2. osa|Glükogeeni süntaasi kinaas 3b hüperaktiivsus uriini kooritud rakkudes ennustab diabeetilise neeruhaiguse progresseerumist

1. osa vaatamiseks klõpsake siin

Lisateabe saamiseks võtke ühendust:emily.li@wecistanche.com

ARUTELU

Ameerika Ühendriikides ja teistes lääneriikides on DKD endiselt progresseeruva haiguse juhtiv etioloogiakrooniline neeruhaigusja paneb riigikassale ja tervishoiusüsteemidele suure koormuse, kuna lõplikku ravi pole veel saadaval.5 On juba ammu teada, et mitte kõigil diabeediga patsientidel ei arene välja DN.5 Olenevalt uuritud kohordist on hinnatud, et DN kannatab 30–50 protsenti diabeedihaigetest. Praeguses kliinilises praktikas võetavad meetmed DKD tekkeriskiga diabeediga patsientide tuvastamiseks piirduvad suures osas silmade kontrollimisega retinopaatia tuvastamiseks ja uriinianalüüsiga albuminuuria avastamiseks.5 Samas näitavad ühtsed epidemioloogilised tõendid, et ekstrarenaalne mikrovaskulopaatia või albuminuuria on oluliselt vastuolus sellest tuleneva haiguse progresseerumisega. DKD.12,13,26,27 Seetõttu on tungiv vajadus töötada välja uudne biomarker DN-i riskiga diabeediga patsientide täpseks kihistamiseks. Käesolevas uuringus teatatakse esimest korda, et GSK3b on parenhüümis üleekspresseeritud ja hüperaktiivne.neerudrakud nii eksperimentaalses kui ka kliinilises DN-is, mis on seotudneeruhaiguse progresseerumine. Veelgi enam, GSK3b hüperaktiivsus uriiniga kooritud rakkudes suudab tõenäoliselt ennustada DN-i progresseerumist.

Cistanche tubulosa hoiab ära neeruhaiguse, proovi saamiseks klõpsake siin

GSK3b, väga konserveerunud, redoks-tundlik seriini/treoniini valgu kinaas, osaleb tsentraalselt insuliini signaaliülekandes, aga ka mitmetes teistes rakulistes signaaliradudes, mis on olulised patofüsioloogiliste protsesside jaoks, mis on seotudneerudvigastus, parandamine ja regenereerimine. Insuliinitundlikes kudedes, nagu maks ja skeletilihas, on GSK3b aktiivne põhitingimustes ja pärsib glükogeeni süntaasi aktiivsust.19,28 Insuliin inaktiveerib kiiresti GSK3b seriini 9 inhibeeriva fosforüülimise kaudu, mille tulemuseks on glükogeeni biosüntees. Üha rohkem tõendeid viitab sellele, et GSK3b düsregulatsioon on seotud II tüüpi suhkurtõvega.19,29–31 Tõepoolest, on andmeid, mis näitavad GSK3b üleekspressiooni ja hüperaktiivsust diabeedihaigete lihastes31–33 ja rasvunud diabeetiliste hiirte rasvkoes.34 Lisaks. GSK3b transgeenne üleekspressioon hiirte skeletilihastes põhjustab glükoositaluvuse halvenemist, insuliiniresistentsust ja hüperinsulineemiat.29,35 Seevastu hiirtel, kellel skeletilihastes puudus GSK3b, oli parem glükoositaluvus.36 Järjekindlalt on GSK3 inhibiitorid, nagu liitium, võimelised. jäljendavad insuliini toimet rakuliinides ja kudedes.37 Lisaks parandasid GSK3 inhibiitorid rasvunud diabeetilistel hiirtel insuliinitundlikkust ja glükoosi homöostaasi.neerudei ole traditsiooniliselt peetud insuliini toime sihtorganiks. Kuid veenvad tõendid viitasid hiljuti sellele, et insuliini signaalimine sisseneerudrakud, eriti podotsüütides, mängivad võtmerolli glomerulaarsete janeerudhomöostaas.39–41 Insuliinipuuduse või -resistentsuse tõttu tekkinud puudulik insuliini signaaliülekanne podotsüütides on tõenäoliselt paljude DN-s täheldatud patoloogiliste kahjustuste pöördeline initsiaator. Lisaks on kliinilised uuringud näidanud, et insuliiniresistentsus korreleerub albuminuuria tekke ja raskusastmega isegi normotensiivsetel patsientidel, kellel ei ole diabeeti, mis viitab sellele, et insuliiniresistentsus iseenesest võib põhjustada albuminuuriat.42 Samamoodi saavutati podotsüütide-spetsiifilise insuliiniresistentsusega hiired insuliiniretseptori tingimuslik väljalülitamine glomerulaarsetes podotsüütides, arenenud albuminuuria ja glomerulaarsed kahjustused, mis koondavad DN-i, hoolimata hüperglükeemia või diabeedi puudumisest.41 Diabeediga loomadel on insuliini sensibilisaatorid aga võimelised aeglustama DN progresseerumist sõltumata glükeemilisest kontrollist.43 Need leiud viitavad sellele, et insuliini signaalimine reguleerib podotsüütide funktsiooni sõltumata vere glükoositasemest. Insuliini signaaliraja võtmemuundurina on GSK3b roll DN-i patogeneesis ja progresseerumises siiski oluliselt alauuritud.

Aastalneerud, GSK3b ekspresseeritakse valdavalt podotsüütides ja vähemal määral mesangiaalsetes ja endoteelirakkudes glomeruluses 20, 21 ning ekspresseeritakse ulatuslikult neerutuubulirakkudes. Meie ja teiste rühmade andmed näitavad, et GSK3b vahendab podotsüütide autonoomset kahjustust, integreerides mitu podotsüütide topaatilist signaaliülekande rada.17, 20, 44, 45 GSK3b ebajärjekindlus, geneetiline või farmakoloogiline blokaad võib kaitsta podotsüütide vigastuste eest ja nõrgendada proteinuuria loommudelites mitmesugused mittediabeetilised glomerulopaatiad.21 Pealegi progresseeruvakroonilineneerudhaigus, leiti, et GSK3b on neerutuubulite ja interstitsiaalse kahjustuse modulaator. Kuid kas ja kuidas GSK3b on DN-is kaasatud, on olnud ebakindel ja väga vastuoluline, kuigi käesolev uuring näitas, et GSK3b aktiveerimine paranesneerudja uriiniga kooritud rakkudes võib seostada DKD arengu või progresseerumisega. Näiteks streptozototsiinist põhjustatud diabeediga rottidel avastasid Lin jt 46, et GSK3b inhibeerimine adenosiintrifosfaadiga konkureeriva inhibiitori (20 Z, 30 E)-6- bromo toimel indirubiin-30 -oksiimis ( BIO) nõrgendas proteinuuriat ja DN-i paranenud glomerulaarseid kahjustusi hüperglükeemia korrigeerimise puudumisel, mis viitab sellele, et GSK3b mängib DN-is kahjulikku rolli. Samuti tegid Paeng jt 22 streptozototsiini poolt indutseeritud diabeediga rottidel BIO-d kasutades sarnased tulemused ja jõudsid järeldusele, et suurenenud GSK3b aktiivsus podotsüütides diabeetilistes tingimustes on seotud podotsüütide apoptoosi ja DN-i kadumisega. See on kooskõlas teise in vitro uuringuga, kus leiti, et GSK3b vahendab podotsüütide dediferentseerumist ja vigastusi pärast kokkupuudet kõrge glükoosisisaldusega söötmega.47 Vastupidi, Mariappan et al.48 väitsid, et GSK3b aktiveerimine leevendab hoopis diabeedist põhjustatud haigusi.neerudvigastus. Nende uuringus raviti streptozototsiini indutseeritud diabeetilisi hiiri naatriumnitroprussiidiga, lämmastikoksiidi doonoriga, mis on võimeline aktiveerima GSK3b. Nad leidsid, et albuminuuria, neerude hüpertroofia ja ekstratsellulaarse maatriksi akumuleerumine glomerulites olid kõik paranenud, kui hüpertensioon või hüperglükeemia ei paranenud. Need leiud on aga teravas vastuolus andmetega, mis on saadud geenidele suunatud knock-in hiirtelt saadud konstitutiivselt aktiivse GSK3-ga, millel tekkis spontaanne albuminuuria ja podotsüütide kahjustus.49 Vastuoluliste leidude ühitamiseks tuleb olla ettevaatlik keemiliste inhibiitorite või aktivaatorite kasutamisel saadud andmete tõlgendamisel. GSK3b. Kuigi BIO-d on korduvalt kinnitatud, et see on väga selektiivne GSK3b väikese molekuliga inhibiitor, ei ole naatriumnitroprussiid GSK3b spetsiifiline aktivaator, kuid sellel on teadaolevalt tugev hemodünaamiline toime,50 mis võib segada selle albuminuuriat vähendavat ja renoprotektiivset toimet diabeetilised hiired. Kokkuvõttes, hoolimata mõningatest vastuolulistest andmetest, kipuvad domineerivad tõendid toetama, et GSK3b on tõenäoliselt seotudneerudvigastusja proteinuuria DN-s. Mainida tuleb paar käesoleva uuringu piirangut. Esiteks piirdusid prekliinilised andmed ainult DB / DB hiiremudelitega. Määrata GSK3b rolli üldistatavusdiabeetiline neerukahjustus, on vaja kinnitada teiste DN-i mudelite, sealhulgas 1. tüüpi DN-mudelite leiud. Teiseks saadi siinsed kliinilised vaatlused diabeedihaigete retrospektiivsetest kohortidest, kellel oli piiratud valimi suurus ja suhteliselt lühike jälgimisaeg. Tõsi, meie tähelepanekute kontrollimiseks ja GSK3b võimsuse kinnitamiseks uriini kooritud rakkudes DKD tulemuste ennustamisel on vaja suuremahulisi, prospektiivseid, randomiseeritud, mitmekeskuselisi uuringuid.

GSK3b, väga konserveerunud, redoks-tundlik seriini/treoniini valgu kinaas, osaleb tsentraalselt insuliini signaaliülekandes, aga ka mitmetes teistes rakulistes signaaliradudes, mis on olulised patofüsioloogiliste protsesside jaoks, mis on seotudneerudvigastus, parandamine ja regenereerimine. Insuliinitundlikes kudedes, nagu maks ja skeletilihas, on GSK3b aktiivne põhitingimustes ja pärsib glükogeeni süntaasi aktiivsust.19,28 Insuliin inaktiveerib kiiresti GSK3b seriini 9 inhibeeriva fosforüülimise kaudu, mille tulemuseks on glükogeeni biosüntees. Üha rohkem tõendeid viitab sellele, et GSK3b düsregulatsioon on seotud II tüüpi suhkurtõvega.19,29–31 Tõepoolest, on andmeid, mis näitavad GSK3b üleekspressiooni ja hüperaktiivsust diabeedihaigete lihastes31–33 ja rasvunud diabeetiliste hiirte rasvkoes.34 Lisaks. GSK3b transgeenne üleekspressioon hiirte skeletilihastes põhjustab glükoositaluvuse halvenemist, insuliiniresistentsust ja hüperinsulineemiat.29,35 Seevastu hiirtel, kellel skeletilihastes puudus GSK3b, oli parem glükoositaluvus.36 Järjekindlalt on GSK3 inhibiitorid, nagu liitium, võimelised. jäljendavad insuliini

toime rakuliinides ja kudedes.37 Lisaks parandasid GSK3 inhibiitorid rasvunud diabeetilistel hiirtel insuliinitundlikkust ja glükoosi homöostaasi.38 Neere ei ole traditsiooniliselt peetud insuliini toime sihtorganiks. Kuid veenvad tõendid viitasid hiljuti sellele, et insuliini signaaliülekanne neerurakkudes, eriti podotsüütides, mängib võtmerolli glomerulaar- ja neerude homöostaasi säilitamisel.39–41 Insuliinipuuduse või -resistentsuse tõttu tekkinud insuliinisignaalide puudumine podotsüütides on tõenäoliselt pöördeline initsiaator. paljude DN-is täheldatud patoloogiliste kahjustuste puhul. Lisaks on kliinilised uuringud näidanud, et insuliiniresistentsus korreleerub albuminuuria tekke ja raskusastmega isegi normotensiivsetel patsientidel, kellel ei ole diabeeti, mis viitab sellele, et insuliiniresistentsus iseenesest võib põhjustada albuminuuriat.42 Samamoodi saavutati podotsüütide-spetsiifilise insuliiniresistentsusega hiired insuliiniretseptori tingimuslik väljalülitamine glomerulaarsetes podotsüütides, arenenud albuminuuria ja glomerulaarsed kahjustused, mis koondavad DN-i, hoolimata hüperglükeemia või diabeedi puudumisest.41 Diabeediga loomadel on insuliini sensibilisaatorid aga võimelised aeglustama DN progresseerumist sõltumata glükeemilisest kontrollist.43 Need leiud viitavad sellele, et insuliini signaalimine reguleerib podotsüütide funktsiooni sõltumata vere glükoositasemest. Insuliini signaaliraja võtmemuundurina on GSK3b roll DN-i patogeneesis ja progresseerumises siiski oluliselt alauuritud.

Neerudes ekspresseeritakse GSK3b valdavalt podotsüütides ja vähemal määral mesangiaalsetes ja endoteelirakkudes glomerulites20, 21 ning ekspresseeritakse ulatuslikult neerutuubulirakkudes. Meie ja teiste rühmade andmed näitavad, et GSK3b vahendab podotsüütide autonoomset kahjustust, integreerides mitu podotsüütide patilist signaaliülekande rada.17,20,44,45 GSK3b ebajärjekindlus, geneetiline või farmakoloogiline blokaad võib kaitsta podotsüütide vigastuste eest ja nõrgendada proteinuuria loommudelites mitmesugused mittediabeetilised glomerulopaatiad.21 Veelgi enam, progresseeruva krooniliseneerudhaigus, leiti, et GSK3b on neerutuubulite ja interstitsiaalse kahjustuse modulaator. Siiski, kas ja kuidas GSK3b on DN-is kaasatud, on olnud ebakindel ja intensiivselt vastuoluline, kuigi käesolev uuring näitas, et GSK3b suurenenud aktiveerimine neerudes ja uriiniga kooritud rakkudes võib olla seotud DKD arengu või progresseerumisega. Näiteks streptozototsiinist põhjustatud diabeediga rottidel leidsid Lin jt 46, et GSK3b pärssimine adenosiintrifosfaadiga konkureeriva inhibiitori (20 Z, 30 E)-6- bromo toimel indirubiin-30 -oksiimis ( BIO) nõrgendas proteinuuriat ja DN-i paranenud glomerulaarseid kahjustusi hüperglükeemia korrigeerimise puudumisel, mis viitab sellele, et GSK3b mängib DN-is kahjulikku rolli. Samuti tegid Paeng jt 22 streptozototsiini poolt indutseeritud diabeediga rottidel BIO-d kasutades sarnased tulemused ja jõudsid järeldusele, et suurenenud GSK3b aktiivsus podotsüütides diabeetilistes tingimustes on seotud podotsüütide apoptoosi ja DN-i kadumisega. See on kooskõlas teise in vitro uuringuga, kus leiti, et GSK3b vahendab podotsüütide dediferentseerumist ja vigastusi pärast kokkupuudet kõrge glükoosisisaldusega söötmega.47 Vastupidi, Mariappan et al.48 väitsid, et GSK3b aktiveerimine leevendab hoopis diabeedist põhjustatud haigusi.neerudvigastus. Nende uuringus raviti streptozototsiini indutseeritud diabeetilisi hiiri naatriumnitroprussiidiga, lämmastikoksiidi doonoriga, mis on võimeline aktiveerima GSK3b. Nad leidsid, et albuminuuria, neerude hüpertroofia ja ekstratsellulaarse maatriksi akumuleerumine glomerulites olid kõik paranenud, kui hüpertensioon või hüperglükeemia ei paranenud. Need leiud on aga teravas vastuolus andmetega, mis on saadud geenidele suunatud knock-in hiirtelt saadud konstitutiivselt aktiivse GSK3-ga, millel tekkis spontaanne albuminuuria ja podotsüütide kahjustus.49 Vastuoluliste leidude ühitamiseks tuleb olla ettevaatlik keemiliste inhibiitorite või aktivaatorite kasutamisel saadud andmete tõlgendamisel. GSK3b. Kuigi BIO-d on korduvalt kinnitatud, et see on väga selektiivne GSK3b väikese molekuliga inhibiitor, ei ole naatriumnitroprussiid GSK3b spetsiifiline aktivaator, kuid sellel on teadaolevalt tugev hemodünaamiline toime,50 mis võib segada selle albuminuuriat vähendavat ja renoprotektiivset toimet diabeetilised hiired. Kokkuvõttes, hoolimata mõningatest vastuolulistest andmetest, kipuvad domineerivad tõendid toetama, et GSK3b on tõenäoliselt seotudneerudvigastusja proteinuuria DN-s. Paar piirangut

tuleb mainida praegust uuringut. Esiteks piirdusid prekliinilised andmed ainult dB / dB hiiremudelitega. Määrata GSK3b rolli üldistatavusdiabeetiline neerukahjustus, on vaja kinnitada teiste DN-i mudelite, sealhulgas 1. tüüpi DN-mudelite leiud. Teiseks saadi siinsed kliinilised vaatlused diabeedihaigete retrospektiivsetest kohortidest, kellel oli piiratud valimi suurus ja suhteliselt lühike jälgimisaeg. Tõsi, meie tähelepanekute kontrollimiseks ja GSK3b võimsuse kinnitamiseks uriini kooritud rakkudes DKD tulemuste ennustamisel on vaja suuremahulisi, prospektiivseid, randomiseeritud, mitmekeskuselisi uuringuid.

Kokkuvõttes näitasid meie uuringud, et GSK3b neeruekspressioon ja aktiivsus võimenduvad eksperimentaalses ja kliinilises DN-is. GSK3b aktiivsus uriiniga kooritud rakkudes võib olla uudne biomarker DN-i progresseerumise ennustamiseks. Meie andmed võivad sillutada teed laiaulatuslikule ja põhjalikule uurimisele selle väärtuse kohta, mida GSK3b uriiniga kooritud rakkudes võib olla DN-i prognostiline biomarker.

MEETODID

Loomade uuringud

Loomkatsed kiitis heaks institutsionaalne loomade hooldamine ja komitee ning need vastavad USA põllumajandusministeeriumi määrustele ja riiklike tervishoiuinstituutide juhendile inimhoolduse ja laboriloomade kasutamise kohta. Isased DB/DB hiired ja kontroll db/m pesakonnakaaslased vanuses 6 nädalat osteti Nanjing University Model Animal Research Centerist (Nanjing, Hiina) ja majutati Zhengzhou ülikooli loomakeskusesse. Kõiki hiiri toideti ad libitum ja 8–10 hiirt tapeti näidatud vanuses. Uriini- ja vereproovid võeti näidatud ajahetkedel. Pärast tapmist koguti neerud edasiseks uurimiseks. Uriini albumiini taset mõõdeti hiire albumiini ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi kvantifitseerimiskomplekti abil (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Uriini kreatiniini tasemed määrati kreatiniini analüüsi komplekti (BioAssay Systems, Hayward, CA) abil.

Rakukultuur

Tinglikult immortaliseeritud hiire podotsüüte lõikude 21 ja 25 vahel kultiveeriti Roswell Park Memorial Institute 1640 söötmes, millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit, eelkirjeldatud tingimustel.22 Podotsüütide subkultuurid allutati diferentseerumise esilekutsumiseks mittelubavatele tingimustele ja neid hoiti 14 päeva. seejärel eksponeeriti normaalsele keskkonnale/kultuurisöötmele, mis sisaldas 5 mM glükoosi, diabeetilist miljööd, mis koosnes glükoosist (25 mM) ja transformeerivast kasvufaktorist b1 (2 ng/ml), või kõrge osmolaalsusega kontrollsöötmega, mis sisaldas 20 mM mannitooli tundi. Hiire proksimaalseid tubulaarseid epiteelirakke ja hiire glomerulaarseid mesangiaalrakke hoiti Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes/F12, millele oli lisatud 5 protsenti veise loote seerumit. Rakud külvati 24 tunniks 70-protsendilise konfluentsusega söötmesse, mis sisaldas 5 protsenti veise loote seerumit, ja seejärel näljutati neid veel 24 tundi, millele järgnes kokkupuude normaalse keskkonnaga/kultuurisöötmega, mis sisaldas 5 mM glükoosi – diabeetilise miljööga, mis koosnes kõrgest glükoosi (25 mM) ja transformeerivat kasvufaktorit b1 (2 ng/ml) või kõrge osmolaalsusega kontrollsöödet, mis sisaldab 5 mM glükoosi ja 20 mM mannitooli 48 tunni jooksul. Rakkude elujõulisust hinnati trüpaansinise välistamisega. Näidatud ajahetkedel rakud fikseeriti või rakulüsaadid koguti edasiseks uurimiseks.

Vektorite mööduv transfektsioon

GSK3b tühja vektorit või hemaglutiniini (HA) märgistatud konstitutiivselt aktiivset (S9A) mutanti (S9A-GSK3b-HA/pcDNA3) kodeerivad vektorid hankis dr Gail VW Johnson (Birmingham, AL) ja need transfekteeriti kultiveeritud podotsüütidesse. mesangiaalrakud ja tubulaarsed epiteelirakud, kasutades Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA), nagu eelnevalt kirjeldatud.44 Transfektsiooni efektiivsust kontrolliti immunofluorestsentsvärvimise või HA immunoblotimisega 12 tunni pärast. Seejärel koguti rakud ja valmistati ette Western blot analüüsi või muude analüüside jaoks.

RNAi

Kolme hiire kogum, mis koosneb GSK3b-spetsiifilistest väikestest, segavatest RNA dupleksidest – 50-CUUGUCCUGUAGAACUUUCtt-30, 50-AUGAUCCAUUUCCAAUCACtt-30 ja 50-AUACCGCAGUCGGACUAUGtt-30 — kujundati ja sünteesiti vastavalt hiire GSK3b geeni täielikule kodeerivale järjestusele (GenBank registreerimisnumber BC060743.1). Lisaks kasutati RNAi kontrollina segatud väikest segavat RNA järjestust (50-GCGAGUAGCGCUAGGAAGUtt-30), mis ei sarnanenud hiirte, rottide või inimeste teadaolevate geenijärjestustega. Lipofektamiini (Invitrogen, Carlsbad, CA) vahendatud geenivaigistamise efektiivsust hinnati GSK3b immunoblotanalüüsiga. 24 tundi pärast RNAi-d täheldati kultiveeritud podotsüütides, mesangiaalsetes rakkudes ja tubulaarsetes epiteelirakkudes GSK3b valgu ekspressiooni rahuldavat supressiooni. Seejärel allutati rakud normaalsele keskkonnale/kultuurisöötmele, diabeetilisele keskkonnale või kõrge osmolaalsusega kontrollsöötmele 48 tunniks, nagu on kirjeldatud ülal, enne kui rakke töödeldi edasisteks analüüsideks.

Kliinilised uuringud

Selle uuringu kliiniline osa vastas 1975. aasta Helsingi deklaratsiooni eetilistele juhistele ja selle kiitis heaks Zhengzhou ülikooli esimese sidushaigla institutsionaalne ülevaatusnõukogu. Inimuuringutes osalejaid sellesse uuringusse spetsiaalselt ei värvatud. Kõik kliinilised andmed koguti tagasiulatuva diagrammi läbivaatamise ja arhiveeritud koelõikude või kogutud uriiniproovide uurimisega. Zhengzhou ülikooli esimese sidushaigla nefroloogia instituudis on regulaarselt võetud ülemääraseid või äravisatud neerubiopsiaproove, aga ka fraktsioneeritud uriiniproove. Uurimiseks valiti juhuslikult DN-i erinevates staadiumides patsientide arhiveeritud identifitseerimata formaliiniga fikseeritud parafiiniga manustatud neeru biopsia kuded. Täiendavad histomorfoloogiliste kahjustusteta neeruproovid saadi veresoonte anomaaliate tõttu siirdamiseks kõrvale jäetud neerudest või implantatsioonieelsetest biopsia kudedest ja neid kasutati normaalsete kontrollidena. Retrospektiivses kohortuuringus skriiniti tagasiulatuvalt sellesse uuringusse 127 II tüüpi suhkurtõvega patsienti, keda jälgiti alates 2010. aastast fraktsioneeritud uriini proovidega. Uuritud patsiendid olid vanuses 29–80 aastat ja neil diagnoositi Ameerika Diabeediassotsiatsiooni kriteeriumide kohaselt II tüüpi diabeet. Välistamiskriteeriumide hulka kuulusid järelkontrolli kadumine, ebapiisav teave,neeruddüsfunktsioon, or overt proteinuria at baseline, or other superimposed kidney diseases such as acute kidney injury or glomerulopathies. Finally, 60 patients have enrolled in this study for further assessment. All patients had been followed up for >5 aastat. Rutiinse jälgimise käigus dokumenteeriti demograafilised andmed ja kliinilised parameetrid, sealhulgas sugu, vanus, kaasuvad haigused, ravimid, diabeedi kestus, vererõhk, glükeemiline tase, seerumi kreatiniini tase, uriinianalüüsi andmed, AÜE ja eGFR. Kliiniline tulemus pärast 5-aastast jälgimist oli neerukahjustuse progresseerumise olemasolu või puudumine, mida defineeriti kui eGFR-i 25-protsendilist vähenemist või albuminuuria progresseerumist, mida näitab albuminuuria raskuse suurenemine erinevatel kliinilistel etappidel. DN, see tähendab normoalbuminuuria, mikroalbuminuuria, makroalbuminuuria või ilmne proteinuuria. Kõik patsiendid andsid kirjaliku teadliku nõusoleku.

Neerude morfoloogia hindamine ja immunohistokeemia analüüs

Parafiiniga manustatud formaliiniga fikseeritud hiire neerukoe plokid lõigati 3- mm osadeks. Üldise histoloogia jaoks töödeldi sektsioone perioodilise happe-Schiffi värvimiseks. GSK3b ja p-GSK3b immunohistokeemiline värvimine viidi läbi, kasutades VECTASTAIN ABC komplekti (Vector Laboratories, Burlingame, CA), nagu eelnevalt kirjeldatud.20 Negatiivse kontrollina asendati primaarne antikeha sama liigi mitteimmuunse seerumiga; värvimist ei tekkinud. Kõikide sektsioonide morfoloogilisi tunnuseid hindas üks vaatleja neerupatoloogi abiga pimesi.

Immunofluorestsentsvärvimine

Kultiveeritud rakud või külmutatud krüostaadi lõigud fikseeriti ja värviti primaarsete antikehadega ning seejärel rakendati Alexa Fluoriga konjugeeritud sekundaarseid antikehi (Invitrogen). Negatiivse kontrollina asendati primaarsed antikehad sama liigi preimmuunse IgG-ga; värvimist ei tekkinud. Lõpuks värviti sektsioonid 40,6-diamidino-2-fenüülindooli või propiidiumjodiidiga ja paigaldati VECTASHIELD kinnitusvahendiga (Vector Laboratories). FL fluorestsentsmikroskoopia jaoks analüüsiti kõiki sektsioone samal ajal, et välistada fluorokroomi muutuvast lagunemisest tingitud artefaktid. Sektsioone uuriti Olympus FL fluorestsentsmikroskoobiga, mis oli varustatud Spot II digitaalkaameraga (Olympus, Tokyo, Jaapan). Kahevärvilise värvimise jaoks saadi kujutised järjestikku, et vältida värvi segamist. Piltide järeltöötluseks, näiteks skaleerimiseks, ühendamiseks ja kolokaliseerimise analüüsiks, kasutati ImageJ tarkvara (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Arvutipõhine morfomeetria

Immunohistokeemilise värvimise pildid jäädvustati ja digiteeriti arvutipõhise pildianalüüsi süsteemi abil, mis koosnes mikroskoobi (Olympus BX41, Olympus) ja arvutiga ühendatud kõrglahutusega laenguga ühendatud seadme digitaalkaamerast. Pilte kuvati pikslite eraldusvõimega 1024 768 pikslit (ruumiline eraldusvõime, 0,24 mm/piksel). Inimese neerukudede immunohistokeemilise värvimise piltide jaoks kasutati ImageJ tarkvara kujutise segmenteerimiseks, läve määramiseks ja signaali intensiivsuse mõõtmiseks. Vajadusel tehti käsitsi parandusi. Üldiselt võeti morfomeetriliseks analüüsiks proovid 10 glomeruli või 10 juhusliku tubulointerstitsiaalse välja ja lõplikud andmed väljendati integreeritud pikslitiheduse väärtusena kontrollrühma suhtes.

Western immunoblot analüüs

Kultiveeritud rakud lüüsiti;neerudkoedvõi isoleeritud neeruglomerulid homogeniseeriti radioimmunosadestamise analüüsi puhvris, millele oli lisatud proteaasi inhibiitoreid, ja proove töödeldi immunoblotanalüüsiks. Piiratud arvu kooritud rakkude immunoblotanalüüsiks uriinis muudeti Western blot analüüsi, nagu eelnevalt kirjeldatud, kasutades suure jõudlusega NuPAGE Bis-Tris geele (Invitrogen) ja kvaliteetseid ülekandemembraane.25 Rafineeritud immunoblotanalüüs võib tuvastada mõõdukalt ekspresseeritud valke vaid 1000 rakus. GSK3b, fibronektiini, kollageeni IV, aktiini ja glütseraldehüüd{6}}fosfaatdehüdrogenaasi (GAPDH) vastased antikehad osteti ettevõttelt Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); sünaptopodiini vastased ravimid osteti ettevõttelt PROGEN Biotechnik GmbH (Heidelberg, Saksamaa); ning ZO-1 ja p-GSK3b vastased saadi firmalt Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Statistiline analüüs

All in vitro studies were repeated 3 to 6 times. For immunoblot analysis, bands were scanned and the integrated pixel density was determined using a densitometer and the ImageJ analysis program, version 1.48 (National Institutes of Health). Data were expressed as mean -SD or median (interquartile range). All included patients had baseline data. Patients with missing data or lost to follow-up were excluded from this study. Continuous variables were analyzed as appropriate by using the t-test, Mann-Whitney U test, or 1-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Student-NewmanKeuls test if there were 3 comparisons or by the Scheffé test if there were >3 võrdlust. Kategoorilisi andmeid võrreldi rühmade vahel, kasutades hii-ruut testi. Kahe parameetri võimalike seoste uurimiseks kasutati lineaarset regressioonianalüüsi. Viidi läbi ühemõõtmelised Coxi proportsionaalsete ohtude regressioonianalüüsid, et hinnata seoseid asjakohaste muutujate ja neerukahjustuse progresseerumise riski vahel, millele järgnes mitmemõõtmeline analüüs võimalike segajate osas. Viidi läbi ROC kõvera analüüs ja mõõdeti ROC kõverate all olevaid alasid, et analüüsida teatud muutujate võimsust neerukahjustuse progresseerumise ennustamisel diabeediga patsientidel. Mittetavaliselt jaotunud muutujad, nagu AÜE, teisendati logaritmiga, et saavutada Coxi proportsiooni ohtude regressioonianalüüside ROC kõvera analüüside normaalsus. Kõik statistilised analüüsid viidi läbi, kasutades PSS versiooni 22 (IBM Corporation, Armonk, NY). P väärtused<0.05 in2-tailed="" tests="" were="" considered="" statistically="" significant="" in="" all="">

AVALIKUSTAMINE

Kõik autorid ei deklareerinud konkureerivaid huve.

TUNNUSTUS

Osa sellest uuringust esitati suulise ettekandena KidneyWeek 2016: American Society of Nephrology Annual Meeting, 15.–20. novembril 2016 Chicagos, IL. RG-d toetas osaliselt sihtasutus Tervis. XL-i toetas teadusstipendium, et saada vabakoolitust. ZL-i toetas Hiina riiklik loodusteaduste sihtasutus toetustega U1604284, 81770672 ja 81873612. Rahastajatel ei olnud mingit rolli selle uuringu kavandamisel ja läbiviimisel, andmete kogumisel ja tõlgendamisel ega käsikirja ettevalmistamisel ja kinnitamisel.

AUTORI KAASALAD

RG töötas välja kontseptuaalsed ideed. XL, ZL ja RG aitasid kaasa uuringu kavandamisele. XL, PW, BC, YG, AYG ja BF viisid läbi rakukultuuri katsed. XL ja ZL viisid läbi loomkatsed ja kogusid andmeid diabeetikutelt. XL, LJW, DKM, LDD, ZL ning aitasid kaasa arutelule ja tulemuste tõlgendamisele. võttis käsikirja kirjutamise juhtrolli. XL, BC ja BF aitasid kaasa käsikirjade redigeerimisele. Kõik autorid nõustusid, et kogu selle töö kontseptsioon ja omandiõigus kuuluvad RG-le. Kõik autorid kiitsid lõpliku käsikirja heaks.

LISAMATERJAL

Täiendavad meetodid.

Tabel S1. Kontrollobjektide ja diabeetilise nefropaatiaga patsientide omadused, mis on jaotatud diabeetilise nefropaatia histoloogiliste klasside järgi. Tabel S2. Algstaadiumis demograafilised, kliinilised ja laboratoorsed andmed varases staadiumis diabeedihaigete retrospektiivse kohordi kohta, kellel puuduvad DKD tunnused. Tabel S3. Varajases staadiumis II tüüpi diabeediga patsientide demograafilised, kliinilised ja laboratoorsed andmed, mis on jaotatud vastavalt nende neerutulemustele pärast 5-aastast jälgimist. Joonis S1. GSK3b suurenenud neerude aktiivsus ennustab haiguse arengut ja tõsidustdiabeetikneerudhaigusdb/db hiirtel. Isaseid db/db ja db/m hiiri jälgiti vanuses 4 kuni 13 nädalat. (A) 4 ja 7 nädala vanustel hiirtel võeti vereproovid ja analüüsiti plasma glükoosisisaldust. *P < 0.001="" versus="" db/m="" hiired="" 7="" nädala="" vanuselt.="" n="" ¼="" 15–18.="" (b)="" punkti="" uriiniproovid="" võeti="" 4,="" 7,="" 10="" ja="" 13="" nädala="" vanuselt="" ning="" neile="" tehti="" uriini="" albumiini="" ja="" uriini="" kreatiniini="" analüüs,="" et="" määrata="" uriini="" albumiini="" ja="" kreatiniini="" suhe="" (uacr).="" *p="">< 0,001="" vs.="" db/m="" hiirtel="" 10="" nädala="" vanuselt="" (n="" ¼="" 15–18);="" #p="">< 0,001="" võrreldes="" db/m="" hiirtega="" 13="" nädala="" vanuselt.="" n="" ¼="" 15–18.="" (c)="" kõik="" hiired="" said="" 7="" nädala="" vanuselt="" avatud="" neeru="" biopsia="" ja="" biopsiaproove="" töödeldi="" immunoblotanalüüsiks="" p-gsk3b,="" gsk3b="" ja="" gapdh="" jaoks.="" (d)="" immunoblotidele="" viidi="" läbi="" densitomeetriline="" analüüs.="" gsk3b="" ja="" p-gsk3b="" suhteline="" arvukus="" määrati="" vastava="" molekuli="" gapdh="" densitomeetriliste="" suhetena="" kordamiste="" muutustena="" võrreldes="" kontroll-db="" m="" hiirtega.="" gsk3b="" suhteline="" aktiivsus="" arvutati="" p="" gsk3b="" ja="" gsk3b="" suhetena="" kontroll-db/m="" hiirte="" voldikutena.="" (e)="" lineaarne="" regressioonanalüüs="" näitas="" statistiliselt="" olulist="" positiivset="" korrelatsiooni="" neeru="" gsk3b="" aktiivsuse="" vahel="" 7="" nädala="" vanustel="" db/db="" hiirtel="" ning="" albuminuuria="" arengu="" ja="" raskusastme="" vahel,="" mis="">diabeetikneerudhaigus13 nädala vanuselt. R ¼ 0,699; P ¼ 0.{16}}{{20}}1. (F) Vastuvõtja tööomaduskõvera analüüs näitas, et neeru GSK3b aktiivsus diabeedi varases staadiumis (7 nädala vanused) tagab suurepärase täpsuse ja võimsuse albuminuuria ja DKD arengu ennustamisel 13 nädala vanuselt db / db hiirtel. Joonis S2. Insuliiniresistentsus ja kõrge ümbritsev glükoosisisaldus aktiveerivad neerurakkudes sünergistlikult GSK3b. (A) kultiveeritud hiire podotsüüdid, (B) uriini glomerulaarsed mesangiaalrakud (MMC) ja (C) neerutuubulaarsed epiteelirakud (TEC) transfekteeriti segatud siRNA oligonukleotiididega (siCon) või siRNA oligonukleotiididega (siIRb), mis on spetsiifilised b-isovormile. insuliiniretseptor (IRB), et modelleerida insuliiniresistentsuse seisundit in vitro. Seejärel eksponeeriti rakke 48 tunniks normaalse glükoosisisaldusega normaalse miljöö (NG) või kõrge glükoosisisaldusega diabeetilise miljöö (HG) juurde. Rakulüsaadid koguti ja neile viidi läbi immunoblotanalüüs IRB, p-GSK3b, GSK3b ja GAPDH jaoks, millele järgnes blotide densitomeetriline analüüs. *P < 0,01="" versus="" irb="" ekspressioon="" sicon-ga="" töödeldud="" rakkudes,="" mis="" on="" eksponeeritud="" samale="" miljööle="" (n="" ¼="" 3),="" #p="">< 0,05="" versus="" sama="" valgu="" ekspressioon="" siirb="" þ="" ng="" või="" sicon="" þ="" hg="" rühmas="" (n="" ¼="" 3),="" &="" p="">< 0,05="" võrreldes="" sama="" valgu="" ekspressiooniga="" teises="" þ="" hg="" või="" siirb="" þ="" ng="" rühmas="" (n="" ¼="" 3).="" joonis="" s3.="" gsk3b="" mrna="" ekspressioonitasemed="" inimese="" neeruproovides,="" mis="" on="" hangitud="" tervetelt="" doonoritelt="" ja="" diabeetilise="" nefropaatiaga="" patsientidelt.="" andmed="" saadi="" saidilt="" www.nephroseq.org="" ju="" ckd="" glomi="" andmestiku51="" alusel="" ja="" väljendati="" log2="" mediaankeskse="" intensiivsusena.="" joonis="" s4.="" gsk3b="" suurenenud="" aktiivsus="" varases="" staadiumis="" diabeedihaigetelt="" kogutud="" uriiniga="" kooritud="" rakkudes="" ennustab="" diabeetilise="" neeruhaiguse="" teket.="" (a,="" b)="" gsk3b="" ja="" aktiveeritud="" gsk3b="" tuvastamine="" uriini="" kooritud="" rakkudes,="" mis="" on="" kogutud="" varases="" staadiumis="" diabeedihaigetelt="" (pts)="" ja="" tervetelt="" kontrollidelt="" (ctrl).="" uriiniga="" kooritud="" rakud="" koguti="" ja="" lüüsiti.="" rakulüsaate="" töödeldi="" gsk3b,="" p-gsk3b="" ja="" gapdh="" immunoblotanalüüsiks.="" (c)="" immunoblotidele="" viidi="" läbi="" densitomeetriline="" analüüs.="" gsk3b="" ja="" p-gsk3b="" suhteline="" arvukus="" määrati="" vastava="" molekuli="" gapdh="" densitomeetriliste="" suhetena="" kordade="" muutustena="" võrreldes="" kontrollidega="" (ctrls).="" gsk3b="" suhteline="" aktiivsus="" arvutati="" p-gsk3b="" ja="" gsk3b="" suhetena="" normaalse="" kontrolli="" voltidena="" (ctrls).="" (d)="" vastuvõtja="" tööomaduste="" kõvera="" analüüs="" näitas,="" et="" suhteline="" gsk3b="" aktiivsus="" (p-gsk3b/gsk3b="" suhe)="" varases="" staadiumis="" diabeedihaigetelt="" kogutud="" uriiniga="" kooritud="" rakkudes="" tagab="" suurepärase="" täpsuse="" diabeedi="" arengu="">diabeetiline neeruhaigus5 aasta jooksul, kusjuures kõveraalune pindala (AUC) on 0,886.

VIITED

1. Umanath K, Lewis JB. Diabeetilise nefropaatia värskendus: 2018. aasta põhiõppekava. Am J Kidney Dis. 2018;71:884–895.

2. Gregg EW, Li Y, Wang J jt. Diabeediga seotud tüsistuste muutused Ameerika Ühendriikides, 1990-2010. N Engl J Med. 2014;370:1514–1523.

3. Haller H, Ito S, Izzo JL Jr jt. Olmesartaan mikroalbuminuuria edasilükkamiseks või ennetamiseks II tüüpi diabeedi korral. N Engl J Med. 2011;364:907–917.

4. Schena FP, Gesualdo L. Diabeetilise nefropaatia patogeneetilised mehhanismid. J Am Soc Nephrol. 2005;16 (suppl 1):S30–S33.

5. Ritz E, Zeng XX, Rychlik I. Diabeetilise nefropaatia kliiniline ilming ja loomulik ajalugu. Panus Nephrol. 2011;170:19–27.

6. Holman RR, Paul SK, Bethel MA jt. 10-2. tüüpi diabeedi intensiivse glükoosikontrolli aasta jälgimine. N Engl J Med. 2008;359:1577–1589.

7. Perkins BA, Ficociello LH, Ostrander BE jt. Mikroalbuminuuria ja risk varase progresseeruva neerufunktsiooni languse tekkeks I tüüpi diabeedi korral. J Am Soc Nephrol. 2007;18:1353–1361.

8. Koye DN, Magliano DJ, Reid CM jt. Normoalbuminurse kroonilise neeruhaiguse progresseerumise risk lõppstaadiumis neeruhaiguseks diabeediga inimestel: CRIC (kroonilise neerupuudulikkuse kohordi) uuring. Olen J Kidney Dis. 2018;72:653–661.

9. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Diabeetilise nefropaatia riski varajaste ennustajate vajadus: kas albumiini eritumise määr on piisav? Diabeet. 2000;49:1399–1408.

10. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Madal glomerulaarfiltratsiooni määr normoalbuminurse 1. tüüpi diabeediga patsientidel: kaugelearenenud glomerulaarkahjustuste näitaja. Diabeet. 2003;52:1036–1040.

11. Krolevski AS. Progresseeruv neerupuudulikkus: diabeetilise nefropaatia uus paradigma I tüüpi diabeedi korral. Diabeedihooldus. 2015;38:954–962.

12. Robles NR, Villa J, Gallego RH. Mitteproteinaarne diabeetiline nefropaatia. J Clin Med. 2015; 4:1761–1773.

13. Adler AI, Stevens RJ, Manley SE jt. Nefropaatia areng ja progresseerumine II tüüpi diabeedi korral: Ühendkuningriigi tulevane diabeediuuring (UKPDS 64). Kidney Int. 2003;63:225–232.

14. Gluhovschi C, Gluhovschi G, Petrica L jt. Uriini biomarkerid varajase diabeetilise nefropaatia hindamisel. J Diabetes Res. 2016;2016: 4626125.

15. Doi T, Moriya T, Fujita Y jt. Uriini IgG4 ja Smad1 on spetsiifilised biomarkerid neerude struktuursete ja funktsionaalsete muutuste jaoks diabeetilise nefropaatia varases staadiumis. Diabeet. 2018;67:986–993.

16. De S, Kuwahara S, Hosojima M et al. Eksotsütoosi poolt vahendatud uriiniga täispikk megaliini eritumine on seotud diabeetilise nefropaatia patogeneesiga. Diabeet. 2017;66:1391–1404.

17. Xu W, Ge Y, Liu Z jt. Glükogeensüntaasi kinaas 3b dikteerib podotsüütide liikuvust ja fokaalset adhesiooni käivet, moduleerides paxilliini aktiivsust: mõju väikeses annuses liitiumi kaitsvale toimele podotsütopaatia korral. Olen J Pathol. 2014;184:2742–2756.

18. Ali A, Hoefiich KP, Woodgett JR. Glükogeeni süntaasi kinaas-3: omadused, funktsioonid ja reguleerimine. Chem Rev. 2001;101:2527–2540.

19. Beurel E, Grieco SF, Jope RS. Glükogeeni süntaasi kinaas-3 (GSK3): regulatsioon, toimed ja haigused. Pharmacol Ther. 2015;148:114–131.

20. Li C, Ge Y, Dworkin L jt. GSK3 b isovorm vahendab podotsüütide autonoomset kahjustust proteinuurilise glomerulopaatia korral. J Pathol. 2016;239:23.