Imetajate kaasasündinud immuunvastuseid reguleeriva bakteritsiidse/läbilaskvust suurendava valgu (BPIFA1) molekulaarne evolutsioon, 1. osa

Abstraktne:

Bakteritsiidne/läbilaskvust suurendav valk, imetajate kaasasündinud immuunsüsteemi peamine tegur, osaleb loomulikus immuunkaitses sissetungivate bakterite eest. BPIFA1 aitab aktiivselt kaasa peremeesorganismi kaitsele mitmete mehhanismide kaudu, nagu antibakteriaalne, pindaktiivsed ained, hingamisteede pinnavedeliku kontroll ja immunomoduleerivad tegevused. Imetajate BPIFA1 geeni evolutsioonilugu ja selektsioonijõud adaptiivse evolutsiooni ajal on aga halvasti mõistetavad. Selles uuringus uuriti inimeste BPIFA1 geeni võrreldes teiste imetajaliikide omaga, et hinnata adaptiivse evolutsiooni tulemusel saadud selektiivset rõhku. Et hinnata, kas positiivne valik toimus või mitte, kasutasime mitut erinevat võimalikkuse testi (M1 vs. M2 ja M7 vs. M8).

Positiivselt valitud kohtade proportsioonid olid olulised, BPIFA1 valgu tõenäosuse logaritmiline väärtus oli 93, 63. Valikuserverit kasutati samas andmekogumis, et kinnitada positiivset valikut konkreetsete saitide jaoks, kasutades mehaanilise-empiirilise kombinatsiooni mudelit, pakkudes seega täiendavaid tõendeid positiivse valiku leidude toetamiseks. Imetajate liikide BPIFA1 geenides leidus veenvaid tõendeid positiivsete selektsioonisignaalide kohta, mis olid selektsioonimärkide ja signaalide loomise jaoks olulisemad.

BPIFA1 valk, tuntud ka kui LPLUNC1 või nasofarüngeaalse kartsinoomiga seotud geen 6 (NAG6), on valk, mis ekspresseerub tugevalt ülemistes hingamisteedes ja suuõõnes. BPIFA1 valk on tihedalt seotud immuunsusega.

Uuringud on näidanud, et BPIFA1 valgul on antibakteriaalne ja immunomoduleeriv toime. BPIFA1 valk võib seostuda invasiivse Escherichia coliga ja hävitada selle rakumembraani, mängides seeläbi antibakteriaalset rolli. Lisaks mängib BPIFA1 valk immunomoduleerivat rolli, aktiveerides Toll-like retseptorite (TLR) 4 ja TLR2 radasid, soodustades põletikulisi reaktsioone, apoptoosi ja immuunrakkude aktivatsiooni.

Samuti on põhjalikult uuritud seost BPIFA1 valgu ja hingamisteede haiguste vahel. Näiteks on uuringud näidanud, et BPIFA1 valgu ekspressioonitase hingamisteede haigustes, nagu bronhiaalastma ja krooniline obstruktiivne kopsuhaigus (KOK), on tihedalt seotud haiguse tõsidusega. Eriti infektsioonitingimustes saab BPIFA1 valgu ekspressioonitaset märkimisväärselt tõsta, osaledes seega hingamisteede immuunvastuse ja taimestiku tasakaalu reguleerimises.

Seetõttu ei saa ignoreerida BPIFA1 valgu rolli immuunsüsteemis ning selle seos hingamisteede haiguste ja infektsioonidega vajab täiendavat põhjalikku uurimist. Seetõttu peame pöörama erilist tähelepanu oma immuunsuse parandamisele. Cistanche mõjutab oluliselt immuunsust. Lihas sisalduvad polüsahhariidid võivad reguleerida inimese immuunsüsteemi immuunvastust, parandada immuunrakkude stressivõimet ja tugevdada immuunrakke. bakteritsiidne toime.

Tervete toiduainete tsitanche saamiseks klõpsake nuppu

Tegime tõenäosusteste, milles võrreldi erinevaid mudeleid, mis põhinevad dN / dS suhetel, et tuvastada positiivse selektsiooni rõhu all olevad spetsiifilised koodonid. Imetajate genoomis tuvastasime BPIFA1 valkude LBP-BPI domeenis positiivselt valitud saidid, sealhulgas lipiide siduva domeeni, millel on DPPC suhtes väga kõrge selektiivsus. BPIFA1 aktiveerib ülemiste hingamisteede kaasasündinud immuunsüsteemi vastuseks paljudele imetajate genoomis leiduvatele geneetilistele signaalidele. Need leiud rõhutavad evolutsioonilisi edusamme immunoregulatoorsetes mõjudes, mis mängivad olulist rolli imetajate liikide antibakteriaalses ja viirusevastases kaitses.

Märksõnad:

BPIFA1; bakteritsiidne; immuunsussüsteem; molekulaarne evolutsioon; positiivne valik.

1. Sissejuhatus

Bakteritsiidne läbilaskvust suurendav valk (BPI) on väga tõhus antimikroobne valk, mis seob ja neutraliseerib bakterite välismembraanilt vabanevaid lipopolüsahhariide [1]. BPI volti sisaldav perekonna A liikme 1 (BPIFA1) geen avaldab teadaolevalt mõju kohalikule immuunsüsteemile ning need mõjud võivad potentsiaalselt mõjutada mikroorganismide kasvu ja invasiooni [2]. Üks võimalikest mehhanismidest, mis selle seose aluseks on, on BPIFA1 võime suurendada bakterite imendumist fagotsüütiliste rakkude poolt ja nende võimet neid hävitada [3].

Kuigi neil on minimaalne järjestuste sarnasus, on BPI-l kaks domeeni, mis kasutavad sama struktuurset voldit [1, 4]. Sissetungivad gramnegatiivsed bakterid põhjustavad integreeritud peremeesreaktsiooni, mida hõlbustab lipopolüsahhariidi siduva valgu (LBP) olemasolu. LBP on endotoksiine siduv valk, mis on BPI-ga tihedalt seotud ja sellega kooskõlastatud [5]. BPIFA1 kontrollib limaskesta mikrobiotat ja interferooni signaaliülekannet. SPLUNC1 (varem tuntud kui BPIFA1) on valguvolte sisaldav pereliige, millel on antibakteriaalne, pindaktiivne ja immunomoduleeriv toime, mis kõik aitavad kaasa peremeesorganismi kaitsele. Hingamissüsteem on selle ekspressiooni peamine koht [6]. SPLUNC1, hiire geeni PLUNC inimese homoloog, omab sama ekspressioonimustrit ülemistes hingamisteedes ja ninaneelu piirkondades kui selle hiire homoloogil. Antibakteriaalset toimet gramnegatiivsete bakterite vastu näitab kodeeritud antimikroobne valk [5]. Mitteväikerakk-kopsuvähi korral võib see olla potentsiaalne molekulaarne marker mikrometastaaside leidmiseks. 3' transleerimata piirkonna alternatiivse splaissimise tulemusena on avastatud mitu transkripti varianti; siiski mõistetakse ainult kolme transkriptivariandi täispikka olemust [7].

Nii hiirtel kui ka inimestel on hingetoru ülaosas märkimisväärne BPIFA1 geeniekspressiooni tase, kuid see ekspressioon väheneb hingetorust kaugenedes, jõudes miinimumini peamiste varrebronhide hargnemiskohas ja muutudes kopsude perifeerias tuvastamatuks. [8]. Ulatuslikud geeniekspressiooni uuringud hiirtel ja inimestel ei ole suutnud tuvastada BPIFA1 perifeerses kopsukoes [9]. Välja arvatud väga madal BPIFA1 mRNA ekspressioonitase hiire harknääres, roti südames ja haistmislimaskestas, ei ekspresseeru BPIFA1 üheski organis ega kudedes väljaspool näriliste hingamissüsteemi [10]. Puuduvad viited sellele, et BPIFA1 mRNA esineks üheski järgmistest inimkudedest: süda, maks, aju, magu, peensool, platsenta, skeletilihased, kõhunääre, põrn, normaalsed lümfisõlmed, perifeersed lümfotsüüdid, eesnääre, munandid või munasarja [11].

BPIFA1 mRNA ekspressioon järgib jaotusmustrit, mis on embrüonaalsetes ja täiskasvanud kudedes väga võrreldav. Seda mustrit täheldatakse mõlemat tüüpi kudedes [1]. BPIFA1 üleekspressioon transgeensetel hiirtel tekitas kontrollitud hingamisteede põletiku mudelis alveolaarseid makrofaage, millel oli süsiniknanotorude suurenenud opsoniseerimine ja fagotsütoos [12]. Lisaks näidati, et kommensaalsed gramnegatiivsed nanobakterid paiknevad koos BPIFA1-ga ninaneeluvähi kudede epiteelirakkudes [13]. Proovid võeti patsientidelt, kellel oli varem tuvastatud ninaneelu kartsinoom. Hiljutise uuringu tulemused näitasid, et BPIFA1 ja mittebakteriaalse LPS-i vahelised koostoimed võivad leevendada mittebakteriaalse LPS-i põhjustatud keha põletikulist vastust. [1].

Selle antibakteriaalse toime ulatus ja selle struktuuri säilimine õhku hingavatel selgroogsetel viitab sellele, et BPIFA1 on arenenud pakkuma olulist peremeesorganismi kaitsevõimet [14]. Kuid selle asukoha tõttu proksimaalsetes hingamisteedes ja selle kõrge taseme tõttu põhitingimustes võib BPIFA1 olla asendamatu. Seda seetõttu, et antimikroobseid efektoreid leidub loomadel rohkesti [15]. Järelikult näib, et BPIFA1-l on kõige olulisem mõju nakkuse vältimisel ja selle puhastamisel enne patogeenide sissetungi. Tänu nendele funktsioonidele saab ära hoida hingamisteede bakteriaalseid infektsioone, mis võivad anda märku immuunsuse aktiveerumisest ja muude hingamisteede funktsioonide paranemisest [15].

Arvatakse, et keskkonnanõuetele reageerivaid adaptiivseid muutusi piiravad biofüüsikalised tegurid, kuid kohanduvaid muutusi sisaldavate alade struktuurseid aspekte ei saa ennustada ühegi evolutsiooniteooriaga [16]. Seda seetõttu, et biofüüsikalised piirangud piiravad valgu funktsiooni säilitamiseks lubatud asenduste tüüpe [17]. Positiivne selektsioon võib olla rohkem levinud valkude osades, kus mutatsioonidel on eeldatavasti väiksem mõju kui valgu muudes osades, kuigi seda ei ole tõestatud (nt allosteerilised regulatsioonikohad) [18]. Siiski eeldatakse, et funktsionaalsed piirkonnad jäävad evolutsiooni käigus oluliselt konserveerituks, kuigi adaptiivsed muutused on seotud soodsate mutatsioonide kiire fikseerimisega [19]. Valgujärjestuste molekulaarset arengut mõjutab oluliselt loodusliku valiku protsess.

Hiljutised arengud genoomi järjestamises ja usaldusväärsed järeldusmeetodid fülogeneetilisel ja populatsiooni tasemel on võimaldanud kiirelt ja põhjalikult hinnata looduslikust valikust tingitud evolutsioonikiirusi ja kohanemisi [20]. Nii fülogeneetilisel kui ka populatsiooni tasemel on järeldusmeetodite loomiseks tehtud palju tööd. Lisaks on valgu struktuursete ja funktsionaalsete andmete kasvav juurdepääs võimaldanud teadlastel uurida struktuursete ja funktsionaalsete piirangute mõju valgujärjestuste arengule ja kohanemisele [16]. Nende struktuuridest ja funktsioonidest tulenevate piirangute tõttu on evolutsiooni ja kohanemise kiirused sama valgu erinevate valkude ja saitide puhul erinevad [19].

Suurem osa raku funktsioonidest on tihedalt läbi põimunud geeniekspressiooni reguleerivate võrgustikega, mis võimaldavad organismidel taluda kõrgemat infektsioonitaset või leevendada nende infektsioonide mõju [21]. Enamik rakufüsioloogiat moodustavatest komponentidest on tihedalt seotud nende geeniekspressiooni reguleerivate süsteemidega, mis on sageli vanad evolutsioonilised kohandused [22]. Need mehhanismid on äratanud märkimisväärset huvi uuringute vastu, mis on kasutanud piiratud hulga mudelliike, mille kohta on olemas geneetiline teave [23]. Siiski on vähe teada mehhanismide kohta, mis viisid nende süsteemide arenguni või kuidas nad kohanesid arengu edenedes erinevate keskkonnatingimustega.

Selle uuringu eesmärk on uurida BPIFA1 geeni evolutsioonilist päritolu, et paljastada selle füüsikalis-keemilised omadused ja rakendada võrdlevat genoomikat, et anda hinnang geenile erinevates imetajaliikides. Viisime läbi põhjalikud võrdlevad uuringud bakteritsiidse/läbilaskvust suurendava valgu (BPIFA1) geeni kohta, mis reguleerib imetajate kaasasündinud immuunvastust, et paremini mõista, kuidas need geenid toimivad. On võimalus, et selektiivne surve avaldab kohanemise arengule märkimisväärset mõju. Selles uuringus uurime nende geenide ajalugu erinevates selgroogsete liikides, samuti seda, kuidas geneetiline mitmekesisus ja looduslik valik on selle geeniperekonna arengut aja jooksul mõjutanud.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Järjestuste otsimine ja analüüs

BPIFA1 geeni aminohappe- ja kodeerivad nukleotiidjärjestused 34 imetajaliigis, sealhulgas selles uuringus võrdlusliikidena inimesed, koguti GenBankist (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank, juurdepääs 20. september 2021) ja need joondati MEGA 6 tarkvaras oleva Clustal Omega tööriista abil [24]. MEGA 6 tarkvaras kasutati BPIFA1 geeni fülogeneetilise puu genereerimiseks maksimaalse tõenäosuse meetodit. See puu ehitati geenidevaheliste evolutsiooniliste suhete põhjal. Bootstrap-testis arvutati keskmine asenduste arv saidi kohta ja haru keskmine pikkus, kasutades taksonoomilise klastrite määramiseks maksimaalse tõenäosusega meetodit 1000 kordusega. Seda meetodit kasutati topoloogia valimiseks täpsemate logaritmilisuse väärtuste jaoks [25, 26]. BPIFA1 geeni uurimiseks kasutatavad liiginimed ja registreerimisnumbrid on esitatud täiendavas tabelis S1.

2.2. Valiku analüüs

Iga koodoni saidi dN/dS suhete võrdlemiseks kasutati maksimaalse tõenäosusega lähenemisviise, et tuvastada spetsiifilised koodonid positiivsele selektsioonile allutatud imetajate BPIFA1 geenijärjestustes [27,28]. Analüüsiks kasutati PAML-is [29] käivitatud CODEML-i ja DATA MONKEY veebiserverit (https://www.datamonkey.org, juurdepääs 29. septembril 2021) [30] ning tulemused määrati koodonite asendussuhteid kasutades, mis olid positiivse selektsiooni all olevate koodonite puhul tunduvalt kõrgemad kui 1. Selle uurimistöö esialgne samm oli maksimaalse tõenäosuse suhte testi abil kindlaks teha, kas positiivne valik toimus või mitte.

See analüüs määras kohtade olemasolu, mille dN/dS suhe oli suurem kui üks. Selles uuringus vastandasime seda funktsiooni täitvale diskreetsele (üldisele) mudelile nullmudeliga, mis keelas saitide esinemise, mille väärtus on suurem kui 1 [31]. Analüüse võrreldi tõenäosuslogi (2∆l) jaotuse abil df=4-ga. Nullhüpotees (M7) kinnitas, et jaotus on piiratud väärtustega 0 ja 1. Alternatiivne mudel (M8) kahe parameetriga, oomega (ω) ja beeta ( ), võimaldab tuletada väärtuse andmestik, mis võib olla suurem kui 1 [27]. Fikseeritud efekti tõenäosust (FEL), ühe tõenäosusega esivanemate loendamist (SLAC) ja juhusliku efekti tõenäosust (REL) kasutavad analüüsid näitasid, et BPIFA1 geen allus positiivsele valikule, kui võrreldi sünonüümsete ja mittesünonüümsete lahknevuste globaalseid väärtusi igas kohas. [32].

Teises etapis kasutati maksimaalse tõenäosuse hinnangut aminohapete positsioonide leidmiseks, mis olid kogu evolutsiooni vältel positiivse valiku objektiks. Selle eesmärgi saavutamiseks kasutati Bayesi teoreemi, mis ennustab positiivsele valikule alluvate saitide posterioorseid tõenäosusi. Positiivset selektsiooni täheldati aminohapete asukohtades, mille tagumine tõenäosus oli vahemikus 95 protsenti kuni 99 protsenti [33]. Aminohappejäägid, mille väärtus oli suure tõenäosusega suurem kui üks, allutati selektiivsele protseduurile. Šveitsi mudel ja Phyre 2 (http://www. sbg.bio.ic.ec.k/pyre/html, juurdepääs 28. septembril 2021) on veebipõhised rakendused, mis kuvavad valgustruktuuridel soodsalt valitud aminohapete asukohti [34].

Prognoosisime nukleiinhapete ja aminohapete evolutsioonilise säilimise asukoha valguses, kasutades ConSurfi tööriista (http://consurftest.tau.ac.il, juurdepääs 28. septembril 2021), mis põhines järjestuste vahelisel fülogeneetilisel suhetel. 35]. BPIFA1 joondatud koodoni järjestust uuriti Selectoni versioonis 2.2 (http://secton.tau.ac.il, juurdepääs 28. septembril 2021), mis võimaldab määrata erinevate koodonite vaheldumisi joondatud järjestustes. Neid suhteid mõõdeti Bayesi järeldusmeetodi abil erinevate tõenäosustestide abil. See viidi läbi positiivselt valitud koodonite kinnitamiseks [36]. Lisaks näidati valikutulemusi erinevates värvides, et tähistada erinevaid valikukriteeriume.

2.3. Rekombinatsiooni analüüs

Rekombinatsiooni tõendite leidmiseks viisime läbi mudeli valimise protseduuri, mis põhines statistilisel tõenäosusel, mis suudab murdepunktide otsimisel ja tõenäolise rekombinantse DNA tuvastamisel läbi sõeluda paljude järjestuste joonduste. See meetod kasutas oma eesmärgi saavutamiseks geneetilist algoritmi, et otsida mitmete järjestuste joondustest rekombinatsiooni katkestuspunkte. GARD-i lähenemisviisi on lihtne haarata, see on kergesti laiendatav ja hästi paralleelne. Ulatuslikud simulatsioonikatsed on näidanud, et meetod ületab peaaegu kõigil juhtudel teisi praeguseid tööriistu, eriti täpsuse osas.

Rekombinatsiooni tõendite uurimiseks hinnati esmalt nukleotiidjärjestusi, et tuvastada haplotüübid (Na) ja hinnata polümorfseid saite (S), nukleotiidide erinevuste keskmist arvu (K) ja nukleotiidide mitmekesisust (π), kasutades DnaSP 5.10 tarkvara [37]. ]. Katkestuspunktide tuvastamine ja rekombinantsete signaalide hindamine nukleotiidjärjestustes viidi läbi Datamonkey veebiserveri veebipõhise GARD-tööriista [38] abil. Lisaks tagab GARD-i kasutamine järjestuste skriinimiseks rekombinatsiooni jaoks, et positiivse selektsiooni tuvastamisele keskendunud meetoditel on vastuvõetavad statistilised omadused.

2.4. Valkude ja valgu interaktsioonide analüüs

Suur huvi on olnud selle uurimise vastu, kuidas valkude ja valkude koostoimed säilivad ühelt liigilt teisele. Kuna interaktoomiandmete eksperimentaalsel tuvastamisel ja kinnitamisel on mitmeid takistusi, oleks intrigeeriv mõista PPI-d, mis on üle kantud liigilt, mis on tõestatud mõnes teises liigis [39]. Andmepank STRING on tasuta bioinformaatika ressurss, mis sisaldab teavet, mis kirjeldab, kuidas valgud mitme tee osana üksteisega suhtlevad. Iga valgusõlme ühendavate joonte arvu ja vaheväärtusi kasutatakse vahesõlmede tuvastamiseks, mis esindavad valke, millel on oluline bioloogiline roll ja mis on üksteisega tihedalt seotud. Võrgu loomiseks kasutati STRING ja võrgu kuvamiseks kasutati tarkvara Cytoscape (http://www.cytoscape.org, juurdepääs 29. septembril 2021) [40]. Tuvastades BPIFA1 valk-valk interaktsioonid immuunvalkude vahel ja koekspressiooni analüüsi, kasutades STRING versiooni 9.1 (http://www.string-db.org, juurdepääs 29. septembril 2021), saime täpsemalt kindlaks teha, kuidas BPIFA1 toimib. molekulaarsel tasemel.

2.5. BPIFA1 valgu struktuurianalüüs

Selles analüüsis koostasime inimese BPIFA1 valgu kristallstruktuuri, kasutades homoloogia modelleerimist veebitööriistadega, nagu Šveitsi mudel (http://swissmodel.expasy. org, juurdepääs 29. septembril 2021) [41], I-TESSAR [42] ja Phyre2 (http://www.sbg. bio1.ic.ac.uk/phyre2/html, juurdepääs 29. septembril 2021) [43]. Kokkupandud sihtvalgu vähendamiseks kasutati konjugeeritud gradiendi meetodit ja Amberi jõuvälja UCSF Chimera 1.10.1 tarkvaras. Lisaks kasutati eeldatava struktuuri stereokeemiliste omaduste hindamiseks ProSA veebiserverit [22].

For more information:1950477648nn@gmail.com