Areneva neeru küpsemisetappide molekulaarne tuvastamine

edmund.chen@wecistanche.com

ABSTRAKTNEHiljutised edusammud tüvirakkude bioloogias on võimaldanud luua neerudorganoidid in vitro ja nende organoidide edasist küpsemist täheldatakse pärast eksperimentaalset siirdamist. Kuid praegused organoidid jäävad ebaküpseks ja nende täpseid küpsemisstaadiume on raske kindlaks teha, kuna teave arenguetapist sõltuvate geeniekspressioonide kohta on piiratud.neerudin vivo. Asjakohaste molekulaarsete koordinaatide loomiseks teostasime arendamise käigus üherakulise RNA sekveneerimise (scRNA-seq).neerudhiire erinevatel etappidel. Valides geenid, mis ilmutasid sündimisel ülesreguleerimist võrreldes embrüonaalse päevaga 15.5, samuti rakuliini spetsiifilist ekspressiooni, koostasime geeniloendid, mis korreleerusid üksikute rakuliinide arenguetappidega. Nende loendite rakendamine siirdatud embrüo suhtesneerud näitas, et enamikul rakutüüpidel, välja arvatud kogumiskanalid, oli küpsemine sarnaneneerudvastsündinute staadiumis in vivo, paljastades rakuliinide mittesünkroonse küpsemise. Seega võivad meie scRNA-seq andmed olla kasulikud molekulaarsed koordinaadid, et hinnata arengu küpsemistneerudja lõpuksneerudorganoidid.

Märksõnad:Neerude areng, üherakuline RNA sekveneerimine, küpsemine, in situ hübridisatsioon, neerud

SissejuhatusTheneerudon tuletatud vähemalt kahte tüüpi prekursoritest: nefroni eellastest ja kusejuhadest (Costantini ja Kopan, 2010). Nefroni eellasrakud annavad efroni, sealhulgas glomerulaarpodotsüüdid, proksimaalsed tuubulid, Henle aasad (LOH) ja distaalsed tuubulid, samas kui kusejuhade pungad hargnevad ulatuslikult, moodustades kogumiskanalid ja kusejuha (Kobayashietal., 2008) (Maroseetal., 2008) (The Componentifferenary for the Components to urintied). voolu. Nefroni eellased ja kusejuha pungad algatavad oma koostoimed embrüopäeva(E)11,5 hiirtel. E15.5 ajal on üldised nefronisegmendid täpsustatud, kuid nefroni eellastest genereeritakse jätkuvalt uusi nefroneid. Pärast glomerulaarset vaskularisatsiooni hakkab uriin voolama E16,5–E17,5 (Rasouly ja Lu, 2013). Vahepeal sisemine (medullaarne) piirkondneerudpikeneb, peegeldades LOH ja kogumiskanalite pikenemist. See medullaarse piirkonna areng jätkub pärast sünnipäeva (P0), samal ajal kui nefroni eellased lõpetavad iseenesliku uuenemise ja kaovad mõne päeva jooksul pärast sündi (Hartmanet al., 2007) (Rumballe et al., 2011) ( Volovelsky jt, 2018).

Hiljutised edusammud tüvirakkude bioloogias on võimaldanud luuaneerudorganoidid in vitro (Morizane et al., 2015; Taguchi jt, 2014; Takasato jt, 2015). Oleme varem loonudneerudpluripotentsetest tüvirakkudest pärinevad organoidid: hiire embrüonaalsed tüvirakud (ESC-d) ja inimese indutseeritud pluripotentsed tüvirakud (iPSC-d) (Taguchietal., 2014). Siiski on selgeks saamas, et organoidid jäävad in vitro ebaküpsesse staadiumisse, mis on samaväärneneerudligikaudu E14,5–E15,5 hiirtel ja 10–14 rasedusnädalal inimestel (Taguchi ja Nishinakamura, 2017; Takasatoet al., 2015; Wu et al., 2018). Meie ja teised töötasime välja ka eksperimentaalse siirdamise meetodidneerudorganoidid immuunpuudulikkusega hiirteks, võimaldades organoidide vaskulariseerumist ja ühendamist peremeesorganismi vereringega (Bantounas et al., 2018; Sharmin jt, 2016; Subramanian jt, 2019; Tanigawa jt, 2018; van den Berg et al., 2018). Siirdamisel omandavad organoidides olevad glomerulaarsed podotsüüdid küpsemad morfoloogilised tunnused, mis on seotud filtreerimisfunktsiooniga, mis võib olla põhjustatud hapnikuvarustusest ja/või interaktsioonist veresoonte endoteelirakkudega. Kuigi täpsed mehhanismid jäävad lahendamata, kasutatakse organoidide küpsemise esilekutsumiseks sageli siirdamist. tüvirakkude bioloogia uurimisvaldkond.

Vaatamata nendele edusammudele on küpsemisetappide täpne määramine keeruline, kuna puuduvad molekulaarsed koordinaadid, st igakülgne informatsioonist sõltuv geeniekspressioon arenemisfaasis.neerud.Praegu pole need koordinaadid isegi hiire embrüonaalsete jaoks saadavalneerudin vivo. See olukord tekib suuresti rakutüüpide arvu suurenemise tõttuneerudiga rakutüüp sisaldab väikeses koguses rakke. Tavapärased geeniekspressiooni analüüsid, mis nõuavad suurt hulka homogeenseid rakke, ei sobi heterogeenseks küpsemiseksneerud.GUDMAP-i andmebaas (www.gudmap.org) on ​​kogunud arenevates riikides palju geeniekspressioonianalüüse.neerud, sealhulgas mõned kokkuneerudja mõned sorteeritud või mikrodissekteeritud rakkudes (McMahon et al., 2008). Siiski isegi

Viimased analüüsid sisaldavad sageli mitmeastmelisi rakke ja seega ei ole andmed küpsemise analüüside jaoks otseselt kasutatavad. Üherakulise RNA sekveneerimise (scRNA-seq) analüüs on võimaldanud uurida geeniekspressiooni keerulistes ja heterogeensetes elundites, sealhulgasneerud, ja osa neist andmetest on talletatud GUDMAP-i andmebaasi (Adam jt, 2017a; Combes et al., 2019a, 2019b; Lindstr€ om et al., 2018; Magella jt, 2017; Ransick jt. , 2019; Wanget al., 2018; Wu jt, 2018). Enamik neist varasematest uuringutest analüüsis aga embrüonaalseid või täiskasvanuidneerudühel ajahetkel või võrrelduna

vivoneerudkoos in vitroneerudorganoidid. Seetõttu on seda käsitlenud vähesed uuringudneerudküpsemine tiinuse keskpaigast sünnini piiratud rakutüübiga (Chen et al., 2015). Molekulaarsete koordinaatide määramiseksneerudküpsemise käigus teostasime areneval hiirel scRNA-seqneeruderinevatel etappidel ja valitud küpsemisest sõltuvad geenid. Lisaks hindasime siirdatud embrüonaalsete neerude küpsemise staatust, võrreldes RNA-seq andmeid ja küpsemisest sõltuvate geenide ekspressioone. Meie RNA-seq andmed ja valitud geenide loendid on võrdlusvahenditeks arengu küpsemiselneerudja lõpuksneerudorganoidid.

Tulemused

arenevate neerude scRNA-seq analüüsTegime areneval hiirel scRNA-seqneerudkolmel erineval etapil: E15.5, E17.5 ja P0. Saadi kvaliteetsed andmed, keskmise näiduga vastavalt 4493, 2360 ja 2467 geeni raku kohta. Pärast andmete analüüsi Seurat v3.1.1 abil (Butler et al., 2018; Stuart et al., 2019a) klassifitseeriti rakud 45 klastrisse, kus P0 juures oli suurem arv tahkeid klastreid kui E15.5 juures (joonis 1A). Enamiku klastrite jaoks tuvastasime rakutüübid, kasutades rakutüübispetsiifilisi markereid: nefroni eellasrakud (Six2þ, klastrid 0, 1 ja 10), glomerulaarsed podotsüüdid (Nphs1þ, klastrid 8 ja 11), glomerulaarsed parietaalsed epiteelirakud (Claudin 1 (Clldn1). )þ, klaster 20), proksimaalsed tuubulid (S1 segment: lahustunud kandja perekond (Slc) 5a2þ, klastrid 15 ja 31; S2 segment: Slc5a2?/Slc34a1þ, klastrid 13 ja 6; S3 segment: Aquaporin 1 (Aqp1)þ1/Slc) (Lee et al., 2015; Ransick jt, 2019), kobar 37), LOH (õhuke laskuv jäse: Aqp1þ/Slc39a8þ (Lee et al., 2015; Ransick et al., 2019), kobar 27; paks tõusev jäse jäse: Uromoduliin (Umod)þ/Slc12a1þ, kobarad 28 ja 17), distaalsed tuubulid (Slc12a3þ, kobar 5), kusejuhade tipud (Retþ, kobarad 22 ja 35) ja kogumiskanalite varred (Aqp21, 6, klastrid 41) (joonis 1B, joonis S1A). Interkaleeritud rakud moodustasid klastri, mis eraldati kogumiskanalite klastritest (Atp6v1g3þ, klaster 39) (joonis 1B). Interstitsiaalsed rakud klassifitseeriti mitmeks klastriks (7, 9, 12, 14, 23, 29, 30, 33 ja 34), mille hulgas klastrid 9/33, 12 ja 34 võivad esindada stromaalseid eellasrakke (Foxd1 (Kobayashi et al. , 2014)), mesangiaalrakud (Nt5eþ) ja reniini tootvad rakud (Ren1þ) (joonis S1B). Endoteelirakkude klastrid (Pecam1þ, klastrid 3, 19, 24, 25 ja 32) sisaldasid Ehd3 rakke (klaster 32, joonis S1C), mis tõenäoliselt esindasid glomerulaarseid endoteelirakke (Patrakka et al., 2007). Seega, Seurat v3.1.1, mis kasutab lähimate naabrite rühmitamiseks integratsiooniankruid (Stuartet al., 2019b), kategoriseeris mitmed rakutüübid edukaltneeruderinevatel arenguetappidel.

Ajalised muutused transkriptsioonifaktori väljendustes ja arengu signaalimistegevuses ajalneerudküpsemine

Nefroni eellased liigitati kolme klastrisse (joonis S1D): klaster 0, mis sisaldab kuut2þ/Cited1þ naiivset rakku, klaster 10, mis sisaldab Six2þ/Cited1þ/Top2a ja prolifereeruvaid naiivseid rakke, ja klaster 1/C, mis sisaldab Six2þ/Cited1þ }/Wnt4þ praimitud rakud (Boyle et al., 2008; Kobayashiet al., 2008; Self et al., 2006). Nefronisegmendi spetsifikatsiooni ajal moodustas nefroni eellaspopulatsioon kõigepealt Mafb þ podotsüütide haru,

mis lõpuks diferentseerusid Nphs1 podotsüütideks (joonised 1B ja 2A). Proksimaalsete tuubulite ja LOH/distaalsete tuubulite oksad moodustusid podotsüütide harust eraldi. Proksimaltuubulite eelkäijarakud

ekspresseerisid transkriptsioonifaktori geene Osr2 ja seejärel Hnf4a (joonis 2B), millest viimane reguleerib proksimaalsetes tuubulites küpsemisest sõltuvaid geene (Deacon et al., 2019; Marable jt, 2018, 2020; Martovetsky

et al., 2013). LOH/distaalsete tuubulite ühised prekursorrakud ekspresseerisid nii Pou3f3 (Nakai et al., 2003) kui ka Sim1, millele järgnes Sim2 ja Gata3 ekspressioon pärast LOH ja distaalsete tuubulite täpsustamist (joonis 2C). Tfap2b, millest hiljuti teatati, et see on oluline distaalse nefroni arengu jaoks (Marneros, 2020), tuvastati ka LOH-s ja distaalsetes tuubulites (joonis S1E). Seega toimuvad ajalised nihked transkriptsioonifaktori ekspressioonides üksikutes nefroni segmentidesneerudküpsemine ja harude perifeersetes otstes olevad klastrid (klastrid 5, 6, 8, 17, 31 ja 37) esindavad iga liini kõige küpsemat etappi.

Arengusignaalide seisukohast tuvastati WNT signaaliraja aktiivsuse indikaator Axin2 peamiselt distaalsete tuubulite arengus, nagu varem teatatud (Jho et al., 2002). Fgf8 ja Etv4, an

FGF signaalimisaktiivsuse näitaja (Maoetal., 2009), väljendusid ka distaalsetes tuubulites, kuid piirdusid ebaküpses staadiumis. Seevastu Bmp7 (Oxburgh et al., 2005) ekspresseeriti distaalsetes tuubulites nii ebaküpses kui ka küpses staadiumis, samuti podotsüütides, samas kui Bmp4 (Miyazaki et al., 2000) tuvastati peamiselt proksimaalsetes tuubulites. Märkasime ka, et peamiste signalisatsiooniteede tegevus oli allapoole.

reguleeritakse küpsetes rakkudes enamikus nefroni segmentides. Näiteks Axin2 (WNT signaaliindikaator) ja Etv4 (FGF signaaliindikaator) puudusid küpsetes podotsüütides ning proksimaalsetes ja distaalsetes tuubulites (joonis 2D). Sama tendentsi täheldati Hey1 (Notch signalisatsiooniindikaator), samas kui Hes1 oli ainult podotsüütides ja proksimaalsetes tuubulites allareguleeritud (joonis 2E). BMP signaaliindikaator Id1 (Korchynskyi ja Ten Dijke, 2002; L? opez-Rovira et al., 2002) vähenes küpsetes podotsüütides ja distaalsetes tuubulites (joonis 2F). Seega täheldatakse selle ajal nefronisegmendi spetsiifilist arengusignaali aktiveerimist, millele järgneb allareguleerimineneerudküpsemine.

Arengufaasist sõltuvad geeniloendid üksikute rakuliinide jaoks

Meie scRNA-seq analüüs näitas, et UMAP-klastrid, mis väljendasid mõningaid kindlaksmääratud liiniga piiratud diferentseerumismarkereid, olid juba E15.5 juures (joonis 1B). Et tuvastada üksikute nefronsegmentide staadiumist sõltuvad geenid, võrreldi esmalt geeniekspressioonid E15.5 ja P0 vahel iga suguvõsa kõige küpsemates klastrites ning leidsime geenid, mis olid P0-ga võrreldes E15-ga oluliselt üles- või allareguleeritud. 5. Siiski leidsime, et need loendid sisaldasid rakulise stressiga seotud geene, nagu kuumašoki valgu geenid, Jun/Fos perekonna geenid ja Gadd45 geenid (Adam et al., 2017a), mida võivad esile kutsuda P0 jaoks kasutatavad karmimad rakkude dissotsiatsiooniprotsessidneerud. Because these genes were ubiquitously expressed, it was difficult to discriminate them from maturation-dependent genes that were ubiquitously expressed. Thus, we decided to select cell-type specific genes and picked up the upregulated or downregulated genes in the corresponding clusters between the two stages. Most of the upregulated genes at P0 showed consistent results in UMAP plots, while the downregulated genes showed less prominent differences between the two stages. In addition, the downregulated genes were detected in more immature cell clusters at P0, reflecting the repetitive differentiation processes from nephron progenitors. Therefore, we decided to focus on the upregulated genes (fold change, >2.5) ja kureeris iga kandidaatgeeni selle spatiotemporaalse ekspressiooni jaoks UMAP-i graafikute põhjal. Lõpuks valitud geenide viiuligraafikud näitasid nende staadiumist sõltuvaid väljendeid üksikute rakuliinide vanuses (joonis 3A, joonised S2, S3, S4A, tabel S1). Punktgraafikud kinnitasid nende rakutüübispetsiifilisi väljendeid (joonis 3B), kuigi paljusid proksimaalsete tuubulite S2 segmendi jaoks valitud geene väljendati ka S1 ja S3 segmentides. Need valitud geenide loendid sisaldasid 4. tüüpi kollageeni alfa3 ahel (Col4a3) ja semaforiin (Sema) 3g podotsüütide jaoks, Slc5a12 (laktaadi transporter) ja tsütokroom P450 perekond (Cyp) 27b1 (D-vitamiini alfa-hüdroksülaas) proksimaalsete tuubulite jaoks, Umod E ja Prostagland E. retseptor 3 (Ptger3) LOH jaoks, Aqp2 ja Aqp3 kogumiskanalite jaoks ning Lipokaliin2 (Lcn2) kusejuhade otste jaoks. Enamik geene oli juba E17.5 juures ülesreguleeritud

ja näitasid võrreldavaid ekspressioonitasemeid P0 omadega, mis viitab sellele, et E15.5 ja E17.5 vahel võib toimuda oluline küpsemine. Me tuvastasime distaalsete tuubulite jaoks ainult mõned geenid (tabel S1), kuna enamik selle rakuliini ülesreguleeritud geene ekspresseeriti ka kogumiskanalites. Kokkuvõttes arenemise scRNA-seq analüüsneerudmitmel küpsemise etapil võimaldas enamikus nefroni segmentides tuvastada etapist sõltuvaid ja liinispetsiifilisi geene.

Esindusgeenide etapist sõltuvate geeniekspressioonide histoloogiline valideerimine

Geeniloendite paikapidavuse kinnitamiseks histoloogilise uuringuga määrasime E15.5 ja P0 valitud geenide ekspressioonid.neerudtavapärase digoksigeniinipõhise in situ hübridisatsiooni või ülitundliku RNAskoobi tehnoloogia abil (Wang et al., 2012). Kuna in situ hübridisatsioon ja eriti RNAskoobi tehnoloogia hõlmab ulatuslikku signaali võimendamist, on ebatõenäoline, et tuvastatakse peeneid erinevusi geeniekspressiooni tasemetes. Seega valisime UMAP-diagrammides geenid, mis näitasid minimaalset ekspressiooni E15.5 juures ja piirdusid ühe liiniga P0 juures. Sellised geenid oleksid kasulikud ka küpsemisetappide kulutõhusaks hindamiseks histoloogiliste lõikude abil. Podotsüütides tuvastati kõik neli uuritud geeni (Col4a3, Sema3g, Htra1, Clic3) kergesti P0 juures ja nende ekspressioonitasemed E15.5 juures olid madalamad kui P0 juures (joonis 4A). ). Seevastu Nphs1 näitas võrreldavat ekspressiooni kahes etapis (joonis 4A). Proksimaalsetes tuubulites näitasid kolm geeni (Slc5a12, Cyp27b1, Kap) nõrku või minimaalseid signaale E15.5 ja tugevat ekspressiooni P0 juures (joonis 4B), samas kui Slc34a1 näitas mõlemas etapis võrreldavat ekspressiooni (joonis 4B). Kolme geeni etapist sõltuvad ekspressioonid valideeriti LOH-s (Umod, Ptger3, Car15), erinevalt Slc12a1 suhteliselt püsivast ekspressioonist (joonis 5A). Samuti teostasime kogumiskanalites kolme geeni (Aqp2, Cdkn2b, Lcn2) in situ hübridisatsiooni ja kinnitasime nende etapist sõltuvaid väljendeid (joonis 5B). Nende hulgas ekspresseeriti Aqp2 ja Cdkn2b kanalivarte kogumises, samas kui Lcn2 tuvastati kuseteedes. Inkontrast, Retand Wnt7b näitasid suhteliselt püsivaid ekspressioonitasemeid (joonis 5B). In situ hübridisatsiooniandmed olid kooskõlas UMAP-i graafikutega, toetades meie scRNA-seq andmete usaldusväärsust.

Esindusgeenide etapist sõltuvate geeniekspressioonide histoloogiline valideerimine

Geeniloendite paikapidavuse kinnitamiseks histoloogilise uuringuga määrasime E15.5 ja P0 valitud geenide ekspressioonid.neerudtavapärase digoksigeniinipõhise in situ hübridisatsiooni või ülitundliku RNAskoobi tehnoloogia abil (Wang et al., 2012). Kuna in situ hübridisatsioon ja eriti RNAskoobi tehnoloogia hõlmab ulatuslikku signaali võimendamist, on ebatõenäoline, et tuvastatakse peeneid erinevusi geeniekspressiooni tasemetes. Seega valisime UMAP-diagrammides geenid, mis näitasid minimaalset ekspressiooni E15.5 juures ja piirdusid ühe liiniga P0 juures. Sellised geenid oleksid kasulikud ka küpsemisetappide kuluefektiivseks hindamiseks histoloogiliste lõikude abil. Podotsüütides tuvastati kõik neli uuritud geeni (Col4a3, Sema3g, Htra1, Clic3) kergesti P0 juures ja nende ekspressioonitasemed E15.5 juures olid madalamad kui P0 juures (joonis 4A). ). Seevastu Nphs1 näitas võrreldavat ekspressiooni kahes etapis (joonis 4A). Proksimaalsetes tuubulites näitasid kolm geeni (Slc5a12, Cyp27b1, Kap) nõrku või minimaalseid signaale E15.5 ja tugevat ekspressiooni P0 juures (joonis 4B), samas kui Slc34a1 näitas mõlemas etapis võrreldavat ekspressiooni (joonis 4B). Kolme geeni etapist sõltuvad ekspressioonid valideeriti LOH-s (Umod, Ptger3, Car15), erinevalt Slc12a1 suhteliselt püsivast ekspressioonist (joonis 5A). Samuti teostasime kogumiskanalites kolme geeni (Aqp2, Cdkn2b, Lcn2) in situ hübridisatsiooni ja kinnitasime nende etapist sõltuvaid väljendeid (joonis 5B). Nende hulgas ekspresseeriti Aqp2 ja Cdkn2b kanalivarte kogumises, samas kui Lcn2 tuvastati kuseteedes. Inkontrast, Retand Wnt7b näitasid suhteliselt püsivaid ekspressioonitasemeid (joonis 5B). In situ hübridisatsiooniandmed olid kooskõlas UMAP-i graafikutega, toetades meie scRNA-seq andmete usaldusväärsust.

Siirdatud embrüonaalsed neerud näitavad küpsemist vastsündinu staadiumi lähedal

Et teha kindlaks, kas siirdatudneerudjärgides füsioloogilist küpsemisprotsessi, teostasime siirdamiskatseid embrüonaalse hiireganeeruddoonorkudedena. Kuna siirdamine

isoleeritud embrüonaalneneerudpõhjustas hüdronefroosi, mis tulenes tõenäoliselt kuseteede valest ühendusest (joonis S5A), kasutasime varem teatatud protokolli, mis potentsiaalselt säilitab puutumata uriinivoolu (Yokote et al., 2015). Selleks siirdasime E12.5neerudühendatud kloaagiga, põie eelkäijaga, täiskasvanud peremeeshiirte munandimanuse rasvkoesse (joonis 6A). Kui koristatakse 12 päeva pärast siirdamist, siisneerudsuurus oli suurenenud (3,29 ? 0,35 mm 2 vs. 0,23 ? 0.02 mm 2, n¼ 3, p < 0,05) ja põies tuvastati uriini (joonis 6A), mis viitab sellele, et uriin voolab läbineeru-põieühendus säilis. Histoloogiline analüüs näitas, et neeru medulla moodustati kortikomedullaarse mustriga (joonis 6A). Rakutüübispetsiifiliste markerite värvimine näitas, et LTL-proksimaalsete tuubulite, SLC12A1-LOH ja KRT8- kusejuhade pungade üldine jaotus oli säilinud (joonis 6B) ja et NPHS1-podotsüütidega glomerulid olid vaskulariseeritud PECAM1-spetsiifiliste S5B (F) endoteelirakkudega. , mida embrüonaalsete neerude in vitro kultiveerimisel täheldatakse harva (Halt et al., 2016). Järgmisena viisime läbi siirdatud embrüonaalsete scRNA-seq analüüsineerudja võrreldi andmeid embrüonaalsetest neerudest in vivo saadud andmetega. Siirdatud neerude UMAP-diagrammid näitasid sarnaseid kobarate mustreid vastsündinute neerude omadega in vivo (joonis 6C), kuid siirdatud neerudes puudusid nefroni eellasrakkude ja kusejuhade tippe esindavad klastrid (joonis 6C, joonised S5C ja D). Ehkki nefrogeense niši ootamatu ammendumise põhjus jääb teadmata, võib see seletada siirdatud neerude väiksemat suurust võrreldes neerudega in vivo, nagu arutame hilisemas osas. Sellegipoolest olid teised rakupopulatsioonid koondunud vastsündinute staadiumis neerudega sarnastesse mustritesse (joonis 6C). Enamiku küpsemisest sõltuvate geenide ekspressioonitasemed siirdatud neerude podotsüütides ja proksimaalsetes tuubulites olid võrreldavad P0 neerude ekspressioonitasemetega (joonis 6D, joonis S6, tabel S2). Kuid paljud geenid kogumiskanalites ekspresseerusid madalamal tasemel kui P{{10}} neerudes, sealhulgas Cdkn2b (joonis 6D, joonis S6, tabel S2). Seevastu Aqp2 ja Aqp3 ekspressioon püsis suhteliselt võrreldaval tasemel P0 neerude ekspressiooniga (joonis 6D). Lisaks jäid Wnt9b ja Hoxd3, mis olid in vivo P0 juures allareguleeritud, siirdatud neerudes kõrgel tasemel (joonis S4A). Seega olid siirdatud neerude kogumiskanalid tõenäoliselt ebaküpsemad kui neerud. P0. Sarnast tendentsi, ehkki vähemal määral, täheldati ka LOH puhul (joonis 6D, joonis S6). Need tulemused viitavad sellele, et küpsemine ei pruugi kõigis rakuliinides toimuda sünkroonselt.

AruteluElundite küpsemine on arengumentalbioloogia üks olulisemaid aspekte. Tüvirakubioloogias kasutatakse siirdamist sageli pluripotentsete tüvirakkudest pärinevate organoidide küpsemise esilekutsumiseks, sealhulgasneerudorganoidid. Küpsemisetappide täpne määramine on aga keeruline, kuna küpsemiseks puuduvad molekulaarsed koordinaadid. Seega viisime läbi hiire embrüonaalsete scRNA-seq analüüsineeruderinevatel arenguetappidel, mis võimaldas tuvastada geene, mis näitasid staadiumist sõltuvat ekspressiooni küpses embrüonaalsesneerud. Rakendades seda teavet siirdatud embrüonaalsete neerude scRNA-seq andmetele, avastasime lisaks, et siirdamise järgne küpsemisprotsess kulges vastsündinute staadiumi lähedal, kuid rakuliinide vahel mittesünkroonselt. Erinevalt hulgijärjestusest suutis scRNA-seq hinnata geeniekspressiooni iga rakuliini kõige küpsemates fraktsioonides, võimaldades seega täpset võrdlust vastavate alampopulatsioonidega nii arenevates kui ka siirdatud neerudes.neeruds. On tõestatud, et staadiumist sõltuvate ekspressioonide jaoks valitud geeniloendid toimivad molekulaarsete koordinaatidena üksikute liinide küpsemisetappide hindamiseks. ScRNA seq andmete lisamine sünnijärgsetes neerudes erinevates etappides ja täiskasvanud neerudes looks täiendavaid kasulikke ressursse küpsemise hindamiseks.

Et teha kindlaks, kas sarnaseid tulemusi on võimalik saavutada olemasolevate andmekogumite abil, analüüsisime uuesti avaldatud scRNA-seq andmeid E14.5 ja P1-s.neerud(Adam jt, 2017a; Magella jt, 2017). Kuid UMAP-i graafikud näitasid, et klastrid, mis esindavad enamiku P1 rakutüüpide küpseid populatsioone, puudusid E14.5 andmetes (joonised S7A ja B), mis takistas meil geeniekspressiooni võrdlemist

vastavad klastrid kahe etapi vahel. Ainsaks erandiks olid kusejuhade tipud. Ret þ klastrid tuvastati mõlemas etapis ja Lcn2 oli ülesreguleeritud P1 juures (joonis S7C), mis on kooskõlas meie tulemustega. Seega olid olemasolevad andmed piiratud kasutusega, rõhutades scRNA-seq andmete ja geeniloendite tähtsust käesolevas uuringus. Näitasime, et siirdatud podotsüüdid ja proksimaalsed tuubulidneerudküpsesid vastsündinute staadiumi lähedal, samas kui kogumiskanalid jäid suhteliselt ebaküpseks. Kogumiskanalite küpsemise halvenemise põhjused tuleb veel välja selgitada. Üheks võimalikuks põhjuseks võib olla uriinivoolust põhjustatud füüsilise jõu vähenemine, kuna kogumiskanalid asuvad kuseteedes kõige kaugemal allavoolu. Siirdasime embrüoneerudkloaagiga, eesmärgiga säilitada parem uriinivool võrreldes isoleeritud neerude tavapärase siirdamisega (joonis S5). Siiski on võimalik, et uriinivool oli nefroni segmentide alumise osa küpsemise soodustamiseks ebapiisav. Teise võimalusena võivad kogumiskanalid olla põiest tagasivoolu tõttu juba saanud mehhaanilisi kahjustusi, kuigi analüüsi ajal ei täheldatud nähtavat hüdroureetrit ega hüdroefroosi. Hilisem doonorilt saadud põie ühendamine peremehe kusejuhaga oli

Joon. 6. Siirdatud küpsemineneerudvastsündinute staadiumi lähedal. (A) E12.5 kogu paigaldusvaadeneerudkoos kloaagiga enne siirdamist (päev 0). Täielik vaade ja histoloogiline analüüs siirdatud neeru hematoksüliini ja eosiini värvimisega, kusjuures põit koguti 12. päeval pärast siirdamist. Punane nool: uriini olemasolu põies. Skaala riba: 500 μm. (B) Immunovärvimineneerud12. päeval pärast siirdamist proksimaalsete tuubulite (LTL: roheline), Henle silmuste (SLC12A1: punane) ja kogumiskanalite (KRT8: hall) markeritega. Skaalariba: 200 μm. (C) UMAP-diagrammid embrüonaalsete neerude kohta in vivo (E15.5 ja P0) ja siirdatud embrüonaalsete neerude kohta (12. päev pärast siirdamist). Nool: nefroni eellane (NP); nooleots: kusejuha ots (UB). POD: podotsüütide; PEC: glomerulaarne parietaalne epiteelirakk; DN: diferentseeriv nefroon; PT: proksimaalne tuubul; LOH: Henle silmus; DT: distaalne tuubul; CD: kogumiskanal; CD-IC: kogumiskanali interkaleeritud rakk; IC; interstitsiaalne rakk; EC: endoteelirakk; TÜ: kusejuha; BC: vererakk. (D) Siirdatud etapist sõltuvate geenide viiuligraafikudneerudvõrreldes embrüonaalsete neerudega in vivo (E15.5 ja P0).

teatati, et see pärsib hüdroonefroosi ja aitas kaasa edasisele arengule (Yokote et al., 2015), seega oleks informatiivne analüüsida meie küpsemismarkergeenide ekspressioone sellistes siirdamistes. Kuigi on vaja täiendavaid uuringuid, osutusid meie geeniloendid kasulikuks üksikute liinide küpsemise seisundi hindamisel arenemisel.neerudsamuti siirdatudneerud. Meie RNA-seq andmed on ka kasulikud koordinaadid küpsemise oleku hindamiseksneerudpluripotentsetest tüvirakkudest saadud organoidid. Praegused neeruorganoidid esindavad embrüonaalses staadiumis olevaid (Taguchi ja Nishinakamura, 2017; Takasato et al., 2015; Wu jt, 2018) ning haiguse modelleerimiseks ja lõpuks siirdatavate neerude genereerimiseks on vaja edasist küpsemist. Praegu on organoidide küpsemisetappide mõõtmiseks saadaval vähe meetodeid, välja arvatud morfoloogilised analüüsid. Seega on meie tulemused aluseks organoidi küpsemise molekulaarsele tuvastamisele. Kuigi tavapäraneneerudOrganoidid koosnevad peamiselt nefronitest (glomerulitest janeeru-tuubulid), teatasime hiljuti kõrgema järgu neerustruktuuride tekkest, mis koosnevad hargnevatest kuseteede pungadest koos nefronitega, mis on jaotunud kusejuhade otste ümber (Taguchi ja Nishinakamura, 2017). Selle saavutasime, kombineerides hiire ESC-st pärinevad nefroni eellasrakud ja kusejuhade pungad embrüonaalsete strooma eellasrakkudega ning teoreetiliselt peaks lähitulevikus olema võimalik luua organotüüpseidneerudstruktuurid ainult hiire ESC-dest ja lõpuks inimese iPSC-dest. Seega oleks järgmine samm organoidide siirdamine edasiseks küpsemiseks. Meie scRNA-seq andmed on kasulikud võrdlusvahendid siirdatud organoidide küpsemisetappide hindamiseks.

Nefrogeense niši ammendumine siirdatudneerudoli ootamatu. Kuigi see ei ole käesoleva küpsemisele keskenduva uuringu peamine ulatus, võib see ammendumine selgitada siirdatud neerude väiksemat suurust võrreldes neerudega in vivo. Nefroni eellased hiirtel tekitavad tekkivaid nefroneid kuni mitu päeva pärast sündi (Hartman et al., 2007; Rumballe et al., 2011; Volovelsky

et al., 2018) ja nefroni eellaste enneaegne ammendumine viib väiksema suurusega neerudeni (Kanda et al., 2014; Self et al., 2006). Jääb veel kindlaks teha, millised hooldustegurid siirdamisel puuduvadneerudja kas selle nähtuse peamine põhjus on nefroni eellasrakkude või kusejuhade otste kadumine. Nende mõistatuste lahendamine viib lõpuks siirdatavate kasvunineerudorganoidid kuni a

võrreldav suurusneerudin vivo. Kokkuvõttes oleme näidanud, et meie scRNA-seq andmed ja geeniloendid võivad olla molekulaarsed alused embrüonaalsete ja siirdatud neerude küpsemisetappide hindamiseks ning need oleksid rakendatavad iPSC-dest saadud neeruorganoidide suhtes. Kuigi me keskendusime käesolevas uuringus nefronite arengule ja küpsemisele, annavad meie scRNA-seq andmete põhjal üksikasjalikud analüüsid teiste liinide, näiteks strooma- ja endoteelirakkude kohta.neerudküpsemine.

materjalid ja meetodid

scRNA-seq analüüsidNeerud eraldati protokolliga, mida muudeti eelnevalt kirjeldatud meetodil (Tanigawa et al., 2016) ja kasutati scRNA-seq analüüside jaoks. E15.5 ja E17.5 analüüsideks kasutati C57BL/6N hiiri (CLEA Japan Inc.) ning Foxd1GFPCreER; tdTomato ja Tbx18MerCreMer: P0 analüüsideks kasutati tdTomato hiiri C57BL/6N ja ICR segatud geneetilisel taustal (Grisanti et al., 2013; Kobayashi et al., 2014). KuusneerudE15.5 juures seediti 10 min 0,25% trüpsiini/EDTA-s. E17.5 ja P0 emaneneerud were minced roughly with forceps, digested with dissociation buffer comprising 2 mg/ml collagenase (Sigma; Cat# 9407), 2.4 U/ml dispase (Gibco; Cat# 17105-041), 2 mM CaCl 2 (Wako; Cat# 031–00435), 50 μ g/ml DNase I (Sigma; Cat# 11284932001), and 10% fetal calf serum (FCS) (Sigma; Cat# 172012) in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Sigma; Cat# D5796) for 15 min at 37? C, washed with phosphate-buffered saline (PBS), and treated with 0.25% trypsin/EDTA for 10 min. Trypsin was inactivated by addition of DMEM/10%FCS containing50 μ g/mlDNaseI,andthecells werewashed with HEPES-buffered saline solution (Thermo; Cat# 14185-052) containing 2% FCS, 50 μ g/ml DNase I, 1 mM CaCl 2 , and 0.035% NaHCO 3 (Wako; Cat# 191–01305). Cells were resuspended in 0.04% BSA/PBS, filtered through a 40- μ m-pore strainer (Falcon; Cat# 352340), and evaluated for their cell number and viability (>90 protsenti), kasutades Countessi automaatset rakuloendurit (Thermo; Cat# C10227). Kokku 5000 dissotsieerunud rakku E15.5 ja E17.5 ning kaks proovi (5000 rakku proovi kohta) P0-st kanti Chromium Controllerile (10x Genomics) . Chromium Single Cell 3 0 Library & Gel Beads Kit v2 (10x Genomics) kasutati oligo-dT-praimitud cDNA raamatukogude loomiseks, mis seejärel sekveneeriti Illumina HiSeq 3000 abil (14 000 lugemist E15.5 jaoks; 7000 lugemist E17.5 puhul; 14 000 lugemist P0 puhul). Proovide Q30 aluse RNA näidud (Q-skoorid, mis näitavad järjestuse kvaliteeti) olid E15.5 puhul 86,2 protsenti, E17.5 puhul 63,8 protsenti ja P0 puhul 93,6 protsenti.

Toorjärjestuse andmeid töödeldi, kasutades Cell Rangeri (versioon 3.0.2; 10x Genomics) käsku Cell Ranger count, et luua iga geeni jaoks ainulaadsete molekulaarsete identifikaatorite (UMI-de) loendustabelid. raku kohta. Esiteks integreerisime kaks P0 näidist, kasutades Cell Rangeri käsku cell ranger aggr, et luua üks kombineeritud P0 valim. Sel hetkel saime E15.5, E17.5 ja P0 proovide jaoks 4158, 5551 ja 10810 rakku söötme näiduga vastavalt 4493, 2360 ja 2467 geeni raku kohta. Need kolm individuaalselt loodud andmekogumit integreeriti käsku cell ranger aggr abil. Kõik järgnevad analüüsid viidi läbi R statistilises programmeerimiskeeles (R Core Team, 2018). Seurati paketti (versioon 3.1.1) kasutati analüüsideks, sealhulgas kvaliteedikontrolliks, andmete normaliseerimiseks, skaleerimiseks ja visualiseerimiseks (Butler et al., 2018) (Stuart et al., 2019a). Kvaliteedikontrolliks rakud, mis ekspresseerisid<200 genes,="">8000 genes (possibly representing doublets), or >20 protsenti mitokondriaalsetest geenidest filtreeriti välja. Lõplik andmestik sisaldas vastavalt 20 672 geeni ning 3 441, 4 592 ja 8161 rakku E15.5, E17.5 ja P0 proovides (kokku: 16 194 rakku). Mõõtmete vähendamiseks kasutati põhikomponendi analüüsi, mille mõõtme väärtus oli 74, mis määrati funktsiooniga JackStrawPlot (Chung ja Storey, 2015). Funktsioon FindVariableFeatures valis välja 2000 parimat väga varieeruvat geeni ja neid kasutati klastrite moodustamiseks koos mõõtmeteabega. Klastrite segmenteerimine viidi läbi, kasutades eraldusvõime väärtust 2,4. Käsk FindClusters genereeris kokku 45 klastrit, mida oli lihtne eristada klastrispetsiifiliste markergeenidega, mis saadi Seurat-paketi funktsiooni FindMarkers abil. Klaster26 koosnes tõenäoliselt surevatest rakkudest, mis põgenesid filtreerimisparameetrite eest, kuna sellel ei olnud spetsiifilisi markergeene, madalaid mitokondriaalseid geene ja suhteliselt väike arv funktsioone. UMAP-i (Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction) graafikud genereeriti paketi uwot abil (Becht et al., 2019). Saadud UMAP-koordinaadid, Seurat' klastri koordinaadid ja klastripõhised markerid eksporditi CSV-failidena kinnitusanalüüsiks, kasutades tarkvara Loupe Cell Browser (10x Genomics). scRNA-seq andmed deponeeriti riiklikusse biotehnoloogia teabekeskusesse geeniekspressiooni omnibus (GSE149134).

Arengufaasist sõltuvate geenikandidaatide valik

Arengufaasist sõltuvate geenikandidaatide valimiseks igas klastris kasutasime funktsiooni FindMarkers, et leida geenid, mis olid P0-ga võrreldes E15.5-ga ülesreguleeritud (nt klastri võrdlus

8 at P0 and cluster 8 at E15.5 for podocytes). Subsequently, we utilized the AverageExpression function to add the average gene expression data for each cluster at each stage for stage-dependent comparisons (log-fold change >1 ja p-väärtus<0.05). to="" determine="" segment-specific="" genes,="" we="" compared="" the="" target="" cluster="" with="" all="" other="" clusters="" at="" p0="" and="" selected="" the="" genes="" with="" low="" p-values="" (p="" <="" 0.05)="" and="" low="" expression="" rates="" in="" other="" clusters="" (pct2=""><0.11). after="" selecting="" the="" overlapping="" genes,="" we="" verified="" them="" in="" umap="" plots="" to="" finalize="" the="" lineage-specific="" stage-dependent="">

Immunohistokeemiline analüüsParafiini lõigud allutati antigeeni otsimisele tsitraatpuhvris, pesti kolm korda PBS-ga ja blokeeriti inkubeerimisega 1% BSA-ga PBS-is 1 tund toatemperatuuril. Seejärel inkubeeriti sektsioone üleöö primaarsete antikehadega temperatuuril 4 °C. C, millele järgneb inkubeerimine Alexa Fluor värvainetega konjugeeritud sekundaarsete antikehadega 90 minutit toatemperatuuril. Tuumad värviti 4,6-diamidino-2-fenüülindooliga (Roche; kataloogi nr 10236276001). Kasutati järgmisi primaarseid antikehi: biotinüülitud LTL (Vector Laboratories; B-1325), küüliku anti-SLC12A1 (StressMarq Bioscience; SPC-401D), roti anti-KRT8 (Develop-mental Studies Hybridoma Bank), Iowa Ülikool; Troma-I), merisea anti-NPHS1 (Progen; GP-N2); ja küüliku anti-CD31 (Abcam; ab28364). Fluorestsentspildid jäädvustati LSM780 konfokaalse mikroskoobiga (Carl Zeiss) või FV3000 konfokaalse mikroskoobiga (Olympus).

In situ hübridisatsioon10 protsendi formaliiniga fikseeritud parafiinilõikude RNAskoobi analüüs viidi läbi, kasutades RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 (ADC; kataloogi nr 323100). Signaali võimendamine viidi läbi TSA pluss fluorofooridega (Thermo Fisher Scientific). RNAscope'i sondide üksikasjad on esitatud tabelis S3. Kap digoksigeniinil põhinev in situ hübridisatsioon viidi läbi vastavalt kirjeldusele (Kaku et al., 2013), kasutades automatiseeritud Discovery Systemi (Roche) vastavalt tootja protokollidele. Kap sond klooniti PCR-ga, kasutades spetsiifilisi praimereid (tabel S3), ja märgistati digoksigeniiniga, kasutades RNA polümeraasi. Iga sondi jaoks uuriti igas embrüonaalses staadiumis kahte kuni kolme proovi ja need näitasid järjekindlaid tulemusi.

Hiire embrüonaalsete neerude siirdamineC57BL/6N tiined emased hiired (E12.5) ja täiskasvanud isased hiired (8–12 nädalat) osteti ettevõttelt CLEA Japan Inc. ja neid hoiti spetsiifilises patogeenivabas loomarajatis. Täiskasvanud peremeeshiired tuimastati, manustades peritoneaalselt tavalist soolalahust, mis sisaldas 0,75 mg/kg medetomidiini, 4{{0}} mg/kg midasolaami ja 50 mg midasolaami. /kg butorfanooli. Hiire embrüonaalsed neerud kloaagiga E12.5 juures siirdati peremeeshiirte munandimanuse rasvkoesse (Yokote et al., 2015). Pärast operatsiooni manustati atipamesooli anesteetikumi antagonistina. Siirdatud embrüonaalsed neerud koguti 12 päeva pärast siirdamist. scRNA-seq analüüsi jaoks eraldati neerud sarnaselt P0 neerudega. Kõik loomkatsed viidi läbi vastavalt meie institutsionaalsetele juhistele ja need kiitis heaks Kumamoto ülikooli eetikakomitee (#A2019-113).

Avalikult kättesaadavate scRNA-seq andmete uuesti analüüsE14.5 hiire embrüonaalse scRNA-seq andmedneerudja P1neerud(Adam et al., 2017b; Magella et al., 2017) laaditi alla Gene Expression Omnibusist (vastavalt juurdepääsunumbrid, GSE94333 ja GSE104396). Kõik järgnevad nende andmete analüüsid viidi läbi statistilises programmeerimiskeeles R (R Core Team, 2018) ja analüüsideks, sealhulgas kvaliteedikontrolliks, andmete normaliseerimiseks, skaleerimiseks ja visualiseerimiseks, kasutati Seurat paketti (versioon 3.2.2). jaotises 4.1.