Mortaliini/glükoosiga reguleeritud valk 75 soodustab maovähi tsisplatiiniresistentsust

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Abstraktne

Plaatinaravi on üks domineerivamaid kemoterapeutilisi strateegiaid maovähiga (GC) patsientide jaoks. Terapeutiline toime on aga vähem kui rahuldav, suuresti tänu omandatud resistentsusele plaatinaravimitele. Seetõttu võib aluseks olevate mehhanismide parem mõistmine oluliselt parandada GC terapeutilist efektiivsust. Selles uuringus püüdsime uurida glükoosiga reguleeritud valgu 75 (GRP75) kemoresistentsusega seotud funktsioone / mehhanisme ja kliinilist tähtsust GC-s. Siin näitasid meie andmed, et võrreldes SGC7901 rakkudega oli GRP75 ekspressioon tsisplatiiniresistentsuses märkimisväärselt kõrgem (rakud (SGC7901 *). GRP75 pärssimine kaotas mitokondriaalse membraanipotentsiaali (MP) säilitamise) ja inhibeeris tuumafaktori erütroidi{{ 10}}seotud faktor 2 (NRF2), fosfatidüülinositool-3 kinaas/valgukinaas B (Pl3K/AKT), hüpoksiaga indutseeritav faktor 1a (HIF-1a) ja c-myc, mis blokeerisid Need protsessid nõrgendasid antioksüdatsiooni/apoptoosi võimeid ja muutsid SGC7901 " rakkude metaboolset ümberprogrammeerimist, mis viis nende rakkude uuesti sensibiliseerimiseni tsisplatiini suhtes. GRP75 üleekspressioon SGC7901 rakkudes põhjustas aga vastupidiseid efekte. Ksenotransplantaadi mudel GC patsientidel, kes said plaatina keemiaravi ja metaanalüüsi, seostati GRP75 kõrget taset positiivselt agressiivsete omaduste ja halva prognoosiga, sealhulgas, kuid mitte ainult, maoga soolevähi ja oli üldise ellujäämise sõltumatu ennustaja. Kokkuvõttes näitas meie uuring, et GRP75 osales GC tsisplatiiniresistentsuses ja et GRP75 võib olla potentsiaalne terapeutiline sihtmärk ravimivastuse taastamiseks plaatinaresistentsetes rakkudes ja kasulik täiendav prognostiline tööriist GC patsientide kliinilise ravi juhtimisel.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Sissejuhatus

Maovähk (GC) oli esimene seedesüsteemi vähktõve esinemissagedus ja teine ​​​​suremus Hiinas. Kaugelearenenud GC praegused ravimeetodid olid kirurgiline operatsioon kombineerituna süsteemse keemiaraviga, kuid pikaajaline elulemus oli kõrge operatsioonijärgse kordumise tõttu vähem kui rahuldav2. Kliinilises praktikas olid plaatinaravimid ühed esmavaliku ravimid kaugelearenenud patsientidel. GC keemiaravi 3. Kuid omandatud resistentsus ravimite suhtes tekkis alati pärast mitut plaatinapõhise ravi tsüklit ja viitab halvale prognoosile.tsisantšSeetõttu oli potentsiaalsete mehhanismide valgustamine ja uudsete ravistrateegiate väljaselgitamine plaatinaravimite resistentsuse ületamiseks GC patsientidel hädavajalik.

Cistanche on vananemisvastane toime

Glükoosiga reguleeritud valk 75 (GRP75) oli stressist indutseeritav molekulaarne chaperon, mis kuulus kuumašoki valgu perekonda4. GRP75 üleekspressioon oli tihedalt seotud kasvaja progresseerumisega mitmesuguste inimese vähivormide korral5-7. Siin leidsime metaanalüüsi uurides, et GRP75 kõrge tase viitas märkimisväärselt halvale prognoosile mitmete seedesüsteemi vähivormide puhul (kolorektaalne vähk, kolangiokartsinoom ja kõhunäärmevähk). Ravimiresistentsuse korral muutis GRP75 inhibeerimine tsisplatiini ja doksorubitsiini resistentsuse hepatotsellulaarse kartsinoomi ja munasarjavähi korral. GRP75 sekvestreeris klassikaliselt p53 tsütoplasmas, põhjustades p53 funktsiooni inaktiveerimise ja pärssides rakenduse-toosi10. Eelmine uuring teatas, et GRP75 positiivsetel kasvajatel oli normaalse p53 funktsiooniga GC korral halvem prognoos võrreldes GRP75 negatiivsete kasvajatega. Siiski oli p53 üks kõige sagedamini muteerunud geene GC-s (mõjutab rohkem kui 50 protsenti patsientidest)l2-15. Seega püstitasime hüpoteesi. et lisaks klassikalisele p53 aktiivsuse represseerimisele võib GRP75 olla seotud plaatinaravimite resistentsuse esilekutsumisega/säilitamisega GC-s, kasutades ap53-sõltumatut meetodit.

Selles uuringus aitas GRP75 kõrgem ekspressioon kaasa tsisplatiini resistentsusele SGC7901 rakkudes ja ksenotransplantaadi mudelis. Mehaaniliselt indutseeris/säilitas GRP75 tsisplatiini resistentsuse, reguleerides antioksüdatsiooni/apoptootilisi võimeid ja metaboolseid ümberprogrammeerimisomadusi.cistanche AustraaliaGC patsientidel aitas GRP75 üleekspressioon kaasa agressiivsetele omadustele ja halvale prognoosile. Meie tulemused näitasid, et GRP75 soodustas tsisplatiini resistentsust GC-s ja võib olla biomarker plaatinaravimiravi vastuse ennustamiseks.cistanche eelisedGRP75 sihtimine võib anda uue arusaama GC süsteemsest kemoteraapiast.

Tulemused

GRP75 mõju tsisplatiiniresistentsusele GC rakkude elujõulisuse analüüsides kasutati SGC7901~ rakkude resistentsuse kontrollimiseks, tsisplatiini Ipsos (uM) SGC7901 ja SGC7901CR rakkude jaoks oli: 5,518 vs. 72,46 (joonis fig. KM-Plotteri andmebaaside põhjal näitas GRP75 suurenenud ekspressioon halba prognoosi (joonis 1B). Lisaks suurenes märkimisväärselt GRP75 ekspressioon SGC7901CR rakkudes võrreldes selle vanemate SGC7901 rakkudega (joonis 1C), mis viitab sellele, et GRP75 võib kaasa aidata tsisplatiini resistentsusele. Selle hüpoteesi kontrollimiseks transfekteeriti SGC7901~ rakud skrambleeritud või GRP75 siRNA-ga ja tsisplatiini IC50-d (uM) skrambleeritud või GRP75 siRNA-ga transfekteeritud SGC7901CK rakkude jaoks olid vastavalt 50,83 vs.20,.{29}} 1D). Seevastu

GRP75 üleekspressioon, transfekteerides GRP75 plasmiidid SGC7901 rakkudesse, näitas, et tsisplatiini IC50-d skrambleeritud või GRP75 plasmiididega transfekteeritud SGC7901 rakkudele olid 3,825 vs. 6,98 (joonis 1E). Need tulemused näitasid ühiselt, et GRP75 mängis olulist rolli tsisplatiiniresistentsuse säilitamisel/indutseerimisel GC-s, kuid mehhanismid jäid edasiseks uurimiseks.

GRP75 aluseks olevad potentsiaalsed mehhanismid põhjustasid tsisplatiiniresistentsuse

Laadisime GEO-st alla mikrokiibi andmestikud GSE122130 (SGC7901CR vs. SGC7901) ja GSE14209 (koed, tsisplatiini suhtes resistentsed vs. tsisplatiini suhtes tundlikud), seejärel teostasime GO-Biological protsessi ja KEGG-Pathway põhineva top DAVID10 analüüsil, analüüsil tulemused on näidatud joonistel 2A-D. SGC7901C* rakkude ja SGC7901 rakkude bioloogiliste protsesside olulised erinevused hõlmasid oksüdatsiooni-redutseerimist, apoptootilist protsessi (joonis 2A), KEGG-raja rikastamise analüüsist leiti, et DEG-de komplektid olid tihedas korrelatsioonis metaboolsete radadega ja fosfatidüülinositool-3 kinaasi/proteiini kinaasiga. (PI3K/AKT) rada (joonis 2B). Vastus ravimile kaasati tsisplatiiniresistentsete ja tsisplatiini suhtes tundlike kasvajakudede bioloogiliste protsesside olulistesse erinevustesse ning metaboolne rada oli ka KEGG-Pathway rikastamise analüüsi põhilüli (joonis 2C, D). Peale selle konstrueeriti Stringi andmebaasi kasutades 60 valgust koosnev võrk, mis interakteeris GRP75-ga märkimisväärselt, seejärel tehti KEGG-Pathway analüüs, et metaboolsed rajad mängisid olulist rolli GRP75 ja selle interaktsioonide vahel (joonis 2E). Nende tulemuste põhjal eeldasime, et antioksüdatsioon / apoptoos ja metaboolne ümberprogrammeerimine võivad soodustada GC ellujäämist ja kasvu, mis põhjustab tsisplatiini resistentsust. GRP75 reguleerimises osalemise mehhanismid vajasid aga täiendavat uurimist (joonis 2F).

GRP75 mõju antioksüdatsioonile ja apoptoosile Siin oli rakusisene ROS-i tase SGC7901CR rakkudes kõrgem võrreldes vanemate kolleegidega (joonis 3A), mis viitab sellele, et SGC7901Ck rakud puutusid kokku suhteliselt kõrgemate oksüdatiivse stressi tingimustes. Eelmine uuring näitas, et GRP75 osales MMP stabiliseerimises, mis on oluline ROS-i genereerimise allikas. Siin kaotas GRP75 katkestamine tsisplatiini poolt indutseeritud MMP säilimise SGC7901CK rakkudes ja GRP75 üleekspressioon avaldas SGC7901 rakkudes vastupidist mõju (joonis 3B).cistanche kolesteroolSeejärel kinnitasime seose GRP75 ning antioksüdatsiooni ja anti-apoptoosi vahel. Nagu on näidatud joonisel 3C, vähendas GRP75 pärssimine SGC7901-s tuumafaktori erütroid{5}}seotud faktori 2 (NRF2) ja selle allavoolu sihtgeenide (HO-1 ja NQO-1) taset. ~ rakud ja GRP75 üleekspressioon näitas SGC7901 rakkudes vastupidist toimet. Veelgi enam, GRP75 või NRF2 hävitamine SGC7901CR rakkudes suurendas veelgi tsisplatiini poolt indutseeritud rakusisest ROS-i põlvkondi, apoptoosi (joonis 3D) ja kaspaasi -3 aktiivsust (täiendav joonis S1). Seevastu GRP75 üleekspressioon SGC7901 rakkudes nõrgendas oluliselt tsisplatiinist põhjustatud ROS-i põlvkondi, raku apoptoosi (joonis 3E) ja kaspaasi -3 aktiivsust (täiendav joonis S1). Need tulemused näitasid, et GRP75 säilitatud/indutseeritud tsisplatiiniresistentsus võib tuleneda antioksüdatsiooni ja anti-apoptoosi indutseerimisest GC rakkudes.

GRP75 mõju metaboolsele ümberprogrammeerimisele Järgmisena uurisime täiendavalt, kuidas GRP75 kutsus esile metaboolse ümberprogrammeerimise muutuse. Üha rohkem tõendeid näitas, et kasvajarakkude metabolism ei olnud ebanormaalne muutus ühes metaboolses rajas, vaid kogu raku metaboolse võrgu ümberprogrammeerimine7. Paljud klassikalised onkogeenid või signalisatsiooniteed olid otseselt või kaudselt seotud metaboolse ümberprogrammeerimisega, näiteks PI3K/AKT, hüpoksiaga indutseeritav faktor la (HIF-la), c-myc jne"'819. Seetõttu kontrollisime, kas GRP75 oli osaleb GC rakkude metaboolses ümberprogrammeerimises. Nagu on näidatud joonisel 4A, täheldasime SGC7901CR rakkudes p-AKT, HIF-la ja c-myc taseme tõusu võrreldes SGC7901 rakkude vanemrakkudega. GRP75 vähendas tsisplatiinist indutseeritud p-AKT, HIF-la ja c-Myc valgu taset ning nende glükolüüsiga seotud allavoolu sihtmärke (HK2: heksokinaas 2; PDK1: püruvaatdehüdrogenaasi kinaas l; ja LDHA: laktaatdehüdrogenaasi A ahel). Vastupidi, GRP75 üleekspressioon SGC7901 rakkudes näitas vastupidist efekti (joonis 4B, C). Lisaks näitas GRP75 või AKT vähenemine SGC7901CR rakkudes glükoosi omastamise ja tsisplatiini poolt indutseeritud rakkude elujõulisuse/kasvu olulist vähenemist. GRP75 üleekspressioon SGC7901 rakkudes märkimisväärselt suurendas tsisplatiinist põhjustatud glükoosi omastamise võimet ja rakkude elujõulisust / kasvu (joonis 1). 4D-F). Need andmed näitasid ühiselt, et GRP75 säilitatud/indutseeritud tsisplatiiniresistentsus GC rakkudes võib toimuda p-AKT, HIF-la ja c-myc vahendatud metaboolse ümberprogrammeerimise kaudu.

In vitro andmete kinnitamine ksenotransplantaadi mudelis Seejärel uurisime GRP75 võimalikku kliinilist tähtsust in vivo. Ksenotransplantaadi andmed näitasid, et ravi ainult tsisplatiiniga või ainult GRP75 pärssimine võib kasvaja kasvu pärssida; tsisplatiinravi kombineerituna GRP75 knockdowniga hõlbustas aga oluliselt tsisplatiini poolt indutseeritud kasvaja kasvu pärssimist (joonis 5A). Lisaks näitasid IHC ja qPCR testid, et tsisplatiin pluss GRP75 siRNA vähendas oluliselt Ki67, GRP75, NRF2, p-AKT ja allavoolu sihtmärkide ekspressiooni võrreldes ainult tsisplatiinraviga, kuid suurendas apoptoosi (määratud TUNELi värvimisega, joonis 5B). , C). Need tulemused näitasid ühiselt, et oksüdatsiooni- / apoptoosivastaste võimete reguleerimise ja metaboolse ümberprogrammeerimise kaudu stimuleeris GRP75 in vivo ellujäämist ja kasvu, mis omakorda viis GC resistentsuseni tsisplatiini suhtes.

GRP75 tuvastamine iseloomuliku vähktõbe soodustava tegurina ja GRP75 kliiniline tähtsus GC-s

Seejärel hindasime GRP75 ekspressiooni GC proovide järjestikustes osades. Nagu on näidatud joonisel 6A, täheldati GC kudedes GRP75 ekspressiooni märkimisväärset tõusu võrreldes külgnevate mittekasvaja mao kudedega. GRP75 üleekspressiooni demonstreeriti GC kudedes IHC intensiivsuse skooriga (joonis 6B). GRP75 tugevamat värvumist täheldati ka pahaloomuliste kasvajate staadiumi TNM klassifikatsiooni suurenemisega (joonis 6C, D). Seejärel jagasime need 116 GC proovi kahte rühma ("GRP75 madal" vs. "GRP75 kõrge", vastavalt IHC intensiivsusele, joonis 6E). Kasvajate põikidiameetrid rühmas "GRP75 high" olid oluliselt suuremad kui rühmas "GRP75 low" (joonis 6F). Lisaks kinnitasime GRP75 kliinilist prognoosi GC-s. Kaplan-Meieri elulemuse analüüs näitas ka, et GC patsientidel "GRP75 kõrge" rühmas oli üldine elulemus halvem kui rühmas "GRP75 madal" (joonis 6G).

Mitme muutujaga analüüs tuvastas, et GRP75 oli üldise ellujäämise sõltumatu ennustaja (tabel 1).cistanche deserticola kõrvaltoimed,Kokkuvõttes näitasid need tulemused, et GRP75-l oli iseloomulik roll GC progresseerumise, tsisplatiiniresistentsuse ja halva prognoosi põhjustamisel. GRP75 kõrge taseme metaanalüüs koos prognoosiga Kirjanduse otsingu ja valiku ning metaanalüüsi vooskeem on näidatud täiendaval joonisel S2. HR väärtuse arvutamiseks ja analüüsimiseks kasutati juhusliku efekti mudelit ja fikseeritud efektiga mudelit, mõlemad näitasid, et kõrge GRP75 tase on oluliselt seotud patsientide halbade tulemustega. Ühendatud HR oli 1,91 (95 protsenti CI 1,62 kuni 2,25), heterogeensusega (I'=0.0 protsenti ,p =0.559) (joonis 7A). Seejärel tegime alarühma analüüsi, mis näitas, et GRP75 ekspressioonitasemel seedetrakti vähi korral (ühendatud HR oli 1,99,95 protsenti CI 1,64 kuni 2,43) on oluline seos halva ellujäämise prognoosiga. Kindlasti leiti sarnaseid tulemusi ka teiste kasvajate puhul (ühendatud HR oli 1,74,95 protsenti CI 1,29 kuni 2,33) (joonis 7B). Mõlemad

Kaasatud uuringute võimaliku avaldamise kallutatuse hindamiseks kasutati Beggi lehtri graafikut ja Eggeri testi. GRP75 ja OS-i vahelise seose analüüsimisel olid Beggi testi ja Eggeri testi p-väärtused vastavalt 0.076 ja 0,024 (joonis 7C ja D). Siiski on Eggeri testil avaldamise kallutatuse hindamisel suurem tundlikkus. Seega kasutati kärpimise ja täitmise meetodit, et muuta meie tulemused usaldusväärsemaks. Nagu on näidatud joonisel 7E, oli fikseeritud efektiga mudeli korrigeeritud HR 1,785 (95 protsenti CI 1,530 kuni 2,081, p<0.001), and="" in="" the="" random="" effect="" model="" was="" 1.792="" (95%="" ci="" 1.515="" to=""><0.001), which="" was="" not="" significantly="" different="" from="" overall="" hr.="" in="" our="" analysis,="" a="" high="" level="" of="" grp75="" showed="" a="" poor="" prognosis="" including="" but="" not="" limited="" to="" gastrointestinal="" cancer,="" which="" was="" highly="" consistent="" with="" our="">

Arutelu

Selles uuringus kasutasime üht esmavaliku kemoterapeutilist ainet GC, plaatinaravimitega patsientide jaoks. Klassikaliselt võivad plaatinaravimid seostuda kovalentselt DNA ahelas guaniiniga ja seega blokeerida DNA2 replikatsiooni ja transkriptsiooni. Kuid ravimiresistentsuse ja soovimatute kõrvaltoimete tõttu oli GC patsientide resistentsuse ümberpööramiseks uute ravistrateegiate väljaselgitamine hädavajalik. Lisaks tekkis GC patsientidel pärast mitme tsisplatiini kuuri saamist ravimiresistentsus ja meie tulemused näitasid, et SGC7901 ~ rakkudel oli võrreldes SGC7901 rakkudega märkimisväärne resistentsus tsisplatiini suhtes.

GRP75 (mortalin/mot-2/HSPA9) mängis võtmerolli inimese vähkkasvajate tekke ja progresseerumise reguleerimisel-7. Hiljuti sai selgeks, et GRP75 mängib olulist rolli ka keemiaravi resistentsuses. Lisaks GRP75-le mängisid tsisplatiiniresistentsuses PI3K/AKT/NF-KB ja muude radade kaudu kriitilist rolli ka teised kuumašoki valgud21-24 GRP75 ja tsisplatiiniresistentsuse molekulaarsest mehhanismist teatati aga harva. Meie uuring näitas, et GRP75 soodustas oksüdatsiooni-/apoptoosivastaseid võimeid ja muutis metaboolset ümberprogrammeerimist, mis viis tsisplatiiniresistentsuse tekkeni GC rakkudes. Samuti avastasime, et GRP75 oli ülesreguleeritud SGC7901~ rakkudes ja patsientide koeproovides ning see oli korrelatsioonis ravimiresistentsuse, ellujäämise, kasvu ja halbade tulemustega. Samal ajal tuvastas mitme muutujaga analüüs, et GRP75 oli üldise elulemuse sõltumatu ennustaja. Lisaks näitas metaanalüüs, et GRP75 kõrge tase näitas halba prognoosi, sealhulgas, kuid mitte ainult, GC, mis oli väga kooskõlas meie uuringuga. Kõik ülaltoodud tulemused kinnitasid, et GRP75 sihtimine võib Eeldatakse, et sellest saab uus lähenemisviis tsisplatiiniresistentsuse muutmiseks ja GC patsientide prognoosi parandamiseks.

Füsioloogilistes tingimustes puutusid rakud vältimatult kokku välistegurite ja rakusisese aeroobse metabolismi põhjustatud ROS-iga. Kahe teraga mõõgana olid sobivad ROS olulised signaalmolekulid, mis reguleerivad rakkude normaalset funktsiooni, samas kui liigne ROS viis apoptoosini. Seetõttu eksisteeris organismis täpne antioksüdantide regulatsioonisüsteem redoks-tasakaalu ja apoptootiliste protseduuride säilitamiseks 20. Kuid erinevalt füsioloogilistest tingimustest olid kasvajate ROS-i tasemed üldiselt oluliselt kõrgemad kui sama koe päritoluga tavalistes kontrollides, mis määras kindlaks erilise koe olemasolu. antioksüdantide süsteem kasvajarakkudes, eriti ravimresistentsete kasvajarakkude puhul27-29. Meie tulemused kinnitasid, et SGC7901CR rakkudel oli suhteliselt kõrgem ROS tase võrreldes SGC7901 rakkudega ja et GRP75 suurendas antioksüdatsiooni / apoptoosi võimet. Kasvajarakkudel oli pikk metaboolsete häirete ajalugu. Juba 1930. aastatel avastas Otto Warburg, et kasvajarakud eelistavad glükolüüsi. Isegi hapnikuga piisavates tingimustes säilitasid kasvajarakud endiselt kõrge glükolüüsi kiiruse ATP tekkeks. Seda ebanormaalset metaboolset mustrit nimetati "Warburgi efektiks"3031. Warburgi efektist tingitud metaboolseid muutusi nimetati hiljuti metaboolseks ümberprogrammeerimiseks ja nende muutuste uuringud andsid GC-rakkude metabolismist sügavama ülevaate. On näidatud, et GC-rakkudel ja normaalsetel rakkudel esines metaboolseid erinevusi mitte ainult glükoosi metabolismis, vaid ka lipiidide ja aminohapete metabolismis³2-35. Selles uuringus leidsime, et muutused glükoosi metabolismis olid üks peamisi ühendab rakkude kasvu, mis viib lõpuks GC tsisplatiini resistentsuseni.

Nagu me mainisime, olid klassikalised onkogeenid ja signaalirajad nagu PI3K / AKT, HIF-la ja c-myc otseselt või kaudselt seotud metaboolse ümberprogrammeerimisega. PI3K / AKT raja aktiveerimine kasvajarakkudes suurendas paljusid metaboolseid aktiivsusi. Esiteks võimaldas see rakkudel omastada glükoosi, aminohappeid ja muid toitaineid. Teiseks suurendas AKT glükolüüsi ja laktaadi tootmist oma mõju kaudu geeniekspressioonile ja ensüümide aktiivsusele ning oli piisav War-burgi efekti esilekutsumiseks vähirakkudes. Kolmandaks suurendas selle raja aktiveerimine makromolekulide biosünteesi ja stimuleeris lipogeensete geenide ekspressiooni ja lipiidide sünteesi. Lisaks inhibeerisid GRP75-AKT ja rakuvälise signaaliga reguleeritud proteiinkinaasid 1 ja 2 Baxi konformatsioonimuutusi ja apoptoosi 8. Kasvajarakud on kohanenud hüpoksiaga, mis hõlmas metaboolset ümberprogrammeerimist HIF-la sihtgeenide ülesreguleerimise kaudu, et stimuleerida glükoosi omastamist, glükolüüsi, piimhappe tootmine ja sekretsioon, glükogeeni säilitamine, glutamiini kat-abolism³ ja triglütseriidide kogunemine lipiidipiiskadesse³. Hiljuti sai selgeks, et GRP75 võib spetsiifiliselt seonduda HIF-la-ga ja olla suunatud mitokondri välismembraanile, mis on seotud VDAC1 ja HK2, mis takistasid apoptoosi. C-myc võib vahendada metaboolset ümberprogrammeerimist mitmel viisil ja c-myc-vahendatud metaboolne ümberprogrammeerimine saavutati suures osas mitokondreid mõjutades. Ühelt poolt soodustas c-myc ka glükolüüsi, reguleerides otseselt glükolüütiliste ensüümide, sealhulgas LDHA, HK2 ja PDK11938 ekspressiooni. Teisest küljest soodustasid c-myc aktiveeritud ensüümid, mis osalevad transkriptsiooni kaudu glutamiini metabolismis, kasutamist. glutamiin kasvajarakkudes mitokondrite poolt. Seda efekti nimetatakse "glutaminolüüsiks". Lisaks vähendas GRP{27}}üleekspressioon Cyclin-B1 ja reguleerib üles Cyclin-D1 ja c-myc, et soodustada munasarjavähirakkude kasvu*. Meie praeguste tulemuste põhjal andsime GRP75 kaudu uue arusaama GC tsisplatiini resistentsusest kui potentsiaalselt olulisest lülist kasvaja metaboolsete ümberprogrammeerimisvõrkude reguleerimisel.

Järeldused

Kokkuvõtteks näitasime, et GRP75 üleekspressioon võib soodustada ellujäämist / kasvu GC rakkudes, reguleerides antioksüdatsiooni / apoptoosi ja metaboolseid ümberprogrammeerimisvõrgustikke, indutseerides seeläbi tsisplatiini resistentsust

materjalid ja meetodid

Rakud, reaktiivid ja kultiveerimistingimused

GC cell lines, SGC7901 cells (mutant-type of p53), and cisplatin-resistance cells (SGC7901CB) were obtained from and STR identified by KeyGENE Bio Co. Ltd (Nanjing, China). Cisplatin(Pt(NH3)2Clz, >99.{1}} protsenti), osteti ettevõttelt Sigma-Aldrich (Shanghai, Hiina). Rakke kultiveeriti RPMI -1640söötmes (Gibco, Grand Island, NY, USA), millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit (FBS), 100 U/ml penitsilliini, 100 ug/ml streptomütsiini (Gibco) ja inkubeeriti. 5 protsenti CO2 37 kraadi juures. Tsisplatiiniresistentsuse fenotüübi säilitamiseks inkubeeriti SGC7901CR rakke söötmes, mis sisaldas tsisplatiini (5 μM).

Ksenotransplantaadid ja ravi

Selle uuringu kiitis heaks Nanjingi Meditsiiniülikooli institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee ning loomi koheldi humaanselt ja pidades silmas kannatuste leevendamist. BALB/c nude hiired saadi SLRC Laboratory Animal Centerist (Shanghai, Hiina) ja neid hoiti tavapäraselt nii, nagu me eelnevalt kirjeldasime *l. Ksenotransplantaadi uuringu jaoks süstiti 2 × 10 kraadi SGC7901CK rakke 100 ul matrigelis 5 nädala jooksul subkutaanselt hiirte külgedele. GRP75 mõju määramiseks GC tsisplatiiniresistentsusele viisime läbi intratumoraalse ja intraperitoneaalse süstimise testi. Lühidalt, hiired jagati juhuslikult 4 rühma (5 hiirt rühma kohta): (1) MOCK, (2) GRP75KD, (3) MOCK (tsisplatiin) ja (4) GRP75 KD (tsisplatiin). 100 ui siRNA-d (si-Con või si-GRP75, 100 nM) süstiti kasvajasse iga 3 päeva järel. Tsisplatiini (5 mg/kg) ravi saanud rühmadele tehti intraperitoneaalsed süstid 3 korda nädalas ja teisi rühmi perfuseeriti võrdse koguse soolalahusega. Kasvajaid mõõdeti igal nädalal ja nende mahud arvutati valemiga: V=Y (laius2 pikkus). 5 nädala pärast hiired surmati ja kasvajakoed eemaldati edasiseks uurimiseks.

Patsiendid ja koeproovid

Selle uuringu kiitis heaks Nanjingi meditsiiniülikooli teise sidushaigla meditsiinieetika komitee ja Nanjingi meditsiiniülikooli Changzhou nr 2 haigla ning igalt patsiendilt saadi osaleja kirjalik teadlik nõusolek. Kliinilised patoloogilised andmed on loetletud täiendavas tabelis S1. Kudede mikrokiibi konstrueeris Zhuoli Biotechnology Co.Ltd (Shanghai, Hiina), nagu me eelnevalt kirjeldasime*

Rakkude transfektsioon

Transfektsiooniks sünteesis skrambleeritud ja pcDNA-3.1-GRP75-Lipu firma General Biotech (Shanghai, Hiina); samas kui siRNA-d olid loetletud täiendavas tabelis S2. Rakud transfekteeriti ajutiselt lipofectamine 3000 reagendiga (Invitrogen, Carlsbad, USA) vastavalt tootja protokollile. Lühidalt, rakud plaaditi 6-süvendiplaatidele tihedusega 1 × 10 kraadi rakke RPMI 1640 söötmes, mis sisaldas 10 protsenti FBS-i ilma antibiootikumideta. Pärast 24-tunnist inkubeerimist transfekteeriti rakke ajutiselt 5 ng/ml segatud või GRP75-Flagiga või 20 nM si-Con või si-GRP75-ga 12 tundi. Pärast transfektsiooni kultiveeriti rakke veel 24 tundi värskes söötmes, millele oli lisatud 10 protsenti FBS-i, enne kui kasutati neid teistes katsetes.

Kvantitatiivne reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon (qPCR) Kasutatud praimerid on loetletud täiendavas tabelis S3. Kogu RNA eraldamine, RNA transkriptsioon cDNA-ks ja qRT-PCR teostamine Applied Biosystems 7300HT masinaga olid kõik vastavalt meie eelmisele uuringule 2. -aktiini amplifitseeriti cDNA terviklikkuse tagamiseks ja ekspressiooni normaliseerimiseks. Korduvad muutused iga geeni ekspressioonis arvutati võrdleva lävitsükli (Ct) meetodil, kasutades valemit 2-(4ACt)

See artikkel on välja võetud Dai et al. Cell Death Discovery (2021) 7:140 https://doi.org/10.1038/s41420-021-00517-w