1. osa Fenüületanoidglükosiidide neuroprotektiivne toime Alzheimeri tõve in vitro mudelis

Kas Cistanche neuroprotektiivne toime on tõeline?

JIANHUA YANG1*, BOWIE JU1,2*, YAO YAN1, HUAN HUAN XU1,

SHANSHAN WU1, DANDAN ZHU1, DANDAN CAO1 ja JUMPING HU2

1 Esimese sidushaigla farmaatsia osakond; 2 Looduslike ravimite osakond,

Farmaatsiakolledž, Xinjiangi meditsiiniülikool, Urumqi, Xinjiang 830011, PR Hiina

Saabunud 8. jaanuaril 2016; Vastu võetud 6. jaanuaril 2017

Abstraktne.

Käesoleva uuringu eesmärk oli uurida neuroprotektiivset toimetfenüületanoidglükosiidid(PhG) H2O2- ja -amüloidpeptiidi (A )1-42- indutseeritud PC12 rakkude kahjustuse kui Alzheimeri tõve (AD) in vitro mudelina. Optimaalsed induktsioonitingimused määrati erinevate inkubatsiooniaegade ja kontsentratsioonide skriinimise teel. PC12 rakke töödeldi 0,5 µM A 1-42 ja H2O2-ga PhG-de juuresolekul 24 tundi ning seejärel hinnati rakkude elujõulisust MTT testiga; Samuti mõõdeti laktaatdehüdrogenaasi (LDH) vabanemist ja malondialdehüüdi (MDA) sisaldust. Optimaalsed tingimused AD mudeli loomiseks olid PC12 rakkude töötlemine 0,5 µM A 1-42-ga 48 tundi või 25 µM H2O2-ga, mis oli lahustatud DMEM-is koos PBS-iga. PhG-d kontsentratsioonides 5, 25 ja 50 µg/ml suurendasid A 1-42 või H2O2-ga vigastatud PC12 rakkude elujõulisust ja vähendasid LDH ja MDA vabanemist. Kokkuvõtteks võib öelda, et A 1-42- ja H2O2-indutseeritud PC12 rakukahjustuse mudel loodi edukalt. Näidati, et PhG-del on märkimisväärne neuroprotektiivne toime A 1-42- või H2O2- indutseeritud rakukahjustuse vastu.

Lisateabe saamiseks võtke ühendust:joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticolal on palju mõjusid, lisateabe saamiseks klõpsake siin

Sissejuhatus

Alzheimeri tõbi (AD), neurodegeneratiivne haigus, mille kliinilisteks tunnusteks on progresseeruv mälukaotus ja kognitiivsete funktsioonide kahjustus (1), on maailmas kõige levinum dementsuse põhjus (2). Finantskulud on AD levimuse tõttu tohutud (3). Seetõttu on kiiresti vaja välja töötada sobivad vahendid AD juhtimiseks ja ennetamiseks.

AD patogenees on tihedalt seotud neurofibrillaarsete puntrate ja seniilsete naastude (SP) kuhjumisega mõjutatud ajupiirkondades (4, 5). -amüloidpeptiidil (A), mis on SP-de peamine komponent, on teatatud, et sellel on põhjuslik roll AD progresseerumisel, kuna sellel on toksiline toime neuronaalsetele rakkudele (6). A-fragmendid, sealhulgas A 1-40, A 25-35 ja A 1-42, on loodud amüloidi prekursorvalgu (7) lõhustamise teel. Leiti, et A 1-42 neurotoksilisus on oluliselt suurem kui A 25-35 ja A 1-40 ning A 1-42 suudab indutseerida AD mudeli (1,{ {13}}). Oksüdatiivne stress võib olla seotud AD patogeneesiga ja on A-indutseeritud neurotoksilisuse (11-13) peamine mehhanism. Mitmed uuringud näitasid, et A 1-42 põhjustas reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) rakusisest akumulatsiooni, mis viis lipiidide ja valkude oksüdeerumiseni, DNA kahjustuseni ja rakutsükli kontrollpunkti signaalide aktiveerimiseni (1, 14, 15). Liigne kogus H2O2 võib põhjustada oksüdatiivseid kahjustusi ja indutseerida PC12 rakkude apoptoosi (16). Seetõttu võib oksüdatiivse stressi sihtimine olla paljutõotav lähenemisviis terapeutiliste strateegiate väljatöötamiseks A-indutseeritud neurotoksilisuse pärssimiseks AD-s. Herba (H.)Cistanche, Hiina taimset ravimit, mida Mandri-Hiinas tavaliselt kasutatakse neerude toitmiseks ning essentsi ja vere täiendamiseks, on kasutatud mälukaotuse ja seniilse kõhukinnisuse raviks (17).Fenüületanoidglükosiid(PhG), üks peamisi koostisosi H.Cistanche, parandab A 25-35 põhjustatud neuronaalse apoptoosi kahjustust oma antioksüdantse toime kaudu (18, 19). Eelmises uuringus tuvastati viis peamist komponenti kõigist PhG-dest, nimeltakteosiid, 2'-atsetüüllakteosiid, ehhinakosiid, tsistanosiidid jaisoakteosiid(20). Nende komponentide hulgasakteosiidjaehhinakosiidon teatatud, et neil on neuroprotektiivne toime A 25-35- või H2O2-indutseeritud neurotoksilisusele (21-23). Näiteks Wu jt (24) soovitasid sedaakteosiidjaehhinakosiidA 1-42 põhjustatud kognitiivse düsfunktsiooni paranemine. Käesoleva uuringu eesmärk oli uurida PhG-de kaitsvat toimet AD in vitro rotirakkude mudelis.

materjalid ja meetodid

EttevalmistuskohtaPhGs. PhG-d ekstraheeriti kokkuH. Cistanchenagu eelnevalt kirjeldatud (25). Õhukuivatatud varsH. Cistanche pulbristati ja ekstraheeriti perkolatsiooniga 80% EtOH-ga. Perkolaat aurustati redutseerimisel

rõhul, millele järgneb resuspendeerimine sobivas koguses H₂O₂(100 µmol/l). Segu isoleeriti SP-825 makropoorsel vaigukolonnis (Mitsubishi Chemical, Tokyo, Jaapan) ja elueeriti 0, 30, 50, 70 ja 90 protsendilise EtOH-ga vees. PhG-rikka fraktsiooni saamiseks kontsentreeriti 30-50% EtOH eluendid ja kuivatati alandatud rõhul. PhGde koguarvu määramiseks viidi läbi ultraviolettkiirguse (UV) spektrofotomeetria. Sisuehhinakosiidjaakteosiidmäärati kõrgsurvevedelikkromatograafiaga vastavalt eelmisele protokollile (26). Kasutati Hypersil ODS-2 kolonni (4,6x250 mm, 5 µm; Dalian Elite Analytical Instruments, Co., Ltd., Dalian, Hiina) ja seda hoiti toatemperatuuril. Liikuvad faasid olid metüültsüaniidid ja vesi, mis sisaldas 0,4% fosforhapet (maht/maht; Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Saksamaa). Voolukiirus oli 0,75 ml/min ja lainepikkuseks määrati 333 nm.

Rakukultuurjauimastiravi.PC12 roti feokromotsütoomi rakuliini andis dr He Chunhui Xinjiangi Meditsiiniülikooli Meditsiinikoolist (Urumqi, Hiina). Rakke kultiveeriti kõrge glükoosisisaldusega Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA), mis sisaldas 10 protsenti veise loote seerumit (Sangon Biotech Co. Ltd., Shanghai, Hiina), 100 U/ml penitsilliin ja 100 U/ml streptomütsiinid inkubaatoris temperatuuril 37 ˚C, mis sisaldab 5 protsenti CO₂ja 95 protsenti õhku. 80-protsendilise konfluentsuse saavutamisel töödeldi rakke 0,25-protsendilise trüpsiiniga ja passeeriti.

Et kõrvaldada ravimi enda sekkumine PC12 rakkude kasvu, viidi läbi toksilisuse katse. Lühidalt, PC12 rakud (3x10⁴rakud/ml) külvati 96-süvendiplaatidele 100 µl/süvend ja inkubeeriti 37 ˚C juures üleöö. Pärast supernatandi äraviskamist lisati tühja rühma 200 µl täielikku DMEM-i, samal ajal kui sekkumisrühmade rakke töödeldi PhG-dega erinevates annustes (5, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ja 200 µg/). ml). Pärast rakkude inkubeerimist temperatuuril 37 °C 48 tundi lisati igasse süvendisse 20 µl MTT lahust (Sigma-Aldrich; Merck KGaA). Pärast 4-tunnist inkubeerimist visati supernatant ära ja igasse süvendisse lisati 150 µl dimetüülsulfoksiidi, millele järgnes loksutamine 10 minutit. Optilise tiheduse (OD) väärtused 490 nm juures tuvastati ELISA plaadilugeja abil.

A 1‑ 42-indutseeritudPC12raku vigastus.Ettevõttelt Bioss Biotech (Peking, Hiina) ostetud 1-42 peptiid lahustati vees (100 µg/ml). Seejärel inkubeeriti segu 4 päeva temperatuuril 37 ˚C ja säilitati enne kasutamist temperatuuril 4 ˚C.

PC12 rakud külvati 96-süvendplaatidele (3xl0⁴rakke 100 µl süvendi kohta). Pärast 24-tunnist kultiveerimist nakkumiseks lahustus 50 µl A 1-42 erinevatel lõppkontsentratsioonidel (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5 või 2 µM). lisati seerumivaba DMEM, millele järgnes inkubeerimine 24, 48, 72 või 96 tundi. Rakkude elujõulisust hinnati MTT testiga. Optimaalne A 1-42 kontsentratsioon oli 0,5, mis määrati µM. PC12 rakud (3xl0⁴rakke süvendi kohta) töödeldi erinevate PhG-de annustega ({{0}}, 0,5, 5, 25 või 50 µg/ml) 0,5 µM A {{8 juuresolekul. }} 24 tunniks. Rakkude elujõulisust hinnati MTT testiga.

H₂O₂-indutseeritudPC12raku vigastus. PC12 rakud külvati 96-süvendplaatidele (3xl0)⁴rakke 100 µl süvendi kohta). Pärast kultiveerimist

24 tunni jooksul nakkumiseks, 100 µl H₂O₂erinevatel lõppkontsentratsioonidel ({{0}}, 25, 50, 100, 200, 300, 400 ja 500 µM) lahustati DMEM-is koos PBS-iga (0,01 mol/l) või ilma, millele järgnes inkubeerimine 24 h. Rakkude elujõulisust hinnati MTT testiga. Optimaalne H₂O₂määrati kontsentratsioon ja lahustiin vitroAD mudel.

PC12 elemendid (3xl0⁴rakke süvendi kohta) töödeldi erinevate PhG-de annustega ({{0}}, 0,5, 5, 25 ja 50 µM). Pärast 24-tunnist kultiveerimist kleepumiseks töödeldi PC12 rakke 100 µl H-ga.₂O₂lahustati DMEM-is koos PBS-iga PhG-de juuresolekul 24 tundi. Rakkude elujõulisust hinnati MTT testiga.

Laktaatdehüdrogenaas (LDH)vabanemise test. Rakukahjustust hinnati LDH aktiivsuse mõõtmisega PC12 rakkude supernatandis, kasutades LDH komplekti vastavalt tootja protokollile (kat. nr 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Hiina). Lühidalt, topeltdestilleeritud H₂O, {0}},2 µmol/ml püroviinamarihapet, maatrikspuhvrit ja koensüüm I puhvrit lisati järjestikku 48 tundi pärast ravimist töötlemist. Pärast 15-minutilist inkubeerimist 37 °C juures lisati 2,4-dinitrofenüülhüdrasiin. Seejärel lisati igasse süvendisse 250 µl 0,4 M NaOH lahust. Supernatant koguti pärast 30-minutilist inkubeerimist toatemperatuuril. Seejärel mõõdeti mikroplaadilugejaga neeldumine lainepikkusel 450 nm.

Mõõtminekohtamalondialdehüüd(MDA). MDA-d mõõdeti PC12 rakkude supernatandis, kasutades kaubanduslikku komplekti (kat. nr 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) vastavalt tootja protokollile. temperatuuril 95 °C 40 minutit. Segu tsentrifuugiti 1006xg ja 25˚C 10 minutit pärast jahutamist. Seejärel kasutati supernatanti MDA sisalduse määramiseks. Seejärel mõõdeti neeldumist mikroplaadilugejaga 532 nm juures.

Hindamine kohta kaitsev mõjusid kohta ehhinakosiid ja vastu akteosiid AD sisse vitro. PC12 rakud külvati tihedusega 3xl0⁴rakke süvendi kohta {{0}}süvendi plaatidel (100 µl süvendi kohta). Rakke inkubeeriti ravimitega, sealhulgas ehhinakosiidiga (kat. nr 111670-200503; Riiklikud Toidu- ja Ravimikontrolli Instituudid, Peking, Hiina) ja akteosiidiga (kat. nr 111530-200505; Riiklikud Toidu- ja Ravimikontrolli Instituudid ) erinevates kontsentratsioonides (0,5, 25 ja 50 µg/ml). Seejärel töödeldi rakke A 1-42 või H-ga₂O₂24 tundi ja rakkude elujõulisust mõõdeti MTT testiga.

Statistiline analüüs. Väärtused on väljendatud keskmise ± standardhälbena. Rühmadevaheliseks võrdluseks kasutati õpilase t-testi. Statistilised analüüsid viidi läbi kasutades SPSS 18.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Tulemused

PhG-de kvantifitseerimine H. Cistanchesist.Ekstraheeritud PhG-de ja standardlahuste UV-spektridehhinakosiidja akteosiid registreeriti ning tulemused näitasid, et UV-spektrid olid ühtsed (joonis 1). UV-spektrofotomeetria

näitas, et PhG sisaldus oli 87,6 protsenti. HPLC tulemused näitasid, et ehhinakosiidi ja akteosiidi sisaldus oli

vastavalt 37,7 ja 17,8 protsenti (joonis 2).

OtsustatuskohtaaideaalnePhGkontsentratsioon. Võrreldes tühja rühmaga oli PhG-l 75, 100, 125, 150, 175 ja 200 µg/ml PC12 rakkudele märkimisväärne inhibeeriv toime (P<0.05), while="" phg="" at="" 5,="" 25="" and="" 50="" µg/ml="" showed="" low="" toxicity="" on="" pc12="" cells,="" and="" the="" cell="" viability="" was="">80 protsenti (joonis 3). Seega kasutati järgnevates katsetes PC12 rakkude töötlemiseks PhG-sid kontsentratsioonis 5, 25 ja 50 µg/ml, kuna need ei mõjutanud rakkude elujõulisust.

A 1‑42-indutseeritudPC12raku vigastus.Võrreldes kontrollrühma omaga oli rakkude elujõulisus 0,5 µM A 1-42 vigastuste rühmas 63 protsenti (P<0.05). the="" cell="" viability="" was="" decreased="" by="" aβ1-42="" in="" a="" concentration-dependent="" manner,="" and="" the="" viability="" was=""><50% in="" the="" 1,="" 1.5,="" and="" 2="" µm="" aβ1-42="" injury="" groups="" (fig.="" 4).="" thus,="" treatment="" with="" 0.5="" µm="" aβ1-42="" for="" 48="" h="" was="" determined="" to="" be="" the="" optimal="" condition="" for="" establishing="" the="">in vitroAD mudel.

Samuti määrati nende PC12 rakkude aktiivsus, mida töödeldi 0,5 µM A 1-42-ga PhG-de ohutute annuste (5, 25 ja 50 µg/ml) juuresolekul 24 tunni jooksul. Võrreldes mudelirühmaga (P<0.01), phgs="" showed="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" rescued="" by="" phgs="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="">

H₂O₂-indutseeritudPC12raku vigastus. 25 uM H-ga töödeldud PC12 rakkude elujõulisus₂O₂DMEM-is koos PBS-iga lahustatuna oli 56,43 protsenti. 200 uM H-ga töödeldud PC12 rakkude elujõulisus₂O₂DMEM-is lahustatud ilma PBS-ita oli 71,64 protsenti (tabel I). Seega töödeldi PC12 rakke 25 uM H-ga₂O₂DMEM-is lahustatud PBS-iga valiti AD mudeli loomise optimaalseks tingimuseks.

Võrreldes kontrollrühmaga oli rakkude elujõulisus mudelrühmas 48,8 protsenti (P<0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" phgs="" had="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" dose-dependently="" increased="">

PhG-d ja PhG-dega kontsentratsioonides 5, 25 ja 50 µg/ml töödeldud PC12 rakkude elujõulisus olid vastavalt 54, 57 ja 64 protsenti (tabel II).

PhG-d pärsivad vigastusest põhjustatud LDH vabanemist PC12 rakkude poolt. Võrreldes kontrollrühmaga suurenes vigastatud PC12 rakkude supernatandi LDH sisaldus, mida PhG-d inhibeerisid kontsentratsioonist sõltuval viisil. See tulemus näitas, et PhG-del on PC12 rakkudele märkimisväärne neuroprotektiivne toime (joonis 6).

inhibeerivad PhG-d kontsentratsioonist sõltuval viisil. See tulemus näitas, et PhG-del on PC12 rakkudele märkimisväärne neuroprotektiivne toime (joonis 7). PhG ja selle komponendid ehhinakosiid ja akteosiid päästavad vigastatud PC12 rakkude elujõulisuse. Võrreldes mudelrühmaga suurendas ravi akteosiidiga oluliselt A 1-42-vigastatud PC12 rakkude elujõulisust annusest sõltuval viisil. PhG-d ja ehhinakosiid suurendasid oluliselt ka A 1-42-vigastatud PC12 rakkude elujõulisust kõigil testitud kontsentratsioonidel (joonis 8A).

Võrreldes mudelrühmaga suurendas akteosiid märkimisväärselt H-ga töödeldud PC12 rakkude elujõulisust₂O₂. PhG-d suurendasid ka H-ga töödeldud PC12 rakkude elujõulisust₂O₂kontsentratsioonidel 5 ja 25 ug/ml mõju ei olnud märkimisväärne (joonis 8B). Lisaks suurendas ehhinakosiid rakkude elujõulisust 25 µg/ml juures.

Kokkuvõtteks võib öelda, et akteosiid, PhG-d ja ehhinakosiid avaldasid A 1-42 või H-ga vigastatud PC12 rakkudele märkimisväärset neuroprotektiivset toimet.₂O₂.