Oletatava 3,5-dikloroaniliini (3,5-DCA) metaboliitide nefrotoksiline potentsiaal ja 3,5-DCA biotransformatsioon Fischer 344 rottide isoleeritud neerurakkudes
Mar 04, 2022
Lisateabe saamiseks võtke ühendust:tina.xiang@wecistanche.com
Abstraktne:Käesoleva uuringu eesmärk oli uurida nelja 3,5-dikloroaniliini (3,5-DCA) metaboliidi (3,5-dikloroatsetaniliid,3,5- in vitro nefrotoksilist potentsiaali. DCAA;3,5-diklorofenüülhüdroksülamiin,3,5-DCPHA;2-amino-4,6-diklorofenool, 2-A-4 ,6-DCP;3,5-dikloronitrobenseen,3,5-DCNB) ja määrata 3,5-DCA metabolismi neerudes in vitro. Tsütotoksilisuse testimiselisoleeritud neerurakud(IKC) isastelt Fischer 344 rottidelt (~ 4 miljonit/ml, 3 ml) puutusid kokku metaboliidiga (0-1,5 mM; kuni 90 min) või vehiikuliga. Nendest metaboliitidest oli 35-DCPHA kõige tugevam nefrotoksiline aine, millel on 35-DCNB vahepealne nefrotoksiline potentsiaal.2-A-4,6-DCP ja 3,{ {12}}DCAA ei olnud tsütotoksiline. Eraldi katsetes vähendas 35-DCNB tsütotoksilisust IKC eeltöötlemine antioksüdantide ja tsütokroom P450, flaviini monooksügenaasi ja peroksidaasi inhibiitoritega, samas kui 3,5-DCPHA tsütotoksilisust nõrgendas kaks nukleofiilset ainet.antioksüdandid(glutatioon ja N-atsetüül-L-tsüsteiin). IKC inkubeerimine 3,5-DCA(0.5-1.0 mm,90 min) andis ainult 3,5-DCAA ja 3,{{12 }}DCNB kui tuvastatavad metaboliidid. Need andmed viitavad sellele, et 3,5-DCNB ja 3,5-DCPHA on potentsiaalsed nefrotoksilised metaboliidid ja võivad kaasa aidata 3,5-DCA poolt indutseeritud nefrotoksilisusele in vivo. Lisaks võivad neerud bioaktiveerida3,5-DCNB toksilisteks metaboliitideks ja 3,5-DCPHA näib genereerivat reaktiivseid metaboliite, mis soodustavad3,5-DCA nefrotoksilisust. In vitro näib 3,5-DCA N-oksüdatsioon olevat 3,5-DCA bioaktiveerimise peamine mehhanism nefrotoksilisteks metaboliitideks.
Märksõnad:nefrotoksilisus; in vitro; rott;3,5-dikloroaniliin;35-diklorofenüülhüdroksüülamiin;3,5-dikloroatsetaniliid;2-amino-4,6-diklorofenool;3,{{ 9}}dikloronitrobenseen
1. Sissejuhatus
Kloroaniliinid on keemilised vahesaadused, mida tavaliselt kasutatakse paljude värvainete, põllumajanduskemikaalide, ravimite ja tööstuskemikaalide tootmisprotsessis. Kokkupuude kloroaniliinidega toimub töökeskkonnas, nende vabanemise või moodustumise kaudu imetajatel mitmete ühendite metabolismi käigus [1-3] või pestitsiidide keskkonnas lagunemise kaudu[1,4-6]. Kloroaniliinide tuvastamist inimese uriinis või veres on kasutatud kloroaniliinipõhiste pestitsiididega kokkupuute biomarkerina [7-10]. Kloroaniliinidega kokkupuutega seotud toksilisus hõlmab hematotoksilisust (nt aneemia või methemoglobineemia)[11-13], põrnatoksilisust [11,14], hepatotoksilisust [14-17], endokriinsüsteemi häireid [18] ja nefrotoksilisust [16,19]. ,20]. Kloroaniliinid loetakse prioriteetseteks saasteaineteks ka keskkonnariskide hindamise uuringutes nende võimaliku kahjuliku tervisemõju tõttu ja pärast pestitsiidide lagunemist põllumajanduspiirkondades keskkonda sattumise tõttu [21,22].
Kolmest monoklooritud ja kuuest deklooritud aniliinist on 3,5-dikloroaniliin (3,5-DCA) kõige tugevam nefrotoksiline in vivo jain vitro[16,19,23]. In vivo kokkupuude 3,5-DCA-ga Sprague-Dawley või Fischeris põhjustas 344 rotti uurea lämmastiku (BUN) kontsentratsiooni suurenemist veres, orgaaniliste ioonide transpordi vähenemist proksimaalsetes tubulaarsetes rakkudes, neerude massi vähenemist, proteinuuria ja hematuuriat. [23,24]. Kõige tõsisemad morfoloogilised muutused toimuvad neerude proksimaalsetes torukujulistes rakkudes, kuid 3,{10}}DCA kokkupuude mõjutab ka distaalseid torukujulisi rakke ja kogumiskanaleid [23]. Edasised uuringud kasutadesisoleeritud neerurakud(IKC) isastelt Fischer 344 rottidelt näitasid, et kontsentratsioonid 10 mm või rohkem 3,5-DCA kokkupuude 90 minuti jooksul suurendab laktaatdehüdrogenaasi (LDH) vabanemist, mis on tsütotoksilisuse näitaja [25 ].
Aniliinühendite toksilisus in vivo on peamiselt tingitud toksiliste metaboliitide moodustumisest. Tuginedes uuringutele aniliini ja mõnede selle klooritud derivaatidega, on nende aniliiniühendite biotransformatsiooniteed selgelt kindlaks tehtud ja hõlmavad N-oksüdatsiooni, N-atsetüülimist ja fenüültsükli oksüdatsiooni [13, 26-28]. Kuigi 35-DCA metabolismi in vivo ei ole üksikasjalikult uuritud, võivad need biotransformatsioonirajad tekitada mitmeid potentsiaalselt toksilisi metaboliite (joonis 1), nagu juhtub ka teiste kloroaniliinide puhul, mille biotransformatsiooniuuringud on läbi viidud [26, 29,30]. Racine'i jt hiljutised uuringud. [25] on näidanud, et 35-DCA metaboliseerub paljude neeruensüümisüsteemide kaudu toksilisteks metaboliitideks. Siiski pole selge, millised metaboliidid on toodetudneerud.
Üks potentsiaalne 3, 5-DCA metaboliit, 4-amino-2, 6-diklorofenool (4-A-2, 6-DCP) , on hinnatud nefrotoksilise potentsiaali suhtes ning see on tugev nefrotoksiline toime in vivo ja in vitro isastel Fischer 344 rottidel [31-33]. Nefrotoksiliste benseenide sageli mono-, di- ja trikloronitrobenseenide nefrotoksilisuse võrdlev in vitro uuring näitas, et 3,5-dikloronitrobenseen (35-DCNB) on dikloronitrobenseenide seas kõige vähem tugevatoimeline nefrotoksiline [34]. . Praeguseks pole ühtegi uuringut, mis oleks uurinud teiste oletatavate 3-5-DCA metaboliitide nefrotoksilist potentsiaali.
Käesoleva uuringu eesmärk oli määrata kolme täiendava oletatava 3,5-DCA metaboliidi, mis tulenevad N-atsetüülimisest, (3,5-dikloroatsetaniliid;) nefrotoksilisuse potentsiaal.
3.5-DCAA), N-oksüdatsioon (3,5-diklorofenüülhüdroksüülamiin; 35-DCPHA) või fenüültsükli oksüdatsioon (2-amino-4,{{ 8}}diklorofenool;2-A-4,6-DCP)(joonis 1) pärast 35-DCA neeruvälist biotransformatsiooni. Uuriti 3,5-DCNB nefrotoksilist potentsiaali IKC mudelis ja selle võimalikke bioaktivatsioonimehhanisme. Lisaks määrati vabade radikaalide/reaktiivsete metaboliitide potentsiaal kaasa aidata 3,5-DCPHA tsütotoksilisusele. Lõpuks viidi läbi biotransformatsiooniuuring, et teha kindlaks, mil määral 3,{20}}DCA biotransformeerub isaste Fischer 344 rottide IKC-s ja määrata, millised metaboliidid tekivad.
2. Tulemused
2.1. Tsütotoksilisuse aja ja kontsentratsiooni seosed 3,5-DCA metaboliitide puhul
Iga 3, 5-DCA oletatava metaboliidi, kontsentratsiooni ja ajakulu uuringud viidi IKC-s läbi, et määrata iga 3, 5-DCA oletatava metaboliidi nefrotoksilisuse potentsiaal. Kokkupuude 3,5-DCAA-ga ei suurendanud oluliselt LDH vabanemist, mis on tsütotoksilisuse marker, ühelgi ajal (60 või 90 min) ega kontsentratsiooni (0-1). 5 mM) testitud (joonis 2A). Lisaks ei põhjustanud kokkupuude 2-A-4,6-DCP-ga LDH vabanemise olulist suurenemist ühelgi testitud kontsentratsioonil (kuni 1,5 mM) pärast 60- või 90-minutilist kokkupuudet ( Joonis 2B). IKC inkubeerimine 3,5-DCNB või 3,5-DCPHA-ga tõi kaasa ajast ja kontsentratsioonist sõltuva LDH vabanemise suurenemise mõlema ühendi puhul, kuigi 3,5-DCPHA kutsus esile suurima tõusu. LDH vabanemine. Olulist LDH vabanemist täheldati 3,5-DCNB kontsentratsioonidel 1,0 või 1,5 mM või rohkem 90 minuti pärast, kuid ainult 1,5 mM 60 minuti pärast (joonis 2C). Seevastu 35-DCPHA kutsus esile olulise tõusu LDH vabanemises 0, 25 mM või rohkem pärast 60 ja 90 minutit, kusjuures LDH vabanemise suurenemine, mida täheldati 90 minuti pärast, on oluliselt suurenenud võrreldes vastava 60-minutilise LDH vabanemise suurenemisega (joonis 2D). Seetõttu oli testitud metaboliitidest 3,5-DCPHA kõige nefrotoksilisem.
2.2. Neerude biotransformatsioon ja 3,5-DCNB tsütotoksilisus
Kuna aniliinid ja nitrobenseenid võivad metaboliseeruda üksteiseks, kavandati täiendavad uuringud, et uurida nende rolli.neerude biotransformatsioonja vabad radikaalid tsütotoksilisuses pärast kokkupuudet 1.0 mM 3,5-DCNB-ga 60 minutit. Vabade radikaalide võimaliku rolli määramiseks 3,5-DCNB tsütotoksilisuses töödeldi IKC-d eelnevalt antioksüdandiga. Eeltöötlemine kõigi antioksüdantidega (-tokoferool, glutatioon, askorbaat ja N-atsetüül-L-tsüsteiin; joonis 3) vähendas märkimisväärselt 3,5-DCNB-indutseeritud tsütotoksilisust.
Neerude biotransformatsiooni rolli uurimiseks 3,5-DCNB toksilisuses IKC-s kasutati eeltöötlust tsütokroomide P450 (CYP), flaviini sisaldavate monooksügenaaside (FMO) ja peroksidaasidega. CYPinhibiitorite kasutamine (joonis 4) näitas, et kaks üldist CYP inhibiitorit (piperonüülbutoksiid [PiBx]; metürapoon) vähendasid märkimisväärselt 3,5-DCNB tsütotoksilisust. Eeltöötlemine FMO inhibiitoritega (n-oktüülamiin; metimasool) ja peroksidaasi inhibiitori merkaptosuktsinaadiga vähendas oluliselt 3,5-DCBN tsütotoksilisust (joonis 5). Indometatsiin, mis inhibeerib tsüklooksügenaasi peroksidaasi aktiivsust, kaldus vähendama 3,5-DCNB-indutseeritud LDH vabanemist, kuid ei saavutanud olulist erinevust (joonis 5).
2.3. Antioksüdandid ja 3,5-DCPHA tsütotoksilisus
Et hakata uurima vabade radikaalide rolli 3,5-DCPHA-indutseeritud tsütotoksilisuses, töödeldi IKC-d eelnevaltantioksüdandid(glutatioon, askorbaat või N-atsetüül-L-tsüsteiin) enne kokkupuudet 3,5-DCPHA-ga (0,5 mM). Tulemused näitavad, et erinevalt 3-st oli 5-DCNB, 3,{{10}}DCPHA poolt indutseeritud tsütotoksilisus osaliselt nõrgendatud N-atsetüül-L-tsüsteiiniga ja täielikult kaitstud glutatiooniga (joonis 6 ).Askorbaat (1.0 või 2,0 mM) ei olnud efektiivne 3,5-DCPHA tsütotoksilisuse vähendamisel.
2.4.3,5-IKC DCA ainevahetus
Varasemad võrdlevad tsütotoksilisuse uuringud kavandati väliselt toodetud oletatavate 3,5-DCA metaboliitide nefrotoksilisuse potentsiaali uurimiseks. Samuti uurisime, kuidas IKC metaboliseerib 3,5-DCA-d, et näha, milliseid metaboliite neerurakud otseselt tootsid. Nendes katsetes inkubeeriti IKC-d kas mittetoksilise kontsentratsiooniga 3, 5-DCA (0,5 mM) või tsütotoksilise kontsentratsiooniga (10 mM) 90 minutit ja söötme proovidega. ja rakke analüüsiti HPLC abil 3,{12}}DCA ja selle metaboliitide suhtes. 3,5-DCA ja selle metaboliitide retentsiooniajad, avastamispiirid ja ekstraheerimiskoefitsiendid on toodud tabelis 1 autentsete 3,5-DCA ja iga metaboliidi (4-A{{) standardite jaoks. 19}},6-DCP,2-A-4,6-DCP, 3,5-DCPHA, 3,5-DCAA ja 3 ,5-DCNB).
Mõlema kontsentratsiooni korral oli inkubatsiooniperioodi lõpus söötmes ja rakkudes peamine ühend lähteühend 3, 5-DCA. Vähem kui 5 protsenti 3,5-DCA-st metaboliseerus 3,5-DCAA-ks ja 3,5-DCNB-ks (tabel 2). Puudusid tõendid konjugeerimata aminoklorofenooli metaboliitide 2-A-46-DCP või 4-A-2,6-DCP.35-DCPHA moodustumise kohta. ei tuvastatud, mis ei olnud üllatav, arvestades selle metaboliidi väga reaktiivset olemust, kuid järeldus, et 3,5-DCNB esines söötmes ja rakkudes, toetab järeldust, et 3,5-DCPHA tekkis ja seejärel oksüdeeriti 3,5-DCNB-ks.
Võimalik, et aminoklorofenoolid moodustusid, kuid metaboliseerusid sulfaadiks või glükuroniidkonjugaatideks. Konjugaatide moodustumise määramiseks inkubeeriti 3,5-DCA-d (10 mM) IKC-ga 45 või 90 minutit. Kuid söötmete või rakulüsaatide töötlemisel arüülsulfataasi või -glükuronidaasiga ei ilmnenud vaba 2-A-4, 6-DCP ega 4-A-2,{ {12}}DCP (andmeid ei kuvata). Need tulemused viitavad sellele, et need kaks metaboliiti ei moodustunud tuvastataval tasemel või oksüdeerusid edasi reaktiivseteks metaboliitideks (joonis 1). Kuna aga 35-DCA ekvivalendid taastusid sisuliselt täielikult, on ebatõenäoline, et nendest metaboliitidest moodustus väga palju, kui üldse.neerurakud.
2.5. Dietüülditiokarbaamhappe (DEDTCA) mõju 3,5-DCA metabolismile
Varasemad uuringud on näidanud, et IKC eeltöötlemine CYP2C inhibiitoritega vähendas märkimisväärselt 3,5-DCA tsütotoksilisust [25]. Üks tõhusamaid 35-DCA toksilisuse inhibiitoreid oli CYP2C inhibiitor DETCA. Et uurida, kuidas DEDTCA mõjutas 3,5-DCA metabolismi, töödeldi IKC-d eelnevalt DEDTCA-ga (0,1 mM), millele järgnes {{10}}DCA (1,0 mM) 90 min inkubatsiooni. 35-DCA ja 3,5-DCA metaboliitide taseme määramine näitas, et 3,5-DCA kogutase söötmes ja rakkudes suurenes vaid veidi, samas kui 3,{{{ 20}}DCAA ja 3,5-DCNB vähendati (tabel 3). 2-A-4.6-DCP-d 4-A-2,6-DCP-d ega 3,5-DCPHA-d ei tuvastatud, mis ühtib varasemate uuringutega (tabel 2).
3. Arutelu
Selle uuringu oluliseks aspektiks oli 3,5-DCA oletatavate väliselt toodetud metaboliitide nefrotoksilise potentsiaali määramine neeru sihtrakkudel. Eeldatakse, et need metaboliidid tekivad aniliini ja kloroaniliinide metabolismi põhjal (joonis 1)[13.26,28,29]. Oleme varem arvutanud, et nefrotoksiline annus 3,{8}}DCA Fischer 344 rotil annaks maksimaalse veretaseme ~1,25 mM [25]. Seega võivad sellest kontsentratsioonist madalamad metaboliitide kontsentratsioonid olla füsioloogiliselt olulised. Käesoleva uuringu tulemused näitavad, et 3,5-DCA, 3,5-DCAA N-atsetüülimisel tekkival metaboliidil oli 3,5-DCA-ga võrreldes oluliselt väiksem nefrotoksiline potentsiaal. See tulemus ei ole üllatav ja on kooskõlas varasemate monokloroaniliinide ja nende metaboliitidega tehtud uuringutega, mis näitavad, et N-atsetüülimise tulemuseks on kloroatsetaniliidi metaboliidid, mille nefrotoksiline potentsiaal on võrreldes lähteühendiga [35, 36]. Seega näib N-atsetüülimine olevat kloroaniliinist põhjustatud nefrotoksilisuse, sealhulgas 3,5-DCA detoksifitseerimise viis. Lisaks on IKC võimeline metaboliseerima 3,5-DCA-d 3-ks,{{30} }DCAA (tabel 2). Kuid arvestades 3,5-DCAA nõrka nefrotoksilist potentsiaali, on ebatõenäoline, et see metaboliit soodustab 3,5-DCA-indutseeritud nefrotoksilisust in vitro.
Erinevalt 3,5-DCAA-st indutseerib vähemalt üks metaboliit, mis tuleneb 3,5-DCA fenüültsükli oksüdatsioonist, nefrotoksilisust. 3,5-DCA oksüdeerimine 4-asendis tekitab 4-A-2,6-DCP (joonis 1), mis on tugev nefrotoksiline in vivo ja in vitro [31-33]. In vivo põhjustab 4-A-2,6-DCP(0,38 mmol/kg,ip) märkimisväärset nefrotoksilisust isastel Fischer 344 rottidel, keda iseloomustab proteinuuria, glükosuuria, kõrgenenud vere uurea lämmastiku (BUN) kontsentratsioon janeerudkehakaal ja proksimaalne tubulaarnekroos S3 segmendis [3132]. In vitro, 4-A-2,6-DCP vähendas p-aminohippuraadi (PAH) ja tetraetüülammooniumi (TEA) omastamist rotisneerukoore viiludkontsentratsioonidel vastavalt 5 μM ja 50 uM 【31】 ja suurenenud LDH vabanemine 50 μM või kõrgemal pärast 2-tunnist kokkupuudet 【33】. IKC-s on LDH vabanemise suurendamiseks nõutav 4-A-2,6-DCP kontsentratsioon 250 μM või suurem ja 90-minutiline kokkupuude. Selle mudeli tsütotoksilisuse esilekutsumiseks vajalikud kõrgemad kontsentratsioonid on tõenäoliselt tingitud albumiini olemasolust IKC inkubatsioonikeskkonnas, kuid mitte Krebs-Ringeri lahuses, mida kasutatakse neerukoore viilude inkubatsiooniuuringutes. Selles uuringus ei suurendanud 2-A-4,6-DCP, mis tuleneb oksüdatsioonist 35-DCA 2-asendis, LDH vabanemist kontsentratsioonidel kuni 1,5 mM ja kuni 90 säritust, mis näitab, et 4-A-2,6-DCP oli tugevam nefrotoksiline kui 2-A-4, 6-DCP. See leid on kooskõlas teiste 4-amino- ja 2-aminofenoolide[37,38] nefrotoksilise potentsiaali võrdlusega. Seega on 4-A-2.6-DCP tõenäolisem kui 2-A-4,6-DCP panus 3,{{38 }}DCA-indutseeritud nefrotoksilisus in vivo.
IKC3,5-DCA metabolismi uuringutes ei leitud ei 2-A-4,6-DCA ega 4-A-2,6- DCA tuvastati vabade metaboliitide või glükuroniidi või sulfaadi konjugaatidena (tabel 2). Kuigi on võimalik, et neid aminodiklorofenoole tekkis väikeses koguses, taastus täielikult IKC inkubatsioonile lisatud 3,{10}}DCA. tuvastati lähteühendina pluss muud metaboliidid (tabel 2). Need tulemused viitavad sellele, etneerudei moodusta piisavalt aminodiklorofenooli metaboliite, et soodustada 3,5-DCA nefrotoksilisust in vitro.
On näidatud, et N-oksüdatsioon on aniliini ja kloroaniliini metabolismi oluline biotransformatsioonirada, mis võib kaasa aidata hepatotoksilisusele ja potentsiaalselt muudele nende ühendite põhjustatud toksilisusele [11, 39-41]. Aniliini N-oksüdeerimisel tekib fenüülhüdroksüülamiini metaboliit, mis oksüdeeritakse edasi nitrosobenseeni metaboliidiks [39] (joonis 1). Fenüülhüdroksüülamiini ja nitrosobenseeni metaboliidid võivad redokstsüklis tekitada vabu radikaale ja oksüdeerida hemoglobiinis sisalduvat raudrauda ja teisi raudrauda sisaldavaid valke raudraudaks. See tsükkel muudab hemoglobiini erütrotsüütides methemoglobiiniks, kuid võib mõjutada ka teiste valkude ja ensüümide bioloogilist aktiivsust, mis vajavad bioloogiliseks aktiivsuseks raua molekuli. Nitrosobenseeni metaboliidid on samuti reaktiivsed ja võivad kovalentselt seonduda rakusiseste makromolekulide nukleofiilidega [42,43]. Nitrosorühma võib edasi oksüdeerida, et moodustada nitrobenseeni metaboliite (joonis 1). Varasemad uuringud on näidanud, et 3,5-DCA võib in vivo esile kutsuda methemoglobineemiat ja et 3,5-DCPHA (joonis 1) on selle toksilisuse eest peamiselt vastutav [40,44,45]. Need leiud viitavad sellele, et 3,5-DCPHA-d toodetakse väljastpoolt, kõige tõenäolisemalt maksas, ja see liigub verre, põhjustades methemoglobineemiat, nagu aniliini puhul [44,45]. Need leiud viitavad ka sellele, et neer puutub kokku 3,{23}}DCPHA-ga, mida toodetakse neeruvälistes kohtades.
3,5-DCNB moodustumine IKC poolt (tabel 2) näitab, et neer võib moodustada 3,5-DCPHA 3,5-DCA-st. Seega võib neer kokku puutuda 3,5-DCPHA-ga nii neerusisesest kui ka -välisest moodustumisest.3,5-DCPHA osutus kõige toksilisemaks testitud metaboliidiks ja on tõenäoline, et 3,{ {13}}DCPHA on 3,5-DCA nefrotoksilisuse peamine põhjustaja, otse neerurakkudele ja/või kaudselt hematotoksilisuse kaudu. Samuti on tõenäoline, et mitmed ensüümsüsteemid on võimelised moodustama 35-DCPHA-d 3-st,5-DCA-st ja need ensüümsüsteemid võivad moodustada ka teisi 35-DCA nefrotoksilisi metaboliite [46, 47]. On näidatud, et aniliiniühendite N-oksüdatsiooni katalüüsivad CYP-d, flaviini monooksügenaasid (FMO-d),
peroksidaasid ja prostaglandiinide süntetaas [48-51]. Varasemad meie labori uuringud on näidanud, et 3,5-DCA nefrotoksilisust IKC-s võivad nende erinevate ensüümide perekondade inhibiitorid erineval määral nõrgendada [25], mis viitab sellele, et ühe ensüümiperekonna inhibeerimine võimaldab 35- DCA bioaktiveerimine jätkub teiste metaboliseerivate ensüümsüsteemide poolt. Et teha kindlaks, kas Racine et al. [25], mis muutsid 3,5-DCA N-oksüdatsiooni, uuriti CYP2C inhibiitori dietüülditiokarbamaadi (DETCA) ja vähemal määral CYP2E1 võimet vähendada DCNB moodustumist. DEDTCA valiti uuringuks, kuna see vähendas märkimisväärselt DCA tsütotoksilisust IKC-s [25]. Avastus, et DEDTCA vähendas 3,5-DCNB moodustumist IKC-s, toetab järeldust, et DEDTCA vähendas 3,5-DCA nefrotoksilisust vähemalt osaliselt, inhibeerides 3,{{21} }DCA. Kuna CYP2E1 inhibiitor isoniasiid ei mõjutanud 3,5-DCA tsütotoksilisust, näib, et CYP2C ensüümid bioaktiveerivad 3,5-DCA toksilisteks metaboliitideks 3,5-DCPHA moodustumise kaudu.
Tsütotoksilisust võib in vitro IKC-s tekitada 3,5-DCPHA kahe võimaliku mehhanismi kaudu; redokstsükkel vabade radikaalide tekitamiseks (nt superoksiidi anioonradikaal) ja oksüdatiivne stress või alküülivate metaboliitide tootmine. Racine et al. [25] leidis, et 3,5-DCA-indutseeritud tsütotoksilisus IKC-s ei olnud tingitud oksüdatiivsest stressist. Nii vähendatud kui ka kogu glutatiooni tase vähenes 3,5-DCA kokkupuute võrra, mis viitab reaktiivse metaboliidi moodustumisele. Käesolevas uuringus vähendasid 35-DCPHA tsütotoksilisust nukleofiilsed antioksüdandid (glutatioon ja N-atsetüül-L-tsüsteiin), kuid mitte nukleofiilne antioksüdant askorbaat (joonis 6). Need tulemused toetavad ühte või enamat 3,5-DCPHA reaktiivset alküülivat metaboliiti kui tsütotoksilist liiki.
Klooritud nitrobenseenid on nefrotoksilised in vivo ja in vitro [34,52,53]. Rickert ja Held [3] leidsid, et isaste Fischer 344 rottide maksa mikrosoomid metaboliseerisid 3-kloronitrobenseeni nitrorühma redutseerimise teel, moodustades 3-kloroaniliini, mis näitab, et metabolism on vahemikus 3,5-DCA ja 3,5-DCNB on pöörduv. Seega tekib 3,5-DCNB redutseerimisel 3,5-dikloronitrosobenseeni ja 3,5-DCPHA-d, nagu 3,5-DCA oksüdeerimisel tekivad need kaks metaboliiti. 3,5-DCNB võimalik panus 3,5-DCA nefrotoksilisusesse oli aga ebaselge. Kui 35-DCNB oli nefrotoksiline metaboliit, oli samuti ebaselge, kas toksiliste keemiliste liikide tekitamiseks on vaja biotransformatsiooni. Praegused tulemused toetavad 3,5-DCNB-d kui toksilist3,5-DCA metaboliiti, mis võib pärast biotransformatsiooni kaasa aidata 3,5-DCA nefrotoksilisusele.
Praegune uuring näitab, et 3,5-DCNB on tugevam nefrotoksiline aine kui 3,5-DCA IKC-s [25]. Lisaks peegeldab antioksüdantide ja oksüdatiivse biotransformatsiooni inhibiitorite võime 3,5-DCNB tsütotoksilisust nõrgendada nende eeltöötluste mõju 3,5-DCA tsütotoksilisuse vähendamisele IKC-s [25]. Need tulemused viitavad sellele, et mis tahes 3,5-DCNB, mis moodustub 3,5-DCA biotransformatsiooni käigus, võib kaasa aidata 3,5-DCA nefrotoksilisusele 3,5- metabolismi kaudu. DCNB muudetakse tagasi 3,5-dikloronitrsobenseeniks ja 3,5-DCPHA-ks. CYPinhibiitorite nõrk aktiivsus 3,5-DCNB tsütotoksilisuse suhtes viitab aga sellele, et teised ensüümsüsteemid (nt mitte-CYP nitroreduktaas) võivad selle mudelisüsteemi nitrorühma vähenemise eest vastutada või sellele kaasa aidata. . Lisaks toetab antioksüdantide võime märkimisväärselt nõrgestada 3.{26}}DCNB tsütotoksilisus nitrorühmast pärinevate vabade radikaalide ja/või reaktiivsete hapniku/lämmastiku liikide rolli selle ühendi nefrotoksilises mehhanismis. Arvestades 3,5-DCNB nefrotoksilisuse märgatavat nõrgenemist mõnede oksüdatiivse metabolismi inhibiitorite (nt n-oktüülamiin ja merkaptosuktsinaat) poolt, on ebatõenäoline, et 35-DCNB on neerurakkudele otseselt toksiline, kuid tekitab selle tsütotoksilisus metaboliitide kaudu. Lisaks näitavad in vitro 3,5-DCA metabolismi uuringud, et neerurakud ei pruugi toota piisavalt 3,5-DCNB-d, et vastutada 3,5-DCA tsütotoksilisuse eest in vitro. Võimalik, et 3,5-DCA neeruväline metabolism toodab piisavalt 3,5-DCNB-d, et aidata kaasa 3,5-DCA-indutseeritud nefrotoksilisusele in vivo, kuid üldine panus on 3,{{ 46}}DCNB kuni 3,5-DCA nefrotoksilisus nõuab täiendavaid uuringuid.
Kokkuvõttes näitavad nende uuringute tulemused, et väljastpoolt genereeritud amiin-odiklorofenooli metaboliidid ja N-oksüdatsioonist tulenevad metaboliidid võivad kaasa aidata 3.5-DCA nefrotoksilisusele in vivo, samas kui {{5} N-atsetüülimine. }DCA on võõrutusmehhanism. In vitro on 3,5-DCA N-oksüdatsioon 3,5-DCA peamine bioaktiveerimise mehhanism tsütotoksilisteks metaboliitideks ning toksilisust vahendavad tõenäoliselt 3,5-dikloronitrsobenseen ja /või 3,5-DCPHA. Lisaks on 3,5-DCNB-indutseeritud nefrotoksilisus tingitud metaboliitide moodustumisest ning 3,5-DCNB nefrotoksilisus on samuti tõenäoliselt vahendatud 3,5-dikloronitrsobenseeni ja/või 35-DCPHA abil.
4. Materjalid ja meetodid
4.1.Loomad
Isased Fischer 344 rotid (200-250 g) saadi ettevõttest Hilltop Lab Animals, Inc. (Scotts-dale, PA, USA). Loomi on majutatud kaks rotti puuri kohta, kus toit ja vesi on ad libitum saadaval, temperatuuri (21-23 kraadi), niiskust (40-55 protsenti) ja valgust (12 tundi sisse / 12 tundi väljas) kontrollitud. Enne kasutamist lasti kõigil loomadel vähemalt üks nädal aklimatiseeruda Ameerika Laboratoorsete Loomade Hoolduse Akrediteerimise Assotsiatsiooni (AAALAC) akrediteeritud loomaasutustes. Kogu loomade kasutamise kiitis heaks Marshalli ülikooli institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee (protokollid 447 (5. august 2010) ja 531 (1. veebruar 2013)) ning loomkatsed viidi läbi vastavalt laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendile. , mille on vastu võtnud Riiklik Terviseinstituut.
4.2. Kemikaalid
Kõik kemikaalid osteti kõrgeima saadaoleva puhtusastmega firmast Fischer Scientific (Pittsburgh, PA, USA) või Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA), välja arvatud 3,5-diklorofenüülhüdroksüülamiin(3,{{3}). }DCPHA), 35-dikloroatsetaniliid (3.5-DCAA) ja 2-amino-4, 6-diklorofenool (2-A{{11 }},6-DCP), mis sünteesiti meie laboris. 3,5-DCPHA sünteesiti 3,5-DCNB redutseerimisel, kasutades hüdrasiin-pallaadiumi süsinikul, kasutades eelnevalt kirjeldatud meetodit Rondestvedt ja Johnson [54] ja puhastati, nagu on kirjeldanud Valentovic et al. [55]. 3,5-DCAA süntees ja puhastamine viidi läbi Newelli et al. meetodil. [56] pannes reageerima võrdsetes kogustes 3,5-dikloroaniliini ja atseetanhüdriidi naatriumatsetaadi juuresolekul. 2-A-4 valmistamiseks nitreeriti 6-DCP, 2,4-diklorofenool McMillani jt meetodil.[29,57], millele järgnes nitro redutseerimine. rühm aminorühmaks naatriumvesiniksulfitiga 10% naatriumhüdroksiidi vesilahuses vastavalt Newell et al. [56].
4.3. Eraldatud neerurakkude ettevalmistamine ja ravi
Isoleeritud neerurakud(IKC) saadi töötlemata isastelt Fischer 344 rottidelt. Isoleeritud neerurakkude saamiseks valiti mudeliks isased Fischer 344 rotid, kuna suurem osa meie varasematest toksilisuse andmetest 3,5-DCA-ga on saadud selles mudelis. Rotid anesteseeriti pentobarbitaaliga (75 mg/kg, ip) ja IKC valmistati Jonesi jt meetodil.[58] kasutades kollagenaasi perfusiooni, nagu on kirjeldanud Racine et al. [25]. Selle tehnikaga eraldatud neerurakud on biokeemilise iseloomustuse põhjal rikastatud neerukoore rakkudes ja neid kasutatakse sageli neerutoksikoloogilistes hinnangutes [59-63]. Rakkude esialgne elujõulisus määrati ligikaudu 85-90 protsendiks laktaatdehüdrogenaasi (LDH) vabanemise ja trüpaansinise (2% w/o) välistamise põhjal. Enne inkubeerimist loendati IKC ja resuspendeeriti Krebs-Henseleiti (pH 7,37; 25 mM Hepes; 2% ilma veise seerumi albumiinita) puhvris kontsentratsiooniga ~4,2 miljonit rakku/ml. IKC (3 ml) eelinkubeeriti 25 ml polükarbonaadist Erlenmeyeri kolbides 5 minutit 37 kraadi juures 95% hapniku/5% süsinikdioksiidi atmosfääris. Pärast eelinkubeerimist eksponeeriti rakke erinevatele kontsentratsioonidele 3,5-DCNB (0.5-1.5 mM), 3.5-DCAA({{32} }.5-1,5 mM),3.5-diklorofenüülhüdroksüülamiin (3,5-DCPHA;0.{{40}}.{{45 }} mM, 2-A-4, 6-DCP （0.5-1.5 mM） või sõiduk (30 μL DMSO) kuni 90 min. Määratud inkubatsiooniperioodi lõpus võeti proovid (0,5 ml) LDH vabanemise testi jaoks, nagu eelnevalt kirjeldatud [20, 25].
Et määrata rollneerude biotransformatsioon3,5-DCNB tsütotoksilisus ja vabad radikaalid35-DCPHA nefrotoksilisuses, töödeldi IKC-d kas antioksüdandi või biotransformatsiooni ensüümsüsteemide inhibiitori (tabel 4) või kandjaga (30uL). DMSO) enne kokkupuudet 10mM35-DCNB-ga (60 min) või 0,5 mM3,5-DCPHA-ga (60 min). Kõik kontsentratsioonid ja eeltöötlusajadantioksüdandidjaneeruensüümide inhibiitoridpõhinesid varem avaldatud uuringutel [20,25].
4.4.IKC 3,5-DCA metabolism
4.4.1.IKC inkubatsioonid ja metaboliitide eraldamine
IKC (~4,2 miljonit rakku/ml; 3 ml) inkubeeriti 3,5-DCA-ga (0,5 või 10mM) Krebs-Henseleiti (KH) puhvris ( pH 7,4) 90 min loksutavas veevannis 95% hapniku/5% süsinikdioksiidi atmosfääris, nagu ülalpool kirjeldatud. 0,5 mM kontsentratsioon 3,5-DCA on mittetsütotoksiline kontsentratsioon 90 minuti pärast, samas kui kontsentratsioon 10 mM kutsub esile tsütotoksilisuse, mida tõendab suurenenud LDH vabanemine. Inkubatsiooniperioodi lõpus koguti 1.0 ml proove ning sööde ja rakud eraldati tsentrifuugimisega. Pelleteeritud rakke pesti KH puhvriga (ilma veise seerumi albumiinita) ja loputusvedelik lisati söötmele. Rakud lüüsiti ultraheliga töötlemise teel ja valk sadestati metanooli (1,0 ml) lisamisega kõikidele proovidele. Proove tsentrifuugiti (3000 g; 10 min 4 kraadi) ja supernatant filtriti läbi 0,45 μ süstalfiltri ja säilitati temperatuuril -20 kraadi, kuni analüüsiti HPLC abil, nagu allpool kirjeldatud.
4.4.2. Sulfaadi ja glükuroniidi konjugaatide määramine
Sulfaadi või glükuroniidi konjugaatide moodustumise kindlakstegemiseks töödeldi mõnes katses ülalkirjeldatud viisil saadud söödet ja rakkude supernatandi fraktsioone ß-glükuronidaasi (6500 ühikut/ml, lõppkontsentratsioon) või arüülsulfataasiga. (200 ühikut/ml, lõppkontsentratsioon) pluss sahharolaktoon (20 mM, lõppkontsentratsioon) 18 tundi (37 kraadi) 0,1 M atsetaatpuhvris (pH 5,0), et hüdrolüüsida vastavalt moodustunud glükuroniid- või sulfaatkonjugaadid 26] . Hüdrolüüs peatati külma metanooli (2,4 ml) lisamisega. Seejärel fraktsioonid filtriti ja säilitati kuni analüüsimiseni, nagu eespool kirjeldatud.
4.4.3. CYP2C metabolismi inhibeerimine DEDCTA poolt
Eraldi katses töödeldi rakke enne 3,5-DCA lisamist dietüülditiokarbamaathappega (DEDTCA, 0,1 mM, 30 min eeltöötlus), mis on CYP2C inhibiitor, et teha kindlaks, millised metaboliidid DEDTCA-ga vähenesid. eeltöötlus. Pärast 90-minutilist inkubatsiooniperioodi töödeldi rakke ja söödet ning säilitati ülalkirjeldatud viisil, et määrata 3,5-DCA kontsentratsioonid ja moodustunud 3,5-DCA metaboliitide kontsentratsioonid.
4.4.4. Metaboliitide HPLC määramine
Söötme proove (75 µl) ja lüüsitud IKC-d analüüsiti Waters Alliance e2695 HPLC süsteemiga (Waters Co., Milford, MA, USA), kasutades Waters 2489 muutuva UV/Vis detektorit 254 nM juures. Kromatogrammid koguti ja integreeriti Empower 3 tarkvara abil (Waters Co., Milford, MA, USA). Waters X Select HSS T3 C18 kolonn (3,5 μm; 4,6 × 15 0 mm²), mis oli varustatud Waters XSelect HSS T3-ga. Ühendite eraldamiseks kasutati VanGuard Cartridge'i (3,5 um; 3,9 × 5 mm2). Liikuv faas koosnes 50:50 metanoolist, veest voolukiirusega 0,75 ml/min. Standardkõverad , määrati avastamispiirid ja ekstraheerimiskoefitsiendid 3,5-DCA ja oletatavate metaboliitide jaoks. Ekstraheerimiskoefitsiendid määrati 1,0 mM3, 5-DCA või proovi võetud metaboliidiproovi integratsiooni võrdlemisel. töötlemine (st metanooli lisamine ja tsentrifuugimine) töötlemata 1,0 mM 35-DCA või metaboliidi proovile.
4.5. Statistika
Andmed on esitatud kui keskmine ± SEM koos N-ga {{0}} eraldi loomkatsetes, välja arvatud N=3 mittetoksilises 0,5 mM 3,5-DCA metabolismi katses. Ravide vahelisi andmeid analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes Tukey test. Olulisus määrati lk<0.05. a="" power="" analysis="" was="" performed="" with="" g*="" power="" software="" version="" 3.1.9.7="" for="" f="" tests,="" anova="" (repeated="" measures,="" within="" factors)="" with="" effect="" size="" f="0.85," α="" error="" probability="0.05," power(1-β="" error="" probability)="0.8" and="" actual="" power="0.832," which="" determined="" a="" sample="" size="" of="" n="4" was="" sufficient="" with="" a="" 95%="" confidence="">
Autori kaastööd: CRR: kirjanduse ülevaade, töö läbiviimine, andmete analüüs ja tõlgendamine, aitas kaasa töö kirjutamisele; MAV: eksperimentaalne kavandamine ja andmete tõlgendamine, DKA: abistab tööde läbiviimisel ja töö ettevalmistamisel; GOR: kirjanduse ülevaade, eksperimentaalne kavandamine, andmete tõlgendamine, kirjutas ja toimetas paberit. Kõik autorid on käsikirja avaldatud versiooni läbi lugenud ja sellega nõustunud.
Rahastamine: Seda uurimistööd toetas osaliselt riiklike tervishoiuinstituutide riiklik üldmeditsiiniteaduste instituut preemia numbriga P20GM103434, GOR. Sisu eest vastutavad ainult autorid ja see ei pruugi esindada riiklike tervishoiuinstituutide ametlikke seisukohti. .
Institutsioonilise ülevaatenõukogu avaldus: Marshalli ülikooli institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee kiitis heaks kõik loomade kasutamise (protokollid 447 (5. august 2010) ja 531 (1. veebruar 2013)) ning loomkatsed viidi läbi vastavalt loomade hooldamise ja kasutamise juhendile. Laboratory Animals, vastu võetud riikliku terviseinstituudi poolt.
Andmete kättesaadavuse avaldus: Selles uuringus esitatud andmed on saadaval vastava autori nõudmisel.
Huvide konfliktid: Autorid ei kinnita huvide konflikti.
Viited
1. Aizawa, H. Pestitsiidide metaboolsed kaardid; Academic Press, Inc.: London, Ühendkuningriik, 1989; 2. köide.
2. Ehlhardt, WJ Vähivastase aine väävli metabolism ja dispositsioon hiirtel, rottidel, ahvidel ja inimestel. Narkootikumide Metab. Dispos. 1991, 19, 370–375. [PubMed]
3. Rickert, DD; Held, SD Kloronitrobenseenide metabolism isoleeritud roti hepatotsüütide poolt. Narkootikumide Metab. Dispos. 1990, 18, 5–9. [PubMed]
4. Lee, JB; Sohn, HY; Shin, KS; Kim, JS; Jo, MS; Jeon, CP; Jang, JO; Kim, JE; Kwon, GS Vinklosoliini ja selle toksilise metaboliidi 3, 5-dikloroaniliini mikroobne biodegradatsioon ja toksilisus. J. Microbiol. Biotehnoloogia. 2008, 18, 343–349. [PubMed]
5. Santos, TCR; Rocha, JC; Alonsa, RM; Martinez, E.; Ibanez, C.; Barcelo, D. Propaniili kiire lagunemine riisipõllukultuurides. Keskkond. Sci. Technol. 1998, 32, 3479–3484. [CrossRef]
6. Marlett, VL; Martyniuk, CJ Bioloogilised vastused fenüüluurea herbitsiididele kaladel ja kahepaiksetel; uued suunad toksilisuse mehhanismide iseloomustamiseks. Comp. Biochem. Physiol. C Toksikool. Pharmacol. 2017, 194, 9–21. [CrossRef]
7. Lindh, CH; Littorin, M.; Amilon, A.; Jonsson, BA 3,5-dikloroaniliini kui vinklosoliini ja iprodioni biomarkeri analüüs inimese uriinis, kasutades vedelikkromatograafiat/kolmekordset kvadrupooli massispektromeetriat. Rapid Commun. Massispekter. 2007, 21, 536–542. [CrossRef]
8. Kutting, B.; Goen, T.; Schwegler, U.; Fromme, H.; Uter, W.; Angerer, J.; Drexler, H. Monoarüülamiinid üldpopulatsioonis – läbilõikeline populatsioonipõhine uuring, mis hõlmas 1004 Baieri subjekti. Int. J. Hyg. Keskkond. Tervis 2009, 212, 298–309. [CrossRef]
9. Turci, R.; Barisano, A.; Balducci, C.; Colosio, C.; Minoia, C. Dikloroaniliinide määramine inimese uriinis gaasikromatograafia/massispektromeetria abil: valideerimisprotokoll ja võrdlusväärtuste määramine Kesk-Itaalias elavas elanikkonnarühmas. Rapid Commun. Massispekter. 2006, 20, 2621–2625. [CrossRef]
10. Vitelli, N.; Chiodini, A.; Colosio, C.; De Paschale, G.; Somaruga, C.; Turci, R.; Minoia, C.; Brambilla, G.; Colombi, A. Töö- ja keskkonna kokkupuude aniliid- ja dikarboksimiid-pestitsiididega. G. Ital. Med. Lav. Ergon. 2007, 29 (lisa 3), 276–277.
11. Chhabra, RS; Thompson, M.; Elwell, MR; Gerken, DK P-kloroaniliini toksilisus rottidel ja hiirtel. Food Chem. Toksikool. 1990, 28, 717–722. [CrossRef]
12. Guilhermino, L.; Soares, AM; Carvalho, AP; Lopes, MC 3,4-dikloroaniliini äge mõju isaste Wistari rottide verele. Chemosphere 1998, 37, 619–632. [CrossRef]
13. Pizon, AF; Schwartz, AR; Shum, LM; Rittenberger, JC; Madalam, DR; Giannonoutsos, S.; Virji, MA; Krasowski, MD Toksikoloogia laborianalüüs ja inimeste kokkupuude p-kloroaniliiniga. Clin. Toksikool. 2009, 47, 132–136. [CrossRef] [PubMed]
14. Koenig, CM; Beevers, C.; Pant, K.; Young, RR Para-kloroaniliini ja aniliini mutageense potentsiaali hindamine Big Blue® rottide maksas, põrnas ja luuüdis perifeerse vere mikrotuumade analüüsiga. Keskkond. Mol. Mutageen. 2018, 59, 785–797. [CrossRef] [PubMed]
15. Valentovic, MA; pall, JG; Anestis, DK; Õlled, KW; Madan, E.; Hubbard, JL; Rankin, GO 2-haloaniliinide äge neeru- ja maksatoksilisus Fischer 344 rottidel. Toxicology 1992, 75, 121–131. [CrossRef]
16. Valentovic, MA; pall, JG; Anestis, DK; Rankin, GO Dikloroaniliini struktuursete isomeeride in vitro toksilisuse võrdlus. Toksikool. In Vitro 1995, 9, 75–81. [CrossRef]
17. Valentovic, MA; Lo, HH; pruun, PI; Rankin, GO 3,5-Dikloroaniliini toksilisus Fischer 344 rottidel, keda on eelnevalt töödeldud tsütokroom P450 inhibiitorite ja indutseerijatega. Toksikool. Lett. 1995, 78, 207–214. [CrossRef]
18. Bhuiyan, MNH; Kang, H.; Kim, JH; Kim, S.; Kho, Y.; Choi, K. Endokriinsüsteemi häired mitme aniliini derivaadi ja nendega seotud mehhanismide poolt inimese neerupealise H295R rakuliinis ja täiskasvanud isastel sebrakaladel. Ökotoksikool. Keskkond. Saf. 2019, 180, 326–332. [CrossRef]
19. Hong, SK; Anestis, DK; Henderson, TT; Rankin, GO Haloaniliinist põhjustatud in vitro nefrotoksilisus: 4-haloaniliinide ja 3,5-dihaloaniliinide mõju. Toksikool. Lett. 2000, 14, 125–133. [CrossRef]
20. Racine, C.; Ward, D.; Anestis, DK; Ferguson, T.; Preston, D.; Rankin, GO 3,4,5-Trikloroaniliini nefrotoksilisus in vitro: vabade radikaalide potentsiaalne roll ja neerude biotransformatsioon. Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 20900–20912. [CrossRef]
21. Boehncke, A.; Kielhorn, J.; Konnecker, G.; Pohlenz-Michel, C.; Mangelsdorfer, I. Concise International Chemical Assessment Document 48-4-Kloroaniliin; Maailma Terviseorganisatsioon: Genf, Šveits, 2003.
22. Vangnai, AS; Kataoka, N.; Soonglerdsongpha, S.; Kslsmbaheti, C.; Tajima, T.; Kato, J. Escherichia coli bioreporteri konstrueerimine ja rakendamine aniliini ja kloroaniliini tuvastamiseks. J. Ind. Microbiol. Biotehnoloogia. 2012, 39, 1801–1810. [CrossRef]
23. Lo, HH; pruun, PI; Rankin, GO Fischer 344 rottidel isomeersete dikloroaniliinide poolt põhjustatud äge nefrotoksilisus. Toxicology 1990, 63, 215–231. [CrossRef]
24. Rankin, GO; Yang, DJ; Teets, VJ; Lo, HH; Brown, PI 3,5-Dikloroaniliinist põhjustatud nefrotoksilisus Sprague-Dawley rotil. Toksikool. Lett. 1986, 30, 173–179. [CrossRef]
25. Racine, CR; Ferguson, T.; Preston, D.; Ward, D.; Ball, J.; Anestis, D.; Valentovic, M.; Rankin, GO Biotransformatsiooni ja oksüdatiivse stressi roll 3,5-dikloroaniliini (3,5-DCA) poolt indutseeritud nefrotoksilisuses isoleeritud Fischer 344 rottide neerukoore rakkudes. Toksikoloogia 2016, 341–343, 47–55. [CrossRef] [PubMed]
26. Hong, SK; Rankin, GO 2-kloroaniliini biotransformatsioon Fischer 344 rotil: uriini metaboliitide tuvastamine. Xenobiotica 1998, 28, 985–994. [CrossRef] [PubMed]
27. Rankin, GO; Racine, C.; Sweeney, A.; Kraynie, A.; Anestis, DK; Barnett, JB Propaniili indutseeritud in vitro nefrotoksilisus. Keskkond. Toksikool. 2008, 23, 435–442. [CrossRef]
