1. osa doksorubitsiin leevendab paradoksaalselt kasvajast põhjustatud põletikku noortel hiirtel

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Ibrahim Y. Abdelgawad et al

Cistanche tubulosa hoiab ära neeruhaiguse, selle saamiseks klõpsake siintooted ja Cistanche herba

Abstraktne:

Doksorubitsiin(DOX) on laste onkoloogias üks enim kasutatavaid kemoterapeutikume. DOX kutsub esile põletikulise vastuse mitmes elundis, mis aitab kaasa DOX-i põhjustatud kahjulikele mõjudele. Vähk ise põhjustab põletikku, mis põhjustab mitmeid patoloogiaid. Käesolevas uuringus uuriti põletikulist vastust DOX-ile jakasvajadkasutades EL4-lümfoomi, immuunkompetentse, juveniilse hiire mudelit. Neljanädalastele isastele C57BL/6N hiirtele süstiti subkutaanselt EL4 lümfoomirakke (5 × 104 rakku hiire kohta) küljepiirkonda.kasvaja- vabadele hiirtele süstiti vehiiklit. Kolm päeva pärast kasvaja implanteerimist süstiti nii kasvajavabadele kui ka kasvajat kandvatele hiirtele 3 nädala jooksul intraperitoneaalselt kas DOX (4 mg/kg/nädalas) või soolalahust. Nädal pärast viimast DOX-i süsti hiired surmati ja südamed, maks,neerud, ja seerum koguti. Põletikuliste markerite geeniekspressioon ja seerumikontsentratsioon kvantifitseeriti vastavalt reaalajas PCR ja ELISA abil. DOX-ravi on oluliselt alla surutudkasvajakasvu kasvajaga hiirtel ja põhjustas kasvajavabadel ja kasvajaga hiirtel olulist südame atroofiat. EL4 kasvajad kutsusid esile tugeva põletikulise vastuse südames, maksas janeerud. Silmatorkavalt leevendas DOX-ravi kasvajavabadel hiirtel DOX-i toime suhtes paradoksaalset kasvajast põhjustatud põletikku, näidates DOX-ravi laialdaselt lahknevat mõju kasvajavabadele ja kasvajat kandvatele hiirtele.

Märksõnad:doksorubitsiin; kasvaja; põletik

1. Sissejuhatus

Doksorubitsiin (DOX), tuntud ka kui adriamütsiin, on üks enim kasutatavaid kemoterapeutilisi aineid laste kliinilises onkoloogias. Vaatamata selle efektiivsusele paljudes vähkkasvajates, sealhulgas lümfoomi, leukeemia ja teiste pediaatriliste vähivormide korral, on DOXi kliiniline kasulikkus mitmete organite toksilisuse tõttu piiratud. Lisaks märgatavale kardiotoksilisusele [1] on näidatud, et DOX põhjustab nefrotoksilisust [2–5] ja hepatotoksilisust [6]. Peaaegu 50 protsenti lastest vähipatsientidest saavad raviprotokolli osana DOX-i [7]. Tänu tõhusatele vähiravile, sealhulgas DOX-ile, on vähktõbe põdevate laste 5-aastane elulemus tõusnud vähem kui 60 protsendilt 1970. aastatel enam kui 80 protsendini praeguseks [8,9]. See toob kaasa suure hulga lapseea vähi ellujäänute (CCS) populatsiooni, hinnanguliselt umbes 400000. Kahjuks on CCS-idel suur risk pikaajaliste kahjulike mõjude tekkeks vähiravi ja/või vähi enda tõttu.

On näidatud, et DOX kutsub esile süsteemse põletiku [10–12] ja põletikulise reaktsiooni mitmes elundis, sealhulgas südames [13],neerud[14] ja maks [15]. On näidatud, et see põletikuline reaktsioon soodustab DOX-i põhjustatud kõrvaltoimeid [16, 17]. Enamik neist DOX-indutseeritud põletikust teatatud uuringutest on läbi viidud aastalkasvaja-vabad loommudelid, mis ei jäljenda kliinilist stsenaariumi, mille kohaselt saavad pediaatrilised vähipatsiendid pärast vähi diagnoosimist DOX-ravi. Samuti on näidatud, et vähk iseenesest põhjustab põletikku, mis soodustab mitmeid patoloogilisi seisundeid, mis võivad süvendada DOX-indutseeritud toksilisust [18, 19]. Seetõttu on kriitiline vajadus luua kliiniliselt olulised loommudelid, et uurida DOX-indutseeritud mitme elundi toksilisuse mehhanisme noortel,kasvaja-kandvad hiired, et uurida DOX-ravi ja vähi enda vahelist koosmõju, et põhjustada selliseid toksilisusi.

Käesolevas uuringus uurisime põletikulist vastust DOX-ile ja kasvajale kliiniliselt olulise süngeense EL{0}}lümfoomi, immunokompetentse juveniilse hiire mudelis. See mudel on vähiuuringutes hästi tõestatud [20] ja on kliiniliselt oluline laste vähipatsientide jaoks, kuna lümfoom on üks levinumaid laste vähi liike [21]. Süngeensete hiirte kasutamine on kriitilise tähtsusega nii DOX-i kui ka kasvaja põletikulise vastuse uurimiseks, kuna immuunsüsteemil on põletiku patogeneesis kriitiline roll [22]. Hiirte vanus oli DOX-i manustamisel 5 nädalat, mis võrdub inimeste noorukiea vanusega 10–12 aastat [23]. Lisaks on manustatud DOX-i annused kliiniliselt olulised vähihaigete laste annuste suhtes [24]. Esmalt määrasime kindlaks DOX-i mõju südamefunktsioonile kasvajavabadel ja kasvajat kandvatel hiirtel, kuna DOX-i põhjustatud kardiotoksilisust peetakse DOX-i kõige kliiniliselt olulisemaks kõrvaltoimeks muude mitme organi toksilisuse kõrval. Seejärel määrasime DOX-i, kasvaja ja nende kombinatsiooni mõju mitmetele põletikumarkeritele südames, maksas janeerudlisaks süsteemse põletiku seerumimarkeritele. Leidsime, et EL4 kasvaja esinemine kutsus esile tugeva põletikulise vastuse mitmes elundis. Üllatavalt leevendas DOX-ravi kasvajast põhjustatud põletikku, mis oli paradoksaalne DOX-i varem teatatud toime suhtes kasvajavabadel hiirtel.

2. Tulemused

2.1. DOX-i mõju kehakaalule ja kasvajate kasvule

Käesolev uuring viidi läbi juveniilsete hiirtega, et jäljendada kliinilist stsenaariumi lastel vähipatsientidel, nagu on kirjeldatud joonisel 1A. Pärast DOX-iga kokkupuudet (4 mg / kg / nädalas 3 nädalat) ei täheldatud olulist haigestumust ega suremust kasvajavabadel ega kasvajaga hiirtel, mis on kooskõlas meie eelmise sama annusega uuringuga [25]. Kuid noorte kokkupuude DOX-iga vähendas oluliselt kehakaalu tõusu võrreldes soolalahusega töödeldud hiirtega (joonis 1B). DOX-i vähivastase toime hindamiseks selles EL4 lümfoomi mudelis mõõtsime pärast hiirte lahkamist kasvaja massi. Krooniline DOX-i manustamine kasvajaga hiirtel pärssis oluliselt EL4 kasvaja kasvu, näidates selle DOX-i annustamisskeemi vähivastast toimet (joonis 1C).

2.2. DOX-i manustamise mõju kasvajavabade ja kasvajaga hiirte südamefunktsioonile ja morfomeetriale

DOX põhjustas südame atroofiat, mida näitas südame massi oluline vähenemine sääreluu pikkuseni (HW / TL) (joonis 1D). Tähelepanuväärselt suurenes DOX-i põhjustatud südame atroofia kasvajaga hiirtel (joonis 1D). DOX-i, kasvaja ja nende kombinatsiooni mõju südamefunktsioonile ja morfoloogiale hinnati transtorakaalse ehhokardiograafia abil. Iga rühma tüüpilised M-režiimi kujutised on näidatud joonisel 2A. DOX ega kasvaja ei põhjustanud olulisi muutusi väljutusfraktsioonis (joonis 2B), südame väljundis (joonis 2C), fraktsionaalses lühenemises (joonis 2D), vasaku vatsakese massis (joonis 2E), vasaku vatsakese (LV) massis (joonis 2E), vasaku vatsakese paksuses diastoolis (LVPW). d) (joonis 2F) või LV tagumise seina paksus süstoolis (LVPW-d) (joonis 2G).

2.3. DOX-i manustamise mõju põletikuliste markerite geeniekspressioonile kasvajat kandvate ja kasvajavabade hiirte südames

Südamed koguti nii kasvajavabadelt kui ka EL4 lümfoomi kasvajat kandvatelt noortelt C57BL/6N hiirtelt üks nädal pärast 4 mg/kg/nädalas DOX-i või samaväärse koguse steriilse soolalahuse manustamist 3 nädala jooksul (n=8 per Grupp). Pärast kogu RNA ekstraheerimist, põletikumarkerite interleukiin-1 alfa (IL-1), interleukiin-1 beeta (IL-1), interleukiin{{12} } (IL-6), kasvaja nekroosifaktor-alfa (TNF-), põletikulised kemokiinid, monotsüütide kemoatraktantne valk-1 (Mcp-1) ja CX C motiivi kemokiinid (Cxcl1, Cxcl9 ja Cxcl10) määrati reaalajas PCR abil. Mitmete põletikuliste markerite geeniekspressioon südames oli kasvajaga hiirtel oluliselt ülesreguleeritud võrreldes kasvajavabade hiirtega, sealhulgas põletikueelsed tsütokiinid IL-1 (joonis 3A), IL-1 (joonis 3A). Joonis 3B), IL-6 (joonis 3C) ja TNF- (joonis 3D) ning põletikulised kemokiinid Mcp-1 (joonis 3E), Cxcl1 (joonis 3F) ja Cxcl10 (joonis 3H). Kui DOX-i manustamine kasvajavabadele hiirtele ei põhjustanud olulisi muutusi põletikumarkerite ekspressioonis südames, siis DOX-i manustamine tühistas oluliselt kasvajast põhjustatud IL-1 (joonis 3B), Mcp{{44} ülesreguleerimise. } (joonis 3E), Cxcl9 (joonis 3G) ja Cxcl10 (joonis 3H). Oluline on see, et kahesuunaline ANOVA näitas olulist interaktsiooniefekti kõigis markerites, välja arvatud Cxcl1, Cxcl9 ja Cxcl10, näidates DOX-i lahknevaid mõjusid südame põletikulistele markeritele kasvajaga patsientidel võrreldes kasvajavabade hiirtega.

2.4. DOX-i manustamise mõju põletikuliste markerite geeniekspressioonile kasvajavabade ja kasvajat kandvate hiirte maksas

Maksad koguti nii kasvajavabadelt kui ka EL4 lümfoomi kasvajat kandvatelt noortelt C57BL/6N hiirtelt üks nädal pärast 4 mg/kg/nädalas DOX-i või samaväärse koguse steriilse soolalahuse manustamist 3 nädala jooksul (n=8 per Grupp). Pärast kogu RNA ekstraheerimist toimub põletikumarkerite IL-1, IL-1, IL-6, TNF-, Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 ja Cxcl10 mRNA ekspressioon maksas. määrati reaalajas PCR abil. Kasvajat kandvatel hiirtel oli põletikueelsete tsütokiinide IL-1 (joonis 4A), IL-1 (joonis 4B), TNF- (joonis 4D), Cxcl9 (joonis 4G) maksaekspressioon oluliselt kõrgem. ja Cxcl10 (joonis 4H) võrreldes kasvajavabade hiirtega. Kuigi see on vähem tähelepanuväärne, näitab kahesuunaline ANOVA kasvaja olulist mõju IL-6 maksa geeniekspressioonile (joonis 4C). Kahesuunaline ANOVA näitas olulist interaktsiooniefekti kasvaja ja DOX-i vahel Cxcl10-s (joonis 4H). DOX-i manustamine vähendas kasvaja poolt indutseeritud IL-1 ja TNF- ülesreguleerimist (joonis 4B, D). Ei DOX ega kasvaja avaldanud olulist mõju põletikuliste kemokiinide Mcp-1 ja Cxcl1 ekspressioonile maksas (joonis 4E, F).

2.5. DOX-i manustamise mõju põletikuliste markerite geeniekspressioonile kasvajavabade ja kasvajat kandvate hiirte neerudes

Neerud koguti nii kasvajavabadelt kui ka EL4 lümfoomi kasvajat kandvatelt juveniilsetelt C57BL/6N hiirtelt üks nädal pärast 4 mg/kg/nädalas DOX-i või samaväärse koguse steriilse soolalahuse manustamist 3 nädala jooksul (n=8 per Grupp). Pärast kogu RNA ekstraheerimist toimub põletikumarkerite IL-1, IL-1, IL-6, TNF-, Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 ja Cxcl10 neerude mRNA ekspressioon. määrati reaalajas PCR abil. Kooskõlas täheldatud muutustega südames ja maksas oli kasvajaga hiirtel märkimisväärselt suurenenud põletikueelsete tsütokiinide IL-1 (joonis 5A), IL-1 (joonis 5B) neerude ekspressioon. TNF- (joonis 5D) ja Mcp-1 (joonis 5E) võrreldes kasvajavabade hiirtega. Lisaks näitab kahesuunaline ANOVA kasvaja olulist mõju Cxcl1 (joonis 5F), Cxcl9 (joonis 5G) ja Cxcl10 (joonis 5H) neerugeeni ekspressioonile. DOX-i manustamine kasvajaga hiirtele parandas märkimisväärselt kasvajast põhjustatud IL-1 (joonis 5B), IL-6 (joonis 5C), TNF- (joonis 5D) ja Mcp{{43} ülesreguleerimist. } (joonis 5E). Nendes markerites näitas kahesuunaline ANOVA ka olulist koostoimet DOX-i ja kasvaja vahel, näidates DOX-i erinevat toimet neerupõletiku markeritele kasvajaga patsientidel võrreldes kasvajavabade hiirtega.

2.6. DOX-i manustamise mõju kasvajavabade ja kasvajat kandvate hiirte südame, maksa ja neerude histopatoloogilistele tunnustele

Südamed, maksad ja neerud koguti ühelt kasvajavaba ja EL4 lümfoomi kasvajat kandvate juveniilsete C57BL/6N hiirte rühmalt üks nädal pärast 4 mg/kg/nädalas DOX-i või samaväärse koguse steriilse soolalahuse manustamist 3 nädala jooksul ( n=4 rühma kohta). Histopatoloogiline hindamine ei näidanud suuri patoloogilisi muutusi südames (joonis 6A). Maksakudedes, mis koguti DOX-ravi saanud kasvajavabalt (kolm hiirt neljast), soolalahusega töödeldud kasvajaga (kolm hiirt neljast), täheldati ainult minimaalset põletikuliste rakkude infiltratsiooni, mida demonstreeriti minimaalselt rakulise segatud (mononukleaarse ja neutrofiilse) põletiku harvaesinevate koldeidena. kaks hiirt neljast) ja DOX-ga ravitud kasvajat kandvad hiired (kolm hiirt neljast) (joonis 6B). Neerude histopatoloogiline hindamine ei näidanud suuri patoloogilisi muutusi kõigis rühmades, välja arvatud DOX-ravi saanud kasvajaga hiirtel (joonis 6C), kusjuures kahel hiirest neljast selles rühmas esines täieliku paksusega torukeste regeneratsiooni, fibroosi ja kerge interstitsiaalset piirkonda. põletik, mis mõjutab ligikaudu 5 protsenti kogu koe pindalast.

2.7. DOX-i erinevad mõjud seerumi põletikulistele tsütokiinidele kasvajavabadel versus kasvajaga hiirtel

Oleme varem teatanud, et äge DOX-i manustamine kutsus täiskasvanud C57BL / 6N hiirtel esile süsteemse põletikulise vastuse [11]. Siin määrasime kindlaks kroonilise DOX-i manustamise mõju põletikuliste markerite IL-6 ja TNF-tasemetele seerumi kasvajavabadel ja kasvajat kandvatel hiirtel. Soolalahusega töödeldud kasvajaga hiirtel ilmnes seerumi IL-6 (joonis 7A) ja TNF- (joonis 7B) märgatav, kuigi statistiliselt ebaoluline suurenemine võrreldes kasvajavabade hiirtega. Oluline on see, et kahesuunaline ANOVA näitas olulist koostoimet DOX-i manustamise ja kasvaja vahel IL-6 ja TNF-tasemete vahel seerumis. Tõepoolest, DOX-i manustamine normaliseeris kasvaja poolt indutseeritud IL-6 ülesreguleerimise sarnasele tasemele kasvajavabade kontrollhiirtega (joonis 7A).