1. osa tsistanid leevendavad sevofluraanist põhjustatud kognitiivset düsfunktsiooni, reguleerides PPAR- -sõltuvat antioksüdanti ja põletikuvastast toimet rottidel

Lisainfo võtke ühendust:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticolal on palju mõjusid, lisateabe saamiseks klõpsake siin

Abstraktne

Selle uuringu eesmärk oli uurida selle kaitsvat toimet ja selle aluseks olevaid mehhanismecistanchesevofluraanist põhjustatud eakate kognitiivse düsfunktsiooni roti mudelil. Vanused (24 kuud) isased SD rotid jaotati juhuslikult nelja rühma: kontrollrühm, sevofluraani rühm, kontrollrühm pluss tsistanche ja sevofluraan plusscistancheGrupp. Seejärel mõõdeti ELISA abil põletikuliste tsütokiinide taset ja rottide kognitiivset düsfunktsiooni hinnati veelabürindi testi, avatud väli testi ja hirmu konditsioneerimistesti abil. Kolm päeva pärast anesteesiat rotid surmati ja hipokampus koguti suhteliste biomolekulide analüüsimiseks. Oksüdatiivse stressi tase märgiti nitriti ja MDA kontsentratsioonina koos SOD ja CAT aktiivsusega. Lõpuks kasutati selle mehhanismi uurimiseks PPAR-antagonisticistanchein vivo. Tulemused näitasid, et pärast sevofluraani sissehingamist tekkisid 24-, kuid mitte 3-kuustel isastel SD-rottidel käitumistestis 3 päeva pärast anesteesiat ilmsed kognitiivsed häired. Intraperitoneaalne süstiminecistancheannuses 50 mg/kg 3 järjestikusel päeval enne anesteesiat leevendas sevofluraanist põhjustatud neuropõletiku taseme tõusu ja vähendas märkimisväärselt hipokampusest sõltuvaid mäluhäireid 24-kuu vanustel rottidel.Cistanchevähendas ka oksüdatiivset stressi, vähendades nitritit ja MDA-d, suurendades samal ajal SOD ja CAT aktiivsust. Lisaks pärssis selline ravi ka mikrogliia aktiveerimist. Lisaks näitasime, et PPAR-inhibeerimine leevendas vastupidiseltcistanche- indutseeritud kaitsev toime. Kokkuvõttes näitasime, et cistanche võib avaldada antioksüdantset, põletikuvastast, apoptoosivastast ja mikrogliia aktivatsioonivastast toimet sevofluraanist põhjustatud kognitiivse düsfunktsiooni tekkele, aktiveerides PPAR-signaali.

MÄRKSÕNAD

cistanche, postoperatiivne kognitiivne düsfunktsioon (POCD), PPAR-, sevofluraan

Cistanchetoidulisandid suurendavad immuunsust

1|SISSEJUHATUS

Postoperatiivne kognitiivne düsfunktsioon (POCD) on laastav tüsistus, millel on pikaajalised tagajärjed ja mida määratletakse kui mälu, tähelepanu, keskendumisvõime ja teabe käsitlemise häireid, mis tekivad pärast operatsiooni ja anesteesiat. Uuringud on näidanud, et ligikaudu 10 protsendil kirurgilistel patsientidel ja peaaegu 40 protsendil eakatest 65-aastastest ja isegi vanematest patsientidest esineb POCD.1 POCD-ga patsientidel on silmatorkavalt kõrgem suremus, halvem elukvaliteet ja suurem sõltuvus sotsiaalkindlustusest kui need, kellel puudub POCD.2,3 Kuigi viimastel aastakümnetel on tehtud palju uuringuid, on POCD patogenees suures osas teadmata.

On hästi teada, et neuropõletik ja oksüdatiivne stress ajus mängivad otsustavat rolli POCD tekkimisel ja progresseerumisel.4,5 Kuigi operatsioonist põhjustatud põletik või oksüdatiivne stress võib põhjustada neuropõletikku ja -kahjustusi ajus ning lõpuks aidata kaasa kognitiivse häire tekkele. Hiljutised aruanded näitavad, et operatsiooni ajal kasutatavad anesteetikumid võivad samuti põhjustada kognitiivseid häireid.3,6,7

Sevofluraani kasutatakse tavaliselt kliinilises anesteesias igas vanuses patsientidel selle madala veregaaside jaotusteguri ja madala metaboolse lagunemise tõttu.8 Siiski on mitmed tõendid näidanud, et sevofluraan võib põhjustada neuropõletikku ja kahjustada kognitiivset funktsiooni. Näiteks teatas Makaryus, et sevofluraanil on neurotoksiline toime aju arengule.9 On näidatud, et prefrontaalse ajukoore ergastavate neuronite vaheline ühenduvuse vähenemine on korrelatsioonis sevofluraani poolt esile kutsutud kognitiivsete häiretega.10 Homoplastiliselt soodustab sevofluraan kognitiivset langust mikrogliia süvenemise tõttu. -reguleeritud neuropõletik rotimudelil PPAR-aktiivsuse allareguleerimise kaudu hipokampuses.1 Kui kirurgiline meetod on kindlaks määratud, ei saa trauma ja põletikulise reaktsiooni astet muuta. Seetõttu võib kognitiivsete häirete vähendamine anesteesia seisukohast muutuda teostatavaks lähenemisviisiks. Thecistancheliiki (hiina keeles Rou Cong Rong) on ​​Hiinas toonikuna kasutatud juba aastaid. Kaasaegsed farmakoloogilised uuringud on näidanud, et tsisantidel on laialdased meditsiinilised funktsioonid, eriti kesknärvisüsteemis (KNS), sealhulgas apoptoosivastane, oksüdatsioonivastane, vananemisvastane, väsimusevastane, immunomoduleeriv põletikuvastane ja neuroprotektsioon.{5 }} Deng jt leidsid, et ehhinakosiidil, mis on üks peamisi tsistanche aktiivseid ühendeid, oli kaitsev toime TNF- -indutseeritud SH-SY5Y rakkude apoptoosile.14 Fenüületanoidglükosiidid, mis on veel üks peamine tsistanche aktiivne ühend, mis andis rohkesti. fenoolhüdroksüül, võib olla redutseerivate radikaalide vesiniku doonoriks ja seega nende eemaldamiseks. On kaks peamist voolu, mille kaudutsisantsidpuhastada vabu radikaale, nimelt osaledes otseselt vabade radikaalide eemaldamises või blokeerides nende tootmist ja reguleerides in vivo vabade radikaalide metabolismiga seotud antioksüdantseid ensüüme, nagu SOD, CAT ja GPX.15 Tistanchesi manustamine aitab aeglustada vananemist fenotüüpe ja kärbeste kognitiivse languse leevendamist, vähendades oksüdatiivset stressi.16 Näiteks uurisid Zhang jt üht tsistangi ekstraheerimist ja kinnitasid selle funktsiooni eluea pikendamisel.17 Seni pole aga üheski uuringus uuritud tsistankide mõju kognitiivsetele võimetele. düsfunktsioon kas loommudelitel või inimestel sevofluraani tingimustes.

Ülaltoodud leidude põhjal tegime ettepanekutsisantsidvõib nõrgendada sevofluraanist põhjustatud kognitiivseid häireid. Selle hüpoteesi kontrollimiseks kasutasime 24-kuuse SD rotte, et saada sevofluraani sissehingamise teel kognitiivsete häirete mudel. Seejärel uurisime selle farmakoloogilist funktsioonitsisantsidPõletikuvastane, oksüdatsioonivastane ja neuroprotektsioon. Samuti uuriti sevofluraani põhjustatud kognitiivsete häirete tekkemehhanismi.

2|MATERJALID JA MEETODID

2.1|Cistanches Herba ekstrakti valmistamine ja standardimine

Ekstraheeriminetsisantsidoli varasemate tööde järgi.18,19 Lühidalt,CistanchesÜrdiekstrakt ekstraheeriti 95% etanooliga vees ja lüofiliseeriti pulbriks. Ekstrakti kontsentratsioonis 10 mg/ml kanti ehhinakosiidi kvantitatiivsele keemilisele analüüsile pöördfaasi kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) abil. Standardühend, ehhinakosiid, saadi ettevõttest Haoxuanbio (Xi'an, Shaanxi, Hiina).

2.2|Sevofluraani indutseeritud kognitiivse düsfunktsiooni roti mudel ja ravi cistanche'iga

Isased Sprague Dawley (SD) rotid vanuses 3 ja 24 kuud osteti ettevõttest Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Rotte kasvatati puhastes akrüülpuurides, kus oli 12-tunnise valguse all vaba juurdepääs veele ja toidule. /tume tsükkel konstantsel temperatuuril 21 kraadi ± 1 kraadi ja niiskusega (45 protsenti -65 protsenti) 1 nädal enne katset majutuseks. Loomkatsete protseduurid andis loa Shanghai TCM-i ülikooli seitsmenda rahvahaigla loomahoolduskomitee. Kõik käitumistestid viidi läbi ruumis, mille temperatuur (21 kraadi ± 1 kraad) ja niiskus (45 protsenti -65 protsenti) kontrolliti.

Esimeses in vivo katsete komplektis kasutati 3- ja 24-kuuse vanuseid isaseid SD rotte. Kuusteist 3-kuust rotti kaaluga 200- 250 g ja kuusteist 24-kuust 24- g kaaluvat rotti määrati juhuslikult sevofluraani sisseveoks (Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. , Lianyungang, Hiina) või kandegaasi (n=8 iga rühma jaoks). Anesteesiarühmade (SEVO) loomadele manustati 4 tunni jooksul 2,6-protsendilist sevofluraani kontsentratsiooni niisutatud 30-protsendilise O2-kandegaasiga voolukiirusel 2 l/min, kasutades multigaasimonitoriga anesteetikumi (Prisma). SP Alpa, Oxon, Ühendkuningriik). Kontrollrühma rottidele manustati sama kaua kandegaasi ilma sevofluraanita.

4 tunniks (n=8 iga rühma kohta). Käitumistestid viidi läbi 1. ja 3. päeval pärast anesteesiat. Seejärel tapeti loomad kohe pärast käitumise hindamist 3. päeval ja aju hipokampust kasutati molekulaarseteks analüüsideks. Kolmandas katsete komplektis jagati kõik tuimastatud rotid juhuslikult nelja rühma (n=8 iga rühma kohta): (a) SEVO rühm; (b) SEVO pluss GW9662 (PPAR- antagonist, iga kord 30 ng) rühm;

c) SEVO pluscistancheGrupp; ja d) SEVO pluscistanchepluss GW9662 grupp. Järgnevad katsed olid sarnased teise katsekomplekti kirjeldusega.

2,3|Käitumise testimine

Morrise veelabürindi test viidi läbi nii, nagu eelnevalt kirjeldatud, väikeste muudatustega, et hinnata käesolevas uuringus rottide ruumilist mälu ja õppimisvõimet.8,20 Paak täideti 40 cm sügavuselt veega ja muudeti läbipaistmatuks. lisades mittetoksilist valget temperavärvi. Vee temperatuuri hoiti 22 ± 1 kraadi juures, et vältida hiire hõljumist. Ringikujuline evakuatsiooniplatvorm (raadiusega 11 cm) asetati 05-1 cm veepinnast allapoole ühte neljast kvadrandist. Kolmel ajahetkel testiti rottide võrdlusmälu pärast 5-päevast treeningut ja iga treeningkatse osa koosnes neljast katsest 15-minutilise intervalliga. Teisel ja kolmandal ajahetkel eemaldati platvorm basseinist, seejärel viidi läbi ruumi- ja töömälu mõõtmine. Aeg, mille iga rott veetis platvormi otsides, registreeriti põgenemislatentsina. Pärast katseid pandi rotid kuumutatud puuridesse, enne kui nad naasid oma puuri.

Avamaa test viidi läbi 1. ja 3. päeval pärast anesteesiat, nagu on kirjeldanud Fricano jt21 Lühidalt, rotte testiti 27, 5 cm × 27, 5 cm ruudukujulisel areenil. Keskmine, 66 protsenti areenist, kuulus "keskuseks". Anksiolüütilise käitumise hindamise parameetrina registreeriti keskuses veedetud aeg.

Hirmu tingimise test viidi läbi nii, nagu eelnevalt kirjeldatud, vähese muudatusega, et uurida käesolevas uuringus rottide ruumilist mälu ja õppimisvõimet.22,23 Treening viidi läbi üks päev pärast anesteesiat. Igal rotil lasti 120 sekundit kambriga kohaneda, millele järgnes kokkupuude helistiimuliga (20 s, 80 dB) ja seejärel jala elektrišokk (2 s, 0,75 mA) 25 sekundit pärast heli. stiimul lõppes. Säritust korrati kaks korda 60-s intervalliga teise ja kolmanda särituse vahel. Konteksti test viidi läbi teisel ja kolmandal päeval pärast operatsiooni. Iga hiir pandi samasse kambrisse, mida kasutati treenimiseks, millele järgnes looma treenimiseks kasutatud sama ajavahemiku jooksul stiimuli ja jalašoki puudumine. Tulemused registreeriti ja koguti külmumisaja (mitteliikumise) protsent.

2.4|Kudede kogumine

Pärast käitumisanalüüsi 3. päeval pärast anesteesiat katserotid surmati; seejärel eemaldati ajukoed kohe ja hipokampus lõigati hoolikalt lahti. Valkude, RNA-de ja tsütokiinide analüüsiks külmutati hipokampus kohe vedelas lämmastikus ja säilitati temperatuuril -80 kraadi. Immunohistokeemiliseks analüüsiks fikseeriti kuded 4-protsendilise paraformaldehüüdiga 72 tundi ja seejärel viidi 20-protsendilise sahharoosi juurde veel 72 tunniks.

2,5|Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs

Kõik rotid surmati pärast käitumistesti 3. päeval. Hipokampuse kuded lõigati kohe jääl ja homogeniseeriti soolalahuses ultraheliga. Seejärel tsentrifuugiti kiirusel 10 000 × g 4 kraadi juures 15 minutit. IL-1, TNF- ja IL-6 tasemed määrati ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) komplektidega (eBioscience, San Diego, CA, USA) vastavalt tootja juhistele. Tuvastamispiirid olid 8.0 pg/mL IL{{10}}, 8.0 pg/mL TNF-i puhul ja 4,0 pg/mL IL{{16} puhul. }. Plasma IL-1, TNF- ja IL-6 kontsentratsioone 1. ja 3. päeval mõõdeti samuti ELISA abil.

2,6|Nitritite/nitraatide ning lipiidide ja valkude oksüdatiivse kahjustuse määramine

Nitriti/nitraadi (NO2−) kontsentratsiooni kogutud supernatandis mõõdeti Griessi reaktsiooniga (Sigma, St. Louis, MO, USA), mis näitas lämmastikoksiidi (NO) produktsiooni indikaatorit. Lühidalt, 100 μl supernatandile lisati 100 μl Griessi reaktiivi. Supernatandi koguvalgusisaldust mõõdeti BCA valguanalüüsi reaktiivikomplektiga (KeyGEN, Hiina) pärast ühetunnist inkubeerimist toatemperatuuril ja neeldumist mõõdeti spektrofotomeetriga 550 nm juures. Tulemused on nmol NO − mg valgu kohta.

Malondialdehüüdi (MDA) tase hipokampuses määrati MDA analüüsikomplektiga (Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Hiina) pärast kogumist homogeneerimise ja tsentrifuugimisega. Lipiidide oksüdatiivne kahjustus määrati tiobarbituurhappega reageerivate ainete (TBARS) testiga. Lühidalt, supernatandi proovid sadestati 10 protsendilise trikloroäädikhappega. Seejärel lisati tiobarbituurhape (0,67 protsenti) ja neeldumist testiti lainepikkusel 535 nm. 1,1,3,3-tetrametoksüpropaan kui välisstandard ja andmed väljendati malondialdehüüdi ekvivalentidena nmol ühe mg valgu kohta.

2,7|Antioksüdantsete ensüümide aktiivsuse tuvastamine

Superoksiiddismutaasi (SOD) aktiivsuse mõõtmiseks lisati 1{{10}} μL supernatante, mis saadi koe homogeniseerimise ja tsentrifuugimisega (10 000 × g, 15 minutit) 4 kraadi juures. 00 μL reaktsioonilahust (50 μL tetrasooliumi pluss 19,95 mL analüüsipuhvrit, sealhulgas 50 mM Tris-HCl, 0,1 mmol/L hüpoksantiinid ja 0,1 mmol/L dietüleentriamiinperäädikhape, pH 8,0). Seejärel lisati segudele reaktsiooni käivitamiseks 20 µl ksantiinoksiidi. Pärast loksutamist ja 20-minutilist inkubeerimist registreeriti spektrofotomeetriga neeldumise muutused lainepikkusel 450 nm. SOD aktiivsused arvutati tuvastamiskomplektiga kaasas oleva valemi abil (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA).

CAT aktiivsus hipokampuse koe supernatandis määrati spektrofotomeetriliselt, arvutades vesinikperoksiidi (H2O2) lagunemiskiiruse 240 nm juures. Lühidalt öeldes lisati substraadi segule (1000 μL), mis sisaldas 0,3 ml H2O2 50 ml 0,05 mol/l PBS-is (pH) 100 μL supernatanti (20 μL). 7.0). Neeldumised registreeriti 1 minut pärast reaktsiooni algust. Tulemused arvutati välisstandardite abil ja väljendati U-na mg valgu kohta.

2,8|RNA eraldamine ja kvantitatiivne PCR

Hippokampuse kuded homogeniseeriti, et saada kogu RNA-d, kasutades TRIzoli (Invitrogen), ja seejärel rakendati transkripti amplifikatsiooni, kasutades iScript cDNA sünteesikomplekti (Bio-Rad). Saadud cDNA-d amplifitseeriti qPCR-ga, kasutades iTaq Universal SYBR Green Supermixi (Bio-Rad) geenispetsiifiliste praimeritega, ja iga geeni suhteline ekspressioon arvutati 2-ΔΔCt meetodil ja normaliseeriti GAPDH kontrolliga. Praimeri järjestused on esitatud tabelis S1.

2,9|Western blot

Hipokampuse kuded homogeniseeriti rakkude lüüsipuhvris (50 mmol/L Tris, pH 7,5, 1 mmol/L EDTA, 150 mmol/L NaCl, 0,5 protsenti Triton X-100 , 0,5 protsenti NP-40, 1 mmol/L fenüülmetüülsulfonüülfluoriidi, 5 mmol/L naatriumvanadaati, 1 mmol/L naatriumfluoriidi, 1 ug/ml aprotiniini, pepstatiini ja leupeptiini). Valgud eraldati SDS-PAGE geelidega ja seejärel viidi geelides olevad valgud üle PVDF membraanidele (Millipore). Membraanid blokeeriti 5% piimaga ja seejärel inkubeeriti spetsiifiliste primaarsete antikehadega, sealhulgas anti- -APP (ab76763, 1:1000 lahjendus), anti-BDNF (ab108319, 1:1000 lahjendus), anti-GFAP (ab68428). , 1:1000 lahjendus), anti-Iba-1 (ab178847, 1:1000 lahjendus), anti-PPAR- (ab209350, 1:1000 lahjendus), anti-NF-κB (ab32360, 1:1000 lahjendus) ja anti-GAPDH (ab181602, lahjendus 1:1000). Seejärel kasutati TBST-d membraanide pesemiseks ja seejärel inkubeeriti seda HRP-ga konjugeeritud sekundaarsete antikehadega (Santa Cruz, CA, USA). Lõpuks jälgis asjakohast valku ECL-süsteem (PerkinElmer), võttes arvesse tootja selgitust. Ja ImageJ-d kasutati suhtelise valgu ekspressiooni kvantitatiivseks analüüsiks.

2.10|Fluorestsents-aktiveeritud rakkude sorteerimise (FACS) analüüs

FACS analüüsi jaoks koguti hipokampuse rakud kohe pärast isoleerimist. Seejärel pesti rakke jääkülma fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) ja resuspendeeriti PBS-is, mis sisaldas 2 protsenti FBS-i. Iga testi jaoks värviti 1 × 105 rakku 100 µl PBS-FBS-s fluorestseeruvalt konjugeeritud CD11b (BD PharMingen, kataloog nr 554982, 1:250) ja CD45 (BD PharMingen, kataloogi nr 554878, 1:250) jääga antibodies. 2 tundi 4 kraadi juures pimedas. Pärast külma PBS-ga pesemist resuspendeeriti rakud 300 ui PBS-FBS-is. Ja voolutsütomeetriline analüüs viidi läbi FACSAria I voolutsütomeetriga (BD Biosciences). Tulemusi analüüsiti FlowJo (versioon 7.6.1) abil.

2.11|Nissl värvimine

Kogutud hipokampus sisestati OCT ühendisse ja lõigati seejärel külmutusmikrotoomi (Leica) abil {{0}} μm koronaalseteks osadeks. Pärast sulatamist laetud alusklaasidele pesti sektsioone kolm korda 0,01 mol/L PBS-iga kokku 15 minutit ja inkubeeriti seejärel kresüülvioletses lahuses (0,5 protsenti, mis sisaldas mõnda tilka jää-äädikhapet). hape) 10-15 minutit toatemperatuuril. Pärast kahekordset destilleeritud veega pesemist dehüdreeriti sektsioonid etanoolis järk-järgult (70 protsenti, 85 protsenti, 95 protsenti ja 100 protsenti). Pärast dehüdratsiooni asetati need ksüleeni ja kaeti kinnitusvahendiga. Lõpuks täheldati Nissli värvimist mikroskoobi all (Leica).

2.12|Andmete analüüs

Andmeid analüüsiti tarkvara GraphPad Prism 6.{1}} abil. Käitumisuuringute andmeid analüüsiti erinevatel ajahetkedel (1. või 3. päev) pärast sevofluraanesteesiat, kasutades korduvate mõõtmistega kahesuunalist dispersioonanalüüsi (ANOVA). Muid andmeid analüüsiti ühesuunalise ANOVA abil enne Bonferroni testi. Kõik katsed viidi läbi kolmes korduses ja tulemused väljendati keskmisena ± SEM P < 0,05="" loeti="" statistiliselt="">

3|TULEMUSED

3.1|Cistanche hoidis ära vanematel rottidel ebanormaalset neuropõletikku

Täiskasvanud ja vananevate rottide kognitiivse funktsiooni erinevuse uurimiseks kasutati sevofluraani anesteesia esilekutsumiseks 3- ja 24-kuuste rottide puhul. Seejärel hinnati hipokampusest sõltuvat käitumist 1. ja 3. päeval (joonis S1A). Nagu on näidatud joonisel S1B, ei olnud 1. päeval nelja katserühma põgenemislatentsus erinevust. Lisaks olid keskuses veedetud aeg ja külmumise protsent sarnased rottidele, kes said 1. päeval kandjat ja sevofluraani (joonis S1C, D). Kuid 3- ja 24- kuu vanustel rottidel olid põgenemislatentsus, keskuses veedetud aja ja patsientide protsendi osas olulised erinevused.

külmutamine pärast sevofluraani esilekutsumist 3. päeval, mis viitab sellele, et sevofluraan muutis oluliselt vanade loomade kognitiivset funktsiooni (joonis S1B-D). Järgmistes katsetes kasutati seega vanu rotte.

Sevofluraaniga kokkupuutunud eakatel rottidel tsistanche mõju uurimiseks neuroinflammatsioonile hindasime põletikueelse tsütokiini taset. Neuropõletiku tõendid ilmnesid 24 tundi pärast sevofluraanesteesiat, mida näitas põletikueelsete tsütokiinide IL-1, IL-6 ja TNF- kõrge kontsentratsioon plasmiidis 1. ja 3. päeval. (joonis 1A, 1) ja neuropõletikku näitasid põletikueelsete tsütokiinide mRNA-de tõus hipokampuses kuni 3 päeva (joonis 1C-E). Iga põletikueelse teguri puhul kõrvaldas tsüstanche-ravi erinevused sevofluraanist põhjustatud muutustes põletikueelsetes vahendajates. Cistanche nõrgendas märkimisväärselt sevofluraani põletikueelseid tsütokiine

3.2|Ravi Cistanches Herba ekstraktiga nõrgendas sevofluraanist põhjustatud oksüdatiivset stressi vanade rottide hipokampuses

Järgmisena uurisime cistanche mõju sevofluraani poolt indutseeritud oksüdatiivsele stressile. Nagu on näidatud joonisel fig 2A, leidsime, et tsüstanšiga töötlemine hoidis ära sevofluraanist põhjustatud oksüdatiivse stressi, nagu viitab nitriti / nitraadi kontsentratsiooni märkimisväärselt vähenemine hipokampuses. Samuti täheldasime, et SEVO pluss cistanche rühmas esines madalam MDA ekvivalentide tase, mis on lipiidide oksüdatiivse kahjustuse indeks, hipokampuses kolm päeva pärast sevofluraani sissehingamist, võrreldes SEVO-ga.

rühm (joonis 2B). Lisaks vähenes sevofluraanesteesiaga (SEVO rühm) saanud rottidel SOD ja CAT aktiivsus 3. päeval pärast anesteesiat hipokampuses. Kuid nende ensüümide hipokampuse aktiivsus suurenes SEVO pluss cistanche rühmas märkimisväärselt, võrreldes SEVO rühmaga (joonis 2C, D).

CistancheToidulisand leevendab antioksüdatiivset stressi

3,3| Cistanches Herba ekstraktiga töötlemine nõrgendas mikrogliia aktivatsiooni

Mikrogliia rakud aktiveeruvad labori või anesteesiast põhjustatud põletiku ajal hipokampuses, mis aitab kaasa patoloogilisele arengule. Et uurida, kas cistanche võib mikrogliia aktivatsiooni ära hoida, mõõtsime aktiveeritud mikrogliia rakkude populatsiooni ja selle suhtelisi markereid. Puhkeolekus olev mikroglia ekspresseeris CD11b ja CD45 madalat ekspressiooni, samas kui aktiveeritud mikroglia ekspresseeris CD11b ja CD45 kõrget taset. Nagu on näidatud joonisel 3A, kinnitasid voolutsütomeetria analüüsi tulemused, et CD45 protsent oli tsistanšiga töödeldud rottidel oluliselt madalam kui SEVO-indutseeritud rottidel (0,495 ± 0).{15} }51 protsenti pärast tsüstanche-ravi vs 1,127 ± 0,032 protsenti SEVO rühmas). Seejärel mõõtsime gliaalmarkereid qRT-PCR abil. Pärast sevofluraaniga anesteesiat mRNA

3,4|Ravi Cistanches Herba ekstraktiga nõrgendas sevofluraani poolt indutseeritud neuronaalset apoptoosi

Neuronaalset apoptoosi põhjustavad osaliselt aktiveeritud mikrogliia ja oksüdatiivne stress ning me olime kinnitanud, et tsistanche võib in vivo ära hoida mikrogliia aktivatsiooni ja oksüdatiivset stressi. Tistanche farmakoloogiliste mõjude edasiseks uurimiseks testisime neuronaalset apoptoosi TUNELi värvimise ja lõhustatud kaspaas 3 ja Bax/Bcl-2 immunoblotiga. Nagu on näidatud joonisel 4A, suurendas sevofluraan rakkude apoptoosi hipokampuse piirkondades. Cistanche manustamine vähendas TUNEL pluss rakke pärast sevofluraanesteesiat. Näitlesime ka kaspaas 3 ja Baxi märkimisväärset kõrget taset, samas kui madalat Bcl-2 taset tuimastatud vanade rottide hipokampuses. Rottidel, kellele manustati enne anesteesiat tsistanši, ilmnes kaspaas 3 aktiivsuse (joonis 4B), lõhustatud kaspaas 3 ja Bax valgu (joonis 4C, D) oluline vähenemine, mis oli kooskõlas TUNELi värvimisel täheldatud vähenenud neuronaalse apoptoosiga.

3,5|Ravi Cistanches Herba ekstraktiga leevendas kognitiivset düsfunktsiooni ja hipokampuse kudede kahjustust pärast sevofluraanist põhjustatud anesteesiat

Cistanche rolli edasiseks uurimiseks kognitiivsele funktsioonile manustati rottidele kolm järjestikust päeva enne anesteesiat suukaudselt 50 mg/kg. Tistanšiga ravitud rühmas (rühm SEVO pluss cistanche) lühenes põgenemislatentsus oluliselt, keskuses viibitud aeg oli pikem ja külmumise protsent suurenes 3. päeval pärast anesteesiat, võrreldes SEVO rühmaga (joonis 5A- C). Need tulemused näitasid, et cistanche võib vähemalt osaliselt päästa kognitiivseid häireid. Lisaks hindasime Nissli värvimise abil nelja rühma neuronite surma ulatust rottide hipokampuses. Kujutised näitasid, et rakkudel ei olnud ilmseid kõrvalekaldeid grupikontrollis ja rühmakontrollis pluss tsüstanche. Kuid ellujäämisneuronite arv CA1 piirkondades vähenes SEVO-indutseeritud rottidel võrreldes kontrollrühma omaga 3. päeval oluliselt. Ravi tsistanšiga muutis SEVO selle toime ja soodustab oluliselt neuronite ellujäämist võrreldes ainult SEVO-indutseeritud rottidega. (Joonis 5D).

3,6|Ravi Cistanches Herba ekstraktiga vähendas sevofluraani poolt indutseeritud põletikueelset tsütokiini tootmist PPAR- -tundlikul viisil

Järgmisena uurisime, kas cistanche mõju tsütokiinide tootmisele oli PPAR{0}}tundlik. Ravi GW9662-ga (rühm SEVO pluss GW9662) suurendas SEVO rühmaga võrreldes IL-1, IL-6 ja TNF-i taset. Kuid ravi tsistanchega vähendas SEVO-indutseeritud põletikueelset tsütokiini tootmist. Tähelepanuväärne

3,7| Tistanches Herba ekstraktiga ravi pärssis sevofluraanist põhjustatud oksüdatiivset stressi PPAR-i kaudu

On teatatud, et sevofluraan võimendab kognitiivset düsfunktsiooni kroonilise vahelduva hüpoksiaga indutseeritud rotimudelis PPAR ekspressiooni pärssimise kaudu hipokampuses.1 Järgmiseks mõtlesime, kascistanchetoimus PPAR{0}}sõltuval viisil. Sel eesmärgil kasutati edasistes uuringutes GW9662, PPAR- selektiivset ja pöördumatut antagonisti. Ravi GW9662-ga 30 ng juures soodustas oksüdatiivset stressi, mida näitas nitriti/nitraadi ja MDA suurenenud tase. Siiski suurenesid antioksüdatiivsed markerid SOD ja CAT hipokampuses 3. päeval võrreldes SEVO-opereeritud rottidega. Ravi kooscistanchevähendas SEVO-indutseeritud oksüdatiivse stressi markerite ületootmist ja hõlbustas SOD ja CAT aktiivsust (joonis 7A-D). Peale selle tekitavad need mõjudcistancheGW9662 tühistas, mida täheldas nitriti/nitraadi (joonis 7A) ja MDA (joonis 7B) tootmise suurenemine. Lisaks on

Cistanche'i mõju SOD ja CAT aktiivsusele muutis ka GW9662 (joonis 7C, D), mis näitab PPAR- osalemist.

3,8|Ravi Cistanches Herba ekstraktiga pärssis mikrogliia aktivatsiooni ja neurotsüüdi apoptoosi ning leevendas kognitiivset langust PPAR- --tundlikul viisil

Järgmine samm oli uurida, kas mõju oncistanchemikrogliia aktivatsiooni ja neurotsüüdi apoptoosi suhtes olid PPAR{0}}tundlikud. Ravi GW9662-ga suurendas CD68 (joonis 8A), GFAP (joonis 8B) ja Iba-1 (joonis 8C) mRNA taset. Nimelt kõrvaldas need GW9662 tekitatud mõjud tõhusaltcistanche, mida täheldas nende samade markerite vähenemine (joonis 8A-C). Veelgi enam, GW9662 poolt toodetud GFAP ja Iba -1 valgu ekspressioon pöördus samuti tagasi tsistanche poolt, mis näitab, et cistanche inhibeerib mikrogliia aktivatsiooni ja sõltub vähemalt osaliselt PPAR-st. Lisaks pärssis GW9662 cistanche mõju -APP ja BDNF valgu ekspressioonile (joonis 8D, E). Uurimaks, kas tsistanche võib inhibeerida neurotsüüdi apoptoosi PPAR{8}}tundlikul viisil, tuvastati apoptoosiga seotud valgud. Nagu on näidatud joonisel fig 8F, G, vähendas cistanche annuses 50 mg/kg proapoptoosi valgu (lõhustatud kaspaas 3 ja Bax) ekspressiooni. Kuid need mõjud päästis suures osas GW9662.

Cistancheekstrakt võib leevendada raku apoptoosi

Kuna oksüdatiivse stressi ja põletiku tasemed olid anesteesiajärgsetel rottidel tihedalt seotud kognitiivse funktsiooniga, määrasime lisaks kindlaks, kascistanchekognitiivse düsfunktsiooni osas sõltus PPAR{0}}. Nagu on näidatud joonisel 8H-J, võrreldes rottidega