3. osa: 2. tüüpi kannabinoidi retseptor soodustab neerufibroosi B-kateniini signaalide korraldamise kaudu
Mar 06, 2022
Kontakt: emily.li@wecistanche.com
Siiski on harva teatatud, et CB2 ja -kateniini vahel on seos.
CB2 on GPCR perekonna liige. Varem avastasime, et CB2 ekspresseerub tubulaarsetes rakkudes, fibroblastides ja makrofaagides. CB2 ekspresseerub ka podotsüütides ja mesangiaalrakkudes.3 CB2 roll kroonilise neeruhaiguse korral oli minevikus vastuoluline. Vaatamata CB2 mRNA ja selle peamise endogeense ligandi 2-AG ülesreguleerimisele kroonilise neeruhaiguse mudelites teatati varem, et CB2 agonist võib leevendada neerufibroosi. Seevastu meie varasemad uuringud tuvastasid geneetiliste väljalülitamise katsete ja testide kaudu CB2 kahjuliku rolli neerufibroosis, kasutades selektiivsemat CB2 pöördagonisti XL-001, uudset CB2 pöördagonisti, mis omab tugevaimat seondumisafiinsust CB2 retseptori suhtes, parima selektiivsusega võrreldes CB1 retseptoriga (2594- korda) ja Ki on 0,5 nM. Pange tähele, et -kateniini ja selle sihtmärke pärsib CB2 geneetiline ablatsioon või farmakoloogiline inhibeerimine. Arvestades, et CB2 on GPCR perekonna liige, võib CB2 moduleerida -kateniini. See hüpotees vajab aga kinnitust. Selles uuringus näitasime, et CB2 vahendab -kateniini aktiveerimist GPCR signaali laine kaudu.
Meie uuring kinnitab ka endokannabinoidsüsteemi esilekerkivat rolli neerufibroosis. Kahest peamisest endokannabinoidist on anandamiidil (N-arahhidonoietanoolamiin) suurem afiinsus CBl suhtes, samas kui 2-AG-l on sarnane afiinsus CB1 ja CB2 suhtes (selle afiinsus CB1 suhtes on veidi suurem). Seega {{ 7}}AG on CB2 retseptori peamine endokannabinoidi agonist. Nimelt onneerudajukoores on sarnaselt kõrge anandamiidi ja 2-AG põhitase; aga 2-AG tase tõuseb rohkem obstruktiivsetelfibrooskohtaaneerud, millega kaasneb anandamiidi taseme langus, mille tulemuseks on nii CB2 kui ka CB1 aktiveerumine. Märkus on, et CB2 kahjulik roll patogeneesisneeru-fibroosseda näitasid meie hiljutises uuringus geneetilised lähenemisviisid, ja seda kinnitab ka käesolev uuring.
Kuigi eelmine aruanne näitas, et CB2 ekspresseeritakse nii põletikulistes rakkudes kui ka podotsüütides kõrgel basaaltasemel, on CB2 ja selle peamine endogeenne ligand 2-AG pärast UUO-d ja IRI-d tegelikult ülesreguleeritud.7 Eelkõige hiirte ja neerufibroosi korral mitmesuguste inimese nefropaatiate korral ekspresseerub CB2 valdavalt neerutuubulite epiteelis, aga ka interstitsiaalsetes fibroblastides ja leukotsüütides (joonis 2; täiendav joonis S1), mis viitab sellele, et CB2 ülesreguleerimine on fibrootiliste neerude tavaline patoloogiline tunnus. Loomkatsetes kasutasime CB2 fluorestsentsi in situ hübridisatsiooni, et tuvastada selle ekspressioonimuster selle madala hinna tõttu. Värvimine näitas, et CB2 ekspresseeritakse peamiselt torukujulises epiteelis. Selle lahknevuse põhjuseks võib olla fluorestsentsi in situ hübridisatsioonitehnika tundlikkus väga rikkalike mRNA-de tuvastamisel ja pildistamise kokkupuuteaeg. Me ei täheldanud CB2 mitte ainult rakumembraanis, vaid ka tubulaarses tsütoplasmaatilises piirkonnas, mis viitab retseptori sisestamisele rakusisedesse osadesse, nagu endosoomid ja lüsosoomid. 6 Fluorestsentsi in situ hübridisatsioonitesti spetsiifilisus kinnitati primaarse CB2 antikehaga ja mõlemad olid. kontrollitud CB2 knockout hiirtel (täiendav joonis S1). Huvitaval kombel täheldasime UUO-mõjutatud korral CB2 heterodimeeri moodustumist CB1-ganeerudja transformeerivad kasvufaktori{0}}indutseeritud torukujulised rakud (täiendav joonis S4), mis viitab sellele, et nende stimuleeriv toime võib olla sünergiline. Siiski ei mõjutanud AM1241 ega XL-001 CB1 ekspressiooni, mis muudab mehhanismid veelgi keerukamaks. Nagu eelnevalt mainitud CB2 ja CB1 vastastikku inhibeerivate mõjude kohta, tuleks nende omavahel seotud mõjude kontrollimiseks läbi viia rohkem uuringuid, mis ei kuulu praeguse uuringu ulatusse. Sellegipoolest näitavad meie varasemad ja praegused leiud järjekindlalt, et CB2 blokaad on potentsiaalne terapeutiline sekkumisstrateegia neerufibroosi ennetamiseks. Lisaks kroonilise neeruhaigusega patsientide teavitamisele annavad meie leiud tervisehoiatused kiiresti kasvavale rühmale.
Joonis 10| Kannabinoidi retseptor tüüp 2 (CB2) on -kateniini (-cat) allavoolu sihtmärk.(a) Bioinformaatika analüüs näitas oletatavate T-rakufaktori (TCF) sidumissaitide (TBS) olemasolu inimese ja hiire CB2 promootorpiirkonnas. geenid. Oletatavate TBS-ide järjestused ja positsioonid CB2 geenides on esile tõstetud (punane), samas kui TBS-i konsensusjärjestus on antud selle paneeli allosas. (b) Tüüpilised kromatiini immunosadestamise (ChlP) testi tulemused, mis näitavad TCF või lümfoidse võimendajaga seondumise faktori (LEF)-1 seondumist CB2 geeni promootori piirkonnaga. Inimeneneerudproksimaalseid tubulaarseid (HKC)-8 rakke transfekteeriti -kateniini ekspressiooniplasmiidiga (pFlag- -cat) või pcDNA3-ga 24 tundi. Rakuüsaadid sadestati TCF, LEF-1, histooni H3 või mitteimmuunse lgG vastaste antikehadega ja kiibi test viidi läbi CB2 geeni promootorite jaoks. Kogu lahjendatud lüsaati kasutati kogu genoomse sisend-DNA-na. (c) CB2 mRNA taseme graafiline esitus. HKC-8 rakud transfekteeriti pFlag- -cat või pcDNA3 plasmiidiga. Kogu RNA-d analüüsiti kvantitatiivse polümeraasi ahelreaktsiooniga.*P<0.05 versus="" the="" pcdna3="" group="" (n="3)." (d,e)representative="" western="" blot="" and="" quantitative="" data="" show="" overexpression="" of="" β-catenin-induced="" upregulation="" of=""><0.05 versus="" the="" pcdna3="" group="" (n="3)." (f="" representative="" graphs="" show="" β-catenin="" induced="" the="" formation="" of="" a="" cb2/β-arrestin="" 1(β-arr1)/="" proto-oncogene="" src="" complex.="" cell="" lysates="" were="" immunoprecipitated="" (ip)="" with="" an="" antibody="" against="" cb2,="" followed="" by="" immunoblotting="" (b)="" with="" anti-β-arrestin="" 1(β-arr1),="" or="" anti-src.(g-i)representative="" westem="" blot="" and="" quantitative="" data="" show="" the="" expression="" of="" cb2,="" β-arrestin="" 1(β-arr1),="" and="" src.="" hkc-8="" cells="" were="" transfected="" with="" pflag-β-cat="" (or="" pcdna3)="" plasmid="" in="" the="" presence="" or="" absence="" of="" cb2="" small="" interfering="" rna=""><0.001 versus="" the="" pcdna3=""><0.001 versus="" the="" flag-β-catenin="" group="" alone="" (n="">endokannabinoidide tarbijate seas nii meelelahutuslikel kui ka meditsiinilistel eesmärkidel. Krooniline tugev kasutamine võib põhjustada nii CB1 kui ka CB2 retseptorite pidevat aktiveerumist, millel võib olla negatiivne mõjuneerudtervist.
Kuigi eelmine aruanne näitas, et -arrestiin 1 mängib rolli neerufibroosis ja -kateniini aktiveerimises, selgitame üksikasjalikumalt -arrestiini 1-vahendatud CB2/ -kateniini raja funktsionaalseid mehhanisme. Leidsime -arrestin 1 on IRI hiirtel rohkem kui -arrestiin 2 (andmeid pole näidatud). On hästi teada, et -arrestiin 1 vastutab GPCR aktiveerimise ja allavoolu signaaliülekande eest Src, AKT, rakuvälise signaaliga reguleeritud proteiinkinaasi (ERK1/2) kaudu. , ja teised kinaasid.2et Src aktiveerimine võib vahendada mitmeid fibroosi soodustavaid radu, nagu epidermise kasvufaktori retseptor ja signaalimuundur ja transkriptsiooni aktivaator (STAT)3," ei saanud me välistada võimalust, et need rajad on ka CB2 allavoolu teed. meie tähelepanekud näitavad, et -kateniini signaaliülekannet vahendab CB2-indutseeritud -arrestiin 1/Src kompleks. Lisaks on -arrestin 1 peamine kontrollpunkti regulaator ja see toimib karkassvalguna, mis käivitab kateniini ümberpaigutamise teel tuuma. Veel üks uudne avastus on see, et CB2 on -kateniini sihtmärk. Selles uuringus on CB2 varem tuvastatud mitu -kateniini sihtmärki. Seetõttu on märkimisväärne, et CB2/-kateniini rada näib olevat luua vastastikune aktiveerimissilmus, mis soodustab koostöös neerufibroosi patogeneesi.
Kokkuvõttes näitavad meie tulemused, et aberrantselt ekspresseeritud CB2 on kriitiliselt seotud neerufibroosiga -arrestiini 1-indutseeritud -kateniini aktiveerimise kaudu. -kateniin käivitab CB2 ekspressiooni, mis hõlbustab retseptori aktiveerimist ja signaali laine edastamist. Need tulemused (i) illustreerivad uudset CB2/-kateniini rada, mis soodustab neerufibroosi, ja (ii) viitavad sellele, et CB2 või -arrestiin 1 sihipärane inhibeerimine võib kaitsta fibroosi eest vastastikuse aktivatsioonisilmuse inhibeerimise kaudu.
LÜHIMEETODID
Üksikasjalikud meetodid leiate jaotisest Täiendavad meetodid.
Loomade mudelid
Isased C57BL/6 hiired osteti Lõuna-Meditsiiniülikooli (Guangzhou, Hiina) katseloomade keskusest. IRI mudeli jaoks lõigati kahepoolsed pediklid mikroaneurüsmi klambritega 32 minutiks 37,5 kraadi juures isheemia ja taastumisperioodil. UUO mudel loodi vasaku kusejuha kolmekordse ligeerimisega 4-0 siidiga pärast kõhu keskjoone sisselõiget. UIRI mudeli jaoks lõigati vasakpoolsed pediklid 35 minutiks mikroaneurüsmi klambrite abil ja kontralateraalsedneerudeemaldati 1 päev enne ohverdamist. Foolhappest indutseeritud nefropaatia mudeli puhul raviti isaseid C57BL/6 hiiri foolhappega ühekordse intraperitoneaalse süstiga 25 mg/kg kehakaalu kohta. Wnt1 või CB2 in vivo ekspressioon või -arrestiin 1 pärssimine hiirtel viidi läbi hüdrodünaamilise geeni kohaletoimetamise meetodiga."5 Üksikasjalikud katseplaanid on näidatud joonistel 5a, 7a ja 9a. Loomkatsed kiideti heaks. Hiina Guangzhou Southern Medical University loomade eetikakomitee poolt. 6-8 nädala vanused CB2 nullhiirte (CB2/) aretuspaarid C57BL/6N taustal osteti ettevõttelt Cyagen Biosciences (lao nr KOCMP{). {19}}Cnr2; Cyagen Biosciences, Guangzhou, Hiina). CB2 retseptori puudulikkust kinnitati pöördtranskriptsiooni-PCR abil.
Inimese neeru biopsia proovid ja rakukultuur
Inimeneneerudlõigud (3 μm) saadi Hiina Guangzhou Lõuna Meditsiiniülikooli Nanfang Hospitalis ja Huadu District People's Hospitalis tehtud neerubiopsiatest. Tavalised kontrollbiopsiad saadi mittekasvajatestneerudkoedpatsientidest, kellel oli neerukartsinoom. Uuringud, mis hõlmasid inimese neerude sektsioone, viidi läbi patsiendi teadlikul nõusolekul ja need kiitsid heaks Nanfangi haigla ja Huadu piirkonna rahvahaigla institutsionaalne eetikakomitee. Inimese proksimaalsed tubulaarsed epiteelirakud (HKC{0}}) hankis dr Lorraine C. Racusen (Johns Hopkinsi ülikool, Baltimore, MD). Tuuma- ja tsütoplasmaatilised fraktsioonid eraldati kaubandusliku komplektiga (BestBio, Shanghai, Hiina).
Seerumi kreatiniini ja vere uurea lämmastiku taseme määramine
Seerumi kreatiniini ja vere uurea lämmastiku tase määrati automaatse keemianalüsaatoriga (AU480 Chemistry Analyzer, Beckman Coulter, Atlanta, GA).
In situ hübridisatsioon
CB2 sondid osteti ettevõttest Boster Technology, Wuhan, Hiina.Neerlõigud (8 μm) fikseeriti 4% formaldehüüdiga ja hinnati CB2 fluorestsentsvärvimisega, kasutades kaubanduslikku komplekti (MK2530, Boster Biological Technology, Wuhan, Hiina).
Histoloogia ning immunohistokeemiline ja immunofluorestsentsvärvimine
Parafiiniga kaetudneerudlõigud värviti, kasutades perioodilist happe-Schiffi ja Massoni trikroomvärvimist, et tuvastada vigastatud tuubulid ja määrata kollageeni sadestumine. Kahjustused kvantifitseeriti arvutipõhise tehnika abil. Immunohistokeemiline ja immunofluorestsentsvärvimine viidi läbi vastavalt parafiini ja külmutatud sektsioonides. Antikehi on kirjeldatud täiendavates meetodites.
