1. osa|Glükogeeni süntaasi kinaas 3b hüperaktiivsus uriini kooritud rakkudes ennustab diabeetilise neeruhaiguse progresseerumist

Xianhui Liang jt

1 Verepuhastuskeskus, nefroloogiainstituut, Zhengzhou ülikooli esimene sidushaigla, Zhengzhou, Hiina; 2 Meditsiini osakond, neeruhaiguste ja hüpertensiooni osakond, Rhode Islandi haigla, Browni ülikooli meditsiinikool, Providence, RhodeIsland, USA; ja 3 meditsiiniosakond, nefroloogia osakond, Toledo ülikooli meditsiinikolledž, Toledo, Ohio, USA

Lisateabe saamiseks võtke ühendust:emily.li@wecistanche.com

Cistanche tubulosa hoiab ära neeruhaiguse, proovi saamiseks klõpsake siin

Kasvavad tõendid näitavad, et glükogeeni süntaasi kinaas (GSK) 3b on võtmemängija erinevatesneeruhaigused. Insuliini signalisatsiooniraja pöördelise muundurina on aga GSK3b roll diabeetikutel.neerud haigusjääb ebakindlaks. DB / DB hiirtel suurenes kogu ja aktiveeritud GSK3b neerude ekspressioon üha enam. See eelnes diabeedi tekkeleneerud haigusja korrelatsioonis sümptomite progresseerumisegadiabeetikneerudvigastused, sealhulgas albuminuuria ja ekstratsellulaarse maatriksi akumuleerumine glomerulites ja tubulointerstitsialis. In vitro indutseeris glomerulaarsete podotsüütide, mesangiaalrakkude ja neerutuubulite rakkude kokkupuude diabeetilise miljööga GSK3 üleekspressiooni ja hüperaktiivsuse, mis tunduvad esilekutsumiseks hädavajalikud ja piisavad.diabeetikrakukahjustused neerurakkudes, sest diabeetilise miljöö tsütopaatilist toimet leevendas GSK3b knockdown, kuid seda jäljendas konstitutiivselt aktiivse GSK3b ektoopiline ekspressioon isegi normaalses keskkonnas. Vastuolu, diabeetilise nefropaatia erineva staadiumiga patsientidelt hangitud neeru biopsia proovid näitasid kogu ja aktiveeritud GSK3b võimendatud ekspressiooni glomerulites ja neerutuubulites, mis on seotud diabeetilise nefropaatia raskusastmega. Veelgi enam, 2. tüüpi diabeediga patsientide retrospektiivsetes kohortides, mida jälgiti üle viie aasta, oli GSK3b suhteline aktiivsus uriiniga kooritud rakkudes sõltumatu riskifaktor neerukahjustuse tekke või progresseerumise suhtes. Lisaks näitas vastuvõtja töö iseloomustuskõvera analüüs, et GSK3b aktiivsus uriiniga kooritud rakkudes andis palju parema võimsuse kui albuminuuria progresseeruva neerukahjustusega diabeediga patsientide eristamisel stabiilse neerufunktsiooniga patsientidest. Seega võimendub GSK3b neeruekspressioon ja aktiivsus eksperimentaalses ja kliinilises diabeetilises nefropaatias. Seega võib uriiniga kooritud rakkudes olev GSK3b olla uudne biomarker diabeedi ennustamisel.neerudhaigusprogresseerumist.

Diabeetiline neeruhaigus(DKD) on endiselt peamine lõppstaadiumis neerupuudulikkuse põhjus Ameerika Ühendriikides ja teistes arenenud riikides.1,2 Siiski ei arene mitte kõigil suhkurtõvega patsientidel diabeetiline nefropaatia (DN), mida tõendavad mitmed pikaajalised Epidemioloogilised järeluuringud.3 Selle heterogeense tulemuse põhjust ei mõisteta täielikult, kuid see näib olevat mitmefaktoriline, hõlmates mitmesuguseid põhjuslikke tegureid, sealhulgas geneetikat, keskkonda, olemasolevaidneerudhaigus, ja diabeedi raskusaste.4,5 Kehv glükeemiline kontroll on olnud albuminuuria ja DN-i üldtuntud riskitegur. Sellegipoolest areneb olulisel osal patsientidest DN vaatamata rangele glükeemilisele kontrollile.6 Kliinilises praktikas on neerukahjustuse riskiga diabeediga patsientide kihistamiseks vaja kasutusele võtta tundlik ja täpne biomarker. Aastaid on albuminuuriat peetud diabeetiliste neerutüsistuste asendusmarkeriks.7,8 Sellegipoolest viitab üha suurem hulk tõendeid, et albuminuuria ei pruugi olla täpne.9,10 Täheldatud on märkimisväärset ebakõla albuminuuria ja neerukahjustuse vahel DN-s. 11,12 Ühendkuningriigi prospektiivse diabeediuuringu andmetel13 patsientidest, kellel tekkis neerukahjustus, ei esinenud 61 protsendil eelnevalt albuminuuriat ja 39 protsendil ei tekkinud uuringu ajal albuminuuriat. Samuti tekkis ainult 24 protsendil patsientidest, kellel tekkis albuminuuria, uuringu käigus neerukahjustus. Teisisõnu, mikroalbuminuuriaga või makroalbuminuuriaga patsientidel ei pruugi valdaval enamusel tekkida neerukahjustus. Need andmed seavad seega kahtluse alla albuminuuria klassikalise paradigma, mis alati eelneb neerukahjustusele DKD progresseerumise ajal. Sellisena on hädavajalik tuvastada uued biomarkerid.

DN ennustamiseks või DN varaseks diagnoosimiseks. Viimase kümnendi jooksul on testitud mitmeid uusi molekule.14–16 Nende hulgas on atraktiivse kandidaadina esile kerkinud glükogeeni süntaasi kinaas 3 (GSK3). GSK3 on väga konserveerunud, kõikjal ekspresseeritud seriini / treoniini valgu kinaas, mida algselt iseloomustati kui insuliini signaaliülekande kaskaadi võtmemuundurit ja reguleerib glükogeneesi. Huvi GSK3 vastu kasvas märgatavalt, kui mõistis, et see toimib ka lähenemispunktina mitmete raku signaaliülekande radade jaoks.põletik, immunomodulatsioon, embrüogenees, koekahjustus, paranemine ja regeneratsioon.17–19 GSK3 eksisteerib kahe isovormina: GSK3a ja GSK3b. Erinevates elundite kudedes ekspresseeritakse 2 isovormi erinevalt. Neerukoores ekspresseerub b-isovorm valdavalt ja paikneb glomerulites ja proksimaalsetes tubulaarrakkudes.20,21 Neerude GSK3b üliaktiivsust on seostatud mitmesuguste neeruhaigustega, sealhulgas proteinuuriliste gloneuropaatiate ja progresseeruva kroonilise neeruhaigusega.22 Sellegipoolest. , insuliini signaaliraja võtmemuundurina, ei ole GSK3b roll DN patogeneesis veel teada. Tuleb veel kindlaks teha, kas GSK3b düsregulatsioon neerudes on seotud DN-iga. Selle probleemi lahendamiseks uuriti käesolevas uuringus kogu ja aktiveeritud GSK3b ekspressiooniprofiile neeruproovides, mis saadi insuliinisõltumatu DN-i hiire dB/dB mudelitest, ja neeru biopsia kudedes patsientidelt, kellel oli 2. tüüpi DN erineva staadium. Lisaks mõõdeti II tüüpi diabeediga patsientide retrospektiivsetes kohortides kogu ja aktiveeritud GSK3b ekspressioonitasemeid uriiniga kooritud rakkudes, millest võeti proov uriinipõhise vedela neeru biopsiana. Uurisime seost GSK3b või selle aktiveeritud vormi ekspressioonitasemete vahel uriini kooritud rakkudes ja neerukahjustuse arengu või progresseerumise vahel diabeediga patsientidel.

TULEMUSED

GSK3b on db/db hiirte neeru parenhüümirakkudes üleekspresseeritud ja hüperaktiivne, mis on seotud albuminuuria ja diabeetilise neerukahjustuse progresseerumisega

Leptiini retseptori puudulikkusega db/db hiired on II tüüpi suhkurtõve ja DN väljakujunenud mudelid. Alates 10 nädala vanusest tekivad db/db hiirtel spontaanselt varajased nähudneerukahjustused, mida iseloomustab progresseeruv albuminuuria ja maatriksi akumuleerumine glomerulites.23 Seevastu vanusega sobivatel kontrollhiirtel (db/m) on veresuhkru tase normaalne ja puuduvad märgatavad tõendidneeruhaigus. 10 nädala vanuselt alanud katses suurenes kogu (joonis 1) ja aktiveeritud (joonis 2) GSK3b (fosforüülitud Y216 [p-GSK3B] juures) neerude ekspressioon db/db hiirtel võrreldes db/m kontrollhiirtega järk-järgult. Joonis 1b ja 2b). See paiknes peamiselt podotsüütides ja mesangiaalsetes rakkudes glomerulites (joonis 1a) ja tubulointerstitsiaalses tubulaarsetes epiteelirakkudes (joonis 2a), nagu on näidatud immunohistokeemilise värvimisega. Morfoloogilisi leide kinnitas terve neeru homogenaatide immunoblotanalüüs (joonis 1c ja 2c). Regressioonanalüüs näitas, et kogu (joonis 1d) ja aktiveeritud (joonis 2d) GSK3b värvumise intensiivsus glomerulites korreleerus positiivselt albuminuuria eritumisega uriiniga erinevates vanustes db / db hiirtel. Isegi diabeedi varases staadiumis db/db hiirtel, näiteks 10 või 14 nädala vanuselt, oli GSK3b aktiivsus neerudes silmatorkavalt tõusnud, mida peegeldab p-GSK3b oluline indutseerimine (joonis 2). Näib, et GSK3b hüperaktiivsus db / db hiirte neerudes varases staadiumis oli suuresti tingitud translatsioonijärgsetest modifikatsioonidest, nagu fosforüülimine Y216 juures, kuid hilisemas etapis oli see peamiselt tingitud kogu GSK3b suurenenud ekspressioonist.

DN-i progresseerumisel suureneb rakuvälise maatriksi akumulatsioon nii glomerulites kui ka interstitsiaalsetes. Tõepoolest, nagu näitas FL fluorestseeruv immunohistokeemia värvimine, näitasid db / db hiire neerud fibronektiini järk-järgult suurenenud ekspressiooni nii glomerulites kui ka interstitsiaalses (joonis 3a). Seda kinnitas veelgi fibronektiini ja kollageeni IV neeruhomogenaatide immunoblotanalüüs (joonis 3b ja c). Lisaks korreleerus kogu ja aktiveeritud GSK3b ekspressioon positiivselt fibronektiini ekspressiooniganeerukuded(Joonis 3d).

Et edasiseks kindlaks teha, kas suurenenud GSK3b aktiveerimine eelneb DKD arengule, jälgiti db/db ja db/m hiiri eraldi katses, mis algas 4 nädala vanuselt prediabeedi staadiumis. 7. nädalal ilmnes db / db hiirtel ilmne hüperglükeemia (täiendav joonis S1A), mis viitab diabeedile, kuid DKD tunnuseid ei esinenud, nagu näitab normaalne albuminuuria (täiendav joonis S1B). Tuleb märkida, et isegi diabeedi nii varases staadiumis oli GSK3b ja p-GSK3b neerude ekspressioon, samuti GSK3b suhteline aktiivsus, väljendatuna p-GSK3b/GSK3b suhtena, varieeruvalt suurenenud, mõõdetuna neerubiopsia kudede immunoblotanalüüsiga. järgneb densitomeetria (täiendav joonis S1C ja D). Lisaks näitas lineaarne regressioonanalüüs, et neeru GSK3b aktiivsus 7. nädalal korreleerus positiivselt albuminuuria ja DKD tekkega 13. nädalal (täiendav joonis S1E). Lisaks näitas vastuvõtja töökarakteristiku (ROC) kõvera analüüs, et neeru GSK3b aktiivsus db/db hiirtel 7 nädala vanustel hiirtel, kui DKD tunnuseid polnud, tagas albuminuuria ja DKD arengu ennustamisel suurepärase täpsuse ja võimsuse (täiendav joonis). S1F).

Neerurakkude kokkupuude diabeetilise miljööga põhjustab GSK3b üleekspressiooni ja hüperaktiivsust, mille tulemuseks on diabeetilised tsütopaatilised muutused

Et teha kindlaks, kas diabeetiline seisund suurendab otseselt GSK3b aktivatsioonineerurakud, kasutati erinevate neerurakuliinide, sealhulgas hiire podotsüütide, mesangiaalsete rakkude ja tubulaarsete epiteelirakkude in vitro kultuure ja eksponeeriti diabeetilisele miljööle, mis koosneb kõrgest ümbritsevast glükoosist ja transformeerivast kasvufaktorist (TGF) b1. Podotsüütide kokkupuude diabeetilise miljööga põhjustas silmatorkavaid podotsüütide kahjustusi, mida iseloomustab podotsüütide markervalgu sünaptopodiini kadu. Sellega kaasnes kogu ja aktiveeritud GSK3b silmapaistev esilekutsumine, nagu näitas FL fluorestseeruv immunotsütokeemiline värvimine (joonis 4a ja b) ning seda kinnitas immunoblotanalüüs

(Joonis 4c ja d). Kultiveeritud mesangiaalsetes rakkudes suurenes ka kogu (joonis 5a) ja aktiveeritud (joonis 5b) GSK3b ekspressioon pärast kokkupuudet diabeetilise miljööga, paralleelselt ekstratsellulaarse maatriksi molekulide, näiteks fibronektiini suurenenud ekspressiooniga (joonis 5). Sarnaselt ekspresseerisid kultiveeritud neerutuubulaarsed epiteelirakud kogu ja aktiveeritud GSK3b pärast diabeetilise miljöö ravi ning sellega kaasnes tubulaarsete rakkude düsfunktsioon ja diferentseerumine, mida iseloomustas epiteeli tiheda ühendusmolekulide, nagu zonula occludens -1 (ZO{6}}) vähenenud ja häiritud ekspressioon. -1) (joonis 6a–d). Seevastu osmolaalsuse kontrollina andis kõigi neerurakkude töötlemine mannitooliga efekti, mis ei erinenud sellest, mida edastas normaalne keskkonnas, mis sisaldas normaalset ümbritsevat glükoosi. Inimese diabeet ei hõlma mitte ainult hüperglükeemiat, vaid ka insuliiniresistentsust. Kuigi loommudelitel või patsientidel on võimatu hüperglükeemiat insuliiniresistentsusest täielikult eraldada, on in vitro mudeleid kasutatud kõrge glükoosi ja insuliiniresistentsuse isoleeritud toime uurimiseks. Insuliiniresistentsuse seisundi jäljendamiseks löödi kultiveeritud podotsüütides, mesangiaalrakkudes ja neerutuubulites rakkudes insuliini retseptori b isovorm (täiendav joonis S2A – C) ning see võimendas GSK3b ekspressiooni ja aktiivsust isegi normaalsetes tingimustes. miljöö, nagu näitavad immunoblotanalüüs ja densitomeetria. Seda toimet tugevdati pärast kokkupuudet diabeetilise miljööga, mis tähistab insuliiniresistentsuse ja kõrge glükoosisisalduse sünergistlikku toimet GSK3b aktiveerimisel.

GSK3b hüperaktiivsus on hädavajalik ja piisav diabeetilise miljöö poolt esile kutsutud neerurakkude vigastuste ja talitlushäirete korral

Et uurida, kas GSK3b hüperaktiivsus on seotud tsütopaatiliste muutustega neerurakkudes, on GSK3b aktiivsuskultiveeritud neerrakke manipuleeriti kunstlikult RNA sekkumisega

(RNAi) või geenide üleekspressioon. Nagu on näidatud joonisel fig 7a, mõjutab väikest segavat RNA-d kasutav RNAi vaevu diabeetilise miljöö tsütopaatilist toimet kõigis neerurakkudes. Seevastu GSK3b vaigistamine tühistas oluliselt diabeetilise miljöö poolt esile kutsutud sünaptopodiini supressiooni podotsüütides, fibronektiini induktsiooni mesangiaalrakkudes ja ZO-1 häireid neerutuubulite rakkudes, mis viitab sellele, et GSK3b on tõenäoliselt hädavajalik diabeediga seotud tsütopaatiliste muutuste vallandamiseks. neerurakud. Et teha kindlaks, kas GSK3b üleekspressioon ja hüperaktiivsus on diabeetilise miljöö poolt esile kutsutud tsütopaatiliste mõjude jaoks piisavad, transfekteeriti rakud ajutiselt kas tühja vektori või GSK3b (S9A) konstitutiivselt aktiivset mutanti kodeeriva vektoriga. Kuigi tühja vektori transfektsioon ei avaldanud peaaegu mingeid mõjusid, põhjustas S9A ektoopiline üleekspressioon sünaptopodiini ekspressiooni kadumise podotsüütides, fibronektiini produktsiooni suurenemist mesangiaalrakkudes ja ZO-1 ekspressiooni vähenemist neerutuubulites isegi normaalses keskkonnas (joonis). 7b), mis meenutab diabeetilise miljöö tsütopaatilist toimet.

Inimese DN progresseerumine langeb kokku GSK3b üleekspressiooni ja hüperaktiivsusega neeru glomerulites ja tuubulites

Et täiendavalt kinnitada, kas ülaltoodud leiud looma- ja rakukultuuri mudelites on kohaldatavad ka kliinilise DN-i puhul, töödeldi normaalsete isikute ja erineva DN-i staadiumiga patsientide neerubiopsia arhiveeritud kudesid GSK3b ja p-GSK3b peroksüdaasi immunohistokeemia värvimiseks. Kontrollsubjektide ja patsientide omadused on kokku võetud täiendavas tabelis S1. Nagu on näidatud joonisel 8a, neeru-

kogu ja aktiveeritud GSK3b ekspressioon suurenes üha enam koos DN progresseerumisega, mis liigitati patoloogilise klassifikatsiooni järgi, mis põhines perioodilise happe-Schiffi värvimisel. See on kooskõlas Nephroseqi andmetega, mis näitavad ka oluliselt suurenenud GSK3b ekspressiooni DN-ga patsientide neeru biopsia kudedes (täiendav joonis S3). Kogu ja aktiveeritud GSK3b suurenenud ekspressioon paiknes valdavalt podotsüütides ja mesangiaalsetes rakkudes glomerulites ning neerutuubulite epiteelirakkudes tubulointerstitsiaalses (joonis 8a), kooskõlas db / db hiirte leidudega. Morfoloogilisi tulemusi kinnitas veelgi arvutipõhine morfomeetriline analüüs, mis näitas positiivset seost kogu (joonis 8b) või aktiveeritud (joonis 8c) GSK3b ekspressioonitasemete ja DN raskusastme vahel.

GSK3b on hüperaktiivne diabeedihaigetelt kogutud uriiniga kooritud rakkudes ja ennustab neerukahjustuse progresseerumist Nii füsioloogilistes kui ka haiguslikes tingimustes toimub neeruepiteelirakkude, nagu glomerulaarsete podotsüütide ja tubulaarsete epiteelirakkude vahetus ja eraldumine pidevalt, mis viib pideva eritumiseni. neerude parenhüümirakkudest uriini. Uriiniga kooritud rakke on edukalt kasutatud uriinipõhise mitteinvasiivse vedela neeru biopsiana teadusuuringute ja diagnostilistel eesmärkidel.24,25 Eelnimetatud järelduste kohaselt suureneb kogu ja aktiveeritud GSK3b ekspressioon neeru parenhüümirakkudes DN-ga ja DB/DB-ga patsientidel. hiirtel isegi varases staadiumis enne albuminuuria ilmnemist mõtlesime, kas GSK3b mõõtmist uriiniga kooritud rakkudes saab ennustamiseks kasutada

inimese DKD areng või progresseerumine. Sel eesmärgil kasutasime diabeedi biopanka ja viisime läbi retrospektiivse kohortuuringu. Kokku kontrolliti sellesse uuringusse 127 II tüüpi suhkurtõvega patsienti, keda jälgiti Zhengzhou ülikooli esimeses sidushaiglas alates 2010. aastast fraktsioneeritud uriini proovidega. Nendest patsientidest jäeti välja 67, kellest 10 jäid jälgimisele, 52-l oli haiguse alguses neerufunktsiooni häire või ilmne proteinuuria ja 5-l diagnoositi hiljem neerubiopsia või pildistamise abil muud neeruhaigused. Lõpuks kaasati sellesse retrospektiivsesse kohortuuringusse 60 patsienti (joonis 9). Nende patsientide demograafilised ja kliinilised omadused algtasemel on kokku võetud tabelis 1. Ühelgi patsiendil ei esinenud algtasemel neerufunktsiooni häireid ega ilmne proteinuuria ning ükski patsient ei alustanud jälgimisperioodi jooksul dialüüsravi. Albuminuuria suuruse järgi jaotati patsiendid 2 alarühma: normoalbuminuuria ja mikroalbuminuuria rühmad. Välja arvatud uriini albumiini eritumise (AÜE) tasemed, ei erinenud kahe patsientide alarühma algtasemel statistiliselt kõik muud kliinilised, biokeemilised ja füsioloogilised parameetrid, sealhulgas diabeedi kestus, glükeeritud hemoglobiini tase, neerufunktsioon, vererõhk ja ettenähtud ravi. . Pärast 5-aastast jälgimist täheldati 60-st patsiendist 29-l neerukahjustuse progresseerumist, mida määratleti kui hinnangulise glomerulaarfiltratsiooni kiiruse (eGFR) vähenemist 25% võrra või albuminuuria seisundi progresseerumist, mida näitab raskusastme suurenemine. albuminuuria DN erinevates kliinilistes staadiumides, st normoalbuminuuria, mikroalbuminuuria, mikroalbuminuuria või ilmne proteinuuria. Seevastu ülejäänud 31 patsiendil ei ilmnenud neeruhaiguse progresseerumise tunnuseid (joonis 9). Patsientide algandmed kihistati neerukahjustuse progresseerumise staatuse järgi pärast 5-aastast jälgimist (tabel 2). Progresseeruva neerukahjustusega patsientidel ilmnes eGFR märkimisväärne vähenemine ja AÜE märkimisväärne tõus võrreldes patsientidega, kellel progresseerumist ei esinenud. Et teha kindlaks, kas GSK3b oli neerurakkudes üleekspresseeritud või üleaktiveeritud ja

mõõdeti GSK3b aktiivsuse tundlikkuse ja spetsiifilisuse hindamiseks uriiniga kooritud rakkudes võrreldes algtaseme albuminuuriaga, et ennustada neerukahjustuse progresseerumist. Nagu on näidatud joonisel 11, näitas GSK3b suhteline aktiivsus uriiniga kooritud rakkudes, väljendatuna p-GSK3b/GSK3b suhtena, suurepärast täpsust ja võimsust progresseeruva neerukahjustusega patsientide eristamisel stabiilse neerufunktsiooniga patsientidest ROC-i all oleva alaga. kõver on 0,844 (95 protsendi usaldusvahemik, 0,747–0,941; P ¼ 0.001 ). Youdeni indeksi maksimeeriv piir oli p-GSK3b/GSK3b suhte puhul 1,24 ja AÜE puhul 76 mg/24 h. Nendel piiridel olid tundlikkus ja spetsiifilisus p-GSK3b/GSK3b suhte puhul 69 protsenti ja 87,1 protsenti ning Ln (AÜE) puhul 69 protsenti ja 77,4 protsenti. Veelgi enam, p-GSK3b/GSK3b suhte ja GSK3b kogutaseme kombinatsioon uriiniga kooritud rakkudes parandas oluliselt eristamisvõimet, kusjuures ROC kõvera alune pindala oli 0,971 (95-protsendiline usaldusvahemik, 0,931–1.{48} }). Need tulemused viitavad sellele, et GSK3b aktiivsuse mõõtmised uriiniga kooritud rakkudes võivad anda diabeediga patsientide neerukahjustuse progresseerumise prognoosimisel palju parema täpsuse kui AÜE.

To further explore whether enhanced GSK3b activation also predicts the development of DKD, a separate cohort of patients with type 2 diabetes but no signs of kidney disease, who started follow-up between 2010 and 2013, were retrospectively screened and examined (Supplementary Table S2). The baseline characteristics of patients were stratified according to the presence or absence of renal impairment or DKD after 5 years' follow-up (Supplementary Table S3), which was defined as either a $25% reduction in eGFR or the persistent presence of albuminuria (>30 mg/24 h). Algtasemel kogutud uriiniga kooritud rakud leiti ja neid uuriti immunoblotanalüüsiga GSK3b ja p-GSK3b jaoks (täiendav joonis S4A ja B). GSK3b aktiivsust hinnati iga proovi p-GSK3b ja kogu GSK3b densitomeetriliste suhetega võrreldes kontrollproovide väärtusega (täiendav joonis S4C).

Erinevate kliiniliste/biokeemiliste muutujate hulgas täheldati, et GSK3b aktiivsus (p-GSK3b/GSK3b suhe) algtaseme uriiniga kooritud rakkudes oli oluliselt kõrgem patsientidel, kellel tekkis DKD kui neil, kellel seda ei tekkinud (täiendav tabel S3). Veelgi enam, ROC kõvera analüüs viitab sellele, et GSK3b suhteline aktiivsus (p-GSK3b / GSK3b suhe) uriiniga kooritud rakkudes tagas suurepärase täpsuse ja võimsuse DKD arengu ennustamisel varases staadiumis diabeediga patsientidel (täiendav joonis S4D).