1. OSA Cistanche Deserticola kvaliteedimuutuste ja keskkonna regulatiivne seos kolmes mulla mikrobioomi analüüsil põhinevas ökotüübis

Keskkond mõjutab mulla mikrobioomi koostist ja funktsiooni, mis kaudselt mõjutab taimede kvaliteeti. Selles uuringus kasutati 16S amplikoni sekveneerimist, et paljastada erinevusedmulla mikroobide kogukonna koosseisCistanche deserticolakolmes ökotüübis (soolalahus-leeliseline maa, rohumaa ja liivane maa). mikroobide kogukonna arvukuse korrelatsioonianalüüsi, fenüületanoidi glükosiidi sisu ja ökoloogiliste tegurite, mikroobide kogukonna regulatiivse seose ja kvaliteedi varieerumise kauduC. deserticolaSee oli seletatud. mulla mikrobioomi metaboolse funktsiooni profiili ennustati Tax4Funi abil. Andmed näitasid, et kolme ökotüübi mulla mikroobide kogukonnad olid oluliselt erinevad (AMOVA, P< 0.001),="" and="" the="" alpha="" diversity="" of="" the="" grassland="" soil="" microbial="" community="" was="" the="" highest.="" core="" microbiome="" analysis="" demonstrated="" that="" the="" soil="" microbial="" communities="" of="">C. deserticolaneil oli enamasti põud, soolataluvus, leelisekindlus ja stressitaluvus, nagu mikrokokkad ja bacillales. Biomarkerid, nimelt okeanošpirillid (soolalahus-leeliseline maa), Sphingomonadales (rohumaa) ja propionibakterid (liivane maa), suudavad eristada kolme ökotüüpi mikroobide kogukonda, kaevati välja LEfSe ja juhusliku metsa kaudu. Korrelatsioonianalüüsi tulemused näitasid, et 2′-atsetüülakteosiidi korreleerub positiivselt okeanospirilliilidega soolalahuses-leeliselises pinnases. Metaboolsete funktsioonide profiilid näitasid väga rikastatud ainevahetust (süsivesikute ja aminohapete ainevahetust) ja keskkonnateabe töötlemist (membraani transport ja signaaliülekanne) radu. üldiselt leiti, et mulla mikrobioomide koostis ja funktsioon on olulised tegurid, mis aitavad kaasaC. deserticolaerinevates ökotüüpides. See töö andis uue ülevaate keskkonna, mulla mikroobide kogukonna ja taimede kvaliteedi varieerumise regulatiivsetest suhetest.

Lisainfo:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola'l on palju efekte, klõpsake siin, et rohkem teada saada

Cistanche deserticolaon mitte-fotosünteetiline parasiittaim, mis võib kasvada kuivades elupaikades, nagu liivane maa ja kuiv jõekraav, samuti stressirohketes tingimustes, nagu soolalahus-leeliseline maa1. See taim parasiteeriti psammofüüdi Haloxylon ammodendroni juurtel, mis näitab tugevat vastupidavust karmidele keskkonnatingimustele2. Taimed tuginevad toitainete saamiseks juurte ja mikroorganismide vahelisele heale vastasmõjule, soodustavad kasvu ja seisavad vastu välisele stressile3. Samal ajal reguleerib mulla mikrobioom makroelementide, mikrotoitainete ja muude taimede kasvuks oluliste elementide biogeokkeemilist tsüklit4. Kuid seosC. deserticolaja risosfääri mulla mikroorganismid jäävad ebaselgeks. Järelikult, esitades risosfääri mulla mikrobioomiC. deserticolaSee on vajalik.

C. deserticolaseda kasutatakse sageli Ida-Aasias, Kesk-Aasias, Põhja-Aafrikas ja teistes riikides mingi toidu- ja tervishoiuravimina mälu parandamiseks, seksuaalse funktsiooni parandamiseks ja maksa kaitsmiseks5,6. Peamised toimeainedC. deserticolaon fenüületanoidi glükosiidid (PhG), iridoidid, lignanid ja polüsahhariidid. Nende komponentide hulgas on phG-d aktiivsed komponendid7. Varasemas uuringus teatati, et phG-de sisaldus erinevates ökotüüpidesC. deserticolamärkimisväärselt difereeritud, mille hulgast 2′-atsetüülaktteosiidi võib kasutada keemilise markerina, et eristadaC. deserticolatoodetud Xinjiangis ja Sise-Mongoolias1. Mikroobide kogukondade uuringud on näidanud, et mikroobide kogukonnad saavad reguleerida oma peremeesorganismide ainevahetust8,9. Seetõttu võrreldakse mikroobide kogukonna ja metaboliitide vahelist seost risosfääri pinnasesC. deserticolaerinevates ökotüüpides on hädasti vaja.16 Mikroobide koosluste mitmekesisuse uurimiseks on läbi viidud taimede risosfääri mullaproovide amplikon sekveneerimine, mis annab uue ülevaate taimede ja mulla mikroobide kogukondade vahelistest suhetest10,11. Näiteks endofüütiliste seente leviku ja dünaamika seost C. songaricumi ja N. tangutorumwasiga uuriti mikrobioomi uuringutes, kasutades suure läbilaskevõimega sekveneerimist11. Selles uuringus viisime läbi 16S rRNA amplikonse sekveneerimise, et saada mulla mikrobioomidC. deserticolaErinevates ökotüüpides. Samuti võrreldi mulla mikroobide kogukonna erinevusi erinevates ökotüüpides ning kaevati välja biomarkerid, mis suutsid eristada kolme ökotüüpi. Seejärel arvutati korrelatsioonianalüüs peamise mikroobide kogukonna arvukuse, PHGde sisu ja ökoloogiliste tegurite kohta ning uuriti regulatiivseid suhteid. Lõpuks, mulla mikrobioomide funktsioonC. deserticolaennustati erinevaid ökotüüpe.

Materjalid ja meetodid

Uuringukoha kirjeldus ja proovide võtmine.Päevakorra uurimiste kohaseltC. deserticolasellel on kolm peamist ökotüüpi, sealhulgas soolalahus-leeliseline maa, rohumaa ja liivane maa. 2017. aasta aprillis kogusime mullaproove, mis esindasid peamisi ökotüüpeC. deserticolaHiinas. Soolalahuse-leeliselisemaa mullaproovid koguti Ebinuri järvest (AB1, AB2, AB3) ja Xinjiangi provintsis asuvastBaichengi rannast (BJ1, BJ2, BJ3, BJ4, BJ5). Rohumaa pinnaseproovid võeti Xinjiangi provintsiS asuvast Tula külast (TL1, TL2, TL3, TL4, TL5). Sandy maa mullaproovid koguti Alxalt (AL1, AL2, AL3, AL4, AL5, AL6) Sise-Mongoolia provintsis ja Minqini maakonnast (GS1, GS2), Changchengi maakonnast (GS3, GS4) Gansu provintsis. Kõikide proovivõtukohtade pikkus-, laiuskraadi- ja kõrgusteave on esitatud tabelis 1 ja joonisel 1. Päevavalguse kohas kasutasime roostevabast terasest silindrilist külvikut läbimõõduga 5 cm, et koguda pinnas, mis asub mahlakas varre kõrval.C. deserticolaja selle peremeesorganismi ning immedi- ately ladustatud kaasaskantavas külmkapis temperatuuril –20 °C. Pärast laborisse transportimist juhiti mullaproovid läbi 2 mm sõela, et eemaldada taimekuded, juured, kivimid jne, ning neid hoiti enne karusnahakatseid külmkapis temperatuuril –20 °C.

DNA ekstraheerimine ja 16S rRNA sekveneerimine.Mulla DNA ekstraheeriti PowerSoili DNA isolatsioonikomplekti (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA) abil, järgides käsiraamatut12. Genoomse DNA puhtust ja kvaliteeti kontrollis 0,8% agaroosgeelide elektroforeesi ja nanodroopiga.

Bakteriaalse 16S rRNA geeni V3-V4 hüpervarieeritav piirkond võimendati praimeritega 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) ja 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT)13. Iga mullaproovi puhul lisati edasi- ja pöördkrundi 5′ otsale 10-kohaline vöötkoodide jada (Allwegene Company, Peking)12. PCR viidi läbi mastercycler gradiendil (Eppendorf, Saksamaa), kasutades 25 μl reaktsiooni vol- umes, mis sisaldas 12,5 μl KAPA 2G Robust Hot Start Ready Mix, 1 μl edasi kruntimist (5 μM), 1 μl pöördkrundi (5 μM), 5 μl DNA-d (kogumassi kogus on 30 ng) ja 5,5 μl H2O. Jalgrattasõidu parameetrid on järgmised: 95 °C 5 minutit, millele järgneb 28 tsüklit 95 °C 45 s puhul, 55 °C 50 s ja 72 °C 45 sekundil, kusjuures loomulik pikendus on 72 °C juures 10 minutit. Reaktsioonitaseme PCR-i eelarvamuste leevendamiseks koondati kolm PCR-toodet valimi kohta. PCR-tooteid puhastati QIAquick Gel Extraction Kiti abil (QIAGEN, Saksamaa) ja seejärel kvantifitseeriti reaalajas PCR14 abil.

Sügav sekveneerimine viidi läbi MISeq platvormil Allwegene Companys (Peking). Pärast käivitamist viidi illumiinianalüüsi torujuhtme versiooni 2.614 abil läbi pildianalüüs, baaskõne ja veahinnang.

Cistanchetubulosa võib vananemisvastane

Andmeanalüüs.Toorandmed vaadati põhjalikult läbi ja järjestused eemaldati järgmiste kõrvalnähtude põhjal: jadad, mis olid lühemad kui 200 bp madala kvaliteediskooriga (≤20) ja sisaldasid mitmetähenduslikke aluseid või ei vastanud kruntide järjestustele ja vöötkoodi siltidele15. Qualifed näidud eraldati proovispetsiifiliste vöötkoodide järjestuste abil ja kärbiti Illumina analüüsitoru versiooniga 2.6. Seejärel analüüsiti andmekogumeid QIIME abil. Järjestused koondati operatiivseteks taksonoomilisteks üksusteks (OTUd) sarnasustasemel 97%16, et luua haruldasi kõveraid ning arvutada rikkuse ja mitmekesisuse indeksid. Tööriista Ribosomal Database Project Classifer kasutati kõigi järjestuste liigitamiseks erinevatesse taksonoomilistesse rühmadesse15. Klastrite analüüsid moodustati iga proovi OTU teabe põhjal, kasutades R-i, et uurida diferentsete proovide sarnasust17. Iga proovi mikroobide kogukondade vaheline Maatriks UniFracdistances arvutati Tayci koefcient abil ja seda kujutati kaalumata paarirühma meetodina aritmeetilise keskmise klastripuuga, mis kirjeldab erinevust (1-sarnasust) mitme proovi vahel18. Selle analüüsi käigus loodi ka Newick-formaadis puu fle. Alfa-mitmekesisust rakendati liikide mitmekesisuse keerukuse analüüsimisel proovi puhul, kasutades nelja indeksit, sealhulgas Chao1, täheldatud liigid, fülogeneetiline mitmekesisus (PD) terve puu ja Shannoni mitmekesisuse indeks. Need indeksid arvutati QIIME tarkvara (Boulder, CO, USA) abil Pythonis (v.1.8.0) (La Jalla, CA, USA)19. Beeta mitmekesisuse analüüsi kasutati proovide erinevuste hindamiseks liikide keerukuse osas. Beeta mitmekesisus arvutati QIIME20 põhikoordinaatide analüüsi (PCoA) ja klastrianalüüsi abil. Molekulaarse dispersiooni (AMOVA) analüüs viidi läbi mothuri abil. EdgeR-i kasutati OTU diferentseerumise arvutamiseks rühmade vahel. Heatmap.2 kasutati soojuskaardi joonistamiseks, samas kui Ggploti kasutati Manhattani kaardi joonistamiseks.

Biomarkeri ja tuuma mikrobioomi määramine.Biomarkeri mikrobioomi määramiseks kasutati mikrobioomi määramiseks lineaarset diskrimineerivat analüüsi (LDA) ja run-dom forest (RF) meetodeid Mikrobioomi analüütikute veebisaidil21.

Veebisait teostab kõigepealt mitteparameetrilist faktoriaalset Kruskal-Wallis sum-rank testi, et tuvastada märkimisväärse diferentse arvukusega tunnused, võttes arvesse eksperimentaalset tegurit või huvipakkuvat klassi, millele järgneb LDA, et arvutada iga diferentiaalselt rikkaliku omaduse väljatõmbe suurus21. Funktsioone peetakse oluliseks nende korrigeeritud p-väärtuse põhjal. Vaikimisi adj.p-väärtuse vähendamine = 0,05. RF-analüüs viiakse läbi juhusliku Foresti paketi5 abil. RF on järelevalvega õppealgoritm, mis sobib suuremõõtmeliseks andmeanalüüsiks. Selles meetodis kasutatakse klassifikatsioonipuude ansamblit, millest igaüks kasvatatakse juhusliku funktsioonivaliku kaudu bootstrapi proovist igas harus22. Mikrobioomi põhianalüüs võeti mikrobioomi analüütiku poolt R-paketi mikrobioomi põhifunktsioonist vastu

peamiste mikroobide kogukondade korrelatsioonianalüüs, phG-de sisaldus ja ökoloogilised tegurid.C. deserticola kolme ökotüübi seitsme fenüületanoidi glükosiidi (PHG) sisu, nimelt echinakosiid, tsistanosiid A, aktiosiid, isoatseosiidi, 2′-atsetüülakteosiidi, tubulosiidi A ja tsistanosiidi F, sisu määrati HPLC kaudu. Kromatograafilised tingimused hõlmavad vee C18 kolonni (150 mm × 3,9 mm, 4,6 μm) ning liikuv faas koosneb atsetonitrioolist ja 0,2% sipelghappest. Kromatograafilised seaded olid järgmised: 0–10 min, 10% →15% A; 10–30 min, 15% →40% A. Fow määr oli 1 ml / min. Neeldumis lainepikkus, sissepritsemaht ja kolonni temperatuur olid vastavalt 330 nm, 10 μL ja 27 °C. Metoodikauuring viitab võrdlusrühma esialgsele katsetööle1.

Selles uuringus koguti 16 meteoroloogiajaama kolme ökoloogilise tüübi lähedal, misC. deserticolaXinjiang Bole 51238, Tacheng 51133, Tori 51241, Karamay 51243, Buxail 51156, Yumin 51137, Emin

51145, Gansu Minqin 52681, Yongchang 52674, Wuwei 52679, Gulang 52784, Sise-Mongoolia Suikou 53419, Hangjinhouqi 53420 ja Wuhai 53512. Seitsme kliimateguri andmed aastatel 1981–2010 olid järgneva korrelatsioonianalüüsi klimatoloogiliste tegurite andmed.

Diferentiaalsete metaboliitide ja bioklimaatiliste tegurite koondamisanalüüs viidi läbi Canoco 5 tarkvara23 abil. Pearsoni korrelatsiooni coefcient arvutati biomarkeri mikrobioomi arvukuse, ühendite telgi ja ökoloogilise teguri andmete integreerimise kohta. Selles uuringus viidi log2 andmete teisendamine enne analüüsi ühtlaselt läbi. SPSS-i kasutati Pearsoni korrelatsiooni arvutamiseks, mis koosnes kuuest biomarkerist, kuuest tuuma mikro-bioomist, seitsmest peamisest C. deserticola aktiivsest komponendist ja ökoloogilistest teguritest kolmes elupaigas, ning sõelumisstandard oli järgmine: pearsoni korrelatsiooni koefitsientne (r) >0,5 ja p väärtus< 0.05.="" the="" relationships="" amongst="" the="" above="" factors="" were="" visualised="" using="" cytoscape24="" (the="" cytoscape="" consortium,="" san="" diego,="" ca,="" usa,="" version="" 3.7.0)="" and="" pheatmap="" (r="">

Mikrobioomi mikroobsete funktsionaalsete valdade ennustamine.Tax4Fun25 (R-pakett, http:// tax4fun.gobics.de/) kasutati mikrobioomide mikroobsete funktsionaalsete valdade ennustamiseks mullaproovides. Mulla mikrobioomi OTU Biom tabelit kasutati C. deserticola mullaproovide metagenoomi imputeerimise sisendfoolina. Seejärel analüüsiti prognoositud geeniklasside arvukust KEGG Orthology (KO) rühma 3. tasemel. Tax4Funi tulemusi analüüsiti paketis doBy (R)26.

Tulemused

Mikroobide kogukonna koosseis.16S rRNA sekveneerimise tulemuseks oli 834 323 toorest lugemist, millest 522 929 läbis kvaliteedi ja pikkuse. Andmekogum koosnes 20 511–48 337 (keskmine: 33 994) järjestust valimi kohta. Kvaliteetsed näidud koondati, kasutades >97% järjestuse identiteeti 3541 mikroobseteks OTUdeks (tabel 1).

Mikroobide kogukond liigitati üldiselt 19 phyla, 46 klassi ja 87 klassi (joonised 2a,b ja S1–S3). Füülitasandil domineerisid soolalahuses leelisemaal Actinobacteria (35%), Proteobacteria (31%) ja Firmicutes (15%). Rohumaal domineerisid Actinobacteria (37%), Proteobacteria (29%) ja Bacteroidetes (9%). Liivasel maal domineerisid Actinobacteria (42%), Proteobacteria (33%) ja Firmicutes (6%). Klassitasandil domineerisid soolalahuse-leelisemaal Actinobakterid (25%), Gammaproteobacteria (21%) ja Bacilli (15%), samas kui Actinobacteria (22%), Alphaproteobacteria (16%) ja Bacilli (8%) domineerisid rohumaadel. Liivasel maal domineerisid Actinobacteria (23%), Alphaproteobacteria (20%) ja Gammaproteobacteria (9%). Tellimuse tasandil (joonised 2c–e) domineerisid soolalahuse-leelisemaal mikrokokid (22%), okeanospiriilid (15%) ja bacillales (15%). Rohumaadel domineerisid mikrokokid (11%) ja Bacillales (8%). Seega olid kõige domineerivamad bakteriaalsed tellimused mikrokokid (10%) ja Acidimicrobiales (7%).

Mullabakterite mitmekesisus kolmes C. deserticola ökotüübis.Valimisisese mitmekesisuse (α mitmekesisuse) mõõtmised näitasid kolme elupaiga hulgas mitmekesisuse kaldepunkti (joonis 2f ja tabel S1). Iga proovi mullabakteriaalse mikroobide kogukonna alfa-mitmekesisust hinnati kogukonna rikkuse (Chao 1, mida väljendati OTU prognoositud koguarvuna igas proovis), vaadeldud liike, PD tervet puud ja Shannoni mitmekesisuse indeksit. Vaadeldud liigid, Chao 1 ja PD kogu puu indeks näitasid, et rohumaade mullakooslustel oli kõrgeim α mitmekesisus, samas kui soolalahuse-leeliseliste ja liivaste muldade α mitmekesisus on sarnane. Rööbastee kõverate tulemused (joonis. S1) on sarnased ülaltoodud tulemustega.

Acteosideincistancheavaldada head mõjuneer

AMOVA tulemused (tabel S2) näitasid, et p< 0.001,="" which="" indicates="" a="" signifcant="" diference="" amongst="" the="" three="" habitats.="" the="" bray="" distance="" diversity="" tree="" clustering="" results="" (fig.="" s2)="" of="" the="" three="" habitat="" soil="" samples="" demon-="" strated="" that="" the="" saline-alkali="" soil="" samples="" were="" closely="" clustered,="" and="" the="" distance="" between="" the="" grassland="" and="" sandy="" soil="" samples="" was="" close.="" the="" results="" of="" the="" unconstrained="" pcoas="" of="" unweighted="" unifrac="" distance="" 2d="" plots="" (fig.="" 2g)="" showed="" that="" the="" diferent="" soil="" samples="" of="" bacterial="" microbial="" community="" from="" diferent="" habitats="" were="">

kolme c. deserticola ökotüübi mullabakteriaalsete koosluste võrdlus.Erinevad OTU arvukuse soojuskaardid ja vulkaanikaart (joonis 3b, e,d,h ja tabel S3) näitasid, et võrreldes liivaste maaproovidega rikastati ja ammendati soolalahuse-leelisemaal vastavalt 24 ja 17otlit korralisel tasandil. Lisaks rikastati ja ammendus rohumaal võrreldes liivaste maaproovidega vastavalt 8 ja 11 OTU-d. Venni diagramm (joonis 3c,f) illustreeris, et liivasel maal oli ammendunud 216 OTU-d, soolalahuses leelis 8

maa ja 1 OTÜ kattusid soolalahuse-leeliseliste ja liivaste maade vahel. Lisaks rikastati 3 börsiväliselt rohumaal, samas kui 161 rikastati liivasel maal, sealhulgas 6 börsiväliselt, mis kattusid rohumaa ja liivase maa vahel. Manhattani krundid (joonis 3a) näitasid, et Xanthomonadale'id olid soolalahuse-leeliselisel maal rikastatumad ja ammendunud kui liivasel maal, samas kui Xanthomonadaceae bakter WWH73, WD2101 mullarühm, Vibrionales ja Verrucomicrobiales olid märgatavalt ammendunud tellimuse tasandil. Võrreldes rohumaad liivase maaga, olid Xanthomonadales, WD2101 mullarühm, Vibrionales ja Verrucomicrobiales märgatavalt ammendunud.

Cistanchedeserticolal on ravile palju mõjuDiabeet

Biomarkeri ja tuummikrobioomi määramine C. deserticola kolmes ökotüübis.LEfSe ja RF (joonis 4a, b,d) meetodeid kasutati selleks, et tuvastada funktsioone, millel on märkimisväärne diferentseeriv arvukus kogu mullaproovides, arvutada iga diferentiaalselt rikkaliku omaduse efekti suurus ja määrata biomarkeri bakteriaalne mikrobioom kolmes elupaigas tellimuse tasandil. Tabelis S4 esitatud tulemused näitasid, et okeanospirillaalide, bacillales'i ja flavobakterite LDA skoor oli soolalahuse-leeliselise maa seas kõrgeim, samas kui Sphingomonadales, Gaiellales, Rubrobacterales, Burkholderiales ja Sphingobacteriales oli rohumaade seas kõrgeim. Liivasel maal domineerisid Propionibacteriales, Rodopillales, Solirubrobacterales, Rhizobiales, Xanthomonadales ja Pseudonocardiales LDA skoor. Kui välja arvata mittevajalikud ja dubleeritud tellimused, liigitati need börsivälised organisatsioonid kuueks klassiks ja nende arvukus tõmmati kuumakaardile (joonis 4c).

Püsivusmeetod võeti kasutusele R-paketi mikrobioomi põhifunktsioonist, et tuvastada tuummikmikmikrobioom kolmes C. deserticola ökotüübis. See põhiline bakteriaalne mikrobioom sisaldas kuut tellimust, sealhulgas mikrokokid, bacillales, rhizobiales, Acidimicrobiales, Streptomycetales jaSphingomonadales. Määratlemata ja dubleerimata tellimuste väljajätmisega liigitati need börsivälised organisatsioonid kuueks klassiks ja nende arvukus tõmmati soojuskaardile (joonis 2h).

Püsivusmeetod võeti kasutusele R-paketi mikrobioomi põhifunktsioonist, et tuvastada tuummikmikmikrobioom kolmes C. deserticola ökotüübis. See põhiline bakteriaalne mikrobioom sisaldas kuut tellimust, sealhulgas mikrokokid, bacillales, rhizobiales, Acidimicrobiales, Streptomycetales jaSphingomonadales. Määratlemata ja dubleerimata tellimuste väljajätmisega liigitati need börsivälised organisatsioonid kuueks klassiks ja nende arvukus tõmmati soojuskaardile (joonis 2h).