Neferiini allergia- ja põletikuvastane toime RBL-2H3 rakkudele

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Abstraktne:Nuumrakud mängivad väga olulist rolli nahaallergiate ja põletike, sealhulgas atoopilise dermatiidi ja psoriaasi korral. Varem leiti, et viitel on nahale põletikuvastane ja vananemisvastane toime, kuid selle mõju nuumrakkudele pole veel üksikasjalikult uuritud. Selles uuringus kasutasime nuumrakke (RBL-2H3 rakud) ja hiiremudeleid, et uurida võrdlusaluse allergiavastast ja põletikulist toimet. Esiteks leidsime, et viide pärsib nuumrakkude degranulatsiooni ja tsütokiinide ekspressiooni. Lisaks täheldasime, et kui nuumrakke stimuleeriti A23187/forbool12-müristaat-13-atsetaadiga (PMA), inhibeeriti intratsellulaarse kaltsiumi taseme tõusu. MAPK/NF-KB raja fosforüülimist vähendab ka võrdluse eeltöötlus. In vivo uuringute tulemused näitavad, et võrdlus võib parandada dinitroklorobenseeni (DNCB) põhjustatud dermatiidi ja nuumrakkude infiltratsiooni ilminguid. Lisaks taastatakse ka barjäärvalkude ekspressioon nahas.tsisantšLõpuks leiti, et võrdlus võib vähendada ühendi 48/80 põhjustatud kriimustuskäitumist. Kokkuvõttes näitavad meie tulemused, et referents on väga hea allergia- ja põletikuvastane loodustoode. Selle toime nuumrakkudele aitab kaasa selle farmakoloogilisele mehhanismile.

Märksõnad:viide; looduslik toode; nuumrakk; dermatiit; kihelus

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Paljud uuringud on kinnitanud, et allergilised haigused ei tulene mitte ainult kaasasündinud immuunaktivatsioonist, vaid ka adaptiivsest aktivatsioonist. Nende hulgas on nuumrakkudel väga oluline roll mitmesugustes allergilistes haigustes, nagu allergiline riniit, astma ja allergiline dermatiit. Nuumrakud ekspresseerivad oma rakumembraanidel IgE retseptoreid (FceRI) ja FceRI retseptoritel on kõrge afiinsus IgE antikehade suhtes [1,2]. Kui antigeenispetsiifiline IgE seondub FceRI-ga, tekib interaktsioon ja tekib allergiline reaktsioon. FceRI agregatsioon võib aktiveerida retseptori türosiinkinaase, algatada allavoolu reaktsioone ja soodustada erinevate võtmevalkude (nagu mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaas; MAPK-d) fosforüülimist, mis viib lõpuks kaltsiumiioonide (Ca2 pluss) sissevooluni, mis on nuumrakkude degranulatsiooni võtmesündmus [3].cistanche AustraaliaAktiveeritud nuumrakud degranuleerivad ja vabastavad keemilised vahendajad. Need allergiliste reaktsioonide korral kasutatavad keemilised vahendajad võivad põhjustada põletikku [4], seega hõlmab allergiliste sümptomite ravi nuumrakkude degranulatsiooni inhibiitoreid. Seetõttu kasutatakse IgE-vahendatud nuumrakkude degranulatsiooni pärssimist sageli uute ühendite tuvastamiseks allergiliste haiguste ennetamiseks ja raviks. On kindlaks tehtud, et anti-dinitrofenüüli (DNP) IgE antikehad ja antigeenid võivad indutseerida passiivseid naha ülitundlikkusreaktsioone (PCA) tüüpilise vahetu ülitundlikkuse in vivo mudelina ja antigeensete allergiate võimaliku uurimisravimina [5,6 ]. Lisaks võivad nuumrakkude degranulatsiooni põhjustada ka mitteimmuunsed stimulandid, näiteks ühendid 48/80 ja A23187. A23187 kaltsiumi ionofoor on juba ammu teadaolevalt stimuleeriv nuumrakkude sekretsiooni, vabastades graanulitest eelnevalt moodustatud vahendajaid, nagu histamiini. [4] Ühend 48/80 on p-metoksü-N-metüülfenetüülamiini segapolümeer. ristseotud formaldehüüdiga, mida kasutatakse laialdaselt nuumrakkude sõltumatuks stimuleerimiseks [7,8]Seetõttu on allergiliste reaktsioonide mehhanismi uurimiseks reagentidena tavaliselt kasutatud sobivaid koguseid ühendit 48/80 ja A23187. Statistiliste hinnangute kohaselt kannatab atoopilise dermatiidi all umbes 15-20 protsenti elanikkonnast. Olenemata sellest, kas selle haiguse all kannatavad lapsed või täiskasvanud, võib atoopiline dermatiit ilma korraliku ravita põhjustada patsientidele psühholoogilist stressi ning koormata nende perekondlikke ja sotsiaalseid tervishoiukulusid [9]. Kahjuks ei ole allergilise dermatiidi raviks sobivat ravimeetodit. Praegused ravivõimalused väldivad endiselt haigusi põhjustavaid allergeene ja steroidide pidev kasutamine on ravi kuldstandard. Vältimatud allergeenid ja ravimite kõrvalmõjud on ajendanud kiiresti välja töötama uusi raviravimeid. Ravimtaimedest ja taimedest eraldatud looduslikud ühendid on potentsiaalsed raviainete allikad põletikuliste haiguste ennetamiseks ja raviks ning allergiliste häiretega patsientide elukvaliteedi parandamiseks.

Cistanche on vananemisvastane toime

Viide pärineb taime Nelumbo nucifera lootose tuumast (seemne embrüost) ja on peamine bisbensüülisokinoliini alkaloid. On tõendeid selle kohta, et viitel on paljude haiguste puhul lai valik farmakoloogilisi omadusi, nagu vähivastane, antioksüdant, põletikuvastane ja neuroprotektiivne toime [10-15].cistanche eelisedKhan et al. avastasime, et viide avaldab fotode vananemisvastast toimet, pärssides UV-vahendatud ROS-i ja malondialdehüüdi (MDA) taseme tõusu inimese keratinotsüütides ja fibroblastides[16,17] Hiljuti leidsime, et viide võib olla alternatiivne ravim atoopiliste haiguste raviks. dermatiit või muud nahaga seotud põletikulised haigused[18]. Siiski on endiselt ebakindel, kas viide mängib nuumrakkudes naha allergiavastast toimet. Selle uuringu eesmärk oli uurida viite mõju nuumrakkude poolt vahendatud allergilistele haigustele, kasutades inimese nuumrakuliine (RBL-2H3 rakud) ja ühendit 48/80- ja DNCB-indutseeritud anafülaksia. hiirte mudel.

La referents proviene del núcleo de loto (el embrión de la semilla) de la planta Nelumbo nucifera y es un svare alcaloide de bisbencilisoquinolina. Existe evidencia de que la referents tiene una amplia gama de propiedades farmacológicas, como efectos anticancerígenos, antioxidantes, antiinflamatorios y neuroprotectores, en muchas enfermedades [10-15]. Beneficios de la cistanche Khan et al. encontró que la referents product efectos anti-fotoenvejecimiento al inhibir el aumento de los niveles de ROS y malondialdehído (MDA) mediado por UV en queratinocitos y fibroblastos referents humanos [16,17] Recientemente, descubrimos alternativa parmiento tiemedicina potentsiaalselt de atópica dermatitis u otras enfermedades inflamatorias relacionadas con la piel[18]. Sin embargo, sigue siendo incierto si la referencia tiene un efecto contra la alergia cutánea en los mastocitos. En este estudio, nuestro objetivo fue investigar los efectos de referencia en las enfermedades alérgicas mediadas por mastocitos, utilizando líneas de mastocitos humanos (células RBL-2H3) y un modelo de ratones con anafilaxia/NCuestoy 48NCuestoy 4NCuestoy .

2. Tulemused

2.1. Neferiini tsütotoksilisuse test roti nuumrakkudega (RBL-2H3)

Kuna roti basofiilne leukeemia (RBL)-2H3 rakud, histamiini vabastavad nuumrakkude analoogid, sobivad nuumrakkude poolt vahendatud põletiku mõju uurimiseks [19], kasutasime neid rakke allergiavastase toime uurimiseks. viiteefektid. Esiteks testisime, kas viide võib nuumrakkudes põhjustada tsütotoksilisust. Kui rakke töödeldakse 24 tunni jooksul võrdluskontsentratsiooniga 1 kuni 30 μM, ei mõjuta võrdlusravi rakkude elujõulisust (joonis 1).

2.2. Neferiin vähendab erinevate aktivaatorite poolt stimuleeritud RBL-2H3 degranulatsiooniefekti

RBL-2H3 rakke kasutatakse tavaliselt degranulatsiooni in vitro uuringutes [20-22]RBL-2H3 rakkude stimuleerimine anti-dinitrofenooli (DNP)IgE ja DNP-ga konjugeeritud inimese seerumi albumiiniga (HSA) käivitab degranulatsiooni. Lisaks on teada, et nuumrakud degranuleeruvad vastusena sünteetilistele ühenditele, nagu ühend 48/80 ja kaltsiumionofoor A23187, ning neid ühendeid on kasutatud mugavate reagentidena in vitro allergiareaktsioonide mehhanismide otsesteks uuringuteks [23, 24]. Tulemused näitasid, et RBL-2H3 tsütoplasma, mida aktivaator ei aktiveerinud, sisaldas piiratud koguses sekretoorseid graanuleid.cistanche kolesteroolAinuüksi võrdluskontsentratsiooni (10 μM) töötlemine ei mõjutanud RBL-2H3 aktiivsust (joonis 2A, B). Kuid erinevate aktivaatorite, sealhulgas ühendi 48/80, A23187 ja anti-DNP/IgE pluss DNP/HSA lisamine täitis tsütoplasma selgelt sekretoorsete graanulitega. Elektronmikroskoobi all on näha, et tsütoplasmas on suur hulk sekretoorseid graanuleid ja mõned sekretoorsed graanulid sulanduvad isegi rakumembraaniga, mis viib degranulatsioonini (joonis 2C-E). Pärast eeltöötlemist võrdluslahusega 10 uM vähenesid sekretoorsed graanulid tsütoplasmas oluliselt (joonis 2F-H). Need tulemused näitavad, et võrdlus võib tõhusalt pärssida aktivaatori poolt stimuleeritud RBL-2H3 aktivatsiooni ja degranulatsiooni.

2.3. Neferiin inhibeerib PMA/A23187-indutseeritud intratsellulaarse kaltsiumi tõusu RBL-2H3-s

Kaltsiumiioonid mängivad raku aktiveerimise protsessis sekundaarse sõnumitooja rolli. A23187 on kõige tõhusam viis kaltsiumiioonide tungimise suurendamiseks läbi rakumembraanide ja nuumrakkude aktivatsiooni stimuleerimiseks. Forbolmüristaatatsetaat (PMA) võib aktiveerida proteiinkinaasi Cand ja suurendada rakusiseseid kaltsiumiioone, et tugevdada A23187 toimet. Kaltsiumiioonide suurenemist nuumrakkudes on peetud ka oluliseks teguriks nuumrakkude aktivatsiooni esilekutsumisel, nii et see mõjutab nuumrakkude degranulatsiooni ning vabastab rohkem põletikulisi tsütokiine ja kemokiine.cistanche deserticola kõrvaltoimed,Seetõttu püüti selles uuringus uurida, kas viide võib pärssida kaltsiumiioonide kontsentratsiooni RBL-2H3-s, kui see pärsib põletikku. Katserühm jagati 20 minutiks võrdluse eeltöötlusega või ilma ning RBL-2H3 stimuleerimiseks ja aktiveerimiseks lisati 1 mM CaClz ja PMA/A23187. Katsetulemused näitasid, et RBL-2H3 töötlemine erinevate võrdluskontsentratsioonidega üksi ei mõjutanud rakusisese kaltsiumiioonide kontsentratsiooni suurenemist. PMA/A23187-indutseeritud Ca2t sissevoolu rühmas suurenes intratsellulaarse kaltsiumiiooni kontsentratsioon oluliselt. RBL-2H3 rakke töödeldi 20 minutit võrdluskontsentratsiooniga (3 μM ja 10 μM) ning kaltsiumioonide kontsentratsioon vähenes oluliselt (joonis 3).

2.4. Neferiin vähendas põletikueelsete tsütokiinide mRNA ekspressiooni PMA/A23187-s, mida stimuleerib RBL-2H3

Naha immuunvastus suurendab nuumrakkude arvu kehas ja seejärel toodavad nuumrakud põletikueelseid tsütokiine ja kiirendavad haiguse kulgu. Põletikueelsed tsütokiinid, eriti TNF-a, IL-6, IL-1 ja IL-8, mitte ainult ei kutsu esile põletikku, vaid põhjustavad ka leukotsüütide infiltratsiooni, granuloomide moodustumist ja kudede fibroosi. PMA/A23187 toimib nuumrakkudele ja indutseerib neid tootma IL-16, IL-6, TSLP ja TNF-, põhjustades allergiaga seotud põletikku. Seetõttu eeltöötlesime RBL-2H3 võrdlusainega 20 minutit ja stimuleerisime PMA/A23187-ga 6 tundi, et tuvastada, kas referents võib IL-1, IL{{ mRNA ekspressiooni alla reguleerida. 19}}, TSLP ja TNF-a. Tulemused näitasid, et rühmas, keda raviti ainult võrdlusravimiga, ei mõjutanud tsütokiini mRNA ekspressioon ja mRNA ekspressioon rühmas, mis kutsus esile PMA/A23187 põletiku, suurenes oluliselt. Referentsiga ravitud rühmas täheldati, et IL-1, IL-6, TSLP ja TNF-a mRNA ekspressioonitasemed olid oluliselt alla surutud (joonis 4).

2.5. Neferiin inhibeerib PMA/A23187-MAPK raja indutseeritud fosforüülimist RBL-2H3-s

Varasemad uuringud on näidanud, et nuumrakud peavad MAPK aktiveerimiseks vabastama intratsellulaarseid kaltsiumioone. Lisaks reguleerib MAPK signaalirada monotsüütide, T-lümfotsüütide, B-lümfotsüütide, tsütokiinide ja kemokiinide ekspressiooni ning indutseerib autoimmuunsust. See mehhanism on sarnane PMA/A23187 aktiveerimisrajale. Selles uuringus uurisime, kas viide võib osaleda MAPK radade reguleerimises. Töötlesime erinevaid võrdluskontsentratsioone (1, 3 ja 10 uM) RBL-2H3-ga 20 minutit ja seejärel stimuleerisime põletiku esilekutsumiseks 30 minutit PMA/A23187-ga. Tulemused näitasid, et kui RBL-2H3 töödeldi ainult erinevate võrdluskontsentratsioonidega, ei mõjutanud p38, JNK ja ERK valkude aktiveerimist. Ainuüksi PMA/A23187-ga ravitud rühmas leidsime, et p38, JNK ja ERK valgud olid aktiveeritud ja neil on märkimisväärne fosforüülimine. Võrdlusmeetodil eeltöödeldud rühmas täheldati, et kõrgemate võrdluskontsentratsioonide korral vähenes p38, JNK ja ERK valkude fosforüülimine oluliselt (joonis 5A-C).

2.6. Neferiin inhibeerib PMA/A23187-NF-B raja indutseeritud fosforüülimist RBL-2H3

Põletikueelsete tsütokiinide ekspressioon sõltub transkriptsioonifaktori NF-KB aktivatsioonist nuumrakkudes. Kui IKB valk fosforüüliti ja lagunes, vabanes NF-kB ja migreerus tuuma, seondudes oma vastavate DNA-le reageerivate elementidega ja soodustades põletikueelsete vahendajate transkriptsiooni. Toodeti palju tsütokiine ja kemokiine, mis reguleerivad immuunvastust, diferentseerumist ja põletikku. Seetõttu uurisime, kas eeltöötlus viitega mõjutab PMA / A23187 poolt indutseeritud valgu fosforüülimist. Töötlesime erinevaid võrdluskontsentratsioone (1, 3 ja 10 μM) RBL-2H3-ks. 20 minuti pärast stimuleeris PMA/A23187 RBL-2H3 1 või 2 tunni jooksul, et kutsuda esile põletik. Tulemused näitasid, et RBL-2H3 töötlemine erinevate võrdluskontsentratsioonidega üksi ei mõjutanud IKBa ja NF-KB fosforüülimist. Kui stimuleerimiseks kasutati PMA/A23187, täheldati IkBo ja NF-KB fosforüülimise olulist suurenemist. Eeltöödeldud rühmas leiti, et IkBa (joonis 6A) ja NF-KB (joonis 6B) fosforüülimine oli oluliselt vähenenud.

2.7. Neferiini mõju 2,4-dinitroklorobenseenist (DNCB) põhjustatud atoopilisele dermatiidile

Haigusuuringute loommudel DNCB on tüüpiline ärritaja, mis põhjustab atoopilist dermatiiti[25]. Meie katses kasutatakse sensibiliseerimisvastuse esimese etapi esilekutsumiseks 1-protsendilist dinitroklorobenseeni (DNCB), mis on lahustatud 75-protsendilises alkoholis. Võrdluslahust (3 mg/kg ja 10 mg/kg) ja DMSO-s lahustatud deksametasooni (Dexa, {{10}},2 mg/kg) manustati intraperitoneaalselt viiendal päeval kümne päeva jooksul . 8., 1. ja 14. päeval rakendati põletiku esilekutsumise teise etapina 0,5 protsenti DNCB-d. Hiired jagati nelja rühma - kontrollrühm, DNCB rühm, võrdlusravi saanud rühm ja deksametasooniga ravitud rühm - ning seejärel pärast rühmade võrdlemist täheldati erinevusi. Me täheldasime, et DNCB kutsus hiirte nahal esile atoopilise nahapõletiku reaktsiooni. Pärast DNCB pealekandmist leiti, et hiirte nahk suurendas punetust ja ketendust. Need kõik on tingitud keratinotsüütide ebanormaalsest proliferatsioonist, infiltratsioonist ja immuunrakkude agregatsioonist. Rühm, keda raviti võrdlusannusega 3 mg/kg ja deksametasooniga 0,2 mg/kg neli päeva, leevendas punetust. Jätkasime hiirte seljanaha seisundi jälgimist kuni 15. päevani. Võrreldes kontrollrühmaga oli DNCB rühmal nahahaigused tugevalt punetavad ja paistes ning esines kõõma ja haavu, mis näisid olevat põhjustatud sügelusest ja valust. . Leiame pärast võrdlusravi ja deksametasooniga ravi vähenemise trendi (joonis 7A). Agregeerunud nuumrakkude arvu jälgimiseks kasutati toluidiinsinist värvi. Nuumrakud tundusid mikroskoobi all vaadeldes lillad. Kvantitatiivselt saab näidata, et paljud nuumrakud, mis infiltreerusid ja kogunesid pärisnahasse DNCB katserühmas, suurenesid oluliselt võrreldes kontrollrühmaga. Võrdlus- ja deksametasooniga ravitud rühmas vähenes infiltratsioon, agregatsioon ja nuumrakkude arv (joonis 7B, C).

2.8. Neferiin parandab barjääriga seotud molekulide mRNA ekspressiooni pärast DNCB töötlemist

AD põhjustatud nahaga seotud põletik võib põhjustada ebanormaalset naha barjääri funktsiooni. Kui nahabarjäär on defektne, on antigeenidel või ärritajatel kergem tungida läbi naha epidermise ja siseneda organismi, et kutsuda esile immuunsüsteemiga seotud reaktsioone. Samal ajal pärsitakse diferentseerumisvalkude, sealhulgas filaggriini, lorikriini ja involukriini tootmist. Seetõttu on kahjustatud nahabarjääri taastamine AD ennetamiseks ja raviks väga oluline [26]. Oma uuringus kasutasime viiteid, et sekkuda DNCB-indutseeritud atoopilise dermatiidi loommudelisse. Pärast hiirte ohverdamist maandati selja nahakude RI-qPCR analüüsi jaoks, et hinnata, kas võrdlus võib parandada mRNA ekspressiooni vähenemist filaggriini, lorikriini ja involukriini puhul pärast DNCB ravi. Tulemused näitasid, et DNCB eksperimentaalrühmas oli kontrollrühmaga võrreldes oluliselt vähenenud filaggriini, lorikriini ja involukriini mRNA ekspressioon. Filaggriini, lorikriini ja involukriini mRNA ekspressioon suurenes märkimisväärselt võrdlus- ja deksametasooniga ravitud rühmas võrreldes DNCB rühmaga (joonis 8).

Lisaks tõestasime, et viitel on allergiavastane kriimustusefekt. Kasutasime BALB/c hiirtel kriimustuskäitumise esilekutsumiseks nuumrakkude degranulatsiooniainet, ühendit 48/80. Nagu on näidatud joonisel 9, leidsime, et võrdlusravi pärssis ühendi 48/80 (50 ug/koha kohta) põhjustatud kriimustuskäitumist. Korduv väiksemate ja suuremate võrdlusdooside (3 ja 10 mg/kg) manustamine 5 järjestikuse päeva jooksul vähendas oluliselt ühendi 48/80 põhjustatud kriimustuste arvu.