Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Chien-Liang Chao , Hsin-Wen Huang , Hui-Chi Huang , Hsin-Fan Chao , Shuen-Wen Yu ,Muh-Hwan Su , Chao-Jih Wang ja Hang-Ching Lin

Abstraktne

Cistanche tubulosa vesiekstrakt(CTE) kasutatakse juba botaanilise retseptiravimina dementsuse raviks Hiinas. Meie varasemad uuringud näitasid, et CTE fenüületanoidi glükosiidid.Cistanche tubulosa vesiekstrakt) on Alzheimeri tõve (AD) vastane aktiivsus, pärssides amüloidide β peptiidi (Aβ) agregatsiooni ja ladestumist. Kuid hiljutistes uuringutes leiti, et fenüületanoidi glükosiide võivad metaboliseerida soolebakterid, sest kõik analüüsitulemused näitasid, et fenüületanoidi glükosiidide biosaadavus on äärmiselt madal. Selles uuringus näitame, kuidas raua kelaat mängib olulist rolli Aβ agregatsiooni ja ladestumise pärssimise mehhanismis.fenüületanoidi glükosiididCTE-st(Cistanche tubulosa vesiekstrakt). Lisaks tõestasime, et fenüületanoidi glükosiidid (1–3) võivad jõuda ajju. Aktiivne CTE(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)komponentide ja tegevusmehhanismi kinnitamine on suureks abiks toodete kvaliteedikontrolli ja biosaadavuse uuringutes tulevikus. Samal ajal pakume uut analüüsimeetodit, mis on kasulik fenüületanoidi glükosiidide (1–3) määramiseks taimedes, toitudes, veres ja kudedes keemiliste sõrmejälgede ja farmakokineetiliste uuringute jaoks.

Märksõnad: Cistanche tubulosa; fenüületanoidi glükosiidid; Alzheimeri tõbi; raua kelaat

Cistanche tubulosa

1. Sissejuhatus

Dementsus on üks levinumaid kroonilisi vananemishaigusi. 2015. aastal hinnati maailma Alzheimeri aruandes, et dementsuse all kannatas umbes 46,8 miljonit inimest ning 2030. aastal on see arv eeldatavasti 74,7 miljonit ja 2050. aastal 131,5 miljonit [1]. Ülemaailmne dementsuse populatsioon suureneb aasta-aastalt ja väljub tulevikus kontrolli alt. Ülemaailmsed tervishoiukulud dementsuse raviks olid 2010. aastal peaaegu 604 miljardit USA dollarit ja 2030. aastal eeldatavasti 1000 miljardit dollarit [2]. Dementsusega patsientidel on suurem juhusliku surma oht [3] ja seetõttu vajavad nad rohkem arstiabi. See on dementsusega patsientide perekondlike hooldajate jaoks raske koorem. Dementsuse mõju hooldajatele, perekonnale ja ühiskonnale võib põhjustada suurt füüsilist, psühholoogilist, elu ja majanduslikku stressi. Dementsusel on kaks peamist vormi: Alzheimeri tõbi (AD) ja vaskulaarne dementsus [4,5]. AD on kõige levinum dementsus ning pöördumatu ja progresseeruv neurodegeneratiivne häire [4–6]. AD oli 2015. aastal Ameerika Ühendriikides kuues peamine surmapõhjus [6].

Hiljutised uuringud kinnitavad, et amüloidide poolt indutseeritud neuronite toksilisus β peptiid (Aβ) (naastud) ja valgu tau (tangles) agregatsioon on tihedalt seotud AD patogeneesiga. Aβ ja valgu tau kogunemine ajusse võib põhjustada neuronite kahjustusi ja mälukaotust [7]. Lahustumatud Aβ oligomeerid kogunevad rakuvälistesse naastudesse ja teatasid, et need põhjustavad sünaptilist düsfunktsiooni, neuronite toksilisust ja rakkude surma [8]. Kahjuks ei ole seni olnud tõhusat ravi Aβ ja valgu tau puhastamiseks või Aβ moodustumise või oligomerisatsiooni pärssimiseks ning pöördumatu neuronikahjustuse peatamiseks või raviks. Praegused terapeutilised ained, nagu galantamiin ja donepesiil, mis on atsetüülkolinesteraasi inhibiitorid, võivad neurotransmitteri taseme tõstmisega mälukaotust ainult ajutiselt leevendada. 2012. aastal ei suutnud ükski kandidaatravim vähendada Aβ toimet suurtes AD patsientide kliinilistes uuringutes [9]. Seetõttu on hädasti vaja uurida uudset ravi Alzheimeri tõve levimuse pärssimiseks. Metallioone peeti hiljuti võtmeteguriks, mis oli tihedalt seotud Aβ liitmisega [10]. Metalli kelaatorid, mida peetakse potentsiaalseteks pliiühenditeks, pakuvad täiesti uut strateegiat AD-vastaseks lähenemisviisiks [9,11–15].

Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wighti kuivatatud vars, Rou Cong Rong, koristatakse laialdaselt Hiina kõrbes Xinjiangis. See on oluline traditsiooniline hiina meditsiin, mis kuulub Hiina farmakopöas indekseeritud toonilisse hiina meditsiini ja mida kasutatakse tuhandeid aastaid füüsilise nõrkuse, neerupuuduse, viljatuse, unustamise, impotentsuse ja seniilse kõhukinnisuse raviks [16,17].Cistanche tubulosa vesiekstrakt(CTE) kapslid on heaks kiidetud vaskulaarse dementsuse botaanilise ravimina Hiinas. Kliinilise uuringu kohaselt, milles osales 18 patsienti, kellel diagnoositi kerge kuni mõõdukas AD, CTE(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)kapslid andsid patsientidele stabiilsema mäluseisundi võrreldes atsetüülkolinesteraasi inhibiitoritega [18]. Meie eelmises uuringus CTE(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)vähenes amüloid β peptiidi (Aβ) sadestumise ja paranes mälukaotus Alzheimeri tõvega sarnastel rottidel [19]. CTE peamisteks komponentideks loetakse fenüületanoidi glükosiide, echinakosiide (1), aktiosiid (2) ja iso-aktiosiid (3)(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)[20]. Ühendil 1 on neuroprotektiivne toime toksilisuse vastu 1-metüül-4-fenüül-1,2,3,6-tetrahüdromüridiin (MPTP) [21], 1-metüül-4-fenüülpüridiniumiooni (MPP+) [22] ja 6-hüdroksüdopamiin (6-OHDA) [23]. Meie eelmine aruanne näitas, et 1 pärsis Aβ oligomerisatsiooni ja toksilisust in vitro uuringus ning pärssis Aβ ladestumist, parandades mälu halvenemist ja kognitiivset düsfunktsiooni Aβ indutseeritud rottidel [24]. Ühendid 2 ja 3 suurendasid Aβ lagunemist ja vähendasid Aβ oligomerisatsiooni in vitro [25]. Ühend 3 vähendas Aβ ladestumise Aβ indutseeritud rottidel [25]. Nende uuringute põhjal on C. tubulosa juba tõestanud, et tal on potentsiaal ravida AD. CTE-d.(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)on tihedalt seotud anti-Aβ koondamise ja ladestumisega [24,25]. CTE paremaks mõistmiseks(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)mehhanismil, peab meil olema mugav ja tõhus meetod aktiivse komponendi tuvastamiseks, samuti ajukoe proovide sisu tuvastamiseks. Enamik uuringuid oli mõeldud echinakosiidi, aktiosiidi ja iso-aktiosiidi kvantitatiivseks määramiseks maitsetaimedes või toiduainetes suure jõudlusega vedela kromatograafia (HPLC) [26–28] abil, kuid ainult kaks uuringut olid määramiseks seerumis või kudedes [29,30]. Siiski ei ole aruannet 1–3 samaaegse analüüsi kohta ajukudedes pärast CTE-d.(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)suuline manustamine. Lisaks ei ole hiljutistest uuringutest veel selge, kas CTE(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)aktiivsed komponendid või nende metaboliidid läbisid edukalt vere-aju barjääri ja toimisid aju neuronitel. Seetõttu pakub see uuring täiustatud ja tundlikku meetodit veenvate tõenditega, mis illustreerivad selgelt CTE aluseks olevat mehhanismi.(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)Aβ koondamise ja deponeerimise vastu.

Cistanche tubulosa vesiekstrakt

2. Tulemused

2.1. Kolme peamise ühendi isoleerimine ja identifitseerimine (1–3)

C. tubulosa kuivatatud varred ekstraheeriti toatemperatuuril 75% EtOH-ga. Kondenseerunud 75% EtOH ekstrakt allutati vaigule ja C18 kolonnikromatograafiale, et anda kolm peamist ühendit: echinakosiid (1), aktiosiid (2) ja iso-aktiosiid (3). Nende struktuure selgitati NMR (Nuclear Magnetic Resonance) spektroskoopia ja ESI-MS (Elektrospray ionisatsioonimass) analüüsiga ning kirjanduse andmetega võrdlemisel [31–33] (joonis 1, täiendavad materjalid arvud S3–S11).

2.2. Fenüületanoidi glükosiidid (1–3) CTE sisuanalüüs(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)

Analüüsimeetod valideeriti fenüületanoidi glükosiidide analüüsimiseks. 1–3 (5,0 mg) ühendid kaaluti täpselt ja segati 50% metanooliga (40 ml). Segud lõigati 5 minutit. Kolm fenüületanoidi glükosiidi (1–3) standardlahust segati standardse laolahusena (100 μg/ml). Standardset laolahust kasutati viie erineva kontsentratsiooni (5,10, 25, 50 ja 100 μg/ml) valmistamiseks vastavalt näidatud lahustest, lahjendades seeriamahtudega 50% metanooli. Fenüületanoidi glükosiidid (1–3) kõverad määrati ülijõudlusega vedela kromatograafia (UPLC) abil 5–100 μg/ml ja olid lineaarsed vastavalt (1, r2 = 0,9999; 2, r2 = 0,9999; 0,9999; 3, r2 = 0,9998). Päevasisene ja päevasisene täpsus [% R.S.D. (suhteline standardhälve)oli 0,1 kuni 1,8%] ja täpsus (95,6–104,2%) oli UPLC-le vastuvõetav 1–3. UPLC kvantifitseeris CTE 1, 2 ja 3(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)sisu vastavalt 254, 38 ja 41 mg/g (joonis S2)

2.3. UPLC/MS/MS valideerimine

Fenüületanoidi glükosiidid (1–3) segati ja naelutati roti ajukoe homogenaadiga ja neid analüüsiti Ultra jõudlusega vedela kromatograafia-tandemmassispektromeetri (UPLC/MS/MS) abil tahke faasi ekstraheerimisega. Avastamise alampiir (LLOQ) 1–3 oli 0,2 ng/ml. Fenüületanoidi glükosiidide taastumine suurenes ajukoe homogenaadiga (10 ng/ml) 91,39% -ga 1,89,54% -ga 2-ga ja 96,81% -ga 3-ga (joonis 2).

2.4. AD-sarnaste roti ajukudede analüüs

Pärast 14-päevast CTE-d(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)suukaudne manustamine (200 mg/kg päevas), AD-sarnased roti ajukuded koguti ja jagati kaheks osaks, hipokampuseks ja striatumiks, ning mõlemad homogeniseeriti [19]. Kuna igast rotist pärit hipokampuse ja striatumi homogenaadid olid liiga vähe, et neid tahkefaasiliseks ekstraheerimiseks ja liigsete eksperimentaalvigade vältimiseks, segati nelja üksiku roti hipokampuse ja striatumi homogenaadid UPLC/MS/MS analüüsitud proovi, kasutades tahke faasi ekstraheerimise meetodit (joonis 3A, B). Fenüületanoidi glükosiide (1–3) täheldati hipokampuses (joonis 3A) ja striatumis (joonis 3B). Tühjades ajukudedes ei olnud märkimisväärset tippu (joonis 3C). Hipokampuses oli echinacoside sisaldus 11,97 ± 0,34 ng/ml, aktiosiidisisaldus 1,25 ± 0,16 ng/ml ja isoatsoliidi sisaldus 1,38 ± 0,08 ng/ml. Striatumis oli echinacoside sisaldus 22,60 ± 1,69 ng/ml, aktioside sisaldus 2,03 ± 0,61 ng/ml ja isoatsetosiidi sisaldus 4,90 ± 0,64 ng/ml. Nagu on näidatud joonisel 4, on CTE(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)läbiks vere-aju barjääri vastavalt märkimisväärsetele tuvastatavatele kogustele 1–3 hipokampuses ja striatumis. CTE-s on sisu 1 palju suurem kui 2 ja 3(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)UPLC analüüsi (joonis S2). Seetõttu on mõistlik märkida, et 1 on ajukoe kõrgeim pärast suukaudset CTE-d.(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)administratsioon. Molekulid 2019, 24, x VASTASTIKUSE EKSPERDIHINNANGU JAOKS 4/12 2.4. AD-laadsete roti ajukudede analüüs pärast 14-päevast CTE-d(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)suukaudne manustamine (200 mg/kg päevas), AD-sarnased roti ajukuded koguti ja jagati kaheks osaks, hipokampuseks ja striatumiks, ning mõlemad homogeniseeriti [19]. Kuna igast rotist pärit hipokampuse ja striatumi homogenaadid olid liiga vähe, et neid tahkefaasiliseks ekstraheerimiseks ja liigsete eksperimentaalvigade vältimiseks, segati nelja üksiku roti hipokampuse ja striatumi homogenaadid UPLC/MS/MS analüüsitud proovi, kasutades tahke faasi ekstraheerimise meetodit (joonis 3A, B). Fenüületanoidi glükosiide (1–3) täheldati hipokampuses (joonis 3A) ja striatumis (joonis 3B). Tühjades ajukudedes ei olnud märkimisväärset tippu (joonis 3C). Hipokampuses oli echinacoside sisaldus 11,97 ± 0,34 ng/ml, aktiosiidisisaldus 1,25 ± 0,16 ng/ml ja isoatsoliidi sisaldus 1,38 ± 0,08 ng/ml. Striatumis oli echinacoside sisaldus 22,60 ± 1,69 ng/ml, aktioside sisaldus 2,03 ± 0,61 ng/ml ja isoatsetosiidi sisaldus 4,90 ± 0,64 ng/ml. Nagu on näidatud joonisel 4, on CTE(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)läbiks vere-aju barjääri vastavalt märkimisväärsetele tuvastatavatele kogustele 1–3 hipokampuses ja striatumis. CTE-s on sisu 1 palju suurem kui 2 ja 3(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)UPLC analüüsi abil. Seetõttu on mõistlik märkida, et 1 on ajukoe kõrgeim pärast suukaudset CTE-d.(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)Administraator.

2.5. Fenüületanoidi glükosiidid (1–3) Metalli kelatsiooni aktiivsus

Kirjanduses viidi vabade ühendite ja nende metallikompleksi määramine läbi HPLC abil [34,35]. Selles uuringus analüüsis UPLC kelatsiooni aktiivsuse mõõdet. Iga fenüületanoidi glükosiidi (1–3) 50 μg/ml lahused lisati vastavalt vase (Cu), kaltsiumi (Ca), magneesiumi (Mg), tsingi (Zn), raua (Fe) või roti seerumi 10 μg/ml lahusesse. Uplc analüüsis iga ühendit iga metallilahusega või seerumiga. Fenüületanoidi glükosiidid (1–3) näitasid metalli kelaatimistegevust raua ja seerumiga (joonis 5, Lisamaterjalide joonis S1). Molekulid 2019, 24, x VASTASTIKUSE EKSPERDIHINNANGU JAOKS 5 12-st proovist AD-sarnastelt rottidelt pärast CTE-d(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)suukaudne manustamine (200 mg/kg, p.o.) [1 (tR = 4,19 min), 2 (tR = 5,13 min) ja 3 (tR = 5,68 min)]. c) Tühi ajukude. Joonis 4. Fenüületanoidi glükosiidid (1–3) olid tuvastatavad roti ajukudedes[19] kasutades UPLC/MS/MS. Esitatud andmed tähendavad ± S.D., n =3 iga rühma kohta. 2.5. Fenüületanoidi glükosiidid (1-3) Metalli kelaatimistegevus. Kirjanduses viidi vabade ühendite ja nende metallikompleksi määramine läbi HPLC abil [34,35]. Selles uuringus analüüsis UPLC kelatsiooni aktiivsuse mõõdet. Iga fenüületanoidi glükosiidi (1–3) 50 μg/ml lahused lisati vastavalt vase (Cu), kaltsiumi (Ca), magneesiumi (Mg), tsingi (Zn), raua (Fe) või roti seerumi 10 μg/ml lahusesse. Uplc analüüsis iga ühendit iga metallilahusega või seerumiga. Fenüületanoidi glükosiidid (1–3)

2.6. Echinacoside'i (1) analüüs Roti seerumis Vivos

Selleks, et mõista echinakosiidi jaotumist roti seerumis, koguti seerum algajast kuni 720 minutini pärast echinakosiidi (1) suukaudset manustamist (100 mg/kg) ja seerum koguti esialgsest ajast kuni 720 minutini pärast echinacoside 'i (1) suukaudset manustamist (100 mg/kg) ja analüüsiti UPLC poolt. Joonisel 6 on näidatud echinakosiidi kontsentratsioon versus ajaprofiilid roti seerumis.

3. Arutelu

Dementsus, eriti AD, on pöördumatu vananemine ja krooniline haigus, mis viib Gordiani küsimuste sõlme. See ületamatu haigus toob kaasa tõsised majandusprobleemid, millel on tohutu ja kasvav rahaline koormus. Kogu maailmas teevad AD teadlased palju jõupingutusi uute AD-vastaste ravimite uurimiseks, kuid ebaõnnestusid mitmetes suurtes kliinilistes uuringutes, mis olid suunatud Aβ-le 2012. aastal [9]. Välja arvatud otsene sihtimine Aβ, peetakse metalliiooni homöostaasi ajus peamiseks põhjuseks, mis on seotud Aβ agregatsiooni ja ladestumisega, mis viib AD moodustumiseni [9,10]. Seetõttu mängivad metalliioonid olulist rolli AD patogeneesis ja metalli kelatsiooni hüpotees on muutunud oluliseks uurimissuunaks [9,13–15].

Vastavalt meie varasematele uuringutele [18,19,24,25], CTE(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)võimaliku dementsusevastase aktiivsusega. Isegi inimeste kliinilistes uuringutes, pärast 1-aastast ravi CTE-ga(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)mõõdukate AD-patsientide kapslid, Alzheimeri tõve hindamise skaala-kognitiivse alamskaala (ADAS-cog) skoor ei näita olulist halvenemist võrreldes enne ravi [18]. CTE(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)hoidis ADAS-cog skoori AD patsientidel stabiilsena, kuid teised retseptiravimid seda ei teinud. Ainus valik AD-raviks litsentseeritud retseptiravimeid on atsetüülkolinesteraasi inhibiitorid (AChEI-d), nagu donepesiili ja galantamiin, mis parandavad AD sümptomeid lühiajaliselt, kuid halvenemine toimub pärast 1-aastast ravi [36]. Kliiniliste uuringute põhjal on CTE(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)tal on võimalus olla AD-vastase aine väljatöötamise potentsiaalne ravi. Meie varasemate aruannete [24,25] põhjal kaitseksid echinakoside (1), acteoside (2) ja iso-aktiosiid (3) neuroneid Aβ kahjustuste eest, vähendaksid Aβ oligomerisatsiooni in vitro ja leevendaksid oluliselt Aβ in vivo poolt indutseeritud kognitiivset düsfunktsiooni. In vitro uuring näitas, et 1–3-aastased aktiivsed annused olid kuni 50 μg/ml [24,25]. Kuid varasemates uuringutes leiti, et suukaudne biosaadavus 1 ja 2 oli rottidel väga madal (0,83% 1 ja 0,12% 2 puhul) [29,30]. Ühendit 1 ei olnud võimalik isegi inimese seerumis pärast suukaudset ehhinaatsea tableti manustamist tuvastada [37]. Praegused uuringud näitavad, et 1–3-l oli halb membraani läbilaskvus ja imendumine soolerakkudes [38] ja enamik 1-st metaboliseeritakse seedetrakti kanalites [39]. 2. ühendi sisaldus roti seerumis oli pärast 15-minutilist intravenoosset süstimist ainult umbes 4,5 μg/ml annusega 10 mg/kg aktiosiidi [30]. Kuid see uuring näitab, et pärast CTE-d tuvastatakse roti ajukudede hipokampuses ja striatumis 1–3.(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)suuline manustamine (joonised 3 ja 4). Lisaks näitas joonis 6, et 1. ühendi sisaldus roti seerumis suurenes umbes 5 korda 15 minutilt 720 minutile pärast ühendit 1 suukaudset manustamist (100 mg/kg). Kaalusime CTE fenüületanoidi glükosiide(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)läbiks vere-aju barjääri ja CTE vahel toimuks kelatsioonitegevus(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)Ja metalli. Kelatsioon on pöörduv keemiline reaktsioon. Raud on seerumi ja aju oluline element [10,40]. Joonisel 5 on näidatud, et kolmel fenüületanoidi glükosiidil oleks metallist kelaatimisaktiivsus raua ja seerumiga. Raud ja seerum muudavad ilmselgelt kolme fenüületanoidi glükosiidi maksimaalset säilitusaja piirkonda. Raua kelatsioon võib olla oluline põhjus, mis viib fenüületanoidi glükosiidide väga madala biosaadavuse valesti tuvastamiseni. Seetõttu tuleks metalli kelaatimise aktiivsust kaaluda kolme CTE vereseerumis ja ajuanalüüsis.(Cistanche tubulosa vesiekstrakt)fenüületanoidi glükosiidid tõelise biosaadavuse ja farmakokineetika taastamiseks. Lisaks näitasid tulemused, et kolm fenüületanoidi glükosiid (1–3) läbivad vere-aju barjääri ja jõuavad aju kudedesse keha vereringe kaudu. Selles uuringus töötati välja kõige kiirem ja tundlikum meetod 1–3 analüüsiks UPLC/MS/MS abil ning esitati võimsaid tõendeid selle kohta, et fenüületanoidi glükosiidid (1–3) on CTE peamised bioaktiivsed koostisosad.(Cistanche tubulosa vesiekstrakt).

Cistanche tubulosa ekstrakt

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Taimne materjal

C. tubulosa varred koguti 2016. aasta mais Hangzhoust, Hiinast. Tehase tuvastas Dr. Lin H.C. Voucheri näidised (nr 20016CT) on hoiule antud Aadressil Sinphar Tian-LiPharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, Hiina.

4.2. Isolatsioon ja puhastamine

Kuivatatud C. tubulosa vars jahvatati pulbriks ja seejärel ekstraheeriti viis korda 75% EtOH-ga.Pärast lahusti aurustumist vähendatud rõhu all tehti toorekstraktile Macroporousresin AB-8 kolonnikromatograafia H2O / EtOH astmiklahusti süsteemidega 20% EtOH kuni 100% EtOH. Õhukese kihi kromatograafia kohaselt koguti edasiseks eraldamiseks neli fraktsiooni (Fr.1 ~ Fr.4). Fr. 2-le tehti cosmosil® 5C18-AR-II veerus (250 mm × 20 mm i.d., 5 μm) preparatiivne suure jõudlusega vedelkromatograafia (HPLC), kasutades mobiilse faasisüsteemina 18% atsetonitriili. Kaashind oli 15 ml/min. Valikuliselt koguti kolm peamist huvi. Sihitud ühendeid sisaldavad fraktsioonid kondenseeriti veelgi kuivaks ja tekitati vastavalt 1, 2 ja 3.

4.3. Eksperimentaalne analüüs

1H ja 13C NMR spektrid saadi Bruker Avance DRX 500 MHz spektromeetrite (Billerica, MA, USA) abil, mille sisestandardiks oli tetrametüülsilane (TMS). Preparatiivne HPLC viidi läbi pöördfaasilise kolonniga (Cosmosil C18-AR-II veerg, 250 mm × 20 mm i.d.; NacalaiTesque, Inc., Kyoto, Jaapan) Shimadzu LC-6AD seeria seadmel, millel on esile tõstetud HPLC UV-visdetectors (Kyoto, Jaapan).

Echinacoside (1):valge pulber; ESI−MS m/z: 785 [M − H]−; 1H NMR (CD3OD, 500 MHz):δ 1,07 (1H, d, J = 6,2 Hz, Rha-H-6), 2,79 (2H, t, J = 5,2 Hz, H-7), 3,56 (1H, m, Ha-8), 3,79 (1H, m, H-30 ),3,91 (1H, m, Hb-8), 4,29 (1H, d, J = 7,7, Glc-H-1), 4,38 (1H, d, J = 7,9 Hz, H-10 ), 5,00 (1H, t, J = 9,6 Hz,H-40 ), 5,17(1H, d, J = 1,5 Hz, Rha-H-1), 6.27 (1H, d, J = 15,9 Hz, H-800 ), 6,58 (1H, dd, J = 8,1,2,0 Hz,H-6), 6,67 (1H, d, J = 8,1 Hz, H-5), 6,70 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 6,77 (1H, d, J = 8,2 Hz, H-500 ), 6,94 (1H,dd, J = 8,3, 2,0 Hz, H-600 ), 7,05 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-200 ), δ 7,59 (1H, d, J = 15,9 Hz), H-700 ); 13C-NMR(CD3OD, 125 MHz): δ 18,5 (Rha-C-6), 36,6 (C-7), 62,6 (Glc-C-6), 69,4 (C-60 ), 70,5 (C-40 ), 70,6 (Rha-C-5),71,5 (Glc-C-4), 72,0 (Rha-C-3), 72,3 (C-8), 72,4 (Rha-C-2), 73,8 (Rha-C-4), 74,7 (C-50), 75,1 (Glc-C-C-3) 2),76.1 (C-20 ), 77.8 (Glc-C-5), 77.9 (Glc-C-3), 81.7 (C-30 ), 103.1 (Rha-C-1), 104.2 (C-10 ), 104.7 (Glc-C-1),114.7 (C-200 ), 115.3 (C-800 ), 116.3 (C-500 ), 116.5 (C-2), 117.1 (C-5), 121.3 (C-6), 123,3 (C-600 ), 127,6 (C-100), 131,5 (C-1), 144,7 (C-3), 146,1 (C-4), 146,9 (C-400 ), 148,2 (C-700 ), 149,8 (C-300), 168,5 (C-900) (joonis S3–S5)

Acteoside (2):valge pulber; ESI−MS m/z: 623 [M − H]−; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 0,94(3H, d, J = 5,9 Hz, H-6000 ), 2,68 (2H, m, H-7), 4,33 (1H, d, J = 7,8 Hz, H-100 ), 4,70 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-400 ),5,01 (1H, s, H-1000 ), 6,18 (1H, d, J = 15,9 Hz, H-80 ), 6,48 (1H, dd, J = 7,9, 1,4 Hz, H-6), 6,62 (1H, d, J = 7,1Hz, H-5), 6,73 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 6,75 (1H, d, J = 7,9 Hz, H-50 ), 6,97 (1H, d, J = 8,1 Hz, H-60 ), 7,01 (1H, s, H-20 ), 7,44 (1H, d, J = 15,8 Hz, H-70); 13C NMR: (DMSO-d6, 125 MHz): δ 18,2 (C-6000 ), 35,1(C-7), 60,8 (C-600 ), 68,8 (C-5000 ), 69,2 (C-400 ), 70,3 (C-3000 ), 70,3 (C-8), 70,4 (C-2000 ), 70,6 (C-4000 ), 71,7 (C-500 ),74,5 (C-200 ), 79,2 (C-300 ), 101,3 (C-1000 ), 102,3 (C-100 ), 113,6 (C-80 ), 114,7 (C-20 ), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50 ), 116,3 (C-2), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60), 125,6 (C-10 ), 129,2 (C-1), 143,6 (C-4), 145,0 (C-3), 145,0 (C-30), 145,6(C-70), 148,5 (C-40), 165,7 (C-90) (joonised S6–S8).

Iso-aktiosiid (3):valge pulber; ESI−MS m/z: 623 [M − H]−; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz):δ 1,07 (3H, d, J = 6,1 Hz, H-6000 ), 2,65 (2H, m, H-7), 4,35 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-100 ), 5,10 (1H, s, H-1000 ),6,27 (1H, d, J = 15,9 Hz, H-80 ), 6,45 (1H, dd, J = 8,0, 1,8 Hz, H-6), 6,58 (1H, d, J = 8,8 Hz, H-5), 6,73(1H, d, J = 1,6 Hz, H-2), 6,74 (1H, d, J = 8,1 Hz, H-50 ), 6,94 (1H, d, J = 8,2 Hz, H-60 ), 7,04 (1H, s, H-20), 7,46 (1H, d, J = 15,8 Hz, H-70 ); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ 17,9 (C-6000 ), 35,2 (C-7), 63,5 (C-600),68,2 (C-5000 ), 70,4 (C-400), 70,6 (C-3000), 71,7 (C-8), 72,1 (C-2000), 73,7 (C-4000 ), 74,1 (C-500 ), 74,5 (C-200 ), 80,9(C-300 ), 100,7 (C-1000 ), 102,7 (C-100 ), 113,9 (C-20 ), 114,9 (C-80 ), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50 ), 116,3 (C-2), 119,6(C-6), 121,5 (C-60), 125,5 (C-10 ), 129,2 (C-1), 143,5 (C-4), 145,0 (C-3), 145,3 (C-30), 145,6 (C-70), 148,5 (C-40), 165,6 (C-90) (joonised S9–S11).

4.4. Tsistanche Tubulosa vesiekstrakti (CTE) valmistamine

Cistanche tubulosa pulbri vars ekstraheeriti kaks korda, reflukseerides veega 1,5 tundi ja ekstraktilahus filtreeriti. FiltreeritudCistanche tubulosavesiekstrakt(CTE) säilitati enne kasutamist temperatuuril 4 ◦C.

5. Järeldused

See uuring näitas, et 1–3 on CTE aktiivne komponent AD-vastases tegevuses. Raua kelatsioon on muutunud uueks kontseptsiooniks uue põlvkonna ravimite kavandamisel AD raviks [41]. CTE on potentsiaalne botaaniline anti-AD Hiina meditsiin, mis on suunatud raua kelatsioonist tingitud Aβ agregatsioonile ja ladestumisele. Lisaks tõestasime veel, et 1–3 jõuab ajju vere-aju barjääri (BBB) kaudu. CTE aktiivsed komponendid ja selle aluseks olev mehhanismi kinnitamine aitavad oluliselt kaasa kvaliteedikontrollile ja tooteuuringute biosaadavusele tulevikus. Samal ajal on esitatud täiustatud ja tõhus analüüsimeetod kasulik 1–3 määramiseks taimedes, toitudes, veres ja ajukudedes keemiliste sõrmejälgede ja farmakokineetilise uurimistöö jaoks.

Viited

1. Wu, Y.T.; Beiser, A.S.; Breteler, M.M.B.; Fratiglioni, L.; Helmer, C.; Hendrie, H.C.; Honda, H.; Ikram, M.A.; Langa, K.M.; Lobo, A.; et al. Dementsuse levimuse ja esinemissageduse muutumine aja jooksul – praegused tõendid. Nat. Rev. Neurol. 2017, 13, 327–339. [CrossRef]

2. Robinson, L.; Tang, E.; Taylor, J.P. Dementsus: õigeaegne diagnoosimine ja varajane sekkumine. BMJ 2015, 350, h3029. [CrossRef]

3. Mitchell, R.; Draper, B.; Harvey, L.; Brodaty, H.; Lähedal, J. Dementsusega ja dementsuseta vanemate inimeste ellujäämine ja omadused, kes hospitaliseeritakse tahtliku enesevigastamise tagajärjel. Int. J. Geriatr. Psych. 2017, 32, 892–900. [CrossRef] [PubMed]

4. Ott, A.; Breteler, M.M.; van Harskamp, F.; Claus, J.J.; van der Cammen, T.J.; Grobbee, D.E.; Hofman, A. Alzheimeri tõve ja vaskulaarse dementsuse levimus: seos haridusega. Rotterdami uuring. BMJ 1995, 310, 970–973. [CrossRef]

5. Kalaria, R.N.; Maestre, G.E.; Arizaga, R.; Friedland, R.P.; Galasko, D.; Hall, K.; Luchsinger, J.A.; Ogunniyi, A.; Perry, E.K.; Potocnik, F.; et al. Alzheimeri tõbi ja vaskulaarne dementsus arengumaades: levimus, juhtimine ja riskitegurid. Lancet. Neurol. 2008, 7, 812–826. [CrossRef]

6. 2018. aasta Alzheimeri tõve faktid ja arvud. Alzheimeri dement. 2018, 14, 367–429. [CrossRef]

7. Hardy, J.; Selkoe, D.J. Alzheimeri tõve amüloidhüpotees: edusammud ja probleemid ravi teel. Teadus 2002, 297, lk 353–356. [CrossRef]

8. Querfurth, H.W.; LaFerla, F.M. Alzheimeri tõbi. N. Engl. J. Med. 2010, lk 362, 329–344. [CrossRef]

9. Ayton, S.; Lei, P.; Bush, A.I. Metallostaasi Alzheimeri tõve korral. Tasuta Radic. Biol. Med. 2013, lk 62, 76–89. [CrossRef]

10. Kim, A.C.; Lim, S.; Kim, Y.K. Metalliioonide mõju Aβ ja Tau liitmisele. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 128. [CrossRef]

11. Robert, A.; Liu, Y.; Nguyen, M.; Meunier, B. Vase ja raua homöostaasi reguleerimine metallist kelaatorite poolt: Alzheimeri tõve võimalik kemoteraapia. A. Chem. Res. 2015, lk 48, lk 1332–1339. [CrossRef] [PubMed]

12. Opare, S.K.A.; Rauk, A. Vask(I) kelaatorid Alzheimeri tõve jaoks. J. Phys. Chem. B 2017, 121, 11304–11310. [CrossRef] [PubMed]

13. Santos, M.A.; Chand, K.; Chaves, S. Hiljutised edusammud multifunktsionaalsetes metallist kelaatorites kui Alzheimeri tõve potentsiaalsetes ravimites. Coord. Chem. Rev. 2016, lk 327–328, 287–303. [CrossRef]

14. D'Acunto, C.W.; Kaplanek, R.; Gbelcova, H.; Kajik, Z.; Briza, T.; Vasina, L.; Havlik, M.; Ruml, T.; Kral, V. Metallomics Alzheimeri tõve raviks: uue põlvkonna kelaatorite kasutamine, mis ühendab metallist katingu sidumise ja transpordiomadused. Eur. J. Med. Chem. 2018, lk 150, 140–155. [CrossRef] [PubMed]

15. Wang, X.; Wang, X.; Guo, Z. Metaliga seotud teranostika: kujunemisjärgus strateegia Alzheimeri tõve vastu võitlemiseks. Coord. Chem. Rev. 2018, lk 362, lk 72–84. [CrossRef]

16. Shao, M.L.; Ema, X.W.; Wu, Z.; Yu, W.M.; Chen, X.N. Hiina farmakopöa; Keemia- ja tööstuskirjastus: Peking, Hiina, 2005; Lk 90.

17. Li, Z.; Lin, H.; Gu, L.; Gao, J.; Tzeng, C.-M. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): üks parimaid traditsioonilise hiina meditsiini farmatseutilisi kingitusi. Esi. Pharmacol. 2016, 7, 41. [CrossRef] [PubMed]

18. Guo, Q.; Zhou, Y.; Wang, C.J.; Huang, Y.M.; Lee, Y.T.; Su, M.H.; Lu, J. Avatud, platseebokontrollita uuring Cistanche tubulosa glükosiidi kapslite kohta (memo taastamine (R)) mõõduka Alzheimeri tõve raviks. Am. J. Alzheimeri dis. 2013, 28, 363–370. [CrossRef]

19. Wu, C.R.; Lin, H.C.; Su, M.H. Pöördumine Cistanche tubulosa vesiekstraktidega Alzheimeri tõve sarnase roti mudeli käitumispuudujääkidest: asjakohasus amüloidide ladestumise ja keskse neurotransmitteri funktsiooni jaoks. BMC täiendus. Altern. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef]

20. Wang, Y.M.; Zhang, S.J.; Luo, G.A.; Hu, Y.N.; Hu, J.P.; Liu, L.; Zhu, Y.; Wang, H.J. Fenüületanoidi glükosiidide analüüs herba Cistanchise ekstraktis LC / ESI-MS / MS. Acta Pharm. Sinic. 2000, 35, 839–842.

21. Geng, X.C.; Tian, X.F.; Tu, P.F.; Pu, X.P. Echinacoside'i neuroprotektiivsed mõjud Parkinsoni tõve hiire MPTP mudelis. Eur. J. Pharmacol. 2007, 564, 66–74. [CrossRef]

22. Zhao, Q.; Yang, X.; Cai, D.; Ye, L.; Hou, Y.; Zhang, L.; Cheng, J.; Shen, Y.; Wang, K.; Bai, Y. Echinacoside kaitseb MPP(+) indutseeritud neuronaalse apoptoosi eest ROS / ATF3 / CHOP raja reguleerimise kaudu. Neurosci. Bull. 2016, 32, 349–362. [CrossRef] [PubMed]

23. Wang, Y.H.; Xuan, Z.H.; Tian, S.; Du, G.H. Echinacoside kaitseb 6-hüdroksüdopaamiinist põhjustatud mitokondriaalse düsfunktsiooni ja põletikuliste reaktsioonide eest PC12 rakkudes, vähendades ROS tootmist. Evid. Põhineb täiendus. Vaheldumisi. Med. 2015, 2015, 189239. [CrossRef] [PubMed]

24. Shiao, Y.J.; Su, M.H.; Lin, H.C.; Wu, C.R. Echinacoside leevendab amüloidide-beetapeptiidide põhjustatud mäluhäireid ja kolinergilist puudujääki amüloidide ladestumise ja toksikoloogia pärssimise kaudu. Food Funct. 2017, 8, 2283–2294. [CrossRef] [PubMed]

25. Shiao, Y.J.; Su, M.H.; Lin, H.C.; Wu, C.R. Acteoside ja iso-aktiosiid kaitsevad amüloid-beeta peptiidi põhjustatud tsütotoksilisust, kognitiivset puudujääki ja neurokeemilisi häireid Vitros ja Vivos. J. Mol. Sci. 2017, lk 18. [CrossRef]