2. osa: 6-Bromo-indirubiini-3 ′-oksiimi (6-BIO) fibroosivastane toime aktivaatorvalgu-1 (AP-1) ​​reguleerimise kaudu Ja spetsiifilisuse valgu-1 (SP-1) transkriptsioonifaktorid neerurakkudes

1. osa jaoks klõpsake nuppusiin.

3.3. 6-BIO nõrgendab fibroosimarkereid ja fibroosiga seotud signalisatsiooniteid proksimaalsetes tuubulites (HK-2) ja interstitsiaalsetes fibroblastirakkudes (NRK49F)

Järgmisena kinnitasime 6-BIO mõju proksimaalsetele torukujulistele rakkudele ja interstitsiaalsetele fibroblastirakkudele. Me täheldasime GSK3 mRNA ekspressiooni kontsentratsioonist ja ajast sõltuvat vähenemist 6-BIO poolt HK-2 ja NRK49F rakkudes (joonis S2A ja B) ning sellega seotud ECM-i ja EMT-ga seotud valkude ekspressiooni. sisseneerudkamberfibroossamuti vähendati (joon. S2E). Veelgi enam, GSK3 suurenenud ekspressioon nende rakkude TGF-ga kokkupuutel vähenes ka 6-BIO-ravi tõttu (joonis S2C ja D). Joonis fig 3 näitab valgu ekspressioonineerudfibroosmarkerid TGF-ga töödeldud HK-2 ja NRK49F rakkudes. Nagu on näidatud joonisel 3A, suurenes PAI-1 ja CTGF valkude ekspressioon märkimisväärselt vastusena ravile 5 ja 10 ng/ml TGF-iga vastavalt HK-2 ja NRK49F rakkudes. Kuid nende ekspressioon vähenes pärast töötlemist 6-BIO-ga märkimisväärselt (joonis 3B).SMADja MAPK signaaliradasid reguleeriti üles TGF-raviga, mis muudeti 6-BIO-raviga (joonis 4). Järgmisena uurisime TGF-vahendatud signaaliülekandes osalevate AP-1 ja SP-1 transkriptsioonifaktorite ekspressiooni HK-2 ja NRK49F rakkudes. Joonis 4D näitab, et TGF-vahendatud PC-JUN ja PC-FOS suurenemine vähenes vastusena ravile 6-BIO ja JNK inhibiitoriga SP600125 ning domineeriva-negatiivse C-JUN transfektsiooniga. Joonis fig 4E näitab valgu intensiivsuse muutust võrreldes kontrolliga. Lisaks nõrgenes TGF-vahendatud SP-1 taseme tõus märkimisväärselt vastusena ravile 6-BIO ja SP-1 siRNA-ga (joonis 4F). Joonis fig 4G näitab valgu intensiivsuse muutust võrreldes kontrolliga. Need tulemused viitasid sellele, et TGF /SMADja MAPK signaalimist ning transkriptsioonifaktoreid, AP-1 ja SP-1, reguleerib 6-BIO.

3.4. 6-BIO nõrgendab PC-JUN, PC-FOS ja SP-1 valkude tuuma ekspressiooni proksimaalsetes tubulaarsetes ja interstitsiaalsetes fibroblastirakkudes

Joonistel 5A ja B on näidatud PAI-1 ja CTGF lokaliseerimine PC-JUN, PC-FOS ja SP-1 abil. PC-JUN, PC-FOS ja SP-1 punane värvumine näitas nende üleekspressiooni tuumas pärast TGF-ravi; samamoodi näitas PAI-1 ja CTGF roheline värvumine nende üleekspressiooni tsütosoolis. Kuid PC-JUN, PC-FOS ja SP-1 ekspressioonitasemeid vähendas 6-BIO-ravi. Need tulemused näitasid, et 6-BIO mõjutab otseselt AP-1 ja SP-1, PAI-1 ja CTGF ekspressiooni reguleerivaid transkriptsioonifaktoreid.

3.5. 6-BIO nõrgendab PAI-1, CTGF, AP-1 ja SP-1 promootori aktiivsust proksimaalsetes tubulaarsetes ja interstitsiaalsetes fibroblastirakkudes

Järgmisena uurisime, kas 6-BIO inhibeerib PAI-1, CTGF, AP-1 ja SP-1 geenide promootori aktiivsust. PAI-1 ja CTGF promootori aktiivsus suurenes vastusena TGF-ile, kuid vähenes 6-BIO-ravi tõttu (joonis 6A ja B). Veelgi enam, vähenemine oli märkimisväärne, kui rakke töödeldi ainult 6-BIO-ga kui TGF-i juuresolekul. AP-1 ja SP-1 seostuvad PAI-1 ja CTGF promootoritega. Joonistel 6C ja 6D on näidatud AP-1 ja SP-1 promootori aktiivsus. AP-1 ja SP-1 lutsiferaasi aktiivsust suurendas TGF-ravi ja vähendas 6-BIO annusest sõltuval viisil. Joonis fig 6E näitab transkriptsioonifaktori ekspressiooni tuumavalgu ekstraktides. Seega kinnitasime, et PC-JUN, PC-FOS ja SP-1 tuumaekspressioon suurenes vastusena TGF-ravile ja seda pärssis 6-BIO-ravi. Joonis fig 6F näitab valgu intensiivsuse muutust võrreldes kontrolliga. Lisaks näitavad meie tulemused, et 6-BIO toimib promootori transkriptsioonifaktori sidumissaidil, et nõrgendada AP-1 ja SP-1 seondumist. Sama kinnitamiseks viisime läbi in vitro promootori sidumise testi 6-BIO juuresolekul. Tuumavalkude ning PC-JUN, PC-FOS ja SP-1 seondumist nõrgestas 6-BIO lisamine kontsentratsioonist sõltuval viisil (täiendav joonis 3). Need tulemused näitavad, et 6-BIO inhibeerib PAI-1 ja CTGF promootori aktiivsust, samuti AP-1 ja SP-1 funktsioone; seega võib sellel olla terapeutilist potentsiaalineerudfibroos.

4. Arutelu

UUO ja TGF-ga töödeldud rotimudeli kasutamineneerudproksimaalsetest tuubulitest ja interstitsiaalsetest fibroblasti rakuliinidest, näitasime, et 6-BIO-ravi võib nõrgendadaneerudkahju. UUO mudel on obstruktiivse nefropaatia tüüpiline loommudel, mida iseloomustab progresseeruv tubulointerstitsiaalnefibroos[43]. Histopatoloogiline analüüsneerudUUO mudelist saadud koed näitasid, et ECM-i akumuleerumine ja tubulaarne atroofia interstitsiaalses ruumis taastati 6-BIO-raviga. Lisaks kasutades TGF-töödeldudneerudproksimaalsetest tuubulitest ja interstitsiaalsetest fibroblastirakkudest, näitasime, et 6-BIO-ravi võib nõrgendadaneerudkahju. UUO mudelis ja TGF-ga töödeldud HK-2 ja NRK49F rakkudes inhibeeris 6-BIOneerudfibroosmarkerid kui ka MAPK jaSMADsignalisatsiooniteed. Lisaks vähendas 6-BIO-ravi UUO ja TGF poolt indutseeritud PC-JUN, PC-FOS ja SP-1 valkude ekspressiooni, samuti AP{{6 tuumaekspressiooni ja promootori aktiivsust. }} ja SP-1 TGF- -töödeldud HK-2 ja NRK49F rakkudes. AP-1 ja SP-1 transkriptsioonifaktorite pärssimist 6-BIO-raviga on seostatud ECM-i akumulatsiooni pärssimisega, mis põhjustabneerudfibroos. See saavutatakse MAPK ja MAPK allasurumisegaSMADsignaalirajad, mis viivad PAI{0}} ja CTGF ekspressiooni vähenemiseni. Meie tulemused näitavad, et 6-BIO võib olla potentsiaalne terapeutiline aineneerudhaiguste vastu, aga ka ennetamiseksneerudUUO ja TGF põhjustatud kahjustused .

Klõpsake orgaanilise Cistanche neeruhaiguse jaoks

Poolsünteetiline rakku läbilaskev indirubiini derivaat 6-BIO kuulub bis-indoolide perekonda ja esineb looduslikult söödavates magude molluskites ja taimedes [12]. Indirubiin sisaldab molekulisisest vesiniksidet 2-C kaksiksideme O ja N1-H rühma vahel ning teist molekulidevahelist molekulidevahelist vesiniksidet. 6-BIO-l on keemiliselt modifitseeritud struktuur, milles 6-asend on asendatud Br-ga, et ületada indirubiini vähesest vees lahustuvusest tingitud halvad farmakokineetilised omadused [44]. Paljud indirubiinid toimivad ATP-ga konkureeriva seondumise tõttu tsükliinist sõltuva kinaasi (CDK) ja glükogeeni süntaasi kinaasi{{10}} (GSK-3) kahekordsete inhibiitoritena, avaldades rohkem kui {{ 12}}kordne selektiivsus võrreldes CDK5-ga [12]. Lisaks sellele inhibeerib 6-BIO GSK-3 märkimisväärselt selektiivselt IC50 väärtusega 0,005 μM [12]. Mitmete rühmade aruannete kohaselt pärsib 6-BIO täielikult MCF-7 rakkude proliferatsiooni ja blokeerib migratsiooni ligikaudu 75 protsenti kontsentratsioonis 10 μM ning pärsib PDK1 fosforüülimist. See näitas, et 6-BIO sisestati PDK1 sidumistaskusse, et moodustada kolm vesiniksidet koos jääkidega liigendpiirkonnas, ja sidumistasku mahutas hõlpsasti 6-BIO-s olevad täiendavad Br-aatomid [45]. Nende omadustega 6-BIO-d uuritakse kui uut ravimit, mis reguleerib rakuprotsesse, nagu vananemisega seotud põletik, oksüdatiivne stress, rakkude ellujäämine, proliferatsioon ja apoptoos vähi, diabeedi ja degeneratiivsete haiguste korral [46,47 ]. Geeniregulatsiooni ja molekulaarsete mehhanismide uuringud on aga seotudneerudkamberfibrooson vähe. Seetõttu püüdsime uurida, kas 6-BIO on nõrgenenudneerudfibroosinhibeerides PAI-1 ja CTGF geeni regulatsioonineerudrakke, vähendades seeläbi ECM-i kogunemist.

Mitmed uuringud on kasutanud UUO mudelit, et teatada korrelatsioonist ECM-i akumulatsiooni ja kroonilise vahelneerudtubulaarse interstitsiaalse põhjustatud haigusfibroos[43]. Veelgi enam, üleekspresseeritud PAI-1 ja CTGF on väidetavalt seotud kõrge ECM-i kogunemisega kroonilise haiguse progresseerumise ajal.neerudhaigus. Seega on tõhusaks inhibeerimiseks oluline tuvastada terapeutiline molekul, mis pärsib geenide signaaliülekannet ja transkriptsiooni, mis on seotud suurenenud ECM-i akumulatsiooniga.neerudfibroos. Seetõttu hindasime selles uuringus 6-BIO-d, ühte glükogeeni süntaasi kinaasi 3 (GSK-3) inhibiitorit.neerudfibroos.

Uurisime PAI{0}} ja CTGF-i valkude mõjuneerudkamberfibroosja kinnitas, et nende ekspressiooni reguleerisid tavalised transkriptsioonifaktorid AP-1 ja SP-1. Transkriptsioonifaktor AP-1 on heterodimeer, mis koosneb JUN-i (C-JUN, JUNB ja JUND), FOS-i (C-FOS, FOSB, Fra-1 ja Fra{) kuuluvatest valkudest {6}}), ATF (aktivatsiooni transkriptsioonifaktor) ja JDP (JUN dimerisatsioonivalgu) perekond [48]. See reguleerib mitmeid rakuprotsesse, nagu rakkude proliferatsioon, surm,

diferentseerumine ja vaskularisatsioon. Varasemas uuringus teatati, et VI tüüpi kollageeni ja fibroblastide aktiveerimine suurendab AP{0}} aktiivsust maksas ja kopsudes [49,50]. AP-1 kaks põhikomponenti, C-JUN ja C-FOS, reageerivad mitmesugustele stiimulitele, nagu tsütokiinid, kasvufaktorid ja stress [51]. Me täheldasime C-JUN ja C-FOS suurenenud fosforüülimist UUO rotimudelis ja TGF-ga töödeldud HK-2 ja NRK49F rakkudes (joonised 2D ja 4D). C-JUN ja C-FOS moodustavad heterodimeere ja seonduvad DNA-s AP-1 sidumissaidiga, toimides seeläbi transkriptsioonifaktoritena, et reguleerida teiste geenide ekspressiooni. Lisaks aktiveerib ERK1/2 ja JNK fosforüülimine vastavalt C-FOS ja C-JUN. Meie uuringus suurenes ERK1 / 2 ja JNK, samuti C-JUN ja C-FOS fosforüülimine tuumas märkimisväärselt vastusena ravile TGF-ga. Kuid 6-BIO-ravi muutis need mõjud märkimisväärselt ümber. Meie uuring näitas, et 6-BIO pärssis tõhusalt ERK1/2 ja JNK fosforüülimist ning vähendas transkriptsioonifaktori AP-1 aktiivsust, inhibeerides seeläbi selle allavoolu C-JUN ja C-FOS fosforüülimist. efektorid. SP-1 inhibeerimine maksa astrotsüütides avaldabfibroosivastanemõju [52]. Teine uuring näitas, et SP-1 mängis olulist rollifibroos[52,53]. Seetõttu hindasime, kas 6-BIO võib pärssida transkriptsioonifaktorit SP-1. Me täheldasime, et SP-1 valgu ekspressioon suurenes vastusena TGF-ravile ja ka UUO mudelis, samas kui see vähenes pärast 6-BIO-ravi. Veelgi enam, 6-BIO-ravi pärssis TGF-i poolt indutseeritud SP-1 tuuma ekspressiooni. Selle tulemusena vähenes 6-BIO-ga töötlemine ka PAI-1 ja CTGF-i, millel on AP-1 ja SP-1 sidumissaidid, promootori aktiivsus (joonis 6). ). Seetõttu viitavad need leiud sellele, et PAI-1 ja CTGF promootori aktiivsuse vähenemine 6-BIO-raviga vähendas PAI-1 ja CTGF valgu ekspressiooni ning vähendas ECM-i akumulatsiooni, vähendades seeläbineerudkamberfibroos.

5. Järeldus

6-BIO-ravi vähendas PAI-d{1}} ja CTGF-i ekspressiooni UUO mudelis ja ravitud TGF-iganeerudrakud. Lisaks inhibeeris 6-BIO TGF-indutseeritud aktiveerimistSMADja MAPK signaaliülekanne, inhibeerides samas ka AP-1 ja SP-1 aktiivsust, mis on kaks mitmest transkriptsioonifaktorist, mis seonduvad PAI-1 ja CTGF geenide promootoritega. AP-1 ja SP-1 inhibeerimine näib olevat üks peamisi mehhanisme, mille abil 6-BIO inhibeeribneerudfibroos. Seega näitavad meie tulemused, et 6-BIO võib olla potentsiaalne raviaine selle vastuneerudhaigused.

CRediT autorluse panuse avaldus

Jung Sun Park: kontseptualiseerimine, metoodika, andmete kureerimine, kirjutamine – algse mustandi ettevalmistamine, kirjutamine – läbivaatamine ja toimetamine, visualiseerimine, rahastamise hankimine. Teoses Ae Jung: Andmete kureerimine, kirjutamine – ülevaade ja redigeerimine. Hong Sang Choi: andmete kureerimine, kirjutamine – ülevaatamine ja redigeerimine. Dong-Hyun Kim: metoodika, andmete kureerimine. Hoon In Choi: metoodika, andmete kureerimine. Eun Hui Bae: kirjutamine – arvustus ja toimetamine, juhendamine. Seong Kwon Ma: kirjutamine – arvustus ja toimetamine,

6. Viited

Allikas pärineb Jung Sun Parkist et al., Biomedicine & Pharmacotherapy 145 (2022) 112402