1. osa: Verbaskosiid kaitseb pankrease rakke ER-stressi eest

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Alessandra Galli 1, pluss , Paola Marciani 1, pluss , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3, Michela Castagna 1 ja Carla Perego 1,*

Abstraktne:

Olulised epidemioloogilised tõendid näitavad, et polüfenoolide rikas toit kaitseb II tüüpi diabeedi tekke eest. Fenüületanoidglükosiidverbaskosiid/akteosiid, laialt levinud polüfenoolne taimne ühend, millel on mitmeid bioloogilisi omadusi, sealhulgas tugev antioksüdant, põletikuvastane ja neuroprotektiivne toime. Selle uuringu eesmärk oli testida võimalikke mõjusidverbascosidepankrease rakkudel, sihtmärk, mida pole kunagi varem testitud. Hiire ja inimese rakke inkubeeritiverbascoside(0,8–16 uM) kuni viis päeva ning rakkude ellujäämise ja funktsiooni hindamiseks normaalsetes või endoplasmaatilise retikulumi (ER) stressi indutseerivates tingimustes kasutati biokeemiliste ja kuvamistehnikate kombinatsiooni. Leidsime annusest sõltuva kaitsva toimeverbascosideoksüdatiivse stressi vastu kloon- ja inimese rakkudes. Mehhaanilised uuringud näitasid, et polüfenool kaitseb rakke ER-stressi vahendatud düsfunktsioonide eest, moduleerides proteiinkinaasi RNA-sarnase endoplasmaatilise retikulumkinaasi (PERK) haru aktiveerimist voldimata valguvastuses ja soodustades mitokondriaalset dünaamikat. Selle tulemusena tuvastati nendes rakkudes suurenenud elujõulisus, mitokondriaalne funktsioon ja insuliinisisaldus. Need uuringud näitavad, etverbascosidesuurendab rakkude võimet tulla toime ER-stressiga, mis on oluline rakkude düsfunktsiooni ja ebaõnnestumise põhjustaja diabeetiliste seisundite korral ning toetab verbaskosiidi terapeutilist potentsiaali diabeedi korral.

Märksõnad:

verbaskosiid; polüfenoolid; insuliini tootvad rakud; diabeet; UPR; oksüdatiivne stress; ER-stress; PERK; põletikuvastane; mitokondrid

1. Sissejuhatus

Diabeet on krooniline haigus, mis mõjutab sadu miljoneid inimesi [1]. 1. tüüpi (T1D) ja 2. tüüpi diabeeti (T2D) iseloomustavad erinevad etioloogiad, millel on insuliinipuudus [2]. Insuliin reguleerib plasma glükoosikontsentratsiooni, stimuleerides glükoosi omastamist lihas- ja rasvarakkudes ning moduleerides maksa glükoosi metabolismi. Toitainete kättesaadavus, hormoonid ja närvisisendid reguleerivad pankrease insuliini sekretsiooni ja hoiavad veresuhkru kontsentratsiooni füsioloogilises vahemikus [3–5]. Seetõttu põhjustab rakkude düsfunktsioon diabeedi, mida iseloomustab tühja kõhuga hüperglükeemia.

T2D on progresseeruv seisund, mille puhul insuliiniresistentsus ja -rakkude talitlushäired on omavahel seotud ning hiljutised tõendid suurendasid huvi -rakkude kriitilise esmase rolli vastu hüperglükeemilises seisundis [6,7]. Mittediabeetilistel rasvunud isikutel kompenseerivad rakud insuliiniresistentsust hormooni suurenenud sekretsiooniga. Kuid mõnel patsiendil langeb nende seisundi halvenedes insuliini tase ja glükoosi tase tõuseb hüperglükeemiani [8, 9].

Glükoos on raku funktsioonide kõige olulisem modulaator. Glükoosi stimulatsioon mõjutab geenide reguleerimist ja valkude ekspressiooni, mis on seotud paljude rakufunktsioonidega, nagu glükolüüs, insuliini süntees ja sekretsioon [10]. Glükoosi poolt indutseeritud insuliini sekretsioon tugineb oksüdatiivsele metabolismile, et toota adenosiintrifosfaati (ATP) ja füsioloogiliselt toodetakse vähe reaktiivseid hapniku liike (ROS). Kuid -rakud ei ole väga hästi varustatud püüdurensüümidega ja see nõrkus muudab nad oksüdatiivse stressi suhtes väga vastuvõtlikuks [11, 12]. Oksüdatiivse stressi tõustes väheneb rakkude insuliini tootmine ja rakud toodavad tsütokiine, mis sütitavad rakukahjustusi põletiku ja apoptoosi kaudu [13]. Huvitav on see, et kuigi vähenenud rakkude massi on varem seostatud rakusurmaga, näitavad hiljutised uuringud rakkude dediferentseerumise suurt rolli [14, 15]. Selgeks on saanud, et T2D-le sõidab mitu etappi. Metaboolsed ja oksüdatiivsed solvamised põhjustavad endoplasmaatilise retikulumi (ER) stressi, mis põhjustab insuliini sünteesi ja sekretsiooni vähenemist, tsütokiinide vabanemisele järgnevad põletikulised protsessid ning rakkude kadu võib toimuda apoptoosi ja dediferentseerumise kaudu. Need teadmised on asjakohaste ravistrateegiate väljatöötamiseks ülimalt olulised, kuna oksüdatiivset stressi ja põletikku saab võidelda ning pankreaserakkude plastilisus võimaldab tüvirakke taastada -rakkudeks, nagu on tõestatud hiirtel [16].

Hiljuti on -rakkude haavatavus oksüdatiivse stressi suhtes edukalt ajendanud kasutama toidust saadavaid antioksüdante diabeedi ennetamiseks [17]. Kõige huvitavamate antioksüdantsete toiduainete hulgas on oliiviõli oma kasulike omaduste poolest tuntud juba iidsetest kreeklastest. Oliiviõli sisaldab suures koguses monoküllastumata rasvhappeid (MUFA) ja mitmeid polüfenoole, nagu türosool, hüdroksütürosool, oleuropeiin ja verbaskosiid.

Verbascoside, tuntud ka kui akteosiid, on fenüületanoidglükosiid, mis on ekstraheeritud Olea europeast, Verbascum liigi taimedest ja 23 muust taimeperekonnast [18–20]. Seda võib saada ka oliiviõli kõrvalsaadustest (see on rikastatud oliiviviljade töötlemisel saadud oliiviveski reovees) või toota ainevahetuse ja sünteetilise bioloogia meetodite abil [21].

Verbaskosiidi biosaadavuse kohta inimestel ei ole veel andmeid. Hiirte, SKBR3 ja Caco{1}} rakkudega tehtud uuringud viitavad sellele, et metaboliseerumata verbaskosiidil võib olla võimalik läbida soolebarjääri, ringleda vereplasmas ja avaldada antioksüdantset toimet [20, 22, 23]. Erinevalt enamikust taimsetest polüfenoolidest toimib verbaskosiid rakkudele peamiselt mitmesuguste ensüümide ja regulatoorsete tegurite geenitranskriptsiooni moduleerimise kaudu, millel on antioksüdantne ja põletikuvastane toime [24–30].

Kuigi on teada palju verbaskosiidi kasulikke toimeid inimeste tervisele, puuduvad andmed selle mõju kohta pankrease rakkudele. Kuna oksüdatiivne stress ja põletik on T2D patogeneesi aluseks, uurisime, kas verbaskosiidiga ravi võib parandada rakkude elujõulisust ja

funktsiooni ER-stressi indutseerivates tingimustes ja iseloomustasime selle toime molekulaarseid mehhanisme. Meie andmed näitavad, et verbaskosiid takistab rakkude oksüdatiivset stressi ja põletikku, moduleerides lahtivolditud valguvastuse aktiveerimist ja soodustades mitokondriaalset dünaamikat, mille tulemuseks on rakkude elujõulisuse ja insuliinisisalduse suurenemine.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Rakukultuur ja materjalid

Hiire tc3 rakke (prof. Hanahan – Biokeemia ja biofüüsika osakond, California ülikool, San Francisco, CA [31]) kultiveeriti RPMI 1640 söötmes (Euroclone SpA, ECB90 0, Pero MI, Itaalia), millele on lisatud 10% (maht/maht) kuumusega inaktiveeritud vasikaloote seerumit (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Itaalia), 1% (maht/maht) penitsilliini-streptomütsiini (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Itaalia) ja 1% (maht/maht) L-glutamiini (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Itaalia). Inimese Langerhansi saarekesed isoleeriti Milanos (Niguarda Ca' Granda) surnukehadelt mitme elundi doonoritelt vastavalt protseduurile, mida on kirjeldanud Ricordi et al. [32]; neid kultiveeriti RPMI söötmes, mis sisaldas 5,5 mmol/l glükoosi, 10 protsenti kuumaga inaktiveeritud veise loote seerumit, 0,7 mM glutamiini, 50 ühikut/ml penitsilliini ja 50 ug/ml streptomütsiini (EuroClone, SpA, Pero MI, Itaalia). Kasutati nelja erineva saarekese preparaati, saarekeste puhtus oli 80 ± 10 protsenti. Saarte isoleerimise ja saarekeste uuringud kiitis heaks Milanos asuva Niguarda Ca' Granda haigla eetikakomitee (11.12.2009). tc3 rakke töödeldi 0,8, 1,6 ja 16 uM verbaskosiidiga (Carbosynth, OV08034, Compton, UK), kofeiinhappe ja hüdroksütürosooliga (lahke kingitus prof. Dell'Aglilt, Universita degli Studi di Milano farmakoloogiliste ja biomolekulaarteaduste osakond Milano, Itaalia) täielikus RPMI söötmes 5 päeva, samal ajal kui inimese saarekesed 16 uM verbaskosiidiga. Kontrollidena kasutati metanooli/etanooliga töödeldud rakke. Oksüdatiivse stressi esilekutsumiseks töödeldi rakke enne analüüsi 20 minutit H2O2-ga (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, USA) 500 uM täielikus RPMI söötmes, samal ajal töödeldi tunikamütsiiniga 2 ug/ml (T7765, Sigma Aldrich). ) viidi läbi ER stressi esilekutsumiseks 7 tundi.

2.2. Rakkude elujõulisuse tuvastamine MTT testiga

Rakud plaaditi 96 mitme süvendiga plaatidele ja viis päeva pärast verbaskosiidiga töötlemist inkubeeriti neid 0,5 mg/mL MTT-ga (3-(4,5-dimetüültiasool{{7}). }üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, USA) 4 tundi niisutatud atmosfääris, mis sisaldab 5 protsenti CO2 37 oC juures. Pärast inkubeerimist resuspendeeriti rakud õrnalt uuesti 100 ul DMSO-s (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Itaalia) ja neeldumine 540 nm juures tuvastati mikroplaadilugejaga (Benchmark, mikroplaadilugeja, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, USA) [33]. Katsed viidi läbi kolmes korduses ja andmed väljendati kontrollproovidega võrreldes korduva suurenemisena.

2.3. Rakusurma tuvastamine voolutsütomeetria abil

Viis päeva pärast inkubeerimist 16 uM verbaskosiidiga eraldati -rakud 7-minutise inkubeerimisega trüpsiini/EDTA-ga, koguti ja tsentrifuugiti; pellet resuspendeeriti õrnalt madala soolasisaldusega fosfaatpuhversoolalahuses. Rakud värviti MuseTM loendus- ja elujõulisuse reagendiga (Millipore, MCH100102, Burlington MA, USA) järgides tootja protokolli ja analüüsiti läbi voolutsütomeetria. Katsed viidi läbi kolmes eksemplaris ja andmed väljendati surnud rakkude protsendina koguarvust.

2.4. ROS-i põlvkond

Intratsellulaarset ROS-i hinnati DCFDA-ga (2/,7/-diklorofluorestseiindiatsetaat) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, USA), membraani läbilaskva sondiga, mis muutub ROS-iga seotuna fluorestseeruvaks [34]. tc3 rakud laaditi eelnevalt 15 uM DCFDA-ga Krebs-Ringeri puhvris (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7,4 ja 2 mM CaCl2).

täiendatud 11 mM glükoosiga 1 tund temperatuuril 37 oC. ROS-i sisaldust tuvastati 30 minuti jooksul nii põhi- kui ka stressitingimustes mikroplaadilugejaga (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Šveits). Keskmised väärtused ja standardhälbed põhinesid kolmel sõltumatul katsel.

2.5. Western Blotting

tc3 rakud koguti ja solubiliseeriti RIPA puhvris (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 1% TERGITOLw NP40, 0,5% deoksükolaati), millele oli lisatud aprotiniini (Sigma Aldrich, St. A452). Louis, MO, USA), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, USA) ja Roche inhibiitorid (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, USA) 40 minutit temperatuuril 4 oC. Valgu kontsentratsioon määrati Bradfordi testiga [35], kasutades Bradfordi reagenti (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, USA), 30 ug valke lahutati 10% SDS-PAGE abil ja kanti nitrotselluloosmembraanidele (Millipore, Burlington). MA, USA). Primaarseid antikehi kanti 2 tunniks blokeerimispuhvrisse 5% rasvavaba piima või 5% BSA lahustega; kasutati järgmisi primaarseid antikehi: hiire anti- -aktiin (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, USA), hiire anti-akroleiin (Abcam, ab48501, Cambridge, UK), hiire anti-BIP (lahke kingitus prof. Borgese Nicalt, Neuroteaduste Instituut, CNR, Milano, Itaalia), küüliku anti-HNE (-diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, USA), hiire anti-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, USA), küüliku anti-fosfo-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), hiire anti-IKB (Cell Signaling Technology Inc. ., 4814, Danvers, MA, USA), küüliku anti-fosfo-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), küüliku anti-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, USA), lamba anti-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Saksamaa), küüliku anti-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, USA), küüliku anti-eIF2 (Cell Signaling Technology) Inc., 5324, Danvers, MA, USA) ja küüliku anti-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, USA). Sekundaarseid HRP-ga konjugeeritud antikehi (Dako Agilent, Santa Clara, CA, USA) kasutati lahjenduses 1:5000. Valgud tuvastati ECL tuvastussüsteemi (Euro-Clone SpA, Pero MI, Itaalia) abil, kasutades Odyssey Fc Image süsteemi (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, Saksamaa) ja riba tihedus kvantifitseeriti Image Studiow Lite tarkvara (LI) abil. -COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) [36]. Katsed viidi läbi kolmes korduses ja andmed väljendati kontrollproovidega võrreldes korduva suurenemisena.

2.6. Mitokondriaalse membraani potentsiaal

tc3 rakke ja inimese Langerhansi saarekesi inkubeeriti 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos-ga (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milano, Itaalia) või 100 uM MitoSpyw Green FM-ga Itaalias (BioLegend, 424805, 3 min, 3 Milano, 3 min. oC; Fluorestsentsi intensiivsused tuvastati mikroplaadilugejaga TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 nm Ex/Em MitoSpyw Orange CMTMRos jaoks; 490/516 nm Ex/Em MitoSpyw Greeni jaoks) (TECAN Infinite⑧, Tecannite⑧nnedorf Group). Rakke inkubeeriti 500 uM H2O2-ga 20 minutit ja fluorestsentsi intensiivsus tuvastati, nagu eelnevalt kirjeldatud. Keskmised väärtused ja standardhälbed põhinesid kolmel erineval katsel.

2.7. Mitokondriaalne morfoloogia ja dünaamika

tc3 rakud laaditi eelnevalt 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos-ga (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milano, Itaalia) 11 mM glükoosi Krebs-Ringeri puhvris temperatuuril 37 oC 30 minutit. Proovid paigutati pildistuskambrisse ja juhuslikud väljad pildistati, kasutades mikroskoobi Axio Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen, Saksamaa) rodoani filtrit. Mitokondriaalse morfoloogia hindamiseks analüüsiti ImageJ osakeste analüsaatori tarkvara abil järgmisi parameetreid: pindala (um2), tsirkulaarsus (4mArea2/Perimeter2) ja Fereti maksimaalne läbimõõt (um) [37].

Ajavahemikuga katsete jaoks viidi üherakuline pildistamine läbi kiirusega 1 kaader sekundis 30 sekundi jooksul kontrolli- või oksüdatiivse stressi tingimustes. Mitokondriaalse kumulatiivse kauguse (um2) mõõtmiseks korrigeeriti kujutisi esmalt fotode pleegitamiseks, seejärel analüüsiti videoid olemasoleva Image-Pro Plusi pistikprogrammi (objekti jälgimine) abil (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA). Kuni kaheteistkümneni

rakud pildistati kolmes sõltumatus katses ja andmed esitati keskmiste väärtuste ja standardhälvetena.

2.8. Insuliini sekretsioon

Inimese isoleeritud Langerhansi saarekesed külvati 96-süvendi plaadile tihedusega 20 saarekest süvendi kohta ning pärast 5-päevast ravi mõõdeti insuliinisisaldust ja sekretsiooni basaaltasemes (3,3 mM glükoos) ja stimuleeriti (16,7 mM glükoosisisaldust). ) tingimused ELISA immuunanalüüsi abil (Mercodia, 10-1113-01, Uppsala, Rootsi).

2.9. Statistilised analüüsid

Kõik statistilised analüüsid viidi läbi programmiga GraphPad Prism 8.0 sõltumatute bioloogiliste kordustega. Kahe rühma vahelisi keskmisi hinnati kahepoolse Studenti t-testi abil ja statistilise olulisuse tõestuseks peeti p-väärtust < 0,05.="" kolme="" või="" enama="" rühma="" keskmisi="" võrreldi="" dispersioonanalüüsi="" (anova)="" abil,="" millele="" järgnes="" mitmekordne="" post-hoc="" (tukey)="" võrdlustest.="" kasutatud="" statistiline="" test,="" täpsed="" p="" väärtused="" ja="" koopiate="" arv="" (n)="" on="" näidatud="" üksikute="" jooniste="" legendides.="" joonistel="" olevad="" vearibad="" näitavad="" keskmist="" ±="" sd="" või="" keskmist="" ±="" se,="" nagu="">

3. Tulemused

3.1. Verbaskosiid parandab rakkude elujõulisust

Kuna puuduvad andmed verbaskosiidi mõju kohta -rakkudele, teostasime rakkude elujõulisuse hindamiseks MTT testi ja nagu on näidatud joonisel 1A, täheldati positiivset annusest sõltuvat suundumust. Seetõttu valisime edasisteks uuringuteks 16 uM kontsentratsiooni, mis osutus statistiliselt tõhusaks rakkude elujõulisuse suurendamiseks. Voolutsütomeetria abil uurisime verbaskosiidi viiepäevase inkubeerimise mõju rakkude ellujäämisele põhitingimustes ja pärast 2{21} } min eeltöötlust 500 uM H2O2-ga. Põhiseisundis ei mõjutanud verbaskosiid rakkude ellujäämist, mis viitab sellele, et MTT testis täheldatud suurenenud rakkude elujõulisus võib olla tingitud mitokondriaalse aktiivsuse paranemisest. Arvestades, et pärast kokkupuudet H2O2-ga vähendas eeltöötlus 16 uM verbaskosiidiga oluliselt oksüdatiivsest stressist põhjustatud rakusurma (joonis 1B, C). Verbaskosiid on keeruline molekul, mida saab modifitseerida hüdrolüüsivate ensüümide abil [18]. Et testida, kas verbaskosiidi metaboliidid võivad põhjustada täheldatud kaitsvat toimet, töödeldi tc3 rakke hüdroksütürosooli ja kofeiinhapetega (0, 8 ja 16 uM) 5 päeva. Mõlemad metaboliidid ei suurendanud rakkude elujõulisust, vastupidi, 16 uM kontsentratsiooni puhul tuvastati tsütotoksiline toime, mis oli olulisem pärast H2O2 kokkupuudet (joonis S1). See leid tõestab, et verbaskosiid, mitte selle metaboliidid, avaldavad H2O2-töötlusele kaitsvat toimet.

3.2. Verbaskosiid moduleerib redoks-homöostaasi ja avaldab rakkudes põletikuvastast toimet

Esmalt kinnitasime tc3 rakkudes verbaskosiidi põletikuvastast ja antioksüdantset toimet, mida täheldati teistes rakutüüpides [24, 29, 34]. Verbaskosiidi ROS-i eemaldamise aktiivsust hinnati tc3 rakkudega, mis olid märgistatud ROS-spetsiifilise DCFDA (2/,7/-diklorofluorestseiindiatsetaat) raku läbilaskva sondiga. Nagu on näidatud joonisel 2A, tuvastati pärast verbaskosiidiga eeltöötlust ROS-i sisalduse märkimisväärne vähenemine nii põhi- kui ka oksüdatiivse stressi tingimustes.

Western blot analüüsid näitasid oksüdatiivse stressi markerite akroleiini ja 4-hüdroksünonenaali (HNE) ekspressiooni olulist vähenemist verbaskosiidiga töödeldud rakkudes. Lisaks avastasime superoksiidi dismutaasi (SOD1) ekspressiooni suurenemise, mis viitab sellele, et verbaskosiid avaldab oma antioksüdantset aktiivsust tõenäoliselt kahe erineva mehhanismiga, otseselt ROS-i püüdjana ja kaudselt, indutseerides antioksüdantsete ensüümide ekspressiooni (joonis 2B, C).

Verbaskosiidi põletikuvastast toimet rakkudele hinnati, hinnates NFKB raja aktivatsiooni, mis on nendes rakkudes kõige olulisem põletikku soodustav rada [38]. Western blot analüüsiga tuvastasime tuumafaktori kappa B (IKB) ja tuumafaktori kappa kerge ahela võimendaja (NFKB) ekspressiooni vähenemise ning NFKB fosforüülimise olulise vähenemise eeltöödeldud rakkudes, mis toetab hüpoteesi verbaskosiidi efektiivsus rakupõletiku vähendamisel (joonis 2D, E).

3.3. Verbascoside moduleerib -rakkude lahtivolditud valguvastust

Seejärel analüüsisime põhjalikult molekulaarset mehhanismi, mille abil verbaskosiid avaldab antioksüdantset ja põletikuvastast rolli, keskendudes endoplasmaatilisele retikulumile, mis on kujunemas rakkudes metaboolsete ja stressisignaalide võtmeandurina. Stressitingimustes saavutab organell homöostaatilise vastuse, mida tuntakse voltimata valgu vastusena (UPR), mille eesmärk on ER funktsiooni taastamine; selle raja liigne aktiveerimine põhjustab aga apoptoosi [39, 40].

Suurenenud ER-stressi markeriteks on chaperones-valkude ülesreguleerimine ja UPR-vastuse aktiveerimine. Verbaskosiidiga töödeldud rakkude Western blot analüüs näitas kahe chaperoniini kuumašoki valgu 70 (HSP70) ja siduva immunoglobuliini valgu (BIP) taseme langust (joonis 3A, B). Lisaks tuvastati proteiinkinaasi RNA-sarnase ER kinaasi (PERK) ekspressiooni märkimisväärne vähenemine ja selle allavoolu efektori, eukarüootse translatsiooni initsiatsioonifaktori 2 (eIF2) fosforüülimise vähenemine.

2. osa vaatamiseks klõpsake siin