Integratiivne omika analüüs selgitab välja mikrovaskulaarse põletikuga seotud teed neerude allografti biopsiates
Mar 24, 2022
Tahkete elundite siirdamisel on mikroRNA-d (miRNA-d) kujunenud võtmeisikuteks allograftrakkude funktsiooni reguleerimisel vastuseks vigastustele. Et saada ülevaade miRNA-de rollist antikehade poolt vahendatud äratõukereaktsioonis, mis on mikrovaskulaarse põletikuga histoloogiliselt määratletud hülgamisfenotüüp,neerud allotransplantaadi biopsiad allutati miRNA, aga ka messenger RNA (mRNA) profiilile. Kasutades ainulaadset mitmeastmelist BIOMARGIN-uuringule spetsiifilist valikuprotsessi (avastuskohort, N=86; valikukohort, N=99; valideerimiskohort, N=298), tuvastati järjepidevalt kuus erinevalt ekspresseeritud miRNA-d: miR-139-5p (alla) ja miR-142-3p/150-5p/155-5p/{ {7}}p/223-3p (üles). Nende ekspressioonitase korreleerus järk-järgult mikrovaskulaarse põletiku intensiivsusega. MiRNA-de sihtgeenide rakuspetsiifilisust uuriti, integreerides nende in vivo mRNA sihtmärgid üherakulise RNA sekveneerimisega sõltumatust allografti biopsia kohordist. Endoteeli päritolu miR-139-5p ekspressioon korreleerus negatiivselt MHC-ga seotud geenide ekspressiooniga. Vastupidi, epiteeli päritolu miR-222-3p üleekspressioon oli tugevalt seotud neeru elektrolüütide homöostaasi halvenemise ja immuunsüsteemiga seotud radade allasurumisega. Immuunrakkudes reguleeris miR-150-5p NF-kB aktivatsiooni T-lümfotsüütides, samas kui miR-155-5p reguleeris mRNA splaissimist antigeeni esitlevates rakkudes. Kokkuvõttes võimaldas integreeritud oomika meil lahti harutada uusi mikrovaskulaarse põletikuga seotud teid ja oletada, et metaboolsed muutused tubulaarsetes epiteelirakkudes tekivad antikehade poolt vahendatud äratõukereaktsiooni tagajärjel väljaspool lähedal asuvat endoteeli sektsiooni.
Märksõnad:neerusiirdamine, mikroRNA, multiomika, mikrovaskulaarne põletik, antikehade poolt vahendatud äratõukereaktsioon
CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST
SISSEJUHATUSsisseneeru siirdamine(KT) jagatakse alloimmuunkahjustus tavaliselt kahte tüüpi allotransplantaadi äratõukereaktsiooniks vastavalt immuunsüsteemi infiltratsiooni ruumilisele jaotusele ja teabele doonori-spetsiifiliste HLA-vastaste antikehade olemasolu või puudumise kohta. Diagnoos põhineb allografti biopsial ja histoloogiliste kahjustuste liigitamisel vastavalt Banffi rahvusvahelisele konsensuse klassifikatsioonile (1). Tubuliit ("t" kahjustus) ja interstitsiaalne põletik ("I" kahjustus) on T-rakkude poolt vahendatud äratõukereaktsiooni (TCMR) iseloomulikud histoloogilised tunnused ja need on seotud otsese tsütotoksilisusega tubulointerstitsiaalsesse sektsiooni. Antikehade vahendatud äratõukereaktsioon (ABMR) on kõige sagedamini seotud ringlevate HLA-vastaste antikehadega, mille põletik on suunatud mikrovaskulaarsele sektsioonile. Aktiivsed ABMR-i histoloogilised kahjustused hõlmavad mononukleaarsete rakkude esinemist glomerulaarsetes kapillaarides ("g" kahjustus) ja peritubulaarsetes kapillaarides ("ptc" kahjustus), mida koos nimetatakse "mikrovaskulaarseks põletikuks" (MVI). Kroonilise aktiivse ABMR-i korral lisanduvad nendele ägedatele kahjustustele kroonilised koekahjustused, nagu siirdatud glomerulopaatia või arteriaalne intimafibroos (1). Kasutades praegusi T'-rakkudele suunatud immunosupressiivseid aineid, arvatakse, et TCMR-il on piiratud prognostiline mõju, samas kui ABMR on transplantaadi ebaõnnestumise peamine põhjus, mis on seotud tõhusate ravimeetodite puudumisega (2).
MVI ja ABMR-i jaoks paremate ravimeetodite leidmiseks on vaja paremat ülevaadet nende vigastusprotsesside aluseks olevatest bioloogilistest mehhanismidest. Suure läbilaskevõimega omikatehnoloogiad näivad selleks otstarbeks sobivat, kuna võimaldavad täpselt ja samaaegselt uurida tuhandeid geene, valke ja metaboliite (3). Kogu transkriptsiooniline ülekuulamineneerudallografti biopsiad on näidanud sügavaid mRNA geeniekspressiooni muutusi vigastatud rakkudes või infiltreeruvates rakupopulatsioonides ABMR-i ajal (4). Vahepeal on mikroRNA-d (miRNA-d) tõusnud rakkude metabolismi võtmeisikuteks, reguleerides transkriptsioonijärgsel tasemel messenger-RNA-d (mRNA). Tegelikult muutsid miRNA-d meie arusaama proliferatsiooni, apoptoosi, diferentseerumise ja arenguga seotud keha füsioloogiliste protsesside peenhäälestusest (5). Pole üllatav, et düsreguleeritud miRNA ekspressioon põhjustab paljude patoloogiate, sealhulgasneeruhaigus(6). Kuna miRNA ekspressiooniprofiilid erinevad haigete ja tervete seisundite vahel, on paljudes uuringutes analüüsitud miRNA-sid kas üksi või koos teiste traditsioonilisemate markeritega, mitte ainult haiguse diagnoosimiseks ja haiguse progresseerumise prognoosimiseks, vaid ka potentsiaalsete ravirakenduste kavandamiseks (7).
Tahkete elundite siirdamise kontekstis võivad miRNA-d olla seotud äratõukereaktsiooniga nende rolli kaudu immuunrakkude funktsiooni reguleerimises ja allograftis elavate rakkude vastuses vigastustele (6, 8). Mitmetes uuringutes on uuritud allotransplantaadi miRNA-sid biomarkerite ja/või efektoritena TCMR-i seadistustes (8, 9), kuid ükski pole seni keskendunud MVI-le ja ABMR-ile. Selles uuringus püüdsime integreerida erinevaid omika tasemeid.neerudallografti biopsiaid, et saada ülevaade miRNA-de rollist selles kahjulikus äratõukereaktsiooni fenotüübis.
MATERJALID JA MEETODID Uuringu kavandamineSee uuring on osa FP7-rahastatud BIOMAmarkersistNeerudGraft Injuries uurimisprogramm (BIOMARGIN, https://cordis.europa.eu/project/id/305499, ClinicalTrials.goy, number NCT02832661), mida juhib Euroopa uurimiskonsortsium, mis otsib allografti immuunkahjustuste biomarkereidneeru siirdamineretsipiendid, millel on diagnostiline ja/või prognostiline väärtus. BIOMARGIN on mitmekeskuseline, perspektiivne, mitmefaasiline uuring, mis viiakse läbi neljalneeru siirdaminekeskused Euroopas (Neckeri haigla, Pariis, Prantsusmaa; Ülikooli haiglad, Leuven, Belgia; Hannoveri meditsiinikool, Hannover, Saksamaa; ja ülikoolihaigla, Limoges, Prantsusmaa). Proove koguti sõeluuringu ja näidustuste biopsiate ajal ajavahemikus aprill 2013 kuni juuni 2015 (joonis IA). Kõik siirdamised viidi läbi negatiivse komplemendist sõltuva tsütotoksilisuse ristsobivusega. Nendes neljas kliinilises keskuses tehti lisaks näidustuste biopsiatele ka protokolli biopsiad 3, 12 ja mõnikord 24 kuud pärast siirdamist vastavalt kohaliku keskuse praktikale. Iga koha institutsionaalne ülevaatenõukogu kiitis uuringu heaks ja kõik patsiendid andsid kirjaliku teadliku nõusoleku.
Uurige kohorteUuring jagati kolme faasi (joonis 1A). Esimeses juhtumikontrolli avastamise faasis kasutati N=88 biopsiaproovi globaalseks miRNA ekspressioonianalüüsiks (N=754 miRNA-d, välja arvatud potentsiaalsed normaliseerivad miRNA-d). . Valisime proovid kättesaadavuse ja histoloogiliste kriteeriumide alusel (välja arvatud glomerulonefriidi või polüoomiviirusega seotud nefropaatia diagnoosiga ja ebaselge diagnoosiga juhud). Kohalike biopsia näitude põhjal tehti esimene valik, mida täpsustas tsentraalse lugemise abil algsest keskusest sõltumatu patoloogide rühm. Statistilist analüüsi (vt miRNA valik) kasutati histoloogiliste fenotüüpide vahel kõige erinevamalt ekspresseeritud miRNA-de laiendatud loendi valimiseks, mis seejärel kvantifitseeriti teises faasis.
Sarnast juhtumikontrolli uuringu ülesehitust kasutati ka teises (valiku)faasis, kus N=99 biopsiaprooviga viidi läbi suunatud miRNA ekspressioonianalüüs (N=143). Sama statistilist torujuhet kasutati veelgi piiratuma miRNA-de loendi valimiseks, mida seejärel 3. faasis kvantifitseerida. Lõpuks, kolmandas (valideerimis) kohordis koguti kõik proovid, mis koguti perspektiivselt ja järjestikku vastavalt BIOMARGIN-protokollile ajavahemikul 24. juunist 2014 kuni 2. juulini 2015 ning piisava kogusega.neerudallografti biopsia kvaliteeti hinnati teise selektsioonifaasi tulemusena valitud 38 miRNA jaoks. Selles reaalses elus aset leidvas kohordis ei tehtud valikut histoloogia, demograafia, aja ega muude tegurite alusel, välja arvatud proovi saadavus ja kvaliteedikontrolli kriteeriumid (biopsia ja RNA saagise piisavus).
miRNA valikR(R Core Team(10) versioonis 1.0.44, biosignaali R paketi (1l) laiendusena töötati välja jõuline statistiline konveier. Lühidalt, avastamisfaasis viisime läbi funktsioonide valikustrateegia, mis hõlmas ühe- ja mitmemõõtmelisi lähenemisviise. Ühemõõtmeliseks valikuks kasutasime mitteparameetrilist testi (Wilcoxon-Mann-Whitney test) ja parameetrilist testi (õpilase t-test) ning Discovery kohorti (BIOS-03-0023, BIOS-06-0238). Iga miRNA transkripti ennustusskoorid igas mitme muutujaga mudelis integreeriti, et saada "mitme muutujaga skoor". Kombineerides nende ühe- ja mitmemõõtmeliste analüüside tulemusi, saime järjestada ja valida miRNA kandidaatide alamhulga, mis oleks osa laiendatud loendist, mida järgmises etapis kvantifitseeritakse.Selle posthoc analüüsi jaoks, mis keskendus VMI radadele, võrreldi iga miRNA keskmine normaliseeritud ekspressioon juhtumite ja kontrollide vahel, kasutades Wilcoxoni testi kõigis kolmes kohordis. Kontrollisime mitut testimist, kasutades Benjamini & Hochbergi valetuvastussageduse (FDR) meetodit.
Kliiniline patoloogiline hinnangIndividuaalseid histoloogiliste kahjustuste skoore hinnati poolkvantitatiivselt vastavalt Banff 2019 kriteeriumidele (16). Terminit "mikrovaskulaarne põletik" (MVI) kasutati glomeruliidi (g) ja/või peritubulaarse kapillaariidi (ptc) kombinatsiooni mis tahes astme kohta. Kõik ABMR-i juhtumid vastasid Banf 2015 või Banff 2017 klassifikatsiooni kahele esimesele kriteeriumile (histoloogiline). tõendid ägeda koekahjustuse kohta ja tõendid praeguse / hiljutise antikehade interaktsiooni kohta vaskulaarse endoteeliga), kuid mitte kõik ei vastanud kolmandale kriteeriumile [doonorispetsiifiliste antikehade (DSA) ja/või CAd värvimise seroloogilised tõendid]. Transplantatsioonijärgsed DSA-d määrati vastavalt kohaliku keskuse praktikale, kusjuures DSA positiivsus määratleti tuvastatavate doonori-spetsiifiliste seerumi anti-HLA antikehadena keskmise fluorestsentsi intensiivsuse (MFI) väärtusega 500 biopsia ajal või mis tahes ajal enne seda.
RNA ekstraheerimine biopsiaproovidest mRNA ja miRNA profileerimiseksMõlemast võeti kahe nõela südamikudneerudallografti biopsia. Ühte kasutati tavapäraseks histoloogiliseks klassifitseerimiseks ja teisest vähemalt pool säilitati kohe Allprotecti koereagendis (Qiagen Benelux BV, Venlo, Holland). Allprotecti tuube hoiti temperatuuril 4 °C (minimaalselt 24 tundi kuni maksimaalselt 72 tundi). ja säilitati seejärel -20 kraadi juures kuni RNA ekstraheerimiseni. Kogu RNA eraldatineerudallotransplantaadi biopsiaproovid, kasutades Allprep DNA/RNA/miRNA universaalset komplekti (Qiagen Benelux BV) QIAcube instrumendil (Qiagen Benelux BV). Eraldatud RNA kogus (neeldumine lainepikkusel 26{20}}) ja puhtus (neeldumise suhe lainepikkustel 230,260 ja 280 nm) mõõdeti spektrofotomeetriga NanoDrop ND-1000 (Thermo). Fisher Scientific/Life Technologies Europe BV, Gent, Belgia). RNA terviklikkuse numbrit (RIN) hinnati Eukaryote nano/pico RNA komplektiga (Agilent Technologies Belgium NV, Diegem, Belgia) seadmel Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies BelgiumNV). Kvaliteedikontrolli indeksid ei erinenud oluliselt VMI ja No vahel. MVI-rühmad [RIN (keskmine ± SD): 5,6 ± 1,96 vs 5,4 ± 1,97, P=0,66; 260/280 suhe (keskmine ± SD): 1,87 ± 0,06 vs 1,87 ± 0,1 l, P{{26 }}.40]. Madala RIN-ga RNA proovide jaoks<6.5), we="" excluded="" samples="" with="" a="" 260/280=""><1.6. the="" extracted="" rna="" was="" subsequently="" split="" and="" stored="" at="" -80℃℃.half="" of="" the="" rna="" extract="" was="" used="" for="" mirna="" profiling="" and="" the="" other="" half="" for="" mrna="" transcriptomic="" analysis.="" the="" associated="" data="" are="" available="" from="" the="" gene="" expression="">
CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEEREDIALÜÜSI
miRNA profileerimineSpecific reverse transcription of 150ngof total RNA was performed using Megaplex"RT Primers Human Pool A v2.1(Step 1)or Custom RT Primers Human Pool (Step 2 and 3)(Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, France), on a Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). No complementary(c)DNA preamplification was required. miRNA expression was assessed by qPCR, using TaqManArray Cards (Applied Biosystems", Thermo Fisher Scientific), where the primers and probe of each miRNA were spottedanddried in duplicate wells of a microfluidic card. We used TaqMan"Array Human MicroRNA A +B Card Sets v3.0 for the discovery cohort(a two-card set enabling quantitation of 754 unselected human miRNAs)and Custom TaqManArray MicroRNA Cards for the selection and validation cohorts. Data analysis was performed by using Expression Suite software version 1.0.3. Assays with a cycle threshold(CT) values >35 loeti väljendamata. RNU44 ja RNU48 ekspressioonid olid kõigis proovides ühtlased, keskmine (RNU44 pluss RNU48) variatsioonikoefitsient oli massiivikaardil A 3,73 protsenti ja massiivikaardil B 3,79 protsenti ning neid kasutati majapidamisgeenidena andmete normaliseerimiseks kõigis alauuringutes.
mRNA transkriptoomiline analüüsTranskriptoomiline analüüs viidi läbi mikrokiibi abil, nagu juba kirjeldatud (17). Lühidalt, biopsiaproovidest ekstraheeritud kogu RNA esmalt amplifitseeriti ja biotinüüliti komplementaarseks RNA-ks (cRNA), kasutades GeneChip 39 IVT PLUS reaktiivikomplekti (Affymetrix) ja hübridiseeriti Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2-ga.0 Arrays( Affymetrix), mis koosnes 54 675 sondikomplektist, mis hõlmasid kogu genoomi. Kasutasime tugevat mitmekiibilist (RMA) normaliseerimist. Iga mRNA keskmine normaliseeritud ekspressioon võrreldi juhtude ja kontrollide vahel, kasutades Wilcoxoni testi. Kontrollisime mitmekordse testimise tõttu alfariski inflatsiooni, rakendades Benjamini & Hochbergi valede avastamise määra (FDR) meetodit. Mikrokiibi andmeid käsitleti vastavalt juhistele Minimaalinformatsioon Microarray Eksperimendi kohta.
In Silico analüüsidTranskriptoomiliste andmete diferentsiaalanalüüsiks kasutati multiomikakatsete bioloogilise tõlgendamise (BIOMEX) tarkvara, kasutades Ensembl ID annotatsiooni (18). Valitud miRNA-de poolt reguleeritud geenikomplektide määramiseks kasutati leidlikkuse raja analüüsi (IPA, Build: 478438M sisuversioon: 44691306, Qiagen) ja OMICSnet (19). OMICSneti kasutati geeniontoloogia analüüsi tegemiseks Reactome raja andmebaasiga, kasutades kogu rada (20). Geenivõrkude ehitamine oli täielikult järelevalveta ja tugines iga üksiku geeni teatatud molekulaarsete interaktsioonide arvule kõigi teiste võrgu geenidega. Suurima interaktsioonide arvuga geenid paigutati automaatselt võrgu keskele, samas kui väiksema interaktsioonide arvuga geenid levisid perifeeriasse. Valitud miRNA-de rakulist päritolu uuriti projekti Fantom5 (21) abil, mis annab inimese rakkudes ja kudedes geeniekspressiooni analüüsi. MiRNA ekspressioonianalüüsi jaoks kaalusime kõikineerud-seotud struktuurrakud ja kõik ringlevad vereloomerakud, ilma edasise selektsioonita.
Üherakuline RNA sekveneerimise andmete analüüsKasutati varem avaldatud inimese üherakulise RNA sekveneerimise (siRNA-seq) andmeid kahest ABMR-i biopsiast ja neljast tervest viitest, mis vastasid siirdamise jälgimise biopsiatele. Seotud töötlemata loendid või maatriksid laaditi alla GEO-st (GSE145927, https://www.ncbi.nlm. nihgov/geo)(22) jaNeerTäppismeditsiini projekt (KPMP, https://atlas.kpmp.org/repository). Proovi kohta genereeritud töötlemata geeniekspressiooni maatriksid liideti ja analüüsiti Seurat V4 paketi abil (23). Seurat' objektide loomiseks ja filtreerimiseks rakendatud parameetrid olid järgmised: rakkude kaasamine, mis ekspresseerivad 500 kuni 10 000 tuvastatud geeni ja vähem kui 25 protsenti mitokondriaalseid transkripte. Pärast filtreerimist integreeriti kõik objektid, kasutades SCTransformi integreerimise töövoogu Seurat'is (24). Lühidalt, 3000 funktsiooni kasutati integreerimiseks, kasutades funktsiooni PrepSCTIntegration, ja funktsiooni FindIntegrationAnchors kasutati partiiefekti piiramiseks. Täielik Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) andmekogum loodi funktsiooni DimPlot ja 16 peamise komponendi abil. Klastrid ehitati 0,6 eraldusvõimega funktsioonide FindNeighbors ja FindClusters abil. Klastrite tuvastamine viidi läbi funktsiooni FeaturePlot abil, hinnates igas klastris konkreetsete markerite väljendust. Punktgraafikud genereeriti, kasutades graafikufunktsioone DotPlot ja FeaturePlot, kusjuures sisendandmetena kasutati normaliseeritud loendusi RNA testis.
CISTANCHE PARANDAB NEeru-/NEERUNEKTSIOONI
Statistiline analüüsPatsiendi ja doonori omadusi kirjeldati kategooriliste muutujate numbrite, protsentide ja sagedustega. Esitasime pidevad muutujad, kasutades kallutatud jaotusega muutujate keskmisi ja standardhälbeid (SD), kui need on normaalselt jaotunud, mediaane ja interkvartiilseid vahemikke (IQR). Võrdlesime nende omadusi, kasutades vajaduse korral Fisheri või Wilcoxoni testi. Me kasutasime Kruskal-Wallise testi, et võrrelda keskmise miRNA ekspressiooni vastavalt MVI intensiivsusele, ja Spearmani testi korrelatsioonianalüüsiks. P-väärtuste statistiline olulisus oli väiksem kui 0.05. Statistiliseks analüüsiks ja andmete esitamiseks kasutasime GraphPad Prismi (versioon 8; GraphPad Software, San Diego, CA) ja RStudiot (versioon 4.{14}}.3). Kasutati järgmisi R-pakette: heatmap3 (heatmap3_1.1.9) heatmap analüüside jaoks, fmsb(fmsb_0.7.0) ja skaalade (skaalad_1.1.1) paketid radarigraafikute jaoks, ggplot2 (ggplot2_3.3.5) tulpdiagrammide jaoks ja complot(corrplot_0.90) korrelatsioonimaatriksi analüüsi jaoks.
TULEMUSED
MVI-ga seotud miRNA-de mitmeastmeline tuvastamineBetween April 2013 and July 2015,646 patients enrolled in the BIOMARGIN study provided 716 indication or surveillance biopsies. Inadequate biopsies (N=49), biopsies with no paired sample for research use(N=135)or samples not passing molecular biology QC(N=49) were excluded, leaving 483 samples from 441 individuals available for this study (Figure 1A). Baseline and clinical characteristics of the study groups are provided in Supplementary Tables S1-3, and the histological characteristics of the biopsies are provided in Supplementary Tables S4-6. In the discovery cohort, a total of 27 patients met the MVI composite endpoint(MVI+), defined as clinical ABMR diagnosis and/or any level of MVI(g and/or ptc>0). Ülejäänud 59 patsienti (MVI-) esitasid erinevaid diagnoose, mis hõlmasid T-rakkude poolt vahendatud äratõukereaktsiooni (TCMR, N=8), interstitsiaalset fibroosi ja tubulaarset atroofiat (IFIA,N=20) ning normaalseid biopsiaid (N{{6}). }}), butno MVI. 754 miRNA kandidaadist ekspresseeriti 18 miRNA-d erinevalt MVI pluss ja MVI-rühmade vahel (joonis 1B). Valikukohordis kvantifitseeriti 99 proovis piiratud nimekiri 143 miRNA-st. Selles valikukohordis ekspresseeriti 14 miRNA-d erinevalt (N=28) ja ilma (N=71)ABMR-i juhtumite vahel (joonis 1C). Lõpuks määrati suurimas läbilõikelises kohordis 38 miRNA-d 298 proovis, millest 12 miRNA-d ekspresseeriti erinevalt ABMR(N=29) ja mitte ABMR (N=269) biopsiate vahel (joonis 1D ).
6 MVI-ga seotud MiRNA järjepidev identifitseerimine ja korrelatsioon histoloogiagaJärgmisena lõikusime 3 erinevalt ekspresseeritud miRNA-de loendit ja tuvastasime 6 miRNA-d, mis olid järjekindlalt seotud MVI või ABMR-iga kolmes sõltumatus kohordis (joonis 2A).miR-142-3p,miR-150-5p,miR -155-5p, miR-222-3p ja miR-223-3p olid MVI/ABMR-is üleekspresseeritud, samas kui miR-139-5p ekspressioon vähenes. Radari graafikud (joonis 2B) näitavad iga etapi diferentsiaalset ekspressiooni 6 miRNA juhtumi ja kontrolli vahel ning toetavad miRNA profiilide tugevust kolmes sõltumatus kohordis. Järgmisena uurisime, kuidas 6 miRNA ekspressioon on seotud üksikute histoloogiliste kahjustustega kõigis 483 allografti biopsias koos. Viie ülesreguleeritud miRNA ekspressioon suurenes järk-järgult koos MVI kahjustuste intensiivsusega, samas kui miR-139-5p ekspressioon oli negatiivses korrelatsioonis (joonis 2C). MiR-139-5p/142-3p/ 150-5p/155-5p/223-3p ei olnud mitte ainult tugevalt seotud ABMR-iga seotud tunnustega (g, ptc, C4d ladestumine), vaid ka TCMR-iga seotud kahjustustega (i, t ) ja IFTA kahjustused (ct, ci), mis viitab nende osalemisele tavalistes, mitte-ABMR-spetsiifilistes põletikulistes ja armistuvates protsessides. Teise võimalusena võib kahjustuste vahel olla oma olemuselt teatud sisemine kollineaarsus, mille tulemuseks on meie võimetus tuvastada ühe kahjustuse tegelikku spetsiifilisust. MiR-222-3p ei olnud korrelatsioonis TCMR või IFTA histoloogiliste kahjustustega (joonis 2D).
Multi-Omicsi integreerimine: mRNA-miRNA interplay MV-sJärgmisena hindasime varem avaldatud avastuskomplektis (25) erinevalt ekspresseeritud geene MVI pluss ja MVI-juhtude vahel. 54 675 sondist tuvastati MVI pluss ja MVI- vahel kokku 2755 erinevalt ekspresseeritud geeni (DEG).
rühmad, mis sisaldavad 1085 allareguleeritud ja 1670 ülesreguleeritud geeni (joonis 3A). MVI pluss proovides olid kõige erinevamalt ekspresseeritud mRNA-d CXCL9 ja CXCL10, mis on kooskõlas varasemate aruannetega (17, 26), et need geenid on ABMR-is kõige rohkem üleekspresseeritud. Järgmisena kasutasime IPA-d ja OMICSneti, et tuvastada in silico iga miRNA oletatavad sihtgeenid. Eeldati, et vähemalt üks kuuest miRNA-st on suunatud kokku 4504 mRNA-le. Seejärel integreerisime need 4504 ennustatud sihtmärki DEG-dega allografti biopsiates. Integreeritud miRNA/mRNA analüüs tuvastas 61 DEG-d, mille sihtmärgiks oli miR-139-5p, mis suurenesid oluliselt MVI pluss biopsiates. Samuti tuvastas see 28, 58, 52, 43 ja 27 kraadi märkimisväärselt vähenenud MVI pluss biopsiates, mis olid vastavalt sihtmärgiks miR-142-3p, miR-150-5p, miR-155-5p, miR{ {22}}p ja miR-223-3p (joonis 3B).
MV-ga seotud miRNA-de raku päritoluKuue miRNA rakulist päritolu iseloomustati mitmel viisilneeru-rakkude ja hematopoeetiliste rakkude alatüübid, kasutades veebis kättesaadavat miRNA atlast [Fantomi andmebaas (27)]. Järelevalveta rühmitamine on diskrimineeritudneeru-rakust pärinevad miRNA-d immuunrakkudest pärinevatest miRNA-dest (joonis 4A). Samuti näitas see iga miRNA jaoks ühte või kahte domineerivat rakutüüpi. MiR-139-5p näis olevat peamiselt ekspresseeritud glomerulaarsete endoteelirakkude (EC) poolt. MiR-222-3p, kuigi selle ekspressioon ei olnud korrelatsioonis tubulaarse põletikuga (Banffi kahjustused"t", joonis 2D), oli peamiselt seotudneeru-epiteelirakud. Ülejäänud nelja miRNA-d ekspresseeriti peamiselt perifeerse vere mononukleaarsetes rakkudes (PBMC) või granulotsüütides, miR-142-3p oli rikastatud NK-rakkude ja monotsüütidega, miR-150-5p CD4 pluss ja CD8 pluss T-rakkudes, miR -155-5p CD19 pluss B-rakkudes ja makrofaagides ning miR-223-3p neutrofiilides.
Üherakuline RNA sekveneerimine tuvastas kõik neerurakud ja infiltreeruvad immuunrakud Iga MVI-ga seotud miRNA potentsiaalse rolli iseloomustamiseks analüüsisime avalikult kättesaadavaid sc-RNAseq andmeid kahestneeru-allotransplantaadi biopsiad ABMR-iga ja kõrge MVI skoor (g2, ptc3) (22). Need andmekogumid integreeriti 4 terve võrdlusbiopsiaga, millel polnud MVI-d. Pärast kvaliteedikontrolli ja filtreerimist tuvastati 31545 rakku ja järelevalveta rühmitamine näitas 12 klastrit (joonis 4B). Kasutasime väljakujunenud markereid (28), et tuvastada kõik peamised elanike ja infiltreeruvad raku alatüübid ja märgistada need (täiendav joonis S2). Järgmisena keskendusime rakupopulatsioonidele, millest arvati, et meie kuus miRNA-d pärinevad. Selle eesmärgi saavutamiseks kihistasime rakud neljaks peamiseks klastriks, mis vastavad endoteelile, epiteelile, lümfotsüütidele ja APC-dele (joonis 4C). Kooskõlas nende andmete varasema analüüsiga (22) ei tuvastatud sc-RNASegi andmekogumites ei neutrofiilseid ega NK-rakkude populatsioone.
miR-139-5p juhib EC aktiveerimist ja antigeeni esitlemise rada MVI ajalMiR-139-5p oli meie uuringus ainuke allareguleeritud miRNA MVI/ABMR-iga (joonis 2A) ja leiti, et see pärineb peamiselt glomerulaarsest EC-st (joonis 4A). Kinnitati, et kuuskümmend üks selle sihtgeenidest on MVI pluss juhtumite hulgimikrokiibis ülesreguleeritud (joonis 3B) ja nende ekspressiooni uuriti täiendavalt üherakulise eraldusvõimega kolmes varem tuvastatud EÜ alamklastris (joonised 4B, C). Nagu on kujutatud joonisel fig 5A, oli aktiveeritud ECcluster tuvastatav ainult MVI pluss proovides. Pealegi suurenesid pooled 61 geenist (N=30) sc-RNAseq MVI pluss biopsiates järjekindlalt, olenemata kolmest EÜ alamklastrist. Nende hulgas oli GBP5 kõige rohkem suurenenud geen. Järgmisena tuvastas geeni ontoloogia analüüs, kasutades neid 30 endoteeli päritolu transkripti, UBE2D1 ja YWHAG geenivõrgu kesksete mängijatena (joonis 5B). Täpsemalt rikastati immuunsüsteemiga seotud radu ja peamise histo-sobivuse kompleksi (MHC) vahendatud antigeeni töötlemise ja esitlemise radu (joonis 5C). Pseudoaja analüüs viidi läbi, et paremini iseloomustada geeniekspressiooni muutusi EÜ aktiveerimise käigus, rakkudevaheline oleku trajektoor (joonised 5D, E), UBE2D1, YWHAG ja GBP5 suurenesid pidevalt MVI-ga seotud endoteeli aktiveerimise ajal. Väga sarnased trajektoorid leiti MHC-ga seotud geenide HLA-A,-B ja -DRA, aga ka bonafiidse endoteeli aktivatsiooni ja põletikumarkerite puhul, nagu VCAM1, CXCL9 ja CXCL10, mis viitab sellele, et kõiki neid geene ekspresseeritakse endoteeli aktiveerimise ajal samaaegselt. Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et miR-139-5p väheneb MV kahjustuste ajal ega suru enam MHC antigeeni esitlusrada aktiveeritud EK-s.
miR-222-3p kahjustab mõlematNeerudFüsioloogilised ja immuunsüsteemiga seotud rajad epiteelirakkudes MVI ajal keskendusime järgmiseks miR-222-3p-le, ülesreguleeritud miRNA-le MVI proovides koosneeru-epiteelirakkude päritolu ja eksklusiivsem korrelatsioon ABMR-iga seotud histoloogiliste kahjustustega (joonised 2A, D, 4A). Hulgiallotransplantaadi koes oli 43 selle sihtgeeni ekspressioon allareguleeritud (joonis 3B) ja seda hinnati edasi ühekordselt raku eraldusvõime erinevatesneeru-epiteelipopulatsioonid, mille me varem tuvastasime (joonised 4B, C). Nendest 43 (95 protsenti) geenist 41 massiline vähenemine kõigis tuvastatud geenidesneeru-epiteelirakkude klastrid viitavad geenide vaigistamisele
profiil VMI-s (joonis 6A). Huvitaval kombel on sellega seotud 4 geenineeru-füsioloogilised rajad (ERBB4, ATPIB1, TIMM50 ja KIF3B), aga ka immuunsüsteemiga seotud geenid (TRAPI ja PEBPI) tuvastati võrgu kesksete geenidena (joonis 6B). 43 geenide geeniontoloogia näitas ErbB signaaliradade, aga ka immuunsüsteemiga seotud radade rikastumist ja tsütokiinide vastust (joonis 6C) ja ERBB4 ekspressiooni kinnitasid veelgineeru-rakud (joonis 6D). Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et VMI ajal on kõrge -222-3p inneeru-epiteelirakke seostatakse mõlemas osalevate geenide tugeva repressiooniganeeru-elektrolüütide homöostaasi rajad ja immuunsüsteemiga seotud rajad epiteelis.
miR-150-5p reguleerib NF-kB aktivatsiooni T-lümfotsüütides MVI ajal Samamoodi uurisime (suurenenud) miR-150-5p regulatiivset rolli MVI ajal T-rakkude klastris, kus see ekspresseeriti kõige domineerivamalt. (Joonis 4A). Joonistasime 58 vähenenud MVI-ga seotud DEG-d, mis tuvastati hulgi allotransplantaadi biopsiaproovides (joonis 3B), ja seisime silmitsi geeniekspressiooniga sc-RNAseq T-rakkude klastris (joonis 7A). Nii miR150-5p-ga sihitud kui ka MVI ajal T-rakkudes spetsiifiliselt alaekspresseeritud geenide osakaal oli üllatavalt madal (15/58,25,9 protsenti), mis viitab sellele, et nende geenide globaalne vähenemine in vivo ei olnud tingitud ainult T-lümfotsüütide sektsioon. Sellegipoolest konstrueerisime sellest kõrgelt valitud 15 geenist koosnevast loendist ja OMICSneti platvormi kasutades geenivõrgu (joonis 7B) ja teostasime geeni ontoloogia analüüsi (joonis 7C). Märkasime, et miR-150-5p üleekspressioon oli seotud NF-ga -KB regulatsioon T-lümfotsüütides MVI ajal.
miR-155-5p Reguleerib mRNA splaissimist APC-des MV ajal Lõpuks rakendati täpselt sama strateegiat 52miR-155-5p-sihtgeenide puhul, mis olid MVI ajal alaekspresseeritud (joonis 3B). Vastupidiselt miR-150-5p-le T-lümfotsüütides täheldasime, et peaaegu kaks kolmandikku miR-155-5p suunatud geenide arv vähenes järjekindlalt APC sc-RNAseq klastris (31/52,59,6 protsenti, joonis 8A). Geenivõrgu analüüs näitas, et AIFMI ja CIAO1 olid kesksed geenid (joonis 8B). Veelgi enam, geeni ontoloogia näitas mRNA splaissimisega seotud radade tugevat rikastumist (joonis 8C).
ARUTELUBIOMARGIN-uuring on oma ainulaadse disaini poolest tüüpiline raamistik multi-oomiliste andmete integreerimiseks. Tõepoolest, väga tugevaid torujuhtmeid kasutati nii avastamise, valiku kui ka valideerimise kohortides, mis hõlmasid suurt hulka patsiente erinevatest siirdamiskeskustest. Kolmes sõltumatus kohordis jälgisime ja kinnitasime samaaegselt 6 miRNA omapärast ekspressiooniprofiili MVI ajal: miR-139-5p vähenes, samas kui miR-142-3p/150-5p/{{5} }p/222-3p ja miR-223-3p suurendati. Oluline on see, et kõigi nende 6 miRNA tase oli korrelatsioonis MVI raskusastmega, mis viitab annusest sõltuvale regulatsioonimehhanismile. Järgmisena kasutasime iga miRNA raku päritolu uurimiseks räniplatvormidel. Hämmastavalt täheldati kahte erinevat miRNA-de rühma: esimene, mis pärines infiltreeruvatest immuunrakkudest ja teine, mis oli spetsiifilisem residentidele.neeru-rakud. Seejärel mõõdeti nii miRNA-sid kui ka mRNA-sid samas biopsiaproovide avastuskomplektis, mis võimaldas MVI-ga seotud in vivo valideeritud erinevalt ekspresseeritud mRNA-de / miRNA-de integreeritud analüüsi. Lõpuks, pärast mRNA-de / miRNA-de seose kirjeldamist koe hulgieraldusvõimega, kinnitasime mRNA-de / miRNA-de koosmõju üherakulise eraldusvõimega neljal 6-st tuvastatud miRNA-st.
Huvitaval kombel oli miR-139-5p ainus miRNA, mis korreleeris negatiivselt MVI kahjustustega. See pärineb peamiselt EÜ-st ja on teatatud, et see reguleerib MHC-ga seotud geene. Selle sihtgeenide hulgas oli UBE2D1 MVI-ga seotud endoteeli aktiveerimise ajal tugevalt ülesreguleeritud. UBE2D perekond on E2 ubikvitiini konjugeeriv ensüümide perekond ubikvitiini-proteasoomi süsteemis (29, 30) ja näidati, et UBeD1 suurendab märtsi-I ubikvitineerimist, mis viib MHC II klassi valkude ülesreguleerimiseni (31). Lisaks oli GBP5 MVI ajal kõige enam esindatud geeniga inaktiveeritud EC, mis on kooskõlas meie hiljutiste aruannetega, mis näitavad, et GBP5 on ABMR-i biopsiates (17) aga ka vereproovides (32) tugevalt ülesreguleeritud. Huvitaval kombel näidati, et GBP5 ekspressioon on inimese emaka mikrovaskulaarsetes endoteelirakkudes indutseeritav II tüüpi interferooniga koos CXCL9 ja CXCL10-ga (33). Nende kahe põletikueelse kemokiini varajane roll ägedas äratõukereaktsioonis on hästi dokumenteeritud ja nende tase uriinis on ette nähtud ägeda äratõukereaktsiooni riski jälgimiseks neerutransplantaadi retsipientide rutiinsel jälgimisel (34). Teine miR-139-5p sihtmärk on YWHAG.YWHAG, mis kodeerib HLA-F valgu perekonda ja seda on kirjeldatud kui diabeetilise nefropaatia aktiivse profibrootilise protsessi käigus erinevalt ekspresseeritud (35). MiR-139-5p võimalik roll fibroosis, mis on viimane ühine rada pärast põletikku, on seda olulisem, et IFTA lisati hiljuti koondskoori, et ennustada neeru allografti ellujäämist pärast ABMR-i (36). Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et miR-139-5p ei represseeri enam MCH antigeeni ekspressiooni Anethumi pinnal MVI ajal ja võiks osaleda kemoatraktsiooni- ja fibroosiprotsessis, kuid need mehhanismid tuleb veel eksperimentaalselt kinnitada ekspressiooni endoteeli pinnal MVI ajal ja võivad osaleda kemoatraktsiooni ja fifibroosi protsessides, kuid need mehhanismid tuleb veel eksperimentaalselt kinnitada.
Teineneeru--tuletatud miRNA, mille tuvastasime, on miR-222- 3p, mille ekspressioon leiti olevat spetsiifilisem MVI kahjustuste suhtes: see on seotud g ja PTC skooridega, samuti C4d ladestumisega, kuid mitte i või t kahjustustega. Kuid see pärines peamiselt epiteelirakkudest. Pärast multi-oomilist integreerimist raku eraldusvõimega tegime kindlaks, et miR-222-3p pärsib peamiselt ErbB signaaliülekannet, mis on ülioluline raku põhifunktsioonide jaoks, nagu proliferatsioon, migratsioon, kasv ja diferentseerumine (37). Inimese bioloogias on füsioloogiline ErbB signaalimine vajalikneeru-elektrolüütide homöostaas ja neerude terviklikkuse säilitamine (38). Meie tulemused tuvastasid ka ADAM22, NRG1, ZNF91 kui ErbB-signaalidega seotud geenid, mis olid MVI ajal epiteelis märkimisväärselt represseeritud. MVI ajal represseeriti neeruepiteelis ka teisi neerufüsioloogia jaoks olulisi geene, nagu ATP1B1 ja KIF3B. Varem on Baker et al. näitas, et ATP1B1 (Na plus /K pluss -ATPaasi b1 alaüksus) ajabneeru-naatriumi tubulaarne reabsorptsioon (39). Lisaks Aguado-Fraile jt. on tuvastanud, et kinesiini perekonna liige 3B (KIF3B) osaleb rakukaubanduses roti proksimaalsetes tuubulite rakkudes. KIF3B näib olevat peamine vahendaja proksimaalsete epiteelituubulite rakkude vastuses isheemiale/reperfusioonile, mida võib kasutadaneeru-isheemilise kahjustuse ravi (40). Seega võime oletada, et miR-222-3p pärsib epiteelis MVI ajal olulisi füsioloogilisi radu. Veelgi enam, immuunsüsteemiga seotud radu reguleerib ka miR-222-3p üleekspressioon: olulised geenid, nagu TRAP1 ja PEBP1, olid tugeva MVI-ga proovides täielikult inhibeeritud. Huvitaval kombel näidati, et TRAP1 paranebneeru-tubulointerstitsiaalne fibroos hiirtel, kellel on ühepoolne kusejuha obstruktsioon kaitsmise teelneeru-torukujuliste epiteelirakkude mitokondrid (41). Lisaks pakub PEBP1 põletikuvastast toimet nii MAPK kui ka NF-KB radade pärssimise kaudu homöostaatilistes/basaaltingimustes (42). sisseneeru-epiteel, Marko et al. näitas elegantselt, et post-isheemiline NF-KB aktiveerimine süvendab tubulaarset vigastust ja süvendab põletikku (43). Meie käes oli miR-222-3p PEBP1 täielikult represseeritud, mis viitab sellele, et NF kB rada vallandub MVI ajal. Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et epiteeli bioloogia on häiritud MVI janeeru-epiteelirakud reageerivad aktiivselt MVI vigastustele, samas kui selle koe osalemist MVI-s käsitletakse harva. Need molekulaarsed leiud võivad heita uut valgust ägedatele torukujuliste vigastuste kahjustustele, mis on väljakujunenud, kuid kaua tähelepanuta jäetud ABMR-kriteeriumid. Lisaks on näidatud, et epiteelirakud võivad sekreteerida eksosomaalset miR-222-3p-d ja indutseerida makrofaagides M2 fenotüüpi (44). Vahepeal on Li et al. teatas hiljuti, et M2 makrofaagid ekspresseerivad üle miR-155 ja edastavad selle miRNA mikrokeskkonda ka eksosoomide sekreteerimise kaudu. Neeru siirdamisel suurenes miR{7}} erinevatel tingimustel (IFTA, äge äratõukereaktsioon ja TCMR) ning kehavedelikus või kudedes (45). Huvitaval kombel võib miR- 155 soodustada epiteeli-mesenhümaalset üleminekut, suunates epiteelirakkudes RASSF4 (46). See miRNA-põhine läbirääkimine makrofaagide janeeru-epiteelirakke tuleb veel hinnataneeru siirdamineja täpsemalt MVI kontekstis. Kooskõlas nende leidudega täheldasime, et miR{0}}p ekspresseeriti peamiselt monotsüüte ja makrofaage hõlmavates APC-des. Selles konkreetses alamrühmas näitas miR- 155-5p-sihtgeenide ontoloogia premRNA splaissimise radade rikastumist. Huvitaval kombel Janssen et al. teatas, et kopsupõletik indutseeris alveolaarsetes makrofaagides mRNA-eelseid splaissimise radu. Veelgi enam, mRNA-eelne splaissimise aktiveerimine erines kudedes elavates makrofaagides võrreldes (vere värvatud) monotsüütidest pärinevate makrofaagidega. Teatati muutustest värvatud makrofaagide põhiainevahetuses, suurenenud väljavool glükolüüsi kaudu ja vähenenud väljavool trikarboksüülhappe tsükli kaudu (TCA tsükkel, st Krebsi tsükkel) (47). Seoses miR-150-5p-ga leidsime, et selle üleekspressioon MVI ajal oli seotud NF-kB rajaga lümfotsüütide klastris, mis hõlmas nii kaasasündinud NKT-rakke kui ka adaptiivseid T-rakke. Huvitaval kombel on miR-150-5p ülioluline küpsete ja funktsionaalsete NK-rakkude genereerimiseks (48) ning teatati, et miR-150-5p-puudulikud CD8 pluss T-rakud on vähem tsütotoksilised (49). Lisaks võivad CD8 T-rakud sekreteerida eksosoomides (50) ka miR-150-5p-d, mis võib omakorda soodustada fibroblastide aktivatsiooni tubulaarsetes epiteelirakkudes ja sellele järgnevatneeru-hiljutiste aruannete kohaselt (51, 52).
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU FUNKTSIOONI
Meie uuringul on mõned piirangud. Keskendusime oma uurimistöös kuuele miRNA-le, mis on järjekindlalt tuvastatud meie mitmeastmelises disainis. Siiski jätkasime samm-sammult miRNA valimist, kusjuures valideerimiskohordis kvantifitseeriti vaid murdosa kõigist teadaolevatest miRNA-dest. MiRNA-de valiku statistiline rada põhines BIOMARGINi esialgsel disainil, mis sobis mitme lõpp-punkti (ABMR, aga ka TCMR ja IFTA) diagnostiliste biomarkerite tuvastamiseks. Seega, kuigi miR-146a oli avastamis- ja valikukohordis märkimisväärselt suurenenud (joonis 2A), ei kvantifitseeritud miR-146a valideerimiskohordis. Seetõttu jäeti miR{5}a meie valikuprotsessist de facto välja, kuigi kirjandus viitab rollile neerusiirdamise isheemias/reperfusioonis (53) ja alloimmuunvastuste Treg-vahendatud kontrollis (54). Lisaks ei saa me välistada, et võimsam valimi suurus oleks andnud rohkem miRNA-sid, nagu miR-138 (alla) ja miR-511 (üles), mida ekspresseeriti selektsioonikohordi ABMR-juhtudel erinevalt ja näitas avastuskohordis samasuunalist suundumust. Lisaks ei teinud me oma biopsiaproovide sc-RNAseq analüüsi, vaid kasutasime veebis saadaolevat sc-RNAseqi andmekogumit. Uuringu kavandamise ja biopsiaproovide kogumise ajal ei olnud scRNAseq-tehnoloogia veel saadaval ning vajadus värskelt kogutud proovide järele ei võimaldanud külmutatud või parafiiniga kaetud proove tagasiulatuvalt kasutada. Samamoodi tehti mRNA profileerimine mikrokiipide abil, mis oli sel ajal võrdlustehnoloogia, mida on nüüd edestanud järgmise põlvkonna RNA-seq. Internetis saadaoleva sc-RNAseqi andmestiku kasutamine piirab meie võimet teatada patsientide põhilistest demograafilistest omadustest. See puuduv teave võib tekitada muret elanikkonnarühmade esindatuse pärast. Pealegi ei kontrollinud me järjestuse tehnilisi aspekte. Seetõttu ei tuvastanud meie sc-RNAseq analüüs valitud eraldusvõimega nendes proovides ühtegi neutrofiilide ega NK-rakkude klastrit. Seetõttu piirdusid meie miR-142-3p ja miR-223-3p allavoolu analüüsid nende vastava sihtgeenivõrgu ja ontoloogia loomisega (täiendav joonis S2) ega võimaldanud üherakulise eraldusvõime uurimist. Kuid miR-223-3p 27 sihtgeeni geenivõrk ja ontoloogia näitasid TCA tsükli rikastumist (täiendav joonis S2) koos ERBB signaalimisega. Seega võime oletada, et nii miR-155-5p monotsüütides kui ka miR-223-3p neutrofiilides mängivad rolli nende rakkude metabolismis ja põletikuvastuses MVI ajal. Pealegi on juba näidatud, et miR-142-3p on neeru allotransplantaadi äratõukereaktsiooni korral suurenenud (9, 55, 56), kuid seni pole seda seostatud konkreetselt ABMR-iga. Teine meie uuringu piirang on see, et spetsiifilised geeniekspressiooni muutused harvaesinevates infiltreeruvates rakkudes võivad olla varjatud geeniekspressiooni analüüsis. Seega on kõigi, isegi haruldaste rakkude alatüüpide nõuetekohaseks uurimiseks vaja täiendavaid uuringuid, mis hõlmavad rohkem proove, kuid neid piirab praegu tehnika suhteliselt kõrge hind.
Kokkuvõtteks uurisime siin MVI-ga seotud molekulaarseid teid, peamist ABMR-iga seotud histoloogilist vigastust. Kasutatud integreeritud oomika lähenemisviis võimaldas meil avada uusi MVI-ga seotud teid ja viitab sellele, et ABMR-i tagajärjel tekivad torukujulised epiteeli metabolismi modifikatsioonid väljaspool lähedal asuvat endoteeli sektsiooni. Meie uuring illustreerib multi-oomika suurt potentsiaali haiguste mehhanismide lahti harutamiseks ja sillutab teed uutele uuringutele, et veelgi selgitada ristkõnesidneeru-residentide ja allotransplantaadiga infiltreeruvate rakkude alamhulgad.