Osa 2: Kalpastatiin hoiab ära angiotensiin Il-vahendatud podotsüütide kahjustuse autofagia säilitamise kaudu

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Palun klõpsake siin 1. osa juurde

3. osa vaatamiseks klõpsake siin

Angel pluss HSD aktiveerib kalpaiini aktiivsust podotsüütides, mis aitab kaasa autofagia blokaadile

Kuna leiti, et Angel aktiveerib kalpaiini aktiivsust (i) mitmes rakutüübis ja (ii) lõhustab mitmeid autofagiaga seotud valke, mõtlesime, kas AngII pluss HSD-vahendatud autofagia blokaad võib olla tingitud Angli poolt indutseeritud kalpaiini aktiivsuse suurenemisest. Esmalt leidsime, et primaarsed podotsüüdid ekspresseerisid kalpaiinide kolme üldlevinud vormi (joonis 3a). Seejärel näitasime, et AngII stimuleeris kalpaiini aktiivsust primaarsetes podotsüütides. Selle kalpaiini aktiivsuse tõusu blokeeris selektiivne kalpaiini inhibiitor (joonis 3b). Kalpaiinide rolli hindamiseks AngII pluss HSD-vahendatud protsessis kasutasime täiendava kalpastatiini transgeeniekspressiooniga hiirt (mis põhjustab kalpaiini aktiivsuse vähenemist).neerudvigastusja autofagia blokaad. CST'g hiirte primaarsed podotsüüdid näitasid vastusena AngII-le vähenenud kalpaiini aktiivsust võrreldes kontrollhiirte podotsüütidega (joonis 3c). Seega vähendas kalpastatiini üleekspressioon podotsüütides AngII-vahendatud kalpaiini aktivatsiooni.

CistanchetubulosaOn paljumõjusid, lisateabe saamiseks klõpsake siin

Järgmisena hindasime autofagia taset CSTTg hiirte podotsüütides. Genereerisime GFP-LC3 transgeeniga CST hiired. LC3-GFP reporter lubas autofagosoome loendada GFP pluss /P62 pluss punktidena. P62 koguneb rakkudesse agregaatidena, kui autofagiline voog on blokeeritud. Põhiolekus loendasime CST1g GFP-LC3 hiirte podotsüütides vähem GFP pluss P62 pluss punkte (joonis 4a, b ja e) ja vähem P62 akumulatsiooni (joonis 4c, d ja f) kui normaalsete podotsüütides

Joonis 4|Autofagilise voo hindamine kalpastatiini transgeensete (CST9) hiirte podotsüütides. (a, b) Tüüpilised immunofluorestsentspildid rohelise fluorestsentsvalgu (GFP) (roheline) ja P62 (punane) ekspressioonist glomerulites 12-nädala vanustelt GFP-LC3 ja CST'GFP-LC3 hiirtelt. Nooleotsad näitavad GFP pluss P62 pluss autofagosoome. (c, d) Tüüpilised immunofluorestsentspildid P62 (roheline) ja podokalüksiini (PODXL; punane) ekspressioonist 12-nädala vanuste GFP-LC3 ja CST'9 GFP-LC3 hiirte glomerulites. Joonise alaosad, millel on prime, näitavad suuremat suurendust. Tuumad värviti Hoechsti (sinise) värviga. Tulbad=50 μm. (e) LC3 pluss P62 pluss punktide arvu kvantifitseerimine podotsüütide kohta. Mann-Whitney test:**P=0.0065. f) P62 pluss pindala kvantifitseerimine glomerulaarsektsiooni kohta. Mann-Whitney test:*P= 0.0420.In(e,f), n =5 GFP-LC3 hiirt ja n =8 CST'9 GFP-LC3 hiirt. Väärtused on esitatud üksikute graafikute ja keskmisena± SEM. Selle pildi vaatamise optimeerimiseks vaadake selle artikli veebiversiooni GFP-LC3 hiirtel, mis viitab suurenenud autofagilisele voolule kõrge kalpastatiini sisaldusega hiirte podotsüütides.

Autofagilist voogu saab jälgida LC3 tsütoplasmaatilise vormi LC3-I konversiooni mõõtmisega LC3 autofagosomaalselt lõhustatud ja fosfatidüületanoolamiiniga sidestatud vormiks LC3-II Western blot meetodil. . CST hiirte podotsüütidel ilmnes suurenenud LC3-I konversioon LC3-II-ks ja vähenenud P62 ekspressioon nii bafilomütsiin A juuresolekul kui ka puudumisel (joonis 5a ja b), mis näitab suurenenud autofagilist voogu kalpastatiini üleekspressiooniga podotsüütides. Lõpuks oli GFP pluss P62 pluss punktide akumuleerumine podotsüütides pärast klorokiini manustamist CST'g GFP-LC3 hiirtel olulisem kui GFP-LC3 hiirtel, kinnitades seega, et kalpastatiini üleekspressioon kutsub esile autofagilise voo podotsüütides in vivo (joonis 5c). -e). Kokkuvõttes näitavad meie andmed, et AngII stimuleerib kalpaiini aktiivsust podotsüütides, et autofagiat inhibeerib kalpaiin podotsüütides ja et endogeense kalpaiini aktiivsuse pärssimine kalpastatiini üleekspressiooniga on piisav, et stimuleerida autofagilist voogu podotsüütides.

CSTT9 hiired on kaitstud Angel pluss HSD-indutseeritud podotsüütide vigastuse eest

CSTT: hiirtel ei ilmnenud ühtegineerudmuutus kuni vähemalt 12 kuu vanuseni (täiendav joonis S5). Analüüsisime podotsüütide vigastusi CST'号 hiirtel AngII pluss HSD-ravi ajal. Kuigi WT hiirtel tekkis pärast 4-nädalast hüpertensiooni kerge glomeruloskleroos ja podotsüütide vigastus, nagu näitas podokalüksiini ja nefriini ebanormaalne ekspressioon, esines CSTTg hiirtel vähem sklerootilisi glomerulaarseid kahjustusi (joonis 6a).

Joonis 5|Autofagosomaalse lagunemise blokeerimine kinnitas suurenenud podotsüütide autofagilist voogu kalpastatiini transgeensetel (CSTT) hiirtel. (a) LC3 ekspressiooni Western blot analüüs. Sequestosome 1 (SOSTM1)/P62 ja ATG5 primaarsetes podotsüütides metsiktüüpi (W või CST'9 hiirtelt. Tubuliini ekspressioon toimib normaliseerimisena. Podotsüüte töödeldi või ei töödeldud bafilomütsiin A1 (BafA1; 100 nM) 4 tundi enne kultiveerimist (b) LC3-ll/'tubuliini ja P62/tubuliini suhte kvantifitseerimine.n=10 WT hiirt ja n =8 CST'9 hiirt. Väärtused on esitatud üksikute graafikutena ja keskmine ± SEM. Kahesuunaline dispersioonanalüüs, mis on seotud raviga: LC3-ll/tubuliin: genotüüp, P= 0.0008;ravi, P<0.0001; for="" p62/tubulin:="" genotype,="" p="0.0884;" treatment,="">< 0.0001.sidak's="" multiple="" comparison="" test:="" for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus="" wt+=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+bafa1,"*p="0.0028" for="" wt+bafa1="" versus="" cstt9="" +bafa1:for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+="" bafa1.(c,d)representative="" immunofluorescence="" images="" of="" the="" expression="" of="" green="" fluorescent="" protein="" (gfp;="" green)="" and="" p62="" (red)="" in="" glomeruli="" from="" 12-week-old="" gfp-lc3="" and="" cst'9="" gfp-lc3="" mice.="" figure="" subparts="" with="" prime="" indicate="" higher="" magnification.="" nuclei="" were="" stained="" with="" hoechst="" （blue）.="" bars="50" μm.="" mice="" were="" treated="" with="" chloroquine（cq;="" 80="" mg/kg）="" 4="" hours="" before="" killing.="" the="" arrowheads="" indicate="" gfp+="" p62+autophagosomes.="" (e)="" quantification="" of="" the="" number="" of="" lc3+="" p62+="" dots="" per="" podocyte.="" n="5" mice="" per="" genotype.="" values="" are="" presented="" as="" individual="" plots="" and="" mean="" ±="" sem.="" unpaired="" t-test="" with="" equal="" sd:*p="0.0302." to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">neerud-international.org.

Joonis 6| Kalpastatiini üleekspressioon hoiab ära angiotensiin Il (Angel) ja kõrge soolasisaldusega dieedi (HSD) vahendatud podotsüütide kahjustuse. (a, b)

Cistanchevõib leevendadaneeruhaigus

Tüüpilised kujutised Massoni trikroomiga värvitud glomeruli lõikudest metsiktüüpi (WT ja kalpastatiini transgeensed (CST'9) hiirtelt pärast 6-nädalast Angll pluss HSD. Bars=50 um.(c,d,f,g) Tüüpilised immunofluorestsentspildid (c,d) podokalüksiini (PODXL) ja (f,g)nefriini (NPHS1) ekspressioonist WT ja CST'9 hiirtel pärast 6-nädalast Angel pluss HSD ja (e,h) seotud kvantifitseerimist. {8}} um. (ii)

cistanchesaab ravidaäge neerupuudulikkus

Tüüpilised immunofluorestsentspildid Wilmi kasvaja 1 (WT1; roheline) ja PODXL (punane) ekspressioonist WT ja CST hiirte glomerulites pärast 6-nädalast Angel pluss HSD-d ja (k) seotud WT1 pluss rakkude arvu kvantifitseerimist glomerulaari kohta osa. Tuumad värviti Hoechstiga (sinine). Baarid =50 um. Punktis (e,h,k) on väärtused esitatud üksikute graafikutena ja keskmised ± SEM,n =9 WT hiirt ja n=7 CSTTg hiirt. Paaritu t-test võrdse SD-ga:**P =0,0095 tolli (e),*P=0,0249 tolli (h), P=0,7891 tolli (k).

ja b) ja säilinud podokalüksiini ja nefriini ekspressioon (joonis 6c-h). Selliseid erinevusi podotsüütide fenotüübis täheldati etapis, kus podotsüütide tuumade tihedus ei erinenud WT ja hüpertensiivsete CST'g hiirte vahel (joonis 6i-k).

Sarnaselt ilmnesid pärast 6-nädalast hüpertensiooni GFP-LC3 ja CST'1 GFP-LC3 hiirtel podotsüütide vigastusi, kuid kahjustused olid GFP-LC3 hiirtel silmatorkavamad (joonis 7). Uriini albumiini ja kreatiniini suhe oli kõrgem GFP-LC3 hiirtel pärast 4-nädalast AnglI pluss HSD-d (joonis 7a). Podotsüütide arv ei erinenud kahe genotüübi vahel, kuid nefriini ekspressioon vähenes oluliselt rohkem GFP-LC3 (kontroll) hiirtel (joonis 7b-e). Korreleerudes kalpastatiini poolt vahendatud kaitsega, näitas ultrastruktuurne analüüs kerget ja fokaalset podotsüütide jala protsessi kadumist GFP-LC3 hiirtel, keda raviti Angl plus HSD-ga, säilitades paremini CST'g hiirte jala protsessi kadumise, kuigi globaalne kvantifitseerimine. jala protsessid glomerulaarse basaalmembraani (GBM) pikkuse kohta ei olnud statistiliselt erinevad, tõenäoliselt seetõttu, et podotsüütide vigastus on meie mudelis fokaalne ja segmentaalne (joonis 7f-h). Tähelepanuväärne on makrofaagide ja T-lümfotsüütide infiltratsioonneerudei olnud rühmade vahel erinevad (täiendav joonis S6). Kokkuvõttes näitasid need tulemused, et kalpastatiin takistas AngII pluss HSD-indutseeritud podotsüütide vigastusi.

Kalpastatiini üleekspressioon taastab hiirte podotsüütides autofaagilise voo pärast Angel pluss HSD-ravi

Lõpuks mõtlesime, kas kalpastatiini poolt vahendatud glomerulaarne kaitse AngII pluss HSD mudelis on seotud autofagia säilitamisega podotsüütides. Huvitaval kombel hoiti CSTTg ja GFP-LC3 CST'g hiirtel ära AnglI pluss HSD-indutseeritud P62 akumuleerumine podotsüütides (joonis 8a-d), mis näitab, et kalpastatiin takistas podotsüütide autofagia blokeerimist. Pange tähele, et autofagosoomide GFP pluss P62 pluss punktide märgistamise arv oli hüpertensiivsete GFP-LC3 ja GFP-LC3 CST hiirte podotsüütides sarnane, mis viitab sellele, et AnglI pluss HSD kutsus esile pigem podotsüütide autofagilise voo aeglustumise kui täieliku seiskumise. (Joonis 8e-g).

Kalpaiini lõhustumiskoha in silico ennustamine podotsüütide valkudes

Kasutasime mitmeid in silico tööriistu, et ennustada potentsiaalseid kalpaiini sihtmärke podotsüütides (täiendavad tabelid S1 ja S2). Võrreldi kolme veebipõhist andmebaasi: GPS-CCD, 4CaMPDB, 5 ja DeepCalpain. In silico analüüs tuvastas mitu podotsüütide valku, nende hulgas nefriini ja podotsiini, mida kalpaiinid võivad lõhustada. Seega võib kalpastatiini poolt vahendatud glomerulaarkaitse olla seotud kalpaiini ensümaatilise aktiivsuse vähenemisega, mis viib mõne podotsüütide valkude lagunemise vähenemiseni.

Lisaks on vähemalt 3 autofagiaga seotud valku kalpaiinide otsesed sihtmärgid. ATG5 lõhustatakse kalpaiinide poolt, mis põhjustab häireid ATG12-ATG5 kompleksi moodustumisel.57 Kalpaiini inhibiitorite manustamine in vivo takistas ka autofagia valgu Beclin-1 lõhustumist.5"In silico analüüs autofagiaga seotud valkude oletatav lõhustamiskoht toetab hüpoteesi, et kalpaiin võib reguleerida autofagiat autofagia valkude ensümaatilise lõhustamise kaudu.

Endoplasmaatilise retikulumi (ER) ja oksüdatiivse stressi markerite mRNA ekspressioon Angll pluss HSD-ga ravitud hiirte glomerulites

Hindasime endoplasmaatilise retikulumi (ER) stressi ja oksüdatiivset stressi kvantitatiivse PCR abil glomerulites AngII pluss HSD-ravi ajal (tabel 1). Algtasemel ei täheldanud me glomeruli5loxlox hiirtel analüüsitud geenide mRNA ekspressioonis muutusi (täiendav WT ja Nphs2.cre Atg5 jooniselt S7). Pärast 6-nädalast hüpertensiooni, Nphs2 glomerulid. cre Atg5loxlox hiirtel ilmnesid ER stressi ja oksüdatiivse stressi radade geenide erinevad mRNA profiilid koos Sod1, Prdxl, Atf4, Gpxl ja Hsp90b1 suurenenud ekspressiooniga võrreldes WT glomerulitega, mis viitab sellele, et autofagia vähenemine podotsüütides soodustas AngII pluss HSD-indutseeritud ER stress ja oksüdatiivne stress. Seevastu CST hiirte glomerulid näitasid ER stressi ja oksüdatiivse stressi radade mitme geeni allareguleerimist ning mõnede proapoptootiliste geenide ekspressiooni vähenemist (joonis 9).

Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et kalpastatiini üleekspressioon võib vältida glomerulaarkahjustusi, vähendades AngII pluss HSD-indutseeritud ER-i ja oksüdatiivset stressi.

ARUTELU

Käesolevas uuringus näitasime, et AngII pluss HSD-indutseeritud hüpertensiooni korral on podotsüütide autofagia märkimisväärselt alareguleeritud. Lisaks olid Atg5 podotsüütide-spetsiifilise deletsiooniga hiired altid AngI pluss HSD-ga indutseeritud glomeruloskleroosile ja podotsüütide kadumisele, näidates seega, et autofagia podotsüütides takistab hüpertensiivse nefropaatia teket, rõhutades autofagia kriitilist rolli Angl pluss HSD-indutseeritud podotsüütides. vigastus. Raku autofagiat reguleerivate ekstratsellulaarsete stiimulite kohta on vähe teada ja need tulemused heidavad valgust podotsüütide autofagia patofüsioloogilisele regulatsioonile AngII poolt.

Enamiku inimese glomerulopaatiate korral on podotsüütide jala protsesside kadumine proteinuuriat põhjustava glomerulaarkahjustuse tunnuseks. Autofagia mängib tõenäoliselt olulist rolli podotsüütide funktsiooni säilitamisel, kuna nendel lõplikult diferentseerunud rakkudel on kõrge autofagia määr isegi stressi puudumisel. Eelmine uuring näitas, et Angi soodustab autofagiat, tekitades tinglikult immortaliseeritud hiire podotsüütide rakuliinis reaktiivseid hapniku liike.5 Reaktiivsete hapnikuliikide tootmine on tõepoolest autofagia üldine indutseerija paljudes rakutüüpides ja sellise lahknevuse põhjused. leiud on ebaselged. Erinevalt viimasest uuringust kasutasime hiire primaarselt kasvatatud podotsüüte, mis säilitasid podotsiini ja nefriini ekspressiooni ning in vivo lähenemisviise, mitte hiire rakuliine. Kinnitame varasemaid aruandeid, et postmitootilistel podotsüütidel on ebatavaliselt kõrge konstitutiivse autofagia tase. LC3-II suurenenud koguse mõõtmine pärast AngII stimuleerimist lüsosomaalsete inhibiitorite juuresolekul või puudumisel on vajalik määramiseks

kas autofagiline voog on suurenenud või blokeeritud. Varasemad uuringud on selle nähtuse tähelepanuta jätnud.

Siin kasutasime AnglI perfusioonil ja HSD-l põhinevat hüpertensiivset mudelit. Podotsüütidel on ATI-retseptorid ja nad puutuvad kokku vabade filtreeritud peptiididega, nagu AngII1,6,26,61-6 Eeldatakse, et RAAS-i inhibeerimise täheldatud renoprotektiivsed toimed võivad – vähemalt osaliselt – olla tingitud selle podotsüütide blokaadist. -spetsiifiline RAAS. Samuti in vivo uuringud

Cistanchevõib leevendadaneeruhaigus