Oliivilehe ekstrakti (OLE) häiritud vasopressiinist põhjustatud akvaporiin-2 liikumine kaltsiumitundliku retseptori aktiveerimise kaudu

Lisateabe saamiseks. kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Vasopressiin (AVP) suurendab vee läbilaskvustneeru-kogumiskanal akvaporiini{0}} (AQP2) kaubitsemise reguleerimise kaudu. Mitmed häired, sealhulgas hüpertensioon ja sobimatu antidiureetilise hormooni sekretsioon (SIADH), on seotud vee homöostaasi kõrvalekalletega. On näidatud, et teatud fütoühendid on inimeste tervisele kasulikud. Siin on oliivilehe ekstrakti (OLE) mõju hinnatud in vitro ja in vivo mudelite abil. Konfokaalsed uuringud näitasid, et OLE takistab vasopressiini poolt indutseeritud AQP2 translokatsiooni plasmamembraanile MCD4 rakkudes ja rottidesneerud. OLE-ga inkubeerimine vähendab AVP-st sõltuvat osmootse vee läbilaskvuse koefitsiendi (Pf) suurenemist. OLE võimalike efektorite selgitamiseks hinnati rakusisest kaltsiumi. OLE suurendab rakusisest kaltsiumi kaltsiumitundliku retseptori (CaSR) aktiveerimise kaudu.NPS2143 , selektiivne CaSR-i inhibiitor, kaotas OLE inhibeeriva toime AVP-sõltuvale vee läbilaskvusele. In vivo katsed näitasid, et ravi OLE-ga suurendab CaSR mRNA ekspressiooni ja vähendab AQP2 mRNA-d paralleelselt AQP2-sihtiva miRNA-137 suurenemisega. Need leiud koos viitavad sellele, et OLE antagoniseerib vasopressiini toimet CaSR-i stimuleerimise kaudu, mis näitab, et see ekstrakt võib olla kasulik häirete leevendamiseks, mida iseloomustab ebanormaalne CaSR-i signaalimine ja mis mõjutab vee reabsorptsiooni neerudes.

Oliivipuu lehti on laialdaselt kasutatud traditsiooniliste vahenditena mitmete haiguste raviks, eriti Vahemere maades. Lehti tarbitakse inimeste toidus tavaliselt ekstrakti või pulbrina infusioonide või taimetee valmistamiseks. Keemilise iseloomustuse analüüs näitas, et oliivipuu lehed sisaldavad mitmeid bioaktiivseid ühendeid, mis võivad avaldada kasulikku mõju teatud haigestumuste, nagu metaboolne sündroom, düslipideemia ja hüpertensioon. Essentsiaalse hüpertensiooniga patsientidel alandas OLE vererõhku ning veidi glükeemiat ja kaltseemiat. Rohelise oliivilehe ekstraktist (OLE)5 on leitud rikastatud arvukalt polüfenoole, nagu oleuropeiin, hüdroksütürosool ja türosool, ning teadaolevalt osalevad need teatud haiguste ennetamisel, mida iseloomustab oksüdatiivne stress. Seetõttu on viimastel aastatel kasvanud erinevate uurimisvaldkondade teadlaste huvi oliivilehtede ekstrakti võimalike kasulike mõjude uurimise vastu. OIE avaldas pahaloomulistes mesotelioomirakkudes olulist antiproliferatiivset toimet, muutes rakusisest kaltsiumi dünaamikat, mis võib olla suunatud T- tüüpi Ca2 pluss kanalid. Huvitaval kombel leiti, et OLE avaldab spontaanselt hüpertensiivsetel rottidel (SHR) geneetilisele hüpertensioonile antihüpertensiivset toimet, mis on seotud veresoonte funktsiooni paranemisega*. Suurenenud vererõhu patogeneesis mängib olulist rolli vee liigne tagasiimendumine. Hüpertensiivsetel patsientidel, keda raviti oliivilehtede ekstraktiga, leiti mitmete põletikuliste tegurite oluline vähenemine, mis on seotud vererõhu langusega. Lisaks iseloomustab liigne veepeetus mitmeid häireid, nagu maksatsirroos, südamepuudulikkus ja sobimatu antidiureetilise hormooni sekretsioon (SIADH). Kehavee homöostaasi kontrollib tihedalt antidiureetiline hormoon vasopressiin (AVP), mis vabaneb dehüdreeritud seisundis. AVP seob oma sarnase V2R retseptori, mis paikneb basolateraalsel membraanilneeru-peamised rakud, aktiveerides seeläbi cAMP signaaliraja, mille tulemuseks on akvaporiini-2(AQP2) kandvate vesiikulite translokatsioon rakusisesest kogumist apikaalsele plasmamembraanile, kus toimub vee reabsorptsioon. Molekulaarsel tasemel võivad neerude veetasakaalu moduleerida mitmed tegurid. Luminaalse kaltsiumi kõrgenenud tase reguleeris lühiajalist vasopressiinist sõltuvat AOP2 liikumist kaltsiumitundliku retseptori (CaSR)1,12 aktiveerimise kaudu. Teisest küljest indutseeris CaSR-i aktiveerimine inimese uriinist eraldatud tinglikult immortaliseeritud neerude proksimaalsetes tubulaarsetes epiteelirakkudes tsütosoolse kaltsiumi olulise suurenemise ja vähendas oluliselt cAMP-i suurenemist, mille põhjustas forskoliini (FK), adenülaadi cvklaasi3 otsene aktivaator. , neeru kogumiskanali MCD4 rakkudes, mis ekspresseerivad stabiilselt veekanalit AOP2, vähendas CaSR-i stimuleerimine cAMP-sõltuvat AQP2 fosforüülimise suurenemist seriinil 256, mis on vasopressiini poolt aktiveeritud signaaliülekande kaskaadi pöördeline sündmus ja mis lõpuks suurendas vee läbilaskvust4 ,15 Lisaks inneerudhiire sisemise medulla neeru viilud, põhjustas CaSR-i aktiveerimine kaltsimimeetilise NPS-R568-ga AQP2-sihtiva miRNA-137 märkimisväärse suurenemise, kinnitades tihedat koosmõju CaSR-i signaaliraja ja AQP{ vahel. {4}}sõltuv vee läbilaskvus17.Käesolevas uuringus hinnati kohalikust Coratina kultivarist saadud oliivilehe ekstrakti mõju vasopressiini poolt indutseeritud AQP2 funktsioonile neeru kogumiskanali MCD4 rakkudes, mis ekspresseerivad stabiilselt AOP2 ja dDAVP ravitud rotid, kellele süstiti ekstrakti. Pakume tõendeid selle kohta, et OLE-ravi neutraliseerib vasopressiini reaktsiooni neerurakkudes, mis võib osaliselt seletada selle diureetilist toimet. Huvitaval kombel näib see mõju olevat seotud OLE-indutseeritud CaSR-i aktiveerimisega, retseptoriga, millel on teadaolevalt negatiivne koosmõju vasopressiini retseptoriga l2.

Lisateavet cistanche'i mõju kohta neerudele

Tulemused

OLE mõju vasopressiini poolt indutseeritud AQP2 funktsioonile MCD4 rakkudes. Et uurida OLE võimalikku seotust vasopressiinist sõltuva AQP2 funktsiooniga,neeru-katsemudelina kasutati kanali MCD4 rakke, mis ekspresseerivad stabiilselt vasopressiini retseptorit 2 (V2R) ja inimese AQP2. Konfokaalsed uuringud (joonis 1A) näitasid, et võrreldes dDAVP-ga töödeldud rakkudega, kus AQP2 värvumine lokaliseeriti apikaalsele plasmamembraanile, hoidis OLE-ga töötlemine ära AOP2 lokaliseerumise membraanil, mis oli indutseeritud dDAVP-ga stimuleerimisega. Kooskõlas nende tähelepanekutega kahjustas OLE-ravi dDAVP-indutseeritud ajalise osmootse vastuse suurenemist (joonisel 1B näidatud kui 1/t) (OLE/dDAVP=88.70±1.{15}} protsenti). n=292 rakku vs dDAVP=206,8±5,49 protsenti ,n=186 lahtrit;p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="191 cells" vs="" ole/ddavp="88.70±1.86%,n=292"><0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

OLE mõju OLE-ga süstitud rottide neerudele.

OLE toimingute edasiseks uurimiseks on läbi viidud in vivo uuringud. Täpsemalt, rottidele on süstitud OLE-d (250 mg/kg/päevas) üks kord päevas kolme päeva jooksul. Alternatiivina raviti rotte koos OLE-ga 3 päeva ja dDAVP-ga 3 0 min. Rottide neeru kogumiskanalist eraldatud ja reaalajas PCR jaoks töödeldud CaSR mRNA hindamine (joonis 6) näitas CaSR mRNA olulist suurenemist OLE-s (OLE=1.87±0.29, n{{). 10}} rotti vs CTR=1,02±0,17, n=5 rotti; p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="">neerud, viidi läbi Western blot analüüs ja konfokaalsed uuringud (joonis 9). OLE/dDAVP-ga süstitud rottidel oli AQP2 fosforüülimine seriinil 256 oluliselt vähenenud võrreldes dDAVP-ga ravitud loomade neerukudedega (OLE/dDAVP=0). 77±0,16, n=5 rotti vs dDAVP=2,16±0,25,n=5 rotti; p<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

Arutelu

Kaltsium on oluline rakusisene sõnumitooja, mis moduleerib paljusid raku funktsioone2. Kaltsiumi ebanormaalne signaaliülekanne võib põhjustada mitmeid haigusi, sealhulgas südamepuudulikkust, vähki ja hüpertensiooni23. Spetsiifiline kontroll valkude ekspressiooni ja aktiivsuse üle, mis kontrollivad mitut intratsellulaarset kaltsiumisignaali, on osutunud edukaks paljude häiretega toimetulemisel ja on seetõttu atraktiivne ravimite väljatöötamiseks. See uuring annab uudse ülevaate OLE toimemehhanismist, näidates selle võimet moduleerida rakusisest kaltsiumi signaaliülekannet CaSR-i stimuleerimise kaudu, mis on seotud vasopressiini poolt indutseeritud AQP2 kaubitsemise ja ekspressiooni peenhäälestusega. Füsioloogilistes tingimustes mängib AQP2 olulist rolli kehavee homeostaasi kontrollimisel25. Intratsellulaarse mehhanismi stimuleerimine, mis viib AQP2 lokaliseerumiseni apikaalses plasmamembraanis, põhjustab ebanormaalset veepeetust ja sellest tulenevat hüponatreemiat, nagu antidiureetilise hormooni (SIADH) sobimatu sekretsiooni sündroomi, maksatsirroosi ja kongestiivse südamepuudulikkuse korral. Hiirel SIADH mudelis, mis on seotud polütsüstilise neeruhaiguse 1 haploinsufektiivsusega, vähenes rakusisese kaltsiumi baastase oluliselt võrreldes metsikut tüüpi hiirte kogumiskanalites mõõdetud tasemega. Madal intratsellulaarne kaltsium vähendas teatud ensüümide, sealhulgas valgufosfataasi PP2A aktiivsust, mille tulemuseks oli AOP2 fosforüülimise ülesreguleerimine seriinil 2561. Seevastu. CaSR-i aktiveerimine kaltsimimeetilise NPS-R568-ga suurendas rakusisest kaltsiumi kontsentratsiooni ja vähendas cAMP taset PKD1 puudulikkusega rakkudes. Oluline on see, et tsütosoolne kaltsium võib kaltsiumi inhibeeritavat adenüülitud tsüklaasi3 alla reguleerida, reguleerides seeläbi cAMP rakusisest taset. MCD4 rakkudes vähendas CaSR-i stimuleerimine NPS-R568-ga tõepoolest AQP2-pS256 adenülaadi inhibeerimise kaudu. tsüklaas4. Selles uuringus hoidis ravi OLE-ga ära vasopressiinist sõltuva cAMP ja AOP2-pS256 suurenemise, mis oli tõenäoliselt sekundaarne rakusisese kaltsiumi kontsentratsiooni suurenemise tõttu. Pange tähele, et kokkupuude välise cAMP allikaga, kasutades läbilaskvat 8-Br-cAMP-d, neutraliseeris oluliselt OLE inhibeerivat toimet V2R rajale.

Tsütosoolse kaltsiumi kõrgenenud tase võib põhjustada rakusurma ja apoptoosi. Intratsellulaarse kaltsiumi sisalduse püsiv tõus 250 nM-lt üle 600 nM soodustas aga neuronite ellujäämist4. MCD4 rakkudes ei ilmne ravi OLE-ga 0,1 mg/ml. tsütotoksiline toime. Sellel kontsentratsioonil suurendas OLE (0,1 mg/ml) veidi intratsellulaarset kaltsiumi taset. Kaltsiumi kuvamine näitas, et äge stimulatsioon OLE-ga põhjustas CaSR-i aktiveerimise kaudu intratsellulaarse kaltsiumi taseme mööduva suurenemise, mis kaob, kui rakke eelinkubeeriti selektiivse CaSR-i antagonistiga NPS2143. Neeru proksimaalsetes tuubulite rakkudes CaSR-i allosteeriline aktiveerimine I-ornitiiniga. vähendas ROS-i tootmist, vähendades seeläbi mitokondriaalset oksüdatiivset stressi, mis põhjustas raku apoptoosi356. Veelgi enam, meie eelmine uuring näitas, et CaSR-i funktsiooni suurendamise variantide ekspressioon vähendas ROS-i vabanemist ja AQP237 S-glutationüülimist. OLE-ga inkubeerimine vähendas ROS-i teket MCD4 rakkudes35, mis näitab selle antioksüdantset võimet. Sellegipoolest on hetkel ebaselge, kas OLE mõjutab AOP2-S-glutationüülimist. Arvukad uuringud näitasid, et OLE-l või oleuropeiinil, mis on OLE põhikoostisosa, võib olla rakusurma pärssimine kaitsev roll.39 Siiski on OLE-d saanud rottidel kirjeldatud annusest sõltuvaid toimeid. Kasulikud vastused saadi annustega 250 ja 500 mg/kg. Seevastu kõrgemate kontsentratsioonide korral võib OLE-ga töötlemisel olla kahjulik mõju, mis võib olla tingitud mitmete fütoühendite prooksüdantsest toimest. Selles uuringus süstiti rottidele kolme päeva jooksul OLE-d annuses 250 mg/kg, mis näitas CaSR-i ülesreguleerimist. CaSR-i ekspressioonitaset suurendavad teatud ühendid, mis toimivad retseptori allosteeriliste aktivaatoritena. Kaltsimimeetikumid vähendasid tõepoolest veresoonte kaltsifikatsioone, suurendades CaSR-i biosünteesi inimese veresoonte silelihasrakkudes0. Sellel võistlusel ei saa välistada võimalust, et teatud OLE ühendid võivad toimida CaSR-i allosteeriliste modulaatoritena. Teisest küljest võib vasopressiiniga stimuleerimine viia IL-6 vabanemiseni, mis võib kaasa aidata CaSR42 ekspressioonitaseme tõusule.

Neerudes seostatakse CaSR-i signaalide stimuleerimist AQP2 ekspressiooni allareguleerimisega, mis võib toimuda miR-137 põlvkonna kaudu. miRNA-d on kesksed transkriptsioonijärgsed modulaatorid. Samuti on kirjeldatud mitmeid vasopressiinist sõltuvaid miRNA-sid, mis on suunatud AQP2 ekspressioonile43. Transfektsioon miR-32 ja miR-137-ga vähendas oluliselt AOP2 ekspressioonitaset mpkCCDc14 rakkudes. Huvitav on see, et OLE võib nõrgendada põletikulisi signaale ja avaldada kaitsvat toimet, moduleerides mitme miRNA ekspressioonitaset." Eelkõige soodustas OLE multiformsete glioblastoomi rakkudes erinevate miRNA, sealhulgas miR-13745 ekspressiooni, mis on seotud rakkude allareguleerimisega. Akt/mTOR signalisatsioonirada 46. Märkimist väärib see, et ravi oleuropeiiniga takistab Akt/mTOR signaaliülekannet kaltsiumi indutseeritud CAMK ja AMPK aktiveerimise kaudu". CaSR aktiveerimine NPS-R568 abil aktiveerib AMPK ja vähendab mTOR aktiivsust inimese proksimaalsetes tubulaarrakkudes3. Kooskõlas nende leidudega suurendab OLE-ga inkubeerimine tsütosoolset kaltsiumi, vähendab PKA aktiivsust ja vähendab tsüsti suurust 3D-rakukultuuri mudelis48. Need leiud koos viitavad sellele, et OLE võib olla kasulik häirete ravis, mida iseloomustab CaSR-i signaaliülekande alareguleerimisega seotud rakusisese kaltsiumi dünaamika düsregulatsioon.

Oliivilehtede ekstrakt koosneb mitmest bioaktiivsest komponendist, sealhulgas polüfenoolidest, kiududest ja mineraalidest49. Hetkel ei ole selge, kas üks ühend või fütoühendite sünergiline kombinatsioon OLE-s võib olla kasulik rakusiseste vastuste moduleerimiseks. Selles uuringus kasutatud ekstrakti on kasutatud võimaliku toidulisandina ja seetõttu on oluline määratleda ekstrakti enda füsioloogiline mõju, arvestades, et mitmed fenoolid, sealhulgas hüdroksütürosool, võivad neerude kaudu filtreerida ja uriiniga taastuda50. Edasised uuringud pakuvad spetsiifiliste komponentide tõhusust, mis võivad CaSR-i kaudu aktiivselt reguleerida rakusisest kaltsiumi signaaliülekannet. Kokkuvõtteks võib öelda, et see uuring annab tõendeid selle kohta, et OLE-d võib pidada uudseks potentsiaalseks adjuvandiks, mis on kasulik häirete leevendamiseks, mida iseloomustab CaSR-i ekspressiooni vähenemine, samuti signaalide edastamine ja neerude vee läbilaskvuse mõjutamine.

materjalid ja meetodid

Kemikaalid ja antikehad.Kõik kemikaalid ja antibiootikumid osteti firmalt Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Saksamaa). Calcein-AM, Fura-2-AM, rakukultuuri sööde, veiseloote seerum (FBS) ja Super Signal West Pico kemiluminestseeruvad substraadid osteti ettevõttelt Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Aquaporin{ {2}}(AQP2) tuvastati, kasutades spetsiifilisi antikehi (C-tail Ab), mis on tekitatud inimese AQP2 viimasele 15 C-terminaalsele aminohappele vastava sünteetilise peptiidi vastu. AQP2-pS256 antikehad kinkis lahkelt prof Peter Deen. Sekundaarsed kitse küülikuvastased mädarõika peroksidaasiga seotud antikehad saadi firmalt Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Saksamaa). Sekundaarne kitse küülikuvastane antikeha, mis oli seotud Alexaga-488, osteti ettevõttest Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Fenoolirikaste ekstraktide tootmine ja keemiline iseloomustus.Fenoolirikka ekstrakti valmistamine oliivilehtedest viidi läbi vastavalt artiklile Ranieri et al.35. Pärast jahvatamist segistiga (Waring-Commercial, Torrington, CT, USA) lisati ddH2O vett (suhe 1/2{10}}, w/y) ja seejärel allutati kolm korda ultraheliuuringule (CEIA, Viciomaggio, Itaalia) 30 minutit 35±5 kraadi juures iga kord. Lõpuks filtriti ekstraktid läbi filterpaberi, lüofiliseeriti ja säilitati temperatuuril -20 °C. Saadud ekstraktid filtriti 0,45 μm nailonfiltritega (Merck KGaA, Darmstadt, Saksamaa) ja kasutati keemiliseks iseloomustamiseks. Fenooli üldsisaldus, antioksüdantne aktiivsus ja üksikute fenoolsete ühendite identifitseerimine viidi läbi vastavalt Difonzo et al. järgi. OLE näitas Folin-Ciocalteu poolt määratud polüfenoolide sisaldust 195 mg-ga. gallushappe ekvivalendid (GAE) ja antioksüdantne aktiivsus, mille määrab ABTS (2,2'-asino-bis(3-etüülbensotiasoliin-6-sulfoonhappe diammooniumisool), mis moodustab 750 μmol TE (Troloksi ekvivalendid) .

Rakukultuur ja ravi.Eksperimentaalse mudelina kasutati hiire kortikaalset kogumiskanali MCD4 rakke, mis ekspresseerivad stabiilselt inimese AQP2 ja kimäärset V2R-Rluc. Rakke kasvatati Dalbec-cosiga modifitseeritud Eagle'i söötme ja F{8}} 1:1 segus, millele oli lisatud 5 protsenti (aastas) veise loote seerumit. 1% (aastas) L-glutamiini ja 1% penitsilliini/streptomütsiini, 5 μM deksametasooni, 400 ug/ml G418 (AQP2 resistentsuse jaoks) ja 1 ug/ml puromütsiini (V2R-Rluc resistentsuse korral) 5% CO sisaldusega niisutatud atmosfääris 37 kraadi juures. MCD4 rakud jäeti põhiseisundisse (CTR) või neid töödeldi pikaajaliselt OLE-ga kontsentratsioonis 0,1 mg/ml O/N, dDAVP-ga 100 nM juures 30 minutiks või koos OLE ja dDAVP või NPS2143-ga 1 μM O/N juures. Teise võimalusena eksponeeriti rakke 45 minutiks 8-Br-cAMP-ga 500 μM juures. Lühiajalised katsed viidi läbi OLE-ga 1 mg/ml 5 minutit ja NPS2143-ga 10 μM juures 15 minutit. Katsed viidi läbi 3-5 sõltumatut korda, kasutades erinevatest lõikudest pärit rakke.

Loomamudel ja ravi.Kõik protseduurid viidi läbi kooskõlas Taani riiklike juhistega katseloomade hooldamise ja käitlemise kohta ning riiklike tervishoiuinstituutide avaldatud juhistega. Protokollid kiitis heaks Kliinilise Meditsiini Instituut. Århusi ülikool vastavalt Taani justiitsministeeriumi väljastatud katseloomade kasutamise litsentsidele (kinnitusnumber 2015-15-0201-00658). Uuringud viidi läbi täiskasvanud isaste Wistari rottidega, kelle algkaal oli 200-225 g. Loomi peeti tavalisel näriliste dieedil (Altromin, Lage, Saksamaa) ja neil oli vaba juurdepääs kraaniveele. Katsete ajal peeti rotte kaheliikmelistes rühmades puuri kohta 12:12-tunnise valguse-pimeduse tsükliga, temperatuuriga 21 ± 2 °C ja õhuniiskusega 55 ± 2 protsenti. Viiele rotile manustati subkutaanselt 1 ng dDAVP-d (Sigma-Aldrich, Glostrup, Taani) 200 ul soolalahuses looma kohta ja viit vehiikuliga töödeldud rotti kasutati kontrollidena. 30 minuti pärast rotid surmati ja neere töödeldi allpool kirjeldatud viisil.

Rakud ja IMCD lüsaadid.Rakke kasvatati {{0}} mm tassidel ja resuspendeeriti puhvris, mis sisaldas 220 mM mannitooli, 70 mM sahharoosi, {{10}}. 5 M EGTA pH 8,0,0,5 M EDTA pH 8,0,1 M Tris-HCl pH 7,4 proteaaside (1 mM PMSF, 2 mg/ml leupeptiin ja 2 mg/ml pepstatiin A) ja fosfataaside (10 mM NaF ja 1 mM naatriumortovanadaadi) inhibiitorid. Alternatiivina valmistati ette ligikaudu 0,5 mm suurused neerulõigud ja tasakaalustati neid 10 minutit puhvris, mis sisaldas 1,8 mM NaCl, 16 mM Hepes, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glükoosi, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM. 1,8 mM KH2PO4 (pH 7,4). Neerupapill peenestatakse kääridega samas puhvris proteaaside (1 mM PMSF, 2 mg/mlleupeptiin ja 2 mg/mlpepstatiin A) ja fosfataaside (10 mM NaF ja 1 mM naatriumi) juuresolekul. ortovanadaadi) inhibiitorid. Pärast ultrahelitöötlust (60 kHz 5 sekundit) tsentrifuugiti lüsaate kiirusel 12, 000 × g 10 minutit. Supernatandid koguti ja kasutati immunoblotanalüüsi uuringutes.

Konfokaalne mikroskoopia.Konfokaalsed uuringud viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud 1. Lühidalt, rakke kasvatati rakukultuuri PET insertidel ja töödeldi ülalkirjeldatud viisil. Alternatiivselt allutati dDAVP-ga töödeldud rottide kontroll-, OLE-st, dDAVP-st ja OLE-st saadud neerulõiked immunofluorestsentskatsetele, nagu eelnevalt kirjeldatud. Pildid saadi konfokaalse laserskaneeriva fluorestsentsmikroskoobiga Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Heerbrugg, Šveits). Geelelektroforees ja immunoblotanalüüs. Valgud eraldati 12% plekivabadel polüakrüülamiidgeelidel (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, US.A.) redutseerivates tingimustes, nagu eelnevalt kirjeldatud =5,52. Lühidalt, valguribad kanti üle Immobilon-P membraanidele (Merck KGaA, Darmstadt, Saksamaa) ja immunoblotiti, kasutades anti-AQP2 (Pre-C-tail Ab) ja anti-AQP2-pS256 antikehi. Immunoreaktiivsed signaalid saadi kasutades Super Signal West Pico kemiluminestseeruvaid substraate koos Chemidoc Systemiga (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Ribad normaliseeriti koguvalgu suhtes, kasutades plekivaba tehnoloogiat (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Densitomeetria analüüs viidi läbi kasutades ImageLab (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) ja analüüsiti kasutades GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Vee läbilaskvuse test.Osmootse vee läbilaskvust mõõdeti nii, nagu eelnevalt kirjeldatud43. Lühidalt, MCD4 rakke kasvatati 40- mm klaasist katteklaasidel. Pärast töötlemist laaditi rakud 10 μM membraani läbilaskva Calcein-AM-iga 45 minutiks temperatuuril 37 kraadi 5% CO, DMEM/F-12. Katteklaasid paigaldati perfusioonikambrisse (FCS2 Closed Chamber System, BIOPTECHS, Butler, USA). Mõõtmised viidi läbi pööratud TE2000-S mikroskoobiga (Nikon Eclipse mikroskoop, Tokyo, Jaapan), mis oli varustatud üherakulise fluorestsentsi mõõtmiseks. ja pildianalüüs. Calcein-AM-iga laetud proove ergutati 490 nm juures. Fluorestsentsi mõõtmised pärast isosmootseid (140 mM NaCl.5 mM KCl, 1 mM MgCl..1 mM CaCl, 10 mM Hepes sulfoonhapet, 5 mM glükoosi, pH 7,4) või hüperosmootseid lahuseid (isosmootne lahus, millele on lisatud 135 mM mannitooli) . viidi läbi tarkvara Metafluor abil (Molecular Devices, MDS Analytical Technologies, Toronto, Kanada). Aja jooksul registreeriti fluorestsentsi andmed pärast rakkude perfuseerimist iso- ja hüperosmootsete lahustega. Rakkude kokkutõmbumise ajaline kulg mõõdeti ajakonstandina (Ki, väljendatuna 1/r, s), mis on vee läbilaskvusega korrelatsioonis parameeter, mis saadi andmete sobitamisel eksponentsiaalfunktsiooniga, mida analüüsiti kasutades GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego). , CA, USA).

Fluorestsentsresonantsi energiaülekande mõõtmised.Intratsellulaarsete cAMP muutuste hindamiseks kasutati fluorestsentsresonantsenergia ülekande (FRET) tehnoloogiat. FRET-katsete jaoks transfekteeriti rakud plasmiidiga, mis kodeeris H96 andurit, mis sisaldas EPAC1 cAMP-siduvat konsensusmotiivi, mis oli põimitud tsüaanfluorestsentsvalgu (CFP) ja cp173Venus-Venuse vahele, nagu eelnevalt näidatud32.33.54. H96 sondi kodeeriv plasmiid kinkis Dr.K. Jalink. ECFP-d ja/või EYFP-d ekspresseerivate rakkude visualiseerimine ja FRET-i tuvastamine viidi läbi pööratud TE2000-S-mikroskoobiga (Nikon Eclipse'i mikroskoop, Tokyo, Jaapan). Iga pilti parandati ja analüüsiti, nagu eelnevalt näidatud55.

Intratsellulaarse kaltsiumi mõõtmine. Intratsellulaarsed kaltsiumi mõõtmised viidi läbi nagu eelnevalt näidatud56. Lühidalt, MCD4 rakud laaditi 4 μM Fura-2 AM-ga 15 minutiks temperatuuril 37 kraadi DMEM/F-12-s. Katse ajal kasutati rakkude perfuseerimiseks Ringeri lahust, mis sisaldas 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM glükoosi, 1,8 mM CaCl, pH 7,4. Fluorestsentsi mõõtmisel paigaldati ülekoormatud rakkudega katteklaasid perfusioonikambrisse (FCS2 Closed Chamber System. BIOPTECHS. Butler, USA). Mõõtmised viidi läbi pööratud TE2000-S mikroskoobiga (Nikon Eclipse mikroskoop, Tokyo, Jaapan). Joonistati fluorestsentsi intensiivsuse suhe lainepikkustel 340 ja 380 nm ning arvutati fluorestsentsi muutusena. Eelkõige võrreldi samas rakutüübis stimuleerimist OLE-ga (1 mg/ml) või NPS2143-ga (10 μM) stimuleerimisega, mis saadi pärast stimuleerimist kaltsiumi vahendatud agonisti ATP (100 μM) maksimaalse annusega, mida kasutati sisekontroll (100 protsenti).

Intratsellulaarset kaltsiumi taset mõõdeti püsiseisundis ja kalibreeriti, nagu on kirjeldanud Grynkiewicz57. OLE-d ja NPS2143 kasutati pikaajaliselt vastavalt 0,1 mg/ml ja l uM ning iga proov kalibreeriti 5 μM ionomütsiini lisamisega 1 mM EGTA (Rm) juuresolekul, millele järgnes 5 μM ionomütsiini lisamist. µM ionomütsiini 5 mM CaCl-s (RMA).

AQP2 ja CaSR mRNA reaalajas PCR analüüs kontroll- ja töödeldud rottidel.Viidi läbi reaalajas PCR katsed, et mõõta mRNA suhtelist ekspressiooni sisemises medulla kogumiskanalis (IMCD), mis oli eraldatud kontroll- ja töödeldud roti neerupapillidest. Valmistati umbes 0,5 mm neeruviilud ja tasakaalustati 10 minutit puhvris, mis sisaldas 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glükoosi, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgS04 ja 1,8 mM KH2PO4 (pH 7,4). Neerupapill eraldati stereomikroskoobi all. Kontroll- ja töödeldud rottide proovid hakiti seejärel kääridega otse Trizolis (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Pöördtranskriptsioon viidi läbi 2,5 ug kogu RNA-ga, kasutades SuperScriptVilo Master Mixi (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). USA), vastavalt tootja soovitustele (25C 10 min; 42C 60 min; 85C 5 min). Reaalajas PCR-i võimendamine viidi läbi, kasutades TagMan Fast Advanced Master Mixi koos CaSR-i, AOP2- ja GAPDH-testidega (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) StepOne'i reaalajas PCR-süsteemis (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). ), seades tootja määratud termilise tsükli tingimused (95 °C 20 s; 40 tsüklit vaheldumisi temperatuuril 95 °C 1 s ja 60 °C 20 s). Tulemused väljendati kui 2- väärtused (suhteline kvantifitseerimine) △ACt=(Ct sihtmärk-Ct GAPDH) töödeldud -(Ct sihtmärk-Ct GAPDH)Sham1.

miRNA{0}} hindamine kontroll- ja ravitud rottidel.miRNA{{0}} sisaldust kontroll- ja ravitud roti medulla sisemises kogumiskanalis hinnati TagMan Advanced miRNA analüüside abil (has-miR-137; testi ID; 477904 mir; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA .US.A), mis võimaldas kvantitatiivse PCR-i abil väga tundlikku ja spetsiifilist teavitamist küpsest miRNA-st. Tehti umbes 0,5 mm suurused neerulõigud ja neid tasakaalustati 10 minutit puhvris, mis sisaldas 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glükoosi, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgS08. KH2PO4 (pH 7,4). Neerupapill eraldati stereomikroskoobiga. Kontroll- ja töödeldud rottide proovid hakiti seejärel kääridega otse Trizolis (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), et ekstraheerida kogu RNA. TaqMan Advanced miRNA cDNA sünteesikomplekt （Kataloog n²∶A25576; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) kasutati cDNA sünteesi saamiseks vastavalt tootja esitatud protokollile (Poly(A) saba reaktsioon; ligeerimisreaktsioon; pöördtranskriptsiooni reaktsioon; miR-Amp reaktsioon). 59-fosforiga sünteetilise RNA (UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG) sünteesis Thermo Fisher Scientific ja seda kasutati kalibreerimiskõvera koostamiseks, et interpoleerida miRNA proovi väärtusi ja saada täpne hinnang (nanogrammides) miR-137 sisaldusele. samples16, kasutades GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Statistiline analüüs.Kõik väärtused on esitatud keskmistena ± SEM Statistiline analüüs viidi läbi ühesuunalise ANOVA abil, millele järgnes Newman-Keulsi mitme võrdluse test *p-ga.<0.05 considered="" statistically="" different="">

Avaldused, eetiline heakskiit ja nõusolek osaleda.Loomkatsed viidi läbi kooskõlas Taani riiklike katseloomade hooldamise ja käitlemise juhistega ning riiklike tervishoiuinstituutide avaldatud juhistega. Århusi ülikooli kliinilise meditsiini instituudi loomahoolduse eetikakomitee kiitis uuringuprotokollid heaks vastavalt Taani justiitsministeeriumi väljastatud katseloomade kasutamise litsentsidele (kinnitusnumber 2015-15-0201-00658). Autorid kinnitavad, et kõik meetodid viidi läbi vastavalt asjakohastele juhistele ja määrustele. Lisaks kinnitavad autorid, et uuring viidi läbi kooskõlas ARRIVE juhistega.

Viited

1. El, SN & Karakaya, S. Oliivipuu (Olea europaea) avaldab potentsiaalset kasulikku mõju inimeste tervisele. Nutr. Rev. 67, 632–638.

2. Javadi, H., Yaghoobzadeh, H., Esfahani, Z., Reza Memarzadeh, M. & Mehdi Mirhashemi, S. Oliivilehtede ekstrakti mõju metaboolsele vastusele, maksa- ja neerufunktsioonidele ning põletikulistele biomarkeritele hüpertensiivsetel patsientidel. PJBS 22, 342–348.

3. Saibandith, B., Spencer, JPE, Rowland, IR & Commane, DM Oliivi polüfenoolid ja metaboolne sündroom. Molekulid

4. Cherif, S. et al. Tiitritud olea ekstrakti kliiniline uuring essentsiaalse arteriaalse hüpertensiooni ravis. J. Pharm. Belgia. 51, 69–71 (1996).

5. Difonzo, GRA et al. Cortina oliivikultuuri rohelised ekstraktid annavad antioksüdantse iseloomustuse ja bioloogilise aktiivsuse. J. Funktsioon. Toiduained 31, 8.

6. Herrero, M. et al. Uued võimalused oliiviõli kõrvalsaaduste väärtustamiseks. J. Chromatogr. 1218, 7511–7520.

7. Marchetti, C. et al. Oleuropeiiniga rikastatud oliivilehtede ekstrakt mõjutab kaltsiumi dünaamikat ja halvendab pahaloomuliste mesotelioomirakkude elujõulisust. eCAM 2015, 908493.

8. Romero, M. et al. Oleuropeiiniga rikastatud oliivilehtede ekstrakti antihüpertensiivne toime spontaanselt hüpertensiivsetel rottidel. Toidufunktsioon 7, 584–593.

9. Hall, JE Pigem neerude düsfunktsioon kui mitterenaalne vaskulaarne düsfunktsioon. Vahendab soolast põhjustatud hüpertensiooni. Tiraaž 133, 894–906.

10. Wilson, JL, Miranda, CA & Knepper, MA Vasopressiin ja akvaporiini reguleerimine-2. Clin. Exp. Nephrol. 17, 751–764.