , samas kui kontrollrühm ei saanud mingit ravi. Hiired on kaalunud ülepäeviti ja hiirte seisundit jälgiti iga päev. Pärast CTPG-ga töötlemist eraldati hiirte elundid ja kaaluti. Elundite indeksid arvutati järgmise valemi järgi: elundi indeks=elundi mass (mg)/kehakaal (g). Splenotsüüdid koguti, loendati ja värviti anti-CD3-APC, anti-CD19-PE, anti-CD49b FITC või anti-CD4-APC, anti-CD{{ 22}}PE, anti-CD8-FITC (BD Biosciences). Proovid tuvastati voolutsütomeetria abil (BD FACSCalibur).

Tsisplatiiniga kombineeritud CTPG kasvajavastane efektiivsus H22 kasvajaga hiirtel

Umbes 6–8 nädala vanustele isastele BALB/c hiirtele süstiti subkutaanselt H22 rakke (1.0 × 106 hiire kohta 100 µl PBS-is). Kui kasvaja maht jõudis ligikaudu 60 mm3-ni, jagati kasvajaga hiired juhuslikult 4 rühma (6 hiirt rühma kohta) ja neid raviti tsisplatiiniga (4 mg/kg), CTPG-ga (400 mg/kg), tsisplatiiniga (4 mg/kg) ja CTPG-ga ( 400 mg/kg) või ilma ravita (kontrollrühm). Kasvajahiirtele süstiti intraperitoneaalselt CTPG-d vastavalt 5., 7., 9., 11. ja 13. päeval. Tsisplatiini süstiti intravenoosselt 7. ja 11. päeval. Kasvaja mahtu ja kehakaalu mõõdeti igal teisel päeval. Kasvaja maht arvutati järgmiselt: Kasvaja maht (V)=a × b2 /2, milles a ja b tähistavad vastavalt kasvaja pikimat ja lühimat läbimõõtu, mõõdetuna nooniuse nihikuga. 20. päeval isoleeriti ja kaaluti elundid ja kasvajad. Splenotsüüdid koguti, loendati ja värviti anti-CD3-APC ja anti-CD19-PE või anti-CD4-FITC ja anti-CD8-APC või anti-CD11b-PE ja anti-Gr-1-APC või anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC ja anti-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Seejärel analüüsiti rakkude sagedusi ja arvu voolutsütomeetria abil (BD FACSCalibur).

Statistiline analüüs

Kõik andmed väljendati kui keskmine ± keskmise standardviga (SEM). Statistiline analüüs viidi läbi ühe-/kahesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, kasutades tarkvara Prism5.{2}}. P<.05 was="" considered="" statistically="">

Tulemused

CTPG inhibeeris HCC rakkude proliferatsiooni in vitro

CTPG komponendid kvalifitseeriti ja kvantifitseeriti HPLC abil, kasutades ehhinakosiidi ja akteosiidi standardeid (täiendav joonis 1A), mis olid Cistanche'i fenüületanoidglükosiidide peamised komponendid. 18 Vastavalt piigi retentsiooniaegadele ja piikide pindaladele sisaldas CTPG 28 protsenti ehhinakosiidi ja 9,9 protsenti akteosiidi. Pealegi oli polüsahhariidide sisaldus CTPG-s fenool-väävelhappe meetodil 34,8 protsenti.19 MTT test näitas, et CTPG vähendas oluliselt BEL-7404 ja HepG2 rakkude elujõulisust annusest ja ajast sõltuval viisil ( Joonis 1A). Järjekindlalt pärssis CTPG-ravi märkimisväärselt BEL-7404-rakkude proliferatsiooni, mida analüüsiti Ki-67-värvimisega (joonis 1B). CTPG mõju splenotsüütide proliferatsioonile in vitro analüüsiti ka MTT testiga. Me täheldasime, et CTPG suurendas splenotsüütide proliferatsiooni annusest sõltuval viisil (joonis 1C).

Mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) signaalirada mängib keskset rolli inimese vähirakkude ellujäämises, diferentseerumises ja ravimiresistentsuses.20 Selleks et uurida, kas MAPK signaalirada oli seotud CTPG pärssiva toimega proliferatsioonile. HCC rakkudest analüüsiti MAPK signaaliraja erinevate valkude fosforüülimise tasemeid HepG2 rakkudes pärast töötlemist CTPG-ga erinevatel kontsentratsioonidel ja erinevatel ajahetkedel. JNK (P-JNK) ja p38 (P-p38) fosforüülimist suurendas CTPG-ravi annusest sõltuvalt. ERK (P-ERK) fosforüülimist reguleeriti alla 200 ja 400 ug/ml CTPG-raviga, samas kui P-ERK-d reguleeriti üles 600 ug/ml CTPG-ravi korral (joonis 1D). Lisaks reguleeriti P-JNK, P-p38 ja P-ERK tasemeid ajast sõltuval viisil (joonis 1D). Need tulemused näitasid, et CTPG võib pärssida HCC rakkude proliferatsiooni MAPK signaaliraja kaudu

CTPG indutseeritud HCC rakutsükli peatamine S-faasis

Lisaks analüüsisime, kas CTPG inhibeeris HCC rakkude proliferatsiooni rakutsükli peatamise indutseerimise kaudu. Pärast CTPG-ga töötlemist täheldati annusest sõltuval viisil BEL{0}} rakkude kuhjumist S-faasis. Samamoodi kutsus CTPG esile ka HepG2 rakutsükli seiskumise S-faasis ja sagedused kasvasid 40,66 protsendilt kontrollrühmas 61,90 protsendini 600 ug/ml CTPG-ga ravitud rühmas (joonis 2A). Tsükliinid ja tsükliin-sõltuvad kinaasid (CDK-d) mängivad olulist rolli rakkude jagunemise kontrollis ja arengus,21 millest olid seotud G2/M faasiga.22 Cyclin D1 ekspressioonitase langes CTPG-raviga annusest sõltuvalt, kuid soodustas G1-d. S-faasi progresseerumine. Samuti vähenesid Cyclin B1, CDK1 ja CDK2 ekspressioonitasemed; need valgud olid seotud G2/M faasiga (joonis 2B). Need tulemused näitasid, et CTPG pärssis HCC rakkude proliferatsiooni, kutsudes esile rakutsükli peatamise.

CTPG aktiveeritud mitokondritest sõltuv apoptoosi rada HCC rakkudes

Samuti tuvastasime, kas CTPG vallandas HCC rakkudes apoptoosi, ja leidsime, et CTPG indutseeris annusest sõltuval viisil apoptoosi HepG2 ja BEL-7404 rakkudes (joonis 3A). Lisaks suurendasid ja vähendasid CTPG-ravi Baxi ja Bcl -2 ekspressioonitasemeid vastavalt annusest sõltuval viisil (joonis 3B). HepG2 rakkude apoptoosi määrati lisaks Hoechst 33342 värvimisega pärast 24-tunnist töötlemist CTPG-ga. Tuuma morfoloogiat jälgiti ümberpööratud fluorestsentsmikroskoobiga. Nagu on näidatud joonisel 3C, värviti kontroll-HepG2 rakud homogeenselt, samal ajal kui CTPG-ga töödeldud HepG2 rakud näitasid kromatiini kondenseerumist ja fragmenteerumist annusest sõltuval viisil, mis oli sarnane tsisplatiiniga töödeldud HepG2 rakkudega. Need tulemused näitasid, et CTPG indutseeris HCC rakkude apoptoosi.

Välise mitokondriaalse membraani terviklikkust reguleerib rangelt perekond Bcl-2 ja Δψm vähendamine soodustab tsütokroom c vabanemist, mis aktiveerib kaspaasi kaskaadi, et kutsuda esile apoptoos.23,24 Kui Δψm väheneb, siis JC{{ 3}} polümeer (punane fluorestsents) laguneb monomeerideks (roheline fluorestsents).25 Seetõttu tuvastati HCC rakkude Δψm pärast 24-tunnist CTPG-ga töötlemist JC-1 värvimisega. Nagu on näidatud joonisel 4A, suurendas FL-1 kanali rohelise fluorestsentsi intensiivsust annusest sõltuvalt CTPG-ravi, samas kui FL-2 kanali punase fluorestsentsi intensiivsus vähenes annusest sõltuvalt mõlemas BEL-7404 ja HepG2 rakud. Pööratud fluorestsentsmikroskoobi vaatlus näitas sarnast tulemust (joonis 4B), mis näitab, et CTPG vähendab HCC rakkude Δψm. Seejärel täheldasime, et tsütokroom c tase tõusis nii BEL-7404 kui ka HepG2 rakkudes pärast CTPG-ravi (joonis 4C), mis kinnitas veelgi Δψm vähenemist CTPG-ga töödeldud HCC rakkudes.

Tsütokroom c vabanemine võib aktiveerida initsiaatorkaspaasi-9, et kutsuda esile apoptoos.26 Western blot analüüsi tulemused näitasid, et lõhustatud kaspaaside -3, -7 ja{{4} } suurenesid, samas kui lõhustatud kaspaasi -8 tase ei muutunud (joonis 5). Aktiveeritud kaspaas -3 võib lõhustada polü(ADP-riboosi) polümeraasi (PARP) DNA parandamise ensüümi, et vältida DNA paranemist ja akumuleerida DNA kahjustusi.27 Samuti täheldasime lõhustatud PARP ülesreguleeritud taset. Kaspaasi kaskaadi rolli CTPG poolt indutseeritud HCC raku apoptoosis määrati täiendavalt, kasutades vastavalt kaspaasi inhibiitorit (Z-VAD-FMK) ja kaspaasi -3 inhibiitorit (Ac-DEVD-CHO). Z-VAD-FMK muutis oluliselt CTPG-ga indutseeritud BEL-7404 ja HepG2 rakkude apoptoosi (täiendav joonis 1B). Samamoodi muutis Ac-DEVD-CHO oluliselt ka CTPG-ga indutseeritud HepG2 rakkude apoptoosi (täiendav joonis 1C). Tulemused näitasid, et CTPG indutseeris HCC rakkude apoptoosi mitokondriaalsest sõltuvast rajast.

CTPG pärssis HCC rakkude migratsiooni in vitro

Vähirakkude migratsiooni peetakse kasvaja metastaaside üheks kriitiliseks protsessiks. Et teha kindlaks, kas CTPG mõjutab HCC rakkude migratsiooni, hinnati HepG2 rakkude liikuvust haavade paranemise testiga. Nagu on näidatud joonistel fig 6A ja B, inhibeeris CTPG-ravi annusest sõltuval viisil märkimisväärselt HepG2 rakkude migratsiooni. MMP perekond ja VEGF mängivad olulist rolli kasvajarakkude migratsioonis.28 Pärast 24-tunnist CTPG-ravi langesid MMP-2 ja VEGF-i tasemed oluliselt (joonis 6C), mis viitab sellele, et CTPG võib pärssida invasiooni ja metastaase. HCC-st.

CTPG suurendas hiirte immuunsust

On teatatud, et Cistanche deserticola polüsahhariididel on immunomoduleerivad funktsioonid, sealhulgas lümfotsüütide proliferatsiooni soodustamine ja makrofaagide aktiveerimine.29 T-rakud ja B-rakud on peamised lümfotsüüdid, mis vahendavad vastavalt rakulist ja humoraalset immuunvastust. CTPG sisaldas 34,8 protsenti polüsahhariidide sisaldust. Seetõttu uurisime CTPG mõju T-rakkude ja B-rakkude proliferatsioonile. Nagu on näidatud lisajoonisel 2A, suurendas CTPG annusest sõltuval viisil oluliselt T-rakkude ja B-rakkude proliferatsiooni isegi tsisplatiini juuresolekul. Huvitaval kombel inhibeeris CTPG märkimisväärselt tsisplatiini poolt indutseeritud splenotsüütide apoptoosi (täiendav joonis 2B), mis näitab, et CTPG võib leevendada tsisplatiini kõrvaltoimeid hiirte immuunsüsteemile.

Jätka lugemist Ⅱ osani...