Morfofunktsionaalne uuring passiivse suitsetamise mõjude kohta rottide neerudele
Feb 19, 2022
SISSEJUHATUSMaailma Terviseorganisatsiooni (WHO) andmetel on suitsetamine maailmas ennetatavate surmajuhtumite peamine põhjus, mõjutades aastas 8 miljonit inimest ja ligikaudu 1,2 miljonit neist surmajuhtumitest on põhjustatud passiivse suitsuga kokkupuutumisest. (1) Sigaretid koosnevad tuhandetest keemilistest komponentidest, mida on hiljuti hinnanguliselt 5600. Nende hulgas on 158 toksikoloogilised omadused, mis võivad suitsu kaudu keskkonda saastada, (2) mis passiivse suitsetaja poolt sissehingamisel sisaldab kuus korda rohkem nikotiini, neli korda rohkem tõrva, seitse korda rohkem süsinikmonooksiidi ja 73 korda rohkem ammoniaaki kui mida aktiivne suitsetaja sisse hingab. (3)
Dülgeri jt (4) võrdlev uuring, mille viidi läbi suitsetajate ja vabatahtlike pereliikmete rühmas, kes ei olnud sigaretisuitsu all, näitasid.neerufunktsioonid neid kahjustab aktiivne suitsetamine. Kuid Elihimas Júnior jt (5) tõid välja, et kokkupuude sigaretisuitsuga võib samuti olla tugevneerudmürgine aine. Jain jt (6) on näidanud, et nikotiin on võimas stiimul inimese mesangiaalsete rakkude proliferatsioonile ja fibronektiini tootmisele, mis raskendab glomerulaarkahjustusi.
Seega mõjutavad suitsetamine ja ringlev nikotiin negatiivselt glomerulaarfiltratsiooni eest vastutavaid struktuure, kuid seost passiivse suitsetamise ja nende struktuuride morfofunktsionaalsete muutuste vahel, mis on tingitud sellest kokkupuutest, ei ole kirjanduses veel täielikult selgitatud ja see on peamine eesmärk. käesolev uuring.
Märksõnad:Tubakasuitsu saastamine; Neerukoor; Neeru glomerulus; Mesangiaalsed rakud; diabeetilised nefropaatiad; Glomerulaarfiltratsiooni kiirus; Rotid, Wistar
EESMÄRKAnalüüsida morfoloogilisi, struktuurseid ja funktsionaalseid aspekteneerudrottidel pärast sigaretisuitsu passiivset sissehingamist.
MEETODIDLoomade hooldamine ja pidamised olid kooskõlas riiklike ja institutsionaalsete loomade heaolu käsitlevate suunistega, mille kehtestasid Colégio Brasileiro de E xperimentação Animal (COBEA) [Brasiilia Loomakatsete Kolleegium] ja Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA)Loomkatsete kontrolli nõukogu]. Loomkatsete eetikakomitee vaatas üle ja kiitis heaks kogu loomade kasutamise (protsess 286/2015). Seetõttu tehti jõupingutusi, et minimeerida kannatusi, ebamugavustunnet ja kasutatavate loomade arvu, koheldes neid inimlikult.
Uuringu ülesehitusEksperimentaalne uuring, mis koosnes isastest rottidest (Rattus norvegicus albinus), kes olid {{0}}nädala vanused ja kaalusid keskmiselt 260 g ja mis jagunesid kontrollrühmaks (CG) ja passiivse suitsetamise rühmaks (SG). CG ja SG jagati CG 7 päevaks (n=10), SG 7 päevaks (n=10), CG 28 päevaks (n=10) ja GTks 28 päevaks (n{ {10}}). Mõlema rühma loomi peeti Faculdade de Medicina de Jundiaí (FMJ) vivaariumis novembrist 2015 kuni jaanuarini 2016 eraldi ruumides, kaks kasti kohta, toatemperatuuril 22±2 kraadi ja heledas/pimedas. tsükkel 12 tundi. Loomade kaalutõus (g) ja filtreeritud vee tarbimine (mL) ja sööt (g) ad libitum (Nuvilab ® ; energiasisaldus: 339 kcal=1418kJ 100,0 protsenti; süsivesikud 54 g või 63,4 protsenti; valgud 22 g või 25,9 protsenti ja lipiide 4 g või 10,6 protsenti – kogus 100 g portsjoni kohta ja protsent kogu energiaväärtusest) jälgiti kogu katse vältel. Keskmise tarbimise arvutamiseks kasutati erinevusi pakutud ja looma poolt tähelepanuta jäetud koguse vahel.
Sigaretisuitsuga kohanemiseks viidi SG loomad järk-järgult kokku põlevate sigarettidega, mis toimusid kahekaupa, kuni 40 sigaretti päevas (kõrge saagis; tõrv: 10 mg; nikotiin: 0,8 mg; vingugaas: 10 mg) seitsme kuni 28 päeva jooksul. Põlemine toimus automaatses suitsetamismasinas (SM-MC-01), mis oli programmeeritud alustama sigarettide põletamist iga 6 tunni järel, põletades 10 sigaretti tsükli kohta. Sigaretisuits aspireeriti ventilatsiooniriiuli, nn "suitsetamisruumi" (joonis 1) sissevoolusüsteemi kaudu ja jaotati homogeenselt loomade suletud kastidesse. Süsinikdioksiidi mõõdeti kastide sees ja keskkonnas, kus peeti CG ja SG loomi, kasutades kalibreeritud süsinikdioksiidi mõõturit (AZ Instruments, mudel AZ 77535, seerianumber 10109975) (sertifikaat 00948/2016).
Uriini maht ja biokeemiliste parameetrite analüüs6. ja 27. päeval paigutati loomad metaboolsetesse puuridesse 24-tunnise uriini kogumiseks. Varsti pärast seda nad kaaluti, anesteseeriti, eutaniseeriti pikaajalise anesteesiaga janeerudja koguti verd. Mikroalbuminuuriat mõõdeti immunoturbidimeetria abil spektrofotomeetrilise analüüsi abil. Mõõdeti plasma kreatiniini kliirensit (võrdlusväärtus: {{0}},58±0,24 mg/dl) (7) ja uriini kreatiniini kliirensit (võrdlusväärtus: 67,2±12,8 mg/dl) (7). Jaffé meetodil. (8) Kreatiniini ja glükoosi analüüside jaoks (võrdlusväärtus: 108±17,4 mg/dL) (7) tsentrifuugiti proove seerumi saamiseks 3, 000 p/min kümme minutit 4 kraadi juures. Seejärel kasutati Laborlabis kreatiniini, Bioclin glükoosi ja Analisa mikroalbuminuuria mõõtmiseks ensümaatilisi komplekte.
Neerude kaalud, mõõtmed ja histoloogiaTheneerudloomadelt saadud materjalid lõigati lahti ja kaaluti analüütilisel skaalal (mudel AB204, Mettler Toledo, Barueri, SP, Brasiilia). Theneerudmõõtmed (pikkus, laius ja kõrgus) saadi pahümeetri abil ning nende raadiusi (r) kasutatineerudruumala kuupsentimeetrites, kasutades valemit vol{0}}/3π (r1.r2.r3), mida kasutatakse ellipsi ruumala arvutamiseks. (9) Histoloogilise analüüsi jaoks paremneerud(RK) lõigati horisontaalselt vahelneeru-poolused ja vasakpoolneneerud(LK) oli ristlõikega, kraniaalne ja kaudaalneneerudhilum sektsioonid, mille keskosa kasutatakse analüüsideks. Kudelõigud sisestati parafiini, lõigati umbes 4 μm paksuseks ja värviti hematoksüliin-eosiini (HE) ja perioodilise happega Schiff (PAS).
Morfomeetria ja stereoloogia Mõõdudneeru-ajukoor saadi kalibreeritud millimeetri okulaariga, mis oli kinnitatud Motic optilise mikroskoobi külge, millel oli 4-kordne objektiiv, RK ja LK histoloogilistel slaididel, värvitud HE-ga.
Kogu kudede morfokvantitatiivne uuring struktuursel tasemel viidi läbi tarkvara Motic Images Plus 2.{1}} abil histoloogiliste lõikude analüüsimiseks ja digitaliseerimiseks. Rühmade glomerulaartiheduse kvantifitseerimiseks tehke pildidneeru-ajukoor jäädvustati 4-kordse objektiiviga HE-ga värvitud histoloogilistele objektiklaasidele. Pildile sisestati LK 15 väljale ja RK 20 väljale testsüsteem, mille moodustasid võrkkest ja viidatud ristumiskohad, mis andsid kokku 100 punkti, lugedes need, mis keskendusid glomerulitele, ja jättes välja need, mis keskendusid. katkendlikud jooned (joonis 2). Glomerulaartihedus testsüsteemi suhtes arvutati järgmiselt: Vv[glom] =p/P (Vv[glom]), glomerulaartihedus protsentides; p on punktid glomerulites ja P on punktide koguarv testimissüsteemis. (10)
Slaididele 40-kordse objektiiviga jäädvustatud piltide glomerulaar- ja kapsliläbimõõtude arvutamiseks
värviti PAS-iga, tõmmati nende struktuuride otste vahele jooned programmiga arvutatud väärtusega (μm). Keskmine läbimõõt saadi pärast mainitud konstruktsioonide suurima ja väikseima läbimõõdu keskmistamist aastal 40neeru-veresooned RK-s ja 30 LK-s, milles täheldati veresoonte ja/või kuseteede pooluseid (joonis 3A). Kapsliruumid saadi nende väärtuste erinevuse järgi.
Nendesse samadesse glomerulitesse, nüüd 60-kordse objektiiviga, sisestati uuesti testsüsteem ja loendati glomerulile ilmunud punktid. Vahetult pärast seda loendati punktid, mis langesid mesangiaalraku tuumadele; (9) need rühmitati mesangiaalsesse ruumi, mida ümbritses mesangiaalne maatriks glomerulaarsete kapillaaride silmuste (11) vahel (joonis 3B). Mesangiaalse raku poolt hõivatud mahufraktsioonid
testsüsteemi (glomerulus) suhtes arvutati järgmiselt: Vv[mesg]=p/P (Vv[mesg], mesangiaalse mahu tihedus on antud protsentides, p näitab punkte mesangiaalraku tuumadel , ja P, mis vastab testisüsteemi punktide koguarvule. (8)
Statistiline analüüsStatistiline analüüs viidi läbi eesmärgiga teha võrdlusi CG ja SG vahel, samuti rühmasiseseid võrdlusi iga uuritud muutuja kohta, kasutades keskmisi ja standardhälbeid. Andmed esitati dispersioonanalüüsile (ANOVA). Dispersioonide homogeensuse eeldust kontrolliti Tukey mitmekordse võrdluse testiga. Kõigi testide olulisuse tase oli p Väiksem kui 0,05 või sellega võrdne. Analüüsiks kasutatud tarkvara oli Biostat 5.3 (Instituto de Desenvolvimento Sustentável Mamirauá, Belém, PA, Brasiilia) ja tehti võrdlusi nii CG ja SG vahel kui ka rühmasiseselt.
TULEMUSED
Süsinikdioksiidi tase (osa miljoni kohta)Suitsuruumi seadmete tõhusust suitsu tekitamisel ja sissepuhumisel kinnitas süsinikdioksiidi taseme tuvastamine. Algne keskmine väärtus enne sigareti põletamist oli SG keskkonnas 62{8}},8 miljondikosa (ppm), mis oli lähedane CG keskkonnas saadud keskmisele väärtusele (571,8 ppm). Kui sigaretid süüdati ja kastidesse puhuti suitsu, tõusis süsinikdioksiidi tase järk-järgult minimaalselt keskmiselt väärtuselt 616,6 ppm kuni maksimaalse keskmise väärtuseni 1267.{9}}ppm (p 0,01 või väiksem).
Kehakaalu tõus ja tarbimine SG-loomadel oli uuritud perioodide jooksul väiksem kehakaalu tõus ning väiksem sööda- ja veetarbimine (tabel 1).
Morfomeetria: neerude kaal ja mõõtmedAasta keskmised väärtused vähenesid oluliseltneerudkaal,neerudmõõtmed (pikkus, laius ja kõrgus),neerudmaht ja kortikaalne paksus SG loomadel uuritud perioodidel. RK pikkuses mõlemal perioodil ja LK kõrguses seitsmepäevasel perioodil erinevusi ei olnud (tabel 2).
Neerukeste morfomeetria ja stereoloogiaMis puudutab glomerulaarmahu tihedust ning glomerulaar- ja kapsli läbimõõtu, siis SG-s täheldatud keskmised väärtusedneerudolid oluliselt madalamad. Kapsliruumide osas olid SG-s täheldatud keskmised väärtused 28 päeva jooksul oluliselt kõrgemad. Glomerulites mesangiaalrakkude poolt hõivatud mesangiaalse mahu tiheduse osas olid SG keskmised väärtused oluliselt kõrgemad (tabel 3 ja joonis 4).
Uriini maht ja biokeemiliste parameetrite analüüs
SG-loomade uriinimaht oli seitsme päeva pärast oluliselt väiksem ja 28. päeval erinevust ei olnud. SG-loomade glükoosi-, kreatiniini- ja mikroalbuminuuria tasemed olid oluliselt kõrgemad ning SG-loomade uriini kreatiniinisisaldus ja kreatiniini kliirensi määr olid uuritud perioodidel oluliselt madalamad (tabel 4).
ARUTELU
Käesolevas uuringus kasutati süsinikdioksiidi, et kontrollida sigaretisuitsu keskkonnasaaste määra. Selle gaasi tasemed SG loomade kastides olid sarnased Colli Neto jt (12) leidudega, kes täheldasid süsinikdioksiidi kontsentratsiooni taset üle 999 ppm. See näitab sigaretisuitsus sisalduvaid komponente, mis ringlesid ja loomad neid sisse hingasid. Lisaks tuvastas Robello (13) töö, kasutades sarnast kokkupuutemeetodit, kõrge kotiniini (nikotiini metaboliidi) taseme SG loomade seerumis.
Selle kokkupuute tõttu suurenes SG loomade kaal uuritud perioodidel väiksema vee ja sööda tarbimise tõttu. Nikotiini sissehingamine sigaretisuitsuga muudab ainevahetust, soodustades suuremat soojuse tootmist ja hapnikutarbimist, mis stimuleerib kilpnääret stimuleerivat hormooni (TSH), mille tulemuseks on ainevahetuse kiirenemine ning glükoosi ja kolesterooli taseme tõus veres. (14) See põhjustab ka dopamiini ja serotoniini kontsentratsiooni ägedat tõusu ajus, pärssides seega toidu tarbimist. (15) Üks selle hüpoteesidest on suitsetajate mõõdukas hüperglükeemiline tase, (16) seda on täheldatud ka praegu. uuringus ja Sinzato jt uuringutes. (17)
Emakasisesest perioodist alates suitsetanud rottidega läbiviidud uuringus täheldas Schiffner (18), et glükoositaluvuse testi analüüs näitas selles rühmas resistentsust insuliini toimele ja kõrgemaid glükoosipiike võrreldes kontrollidega, mis viitab sellele, et suitsetajatel on raskem glükoosi omastamine, mis on tingitud insuliini väiksemast saadavusest, insuliiniretseptorite väiksemast arvust ja/või funktsioonist või väiksemast võimest indutseerida rakusisest signaaliülekandekaskaadi, mis hõlbustab glükoosi omastamist.
Nende tegurite tulemusenaneerudKäesolevas uuringus mõjutati kaalu ja mõõtmeid, mis kulmineerusid väiksemateganeerude mahud, mida täheldati ka Dündari jt eksperimentaalses uuringus. (19) Kuigi teatud morfoloogilised muutused ei pruugi tähendada kahjustusineerufunktsioon, näib see seos suitsetamisel järgnevat otseselt proportsionaalselt, kuna kortikaalse paksuse hindamisel SG-s täheldati olulist atroofiat. Tegelikult seos kortikaalse paksuse janeerufunktsioonon soovitatud, eriti kui esineb proportsionaalne glomerulite arvu vähenemine, (20) mida täheldati ka käesolevas uuringus, kusjuures glomerulite mõõtmed on oluliselt vähenenud.neeru-korpuse läbimõõt. Kuid kapsliruum suurenes SG-s pikema kokkupuuteajaga, tõenäoliselt glomerulaardiameetri vähenemise tõttu, mis võimaldas sellest tulenevalt glomerulaarfiltratsiooni kiirust (GFR) vähendada. (19)
Mesangiaalse mahutiheduse hindamisel suurenes SG loomade arv märkimisväärselt. Mesangiaalne rakk, mis aitab ja moduleerib GFR-i ja glomeruluse pindala tänu oma võimele
vasoaktiivsete ravimite toimel kokku tõmbuda ja lõõgastuda, võib esineda märkimisväärne proliferatsioon koos glomerulaarskleroosi ja tubulointerstitsiaalse fibroosiga loomadel vastusena suitsetamisest põhjustatud glomerulaarsetele endoteeli kahjustustele. (21,22)
Tingituna täheldatud morfoloogilistest muutustest ja SG loomade väiksemast veetarbimisest, mida täheldati ka Gonçalves-Silva jt (23) uuringutes, muutusid SG-s ka vere- ja uriinianalüüsi biokeemilised parameetrid, pakkudes toetusi. et mõista võimalikku kahjuneerufunktsioon, kuna kreatiniini, uriini kreatiniini ja uriinimahu tasemed, mida kasutati kreatiniini kliirensi määra määramiseks, et hinnata GFR-i, olid oluliselt madalamad. Suitsetamine soodustab albumiini-kreatiniini suhte olulist suurenemist, millega kaasneb muutusi glomerulaarkapillaaride rõhus ja neerufunktsioonis (24) ning vähe on uuringuid, mis näitavad passiivsete suitsetajate vereringes sisalduvat nikotiini ja.neeruhaigused, eriti seoses ägeda kokkupuutega. (25)
Seega võib tsirkuleeriva nikotiini akuutne toime olla seotud glomerulaarse endoteeli düsfunktsiooniga, kuna selles uuringus oluliselt kõrgenenud püsiv mikroalbuminuuria tase määrab ja klassifitseerib nefropaatia alguse ja progresseerumise ning väljendab endoteeli düsfunktsiooni ja vigastuste riskifaktorit. makro- ja mikrotsirkulatsiooni. (26) Cooper (27) näitas, et nikotiin kiirendab nefropaatiate tekkimist, mis tuvastatakse suureneva mikroalbuminuuriaga, mis areneb proteinuuriaks, järeldades, et aktiivne ja passiivne suitsetamine on mürgisedneerufunktsioon.
KOKKUVÕTESigaretisuitsu kokkupuude ja passiivne sissehingamine loomade poolt põhjustas nende neerudes morfoloogilisi ja struktuurseid muutusi. Koos kokkupuutest tingitud biokeemiliste parameetrite muutustega vähenes glomerulaarfiltratsiooni kiirus, mis näitab, et kokkupuude passiivse suitsuga võib kahjustadaneerufunktsioon, millel on sarnane toime aktiivse suitsetamisega.
