Melatoniin hoiab ära T-lümfotsüütide infiltratsiooni hüpertensiivsete rottide neerudesse, mis on põhjustatud kõrge soolasisaldusega dieedist, takistades CXCR3 ligandi kemokiinide ekspressiooni

Lisateabe saamiseks:ali.ma@wecistanche.com

Ariel Bier¹, Rawan Khashab², Yehonatan Sharabi^1,2,3, Ehud Grossman^1,2,3ja Avshalom Leibowitz^1,2,3,*

¹Medicine D, Chaim Sheba meditsiinikeskus, Tel-Hashomer 5262000, Iisrael; arielbier@gmail.com (AB);Yehonatan.Sharabi@sheba.health.gov.il (YS); Ehud.Grossman@sheba.health.gov.il (EG)² Hypertension Unit, the Chaim Sheba Medical Center, Tel-Hashomer 5262000, Israel;rawankhasbab@gmail.com³Sackleri arstiteaduskond, Tel-Avivi ülikool, Tel-Aviv 6997801, Iisrael*

Kokkuvõte: Eelmises uuringus näitasime sedamelatoniintakistabneerudkahju soolast põhjustatud hüpertensiooni mudelis, vähendades oksüdatiivset stressi. Me oletasime, et see toime hõlmab melatoniini immunomoduleerivaid omadusi. In vivo Study-Dahl soolatundlikele (DSS) rottidele toideti normaalset toitu, kõrge soolasisaldusega dieeti (HSD) või HSD-d jamelatoniin(30 mg/kg/päevas) nende vees nelja nädala jooksul.Neerudkoguti lümfotsüütide vahetuks isoleerimiseks ja iseloomustamiseks voolutsütomeetria abil (CD3 pluss CD4 plus ja CD3 plus CD8 plus) ning lümfotsüütide kemoatraktandi (peamiselt CXCL) jaokskemokiinid) geeniekspressiooni uuringud. In vitro uuringus rottidel kultiveeriti mesangiaalseid rakke (RMC) kõrge soolasisaldusega söötmes ilma ja koosmelatoniin. HSD-d seostati kontrolliga võrreldes CD4 pluss ja CD8 pluss T-lümfotsüütide olulise renalinfiltratsiooniga. Melatoniin vähendas oluliselt neerude lümfotsüütide infiltratsiooni. HSD suurendas oluliselt CXCL-i mRNA ekspressioonikemokiinid.HSD-le melatoniini lisamine kaotas selle efekti. RMC rakkude töötlemine soolaga suurendas CXCL10 ja CXCL11, kuid mitte CXCL9 ekspressiooni. Lisaminemelatoniinkultiveerimissöötmesse hoidis seda kasvu ära. HSD-ga toidetud rottide ravimine melatoniiniga vähendas neeru lümfotsüütide kemoatraktandi RNA ekspressiooni ja on seotud neeru T-lümfotsüütide infiltratsiooni olulise vähenemisega. Sool võib avaldada otsest mõju kemokiini tootvatele neerurakkudele, mida melatoniiniravi nüristab.

Märksõnad:melatoniin; sool; T-lümfotsüüdid; hüpertensioon;neerud; CXCL 9; CXCL 10; CXCL 11

1. Sissejuhatus

Hüpertensioon (HTN) on juhtiv muudetav kardiovaskulaarne riskitegur. Elanikkonna vananemise tõttu suureneb HTN-i levimus pidevalt, ulatudes edenenud vanuses kuni 30 protsendini [1]. Vaatamata mitmesugustele meditsiinilistele ravivõimalustele on HTN-i ülemaailmne kontroll kehv. Kontrollimatu HTN-i tagajärjed on laastavad, avaldades rahvatervisele tohutut negatiivset mõju [2].

HTN-i patogeneesis osalevad mitmesugused käitumuslikud, keskkonna- ja geneetilised tegurid. Lääne toitumise kõrget soolasisaldust peetakse HTN-i peamiseks teguriks ning seda seostatakse suurenenud haigestumuse ja suremusega. Suunised ja avalikud algatused soovitavad elanikkonna soolatarbimist vähendada. Kuid mitte igaüks ei pruugi sellest piirangust kasu saada, kuna soolatundlikkust HTN-iga ühendavat patofüsioloogiat ei mõisteta täielikult ja see vajab paremat mehaanilist mõistmist [3]. Seega on uued strateegiad HTN-i paremaks mõistmiseks ja kontrollimiseks üliolulised, muutes uued uurimisparadigmad koheseks vajaduseks.

On leitud, et põletik ja oksüdatiivne stress on seotud olulise HTN-i patogeneesiga. Neid protsesse käivitavate ja jätkavate vallandajate uurimisel viitavad paljud eksperimentaalsed HTN-mudelid adaptiivse immuunvastuse kaasamisele [4].

Klõpsake selleksCistanche kasulikud omadused ja kõrvaltoimed neerufunktsioonile

Vihjeid, mis ühendavad adaptiivset immuunsust HTN-iga, on eksisteerinud juba alates 1960. aastatest. Kuid alles viimasel ajal, kui immuunsüsteemi paremini mõistetakse, on selles suunas edu saavutatud. Guziki jt teedrajav uuring. näitas, et angiotensiin (Ang) II või deoksükortikosterooni (DOC) soola HTN nüristati rag1-/-hiirtel, kellel on T- ja B-lümfotsüütide puudulikkus, ning T-, kuid mitte B-rakkude adoptiivne ülekanne võib taastada BP-vastuse [5]. Alates sellest artiklist leiti, et enamikus tavalistes loomamudelites on HTN-i patogeneesi jaoks olulised mitmesugused adoptiivse immuunsuse komponendid. T-rakkude rolli soola poolt indutseeritud HTN mudelis on samuti põhjalikult uuritud. In vitro uuringud näitavad, et sool võib tõugata naiivseid T-rakkude diferentseerumist TH17-rakkudeks [6]. Paljud in vivo tööd kõrge soolasisaldusega dieediga (HSD) indutseeritud HTN-mudelitega, nagu Dhal soolatundlikud (DSS) rotid, näitavad ulatuslikku neerude T-rakkude infiltratsiooni [7–9].

Paljude füsioloogiliste protsesside hulgas onmelatoniinseotus vererõhu reguleerimisega on mõnevõrra intuitiivne. Tsirkadiaanne vererõhu muster soodustab ulatuslikke uuringuid melatoniini ja HTN-i kohta. Paljud minevikus tehtud tööd, nii inimestel kui ka eksperimentaalsetes mudelites, ühendasid madala melatoniini taseme HTN-iga [10]. Mõned kliinilised andmed viitavad sellele, et melatoniini lisamine võib ravida HTN-i, peamiselt öise HTN-iga patsientidel [11]. Nende andmete ebaühtlus tekitab aga küsimusi, kas mittetsirkadiaansed melatoniini omadused on samuti seotud vererõhu reguleerimisega.

Melatoniini põletikuvastased ja antioksüdatiivsed omadused on näidanud, et melatoniinil on koostoime immuunsüsteemiga. Uued andmed on seostanud melatoniini signaaliülekande rolli T-rakkude arengus, aktiveerimises, diferentseerumises ja mälus. On tõendeid selle kohtamelatoniinT-rakkudel esinevad membraani- ja tuumaretseptorid [12,13].Melatoniinmõjutab paljude immuunvastusega seotud tsütokiinide, näiteks ainterferooni (IFN) tootmist, mis on Th1 vastuse pöördeline regulaator [14].

Mõnede teadlaste sõnul soodustavad oksüdatiivne stress ja T-rakkude reaktsioon HTN-i ja elundite hüpertensiivsete kahjustuste teket [15]. Oma eelmises töös näitasime sedamelatoniinvähendab lokaalset (neeru) oksüdatiivset stressi ja hoiab ära soolast põhjustatud neerufibroosi ja proteinuuria soolatundlikus HTN rotimudelis (DSS-mudel) [16]. Kuna oksüdatiivsel stressil on HTN-ga seotud adaptiivses immuunvastuses keskne roll, oletasime, et melatoniini immunomoduleerivad omadused vastutavad selle kaitsva rolli eest HSD-indutseeritud HTN-is.

Selle uuringu eesmärk on hinnata, kasmelatoniinvähendab soola poolt indutseeritud T-rakkude vastust ja selgitab selle toime eest vastutavaid mehhanisme.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Loomad ja uuringuprotokoll

Uuringuprotokolli kiitis heaks Iisraeli Sheba meditsiinikeskuse institutsionaalne loomaeetika komitee. Nende tervislikku seisundit jälgiti iga looma kehakaalu mõõtmise ja igapäevase üldise liikumise ja terviseseisundi jälgimise teel. Neljanädalased isased Dahli soolatundlikud rotid (RGD Cat# 1582190, RRID: RGD_1582190) olid hoitakse loomade rajatises tavalistes puurides (kaks rotti puuri kohta) temperatuuril 22 ◦C 14 h valguse/10 h pimeduse tsükliga. Rotte peeti tavalisel soolatoidul ja neile anti viiepäevase kohanemisperioodi jooksul ad libitum juua kraanivett. Seejärel jagati rotid 8 nädala jooksul vastavalt dieedile kolme rühma (n=8). Eetikakomitee sõnul tuli haiguse ja kannatuse tunnustega loomad ohverdada.

Kontrollrühmale toideti standardset rotitoidu dieeti (2018 SC; Teklad Envigo, Madison, WI, USA) ja kraaniveega; kõrge soolasisaldusega dieedi (HSD) rühma toideti sobiva rikastatud soolatoiduga (4 protsenti) (TD.120485; Teklad Envigo, Madison, WI, USA) ja kraaniveega ningmelatoniinrühmale toideti sama rikastatud soola dieeti (4 protsenti) joogivees melatoniiniga (M5250; Sigma, Rehovot, Iisrael) (30 mg/kg/päevas). Kehakaalu ja veetarbimist mõõdeti perioodiliselt. Õige melatoniini kogus lahustati igas puuris sobivas veevajaduses, et anda igale loomale õige annus. Nullpäev on HSD ja melatoniini tarbimise alustamise päev. Uuringu lõpus surmati rotid sügava tuimestusega 3-protsendilise isofluraaniga (anesteesia sügavust kinnitas jala tagumine pigistamine) janeerudkoristati. Mõlemad neerud eemaldati ja poolopereeriti. Neerud võeti voolutsütomeetria analüüsiks, välja arvatud mitu osa, mis eemaldati kiiresti ja külmutati vedelas N2-s ning säilitati temperatuuril –80 ◦C. RNA ekstraheerimiseks kasutati külmutatud materjale.

Cistanche-neeruhaiguse sümptomid

2.2. Reaalajas kvantitatiivne pöördtranskriptsiooni PCR

Geenide mRNA ekspressioonitasemed tehti kindlaksneerudreaalajas kvantitatiivse pöördtranskriptaasi-PCR (qRT-PCR) abil. Kogu RNA ekstraheeriti neerukoest, kasutades NucleoSpin RNA komplekti (MACHERY-NAGEL, Düren, Saksamaa). Pöördtranskriptsioon viidi läbi, kasutades Applied Biosystems High-Capacity cDNAReverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). qRT-PCR reaktsioonid viidi läbi, kasutades Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK) ja Applied Biosystems 7500 reaalajas PCR süsteemi. Tsüklitingimused olid järgmised: esimene samm 95 ◦C 0.20 min ja seejärel 40 tsüklit sulamisfaasi 3 s temperatuuril 95 ◦C ja pikendatud etapp 30 s temperatuuril 60 ◦C. 40 tsükli lõpus viidi läbi sulamiskõver. Sisekontrollina kasutati ribosomaalse valgu lateraalse varre subühiku P0 (Rplp0) mRNA-d. Praimerid on loetletud tabelis 1.

Tabel 1. Selles uuringus kasutatud rottide praimerite loetelu.

2.3. T-rakkude eraldamine neerudest

Pärast neerukapsli eemaldamist kaksneerudpeeneks peeneks ja näristati 2 ml süstla kolviga läbi 100 µm rakusõela RPMI 1640-s, mis sisaldas 2 mML-glutamiini, 10 protsenti FBS-i, 10 ug/ml DNaasi 1 (Stem Cells Technology, Cambridge, MA , USA) ja 0,1 protsenti IV tüüpi kollagenaasi (CLS 4, Worthington Decatur, AL, USA). Lahust inkubeeriti 25 minutit temperatuuril 37 °C. Seejärel lisati neeruhomogenaadile pesulahus (DPBS/2% FBS/2 mM EDTA) kuni 45 ml-ni ja filtriti läbi 70 µm rakufiltri. Lahust tsentrifuugiti kiirusel 400 x g/7 min. ja pellet suspendeeriti 5 ml pesulahuses ja filtriti läbi 40 µm rakusõela ja fuugiti uuesti kiirusel 400 x g/7 min. Pellet resuspendeeriti 3 ml FBS-s (10 mM EDTA) ja kanti Histopaque -1083 peale (Sigma, Rehovot, Israel) ning tsentrifuugiti 20 ◦C juures kiirusel 400 × g/30 min ilma piduriteta. Histopaque'i kohal asuv mononukleaarne rakukiht eemaldati, pesti kaks korda pesulahusega ja suspendeeriti voolutsütomeetriliseks analüüsiks 5 ml pesulahuses.

2.4. Voolutsütomeetria

Igast rühmast,neerudanalüüsiti 5–7 rotti. Iga proovi jaoks võeti 1 × 106 rakku. Eraldatud mononukleaarseid rakke inkubeeriti ekstratsellulaarsete markeritega: anti-CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-0030-82, RRID:AB_465493) ja selle isotüübi kontroll (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-4742-41, RRID) :AB_10753770), anti-CD4 (Thermo FisherScientific Cat# 17-0040-80, RRID:AB_1210581) ja selle isotüübi kontroll (Thermo Fisher Scientific Cat# 17-4724-81, RRID: AB_470188), anti-CD8 (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-0084-82, RRID:AB_10548361) ja selle isotüübi kontroll (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-4714-80,RRID: AB_657914). Kõiki rakke analüüsiti voolutsütomeetria abil (BD FACSCalibur Flow Cytometry System, RRID: SCR_000401), kasutades FlowJo tarkvara (FlowJo, RRID: SCR-008520).

Cistanche-neeru funktsioon

2.5. Rakukultuur

Mesangiaalne roti rakuliin RMC (ATCC Cat# CRL{{0}}, RRID: CVCL_0506) saadi ATCC®-st. Rakku kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud Eagle söötmes (01-055-1A, biological Industries, Beit HaEmek, Iisrael) 4 mM L-glutamiiniga, mis oli reguleeritud nii, et see sisaldaks 1,5 g/l naatriumvesinikkarbonaati ja 4,5 g/l glükoosi ning millele lisati 0,4 mg/mLG418 ja 15 protsenti veise loote seerumit. Melatoniin saadi firmast Sigma (M5250 Rehovot, Iisrael). A 250 mMmelatoniinvaru valmistati etanoolis. Rakke kultiveeriti normaalsetes või kõrge soolasisaldusega (lisades söötmele 80 mM NaCl) tingimustes ilma melatoniinita või koos melatoniiniga (0,5 mM). Melatoniiniga töötlemine ajastati 45 minutit enne NaCl lisamist söötmele. Kõik katsed viidi läbi 6 süvendiga plaatidel, kus süvendi kohta oli 3 × 105 rakku, ja need viidi läbi 6 sõltumatu katsega.

2.6. Statistiline analüüs

Andmed on esitatud kui keskmine ± SEM. Statistilised analüüsid viidi läbi kasutades IBMSPSS Statistics, RRID: SCR_019096. Ühesuunaline dispersioonanalüüs (ANOVA) ja posthoc Tukey meetod uurisid rühmadevahelisi erinevusi. Reaalajas qPCR andmeid analüüsiti kasutades DataAssist, RRID: SCR_014969.

3. Tulemused

3.1. Melatoniin kaitseb HSD-d tarbivaid rotte

Rottide vanus selle uuringu ajal oli 4–13 nädalat. Selles vanuses näitab rottide heaolu kontrollrühmas täheldatud kaalutõus [17]. Kuid HSD-rühm saavutas platoo 30. päeval ja lisamiselmelatoniinHSD leevendas seda nähtust (joonis 1A). HSD rühmal oli katseperioodil kõrge suremus, kus 50 protsenti rottidest suri või neil oli kliiniline seisund, mis nõudis loomaeetikakomitee reeglite kohaselt eutanaasiat. Melatoniinilisandid takistasid oluliselt rottide suremust, kus katseperioodi lõpus suri 58. päeval vaid üks kaheksast rotist (joonis 1B).

Joonis 1.Melatoniinparanenud vererõhk ja elulemus HSD-s. DSS-rotte raviti 9 nädalat HSD-ga melatoniiniga ja ilma. Soolarikas dieet vähendas kehakaalu alates 36. päevast ja melatoniin vähendas seda mõju (A). HSD suurendas suremust alates 4. päevast 0. HSD-fedraatide töötlemine melatoniiniga parandab nende ellujäämist. (B). (n=8) *-p Vähem või võrdne 0,05 soola ja soola pluss melatoniin versus kontroll. #-p Vähem või võrdne 0,05 soola versus kontroll ja sool pluss melatoniin. HSD – kõrge soolasisaldusega dieet.

3.2. Melatoniin hoiab ära HSD põhjustatud T-rakkude infiltratsiooni neerudesse

Me eraldasime rakudneerudja suunati need T-raku markerile CD3. CD3 pluss rakud ühendati CD4 ja CD8 külge. Nii CD3 pluss CD4 plus kui ka CD3 pluss CD8 plus olid HSD-s oluliselt kõrgemad (vastavalt 5,18 ± 1,62 ja 4,6 ± 0,75 protsenti) võrreldes kontrolliga (0,16 ± {{18}). }.{{20}}vastavalt 2 ja 0,95 ± 0,15 protsenti) jamelatoniinHSD lisamine vähendas nii CD3 pluss CD4 plus kui ka CD3 pluss CD8 plus rakkude arvu tagasi kontrolltasemele (vastavalt 0,68 ± 0,21 ja 1,37 ± 0,45) (joonis 2A–D).

Joonis 2. Melatoniin takistab T-rakkude infiltratsioonineerud. T-rakud eraldati rottide neerudest ja kontrolliti CD3 suhtes. CD3-positiivsed rakud määrati CD4 ja CD8 jaoks. Melatoniin (C) vähendas nii CD3 pluss CD4 pluss kui ka CD3 pluss CD8 pluss võrreldes HSD-ga ilma melatoniinita (B) ilma erinevuseta kontrollrühmast (A). Kõigi rottide analüüs on näidatud (D) (n=7–8). HSD – kõrge soolasisaldusega dieet. *-p Väiksem või võrdne 0.05 versus kontroll. #-p Väiksem või võrdne 0,05 versus sool pluss melatoniin.

3.3. Melatoniin vähendab teatud neerukemokiine, mis olid HSD-s ülereguleeritud

T-rakkude värbamist põletikulistesse kudedesse reguleerib kohalik kemokiiniekspressioon. Seetõttu mõõtsime kahe kemokiini perekonna ekspressiooni rottidelneerud: kemokiini (CXC motiiv) ligandi (CXCL) perekond ja kemokiini (C-Cmotif) ligandi (CCL) perekond.

CXCL perekonna puhul olid CXCL 9, 10 ja 11, mis meelitavad T-rakke oma sihtkudedesse, kasutades T-rakkudel CXCR3 retseptorit, HSD rottidel oluliselt ülesreguleeritud. TäiendusmelatoniinHSD-le vähendas nende ekspressioon tagasi kontrolltasemetele. Sama muster tuvastati ka CXCL 1 ja 16 puhul. CXCL12 puhul aga HSD-s ülesreguleerimist ei tuvastatud (joonis 3A).

CCL perekonna puhul ei näidanud CCL 2, 4, 12, 17, 19 ja CX3CL1 HSD ülesreguleerimist. CCL3 oli HSD korral ülesreguleeritud, kuid melatoniini lisamisega dieedile olulisi muutusi ei tuvastatud. CCL7 puhul on HSD oluline ülesreguleerimine ja märkimisväärne allareguleerimine, lisadesmelatoniintuvastati HSD-le (joonis 3B).

Joonis 3. ÜlereguleerimineneerudkemokiinidHSD-s melatoniiniga ja ilma. Rottidel määrati kemokiini (CXC motiiv) ligandi (CXCL) perekonna (A), kemokiini (CC motiiv) ligandiperekonna ja CX3CL1 (B) ekspressioon. (n=7–8) *-p Väiksem või võrdne 0.{11}}5 versus kontroll. #-p Väiksem või võrdne 0,05 versus sool pluss melatoneerimine. HSD – kõrge soolasisaldusega dieet.

3.4. Melatoniini otsene mõju RMC mesangiaalsele rakuliinile

Seejärel keskendusime CXCL9-le, 10-le ja 11-le, mis meelitavad T-rakke, seondudes retseptoriga CXCR3. Me määrasime nende väljendusekemokiinidRMC rakkudes, mis on roti mesangiaalne rakuliin.

Töötlesime rakke 80 mM NaCl-ga ilma ja 0,5 mM-gamelatoniin. See NaCl kontsentratsioon suurendas oluliselt CXCR10 ekspressiooni 2,4 ± 0.26- korda võrreldes kontrolliga ja 0,5 mM melatoniini lisamine vähendas oluliselt see avaldis 1,4 ± 0.{{10}} korda võrreldes kontrolliga (joonis 4A). CXCL11 puhul suurendas 80 mM NaCl ekspressiooni oluliselt 3 ± 048- korda võrreldes kontrolliga ja 0,5 mM melatoniini lisamine vähendas seda ekspressiooni oluliselt 1,8 ± 0-ni.{22 }}kordne võrreldes kontrolliga (joonis 4B). CXCL9 RMC rakkudes ei tuvastatud.

Joonis 4. Sool reguleeris üles CXCL10 ja CXCL11 ekspressiooni mesangiaalses rakuliinis, kus melatoniravi vähendas selle ekspressiooni. RMC-d (rottide mesangiaalne rakuliin) töödeldi soolaga 80 mM 0,5 mM melatoniiniga ja ilma. CXCL10 (A) ja CXCL11 (B) reguleeriti üles soolaga töötlemise ja lisadesmelatoniinseda ülesreguleerimist vähendada. Graafikud näitavad 6 sõltumatut katset. *-p Väiksem või võrdne 0.001 versus kontroll #-p Väiksem või võrdne 0.005 versus sool 80 mM ja melatoniini 0,5 mM. $-p Väiksem või võrdne 0,05 versus soola 80 mM ja melatoniiniga 0,5 mM.

4. Arutelu

Kasulik mõjumelatoniinHTN-i kohta on demonstreeritud varasemates uuringutes ja seda soovitati raviresistentse HTN-i võimaliku toimeviisina [18]. Oma esimeses uuringus keskendusime oksüdatiivsele stressile ja näitasime, et melatoniin vähendab HSD põhjustatud oksüdatiivset stressi. Käesolevas uuringus keskendusime adaptiivsele immuunefektile ja näitasime, et melatoniin parandab HSD-ga toidetud rottide ellujäämist. See toime on seotud neerudesse infiltreeruvate T-rakkude arvu vähenemise ja neerude allareguleerimiseganeerudkemokiini ekspressioon.

Ajaloolised andmed näitavad, et HSD-d tarbivatel DSS-rottidel areneb raske HTN ja nende suremus on suurem [19]. Dahl ise teatas mudeli loomisel, et kui DSS-rottidele pandi võõrutamise ajal (21–23 päeva vanuselt) HSD (8% NaCl), tekkis neil kiiresti HTN ja kõik surid soolaga toitmise 16. nädalaks [20]. Hiljem, pärast tüve mõningaid modifikatsioone, avaldasid Rapp et al. teatas, et kõik rotid olid surnud kaheksa nädala jooksul pärast HSD-d (8 protsenti NaCl) [21]. Meie uuringus osalenud rottidel oli kõrge suremus, kuid see ei ulatunud 100 protsendini, tõenäoliselt seetõttu, et nende toidus oli madalam soolasisaldus (4 protsenti). Sellegipoolest on ilmne, etmelatoniintoidulisandid hoidsid oluliselt ära suremust.

Kaalutõus on rottide heaolu marker vanuses 4–13 nädalat. DSS-rott pärineb Sprague Dawley'st, mis on hästi iseloomustatud tüvi. Rottide vanuses, mida me oma katsetes kasutasime, peaksid rotid järjekindlalt kaalus juurde võtma [22]. Paljudes loomkatsetes peetakse kaalu vähendamist üheks katsete "lõpp-punktiks" [23]. Mitmete uuringute põhjal on selge, et DSS-rottide HSD tulemuseks on kontrollrühmaga võrreldes madalam kehakaalu tõus [24,25]. Kooskõlas nende uuringutega täheldasime ka rühmade vahel kaaluerinevusi. Siin ei võtnud rotid pärast neljanädalast HSD-d kaalus juurde. Melatoniin peatas ka selle HSD mõju, kuna melatoniiniga ravitud rotid jätkasid kehakaalu suurenemist, kuigi vähem kui kontrollid.

Võimemelatoniinvererõhu alandamiseks loommudelitel avastati 20. sajandi seitsmekümnendate lõpus [26–28]. Sellest ajast alates on seda teatatud mitmes teises mudelis, näiteks et kõrge fruktoosisisaldusega dieet kutsub esile metaboolse sündroomi spontaanselt hüpertensiivsetel rottidel [29, 30]. Meie uuringud selles valdkonnas on esimesed, mis näitavad, et melatoniin mängib rolli soolast põhjustatud HTN-is, vältides elundikahjustusi ja vähendades suremust.

Selles uuringus näitasime, et HSD kutsub esile T-lümfotsüütide infiltratsioonineerud, protsessi, mida on DSS-rottidel kirjeldanud peamiselt Mattsoni rühm [31–33]. Selle infiltratsiooniprotsessi keskset rolli DSS-mudelis on demonstreerinud hiljutine uuring, milles täheldati, et T-rakupuudulikud DSS-rotid on kaitstud nende eest. HSD ja splenotsüütide ülekande poolt indutseeritud HTN süvendab soolatundlikku HTN-i [34].

Melatoniin võib T-rakke mõjutada erinevates aspektides (ülevaadet vt [35]). See uuring näitas seda esimest kordamelatoniinvähendab nii CD4 pluss kui ka CD8 pluss T-rakkude ligitõmbamistneerudHSD-s. See melatoniini mõju võib olla mehhanism, mis rõhutab selle kasulikku mõju selles mudelis.

Melatoniini võimet vähendada T-rakkude infiltratsiooni on kirjeldatud eksperimentaalses autoimmuunse entsefalomüeliidi (EAE) hiirte mudelis. EAE puhul näidati, et melatoniin vähendab CD4 pluss T-rakkude ja Th17-rakkude infiltratsiooni kesknärvisüsteemi [36,37].

T-rakkude külgetõmbejõudu konkreetse koe suhtes reguleerivad peamiselt kohalikud kõrged kontsentratsioonidkemokiinidmis on kemotaktilised tsütokiinid, mis kontrollivad immuunrakkude migratsioonimustreid ja positsioneerimist. Kaks suurt kemokiinide perekonda, mis indutseerivad T-rakkude infiltratsiooni, on CXC motiivi ligandi (CXCL) ja CC motiivi ligandi (CCL) kemokiinide perekond [38].

Cistanche neerufunktsiooni häirete parandamiseks

Meie uuringus ei leidnud me CCL-i perekonna vastuses HSD-le ega sellele püsivat mustritmelatoniin. Üheksastkemokiinidselles perekonnas täheldati ainult CCL7 ja CLL21, et suurendada nende ekspressiooni HSD tõttu ja melatoniini lisamine vähendas seda. HSD suurendas CCL3 ekspressiooni, kuid melatoniiniga töödeldud rottidel vähenemist ei tuvastatud. Hiljutine sama mudeli uuring näitas, et HSD reguleerib CCL2 sisemuses ülesneerudkasutades RNA-Seq meetodit [39]. Kuid selles uuringus testiti taset 3. ja 21. päeval pärast dieedi algust. Meie uuringus testisime taset kaheksa nädala pärast. Võimalik, et kemokiini ekspressioon muutub HSD perioodi jooksul.

Vastupidi, enamiku CXCL perekonna, sealhulgas CXCL 1, 9, 10, 11 ja 16 tase tõusis HSD-ga ravitud rottidel jamelatoniinlisamine kaotas selle juurdekasvu. Ainult CXCL12 ei näidanud vastuse suurenemist HSD-le.

CXCL9, CXCL10 ja CXCL11, mida nimetatakse "interferooniga indutseeritavateks CXC kemokiini retseptori 3 ligandideks", indutseeritakse IFN-ga ja need on CXC kemokiini retseptori 3 (CXCR3) ligandid. In vivo uuringud on näidanud nende tähtsust T-lümfotsüütide aktiveerimisel ja sihtorganisse värbamisel [40–42]. Youn et al. näitasid inimese hüpertensiooniga patsientidel nii T-rakkude infiltratsiooni neerudes kui ka kõigi kolme CXCR3 kõrgenenud taset vereringeskemokiinid, mis viitab sellele, et CXCR3 ja selle ligandid on olulised inimese HTN-is osalevate T-rakkude jaoks [43]. Teine uuring on näidanud, et CXCL10 on kõrgenenud hüpertensiivsetel patsientidel ja selle tase on korrelatsioonis nende vererõhu väärtustega [44].

Nende uuringute tõttu keskendusime CXCL9-le, CXCL10 ja CXCL11-le. Kultiveerisime mesangiaalset roti rakuliini ja töödeldi neid 80 mM NaCl ja 0,5 mM melatoniiniga. Leidsime, et CXCL 10 ja 11 on rakkudes ülesreguleeritud ja melatoniin kaotab selle tõusu. Meie tulemused näitavad, et soola mõju CXCL 10 ja 11 tõstmisel ning vastupidine toimemelatoniin, tuvastati mõlemad otseselt mesangiaalsetes rakkudes. Seevastu CXCL9 nendes rakkudes ei tuvastatud.

Meie uuringul on piirangud. Meie FACS-i tulemustes olid paljud CD3 plussidest topeltnegatiivsed nii CD4 kui ka CD8 puhul. Samad tulemused ilmnesid Mattsoni 2010. aasta uuringus [31]. Kuid Mattsoni rühma uuemates uuringutes oli CD3 pluss CD4-CD8-rakke väga vähe [32,33,45,46]. Topeltnegatiivsete CD3 rakkude märkimisväärne vähenemine võis olla tingitud CD45 markeri lisamisest ja ainult CD45-positiivsete rakkude analüüsimisest, mis viidi läbi Mattsoni hilisemates uuringutes. Võimalik, et CD3 pluss CD4-CD8- suur populatsioon on artefakt. CD3 pluss CD4 plus ja CD3 pluss CD8 pluss rakupopulatsiooni kohta pole aga artefakti teada.

5. Kokkuvõtted

Kokkuvõtteks võib öelda, et kõrge soolasisaldusega dieet on seotud T-rakkude infiltratsiooniganeerudDSS-rottidest. Sool suurendas ka spetsiifiliste T-rakkude kemoatraktantide ekspressiooni neerudes. Ravi koosmelatoniin(30 mg/kg/päevas) kaotas need toimed (melatoniinvähendab HSD-indutseeritud T-rakkude infiltratsiooni neerudesse koos CXCL3 ligandi kemokiini ekspressiooni vähenemisega).

Meie in vitro uuring näitab, et sool ja melatoniin võivad reguleerida kemoatraktantide ekspressiooni, mõjutades otseseltneerudrakud.

Autori kaastööd: Conceptualization, AL; formaalne analüüs, AB ja RK; uurimine, RK;metoodika, AB ja AL; kirjutamine – algne mustand, AB ja AL; kirjutamine – läbivaatamine ja toimetamine, YSand EG Kõik autorid on käsikirja avaldatud versiooni läbi lugenud ja sellega nõustunud.

Rahastamine: see uurimus ei saanud välist rahastamist.

Institutsioonilise ülevaatenõukogu avaldus: uuringuprotokolli kiitis heaks Sheba meditsiinikeskuse institutsionaalne loomaeetikakomitee, protokoll nr 1219/19/ANIM ja tervishoiuministeeriumi protokoll nr 16418.

Teavitatud nõusoleku avaldus: Ei kohaldata.

Andmete kättesaadavuse avaldus: selles uuringus esitatud andmed on saadaval vastava autori nõudmisel.

Tänuavaldused: Autorid tänavad Zehava Shabtaid suurepärase tehnilise toe eest ja Michael Kanovskit toimetusteenuste eest.

Huvide konflikt: autorid ei deklareeri huvide konflikti.

Viited

1. Olsen, MH; Angell, SY; Asma, S.; Boutouyrie, P.; Burger, D.; Chirinos, JA; Damasceno, A.; Delles, C.; Gimenez-Roqueplo, AP; Hering, D.; et al. Üleskutse tegevusele ja elukäigustrateegia, et käsitleda praeguste ja tulevaste põlvkondade kõrgenenud vererõhuga seotud ülemaailmset koormust: Lanceti hüpertensioonikomisjon. Lancet 2016, 388, 2665–2712. [CrossRef]

2. O'Brien, E. Lanceti hüpertensioonikomisjon: praeguste ja tulevaste põlvkondade kõrgenenud vererõhu globaalse koormuse käsitlemine. J. Clin. Hüpertensioon 2017, 19, 564–568. [CrossRef]

3. O'Donnell, M.; Mente, A.; Yusuf, S. Naatriumi tarbimine ja südame-veresoonkonna tervis. Circ. Res. 2015, 116, 1046–1057. [CrossRef]

4. Schiffrin, EL Väikeste arterite ümberkujunemise mehhanismid, antihüpertensiivne ravi ja immuunsüsteem hüpertensiooni korral. Clin. Uurige. Med. 2015, 38, E394–E402. [CrossRef]

5. Guzik, TJ; Hoch, NE; Brown, KA; McCann, LA; Rahman, A.; Dikalov, S.; Goronzy, J.; Weyand, C.; Harrison, DG T-raku roll angiotensiin II-indutseeritud hüpertensiooni ja veresoonte düsfunktsiooni tekkes. J. Exp. Med. 2007, 204, 2449–2460. [CrossRef][PubMed]

6. Kleinewietfeld, M.; Manzel, A.; Titze, J.; Kvakan, H.; Yosef, N.; Linker, RA; Muller, DN; Hafler, DA Naatriumkloriid juhib autoimmuunhaigust patogeensete TH17 rakkude indutseerimise kaudu. Loodus 2013, 496, 518–522. [CrossRef]

7. Mattson, DL; Lund, H.; Guo, C.; Rudemiller, N.; Geurts, AM; Jacob, H. Rekombinatsiooni aktiveeriva geeni 1 geneetiline mutatsioon Dahli soolatundlikel rottidel nõrgendab hüpertensiooni ja neerukahjustusi. Olen. J. Physiol. Regul. Täisarv. Comp. Physiol. 2013, 304, 407–414.[CrossRef]

8. Mattson, DL Immuunrakkude infiltreerumineneerudsoolatundliku hüpertensiooni ja neerukahjustuse korral. Olen. J. Physiol. Ren. Physiol.2014, 307. [CrossRef] [PubMed]

9. Lu, X.; Crowley, SD põletik soolatundliku hüpertensiooni ja neerukahjustuste korral. Curr. Hypertens Rep. 2018, 20. [CrossRef][PubMed]

10. Baker, J.; Kempinski, K. Role ofmelatoniinvererõhu reguleerimisel: täiendav antihüpertensiivne aine. Clin. Exp. Pharm.Physiol. 2018, 45, 755–766. [CrossRef] [PubMed]

11. Grossman, E.; Laudon, M.; Zisapel, N. Melatoniini mõju öisele vererõhule: Randomiseeritud kontrollitud uuringute metaanalüüs. Vasc. Terviseriskide juht. 2011, 7, 577–584. [CrossRef] [PubMed]

12. Pozo, D.; Delgado, M.; Fernandez-Santos, JM; Calvo, JR; Gomariz, RP; Martin-Lacave, I.; Ortiz, GG; Guerrero, JM Mel1a-melatoniini retseptori mRNA ekspressioon roti tüümuse ja põrna lümfotsüütide T- ja B-alarühmades. Faseb J. Väljas. Publ. Fed.Am. Soc. Exp. Biol. 1997, 11, 466–473. [CrossRef]

13. Guerrero, JM; Pozo, D.; García-Mauriño, S.; Osuna, C.; Molinero, P.; Calvo, JR. Tuumaretseptorite kaasamine melatoniini poolt suurendatud IL-2 tootmisesse Jurkat rakkudes. Ann. NY Acad. Sci. 2000, 917, 397–403. [CrossRef] [PubMed]

14. Farez, MF; Mascanfroni, ID; Méndez-Huergo, SP; Yeste, A.; Murugaiyan, G.; Garo, LP; Balbuena Aguirre, ME; Patel, B.;Ysrraelit, MC; Zhu, C.; et al.MelatoniinAitab kaasa hulgiskleroosi retsidiivide hooajalisusele. Cell 2015, 162, 1338–1352.[CrossRef] [PubMed]

15. Kirabo, A.; Fontana, V.; de Faria, APC; Loperena, R.; Galindo, CL; Wu, J.; Bikinejeva, AT; Dikalov, S.; Xiao, L.; Chen, W. et al. DC isoketaaliga modifitseeritud valgud aktiveerivad T-rakke ja soodustavad hüpertensiooni. J. Clin. Uurige. 2014, 124, 4642–4656. [CrossRef][PubMed]

16. Leibowitz, A.; Volkov, A.; Vološin, K.; Shemesh, C.; Barshack, I.; Grossman, E. Melatoniin takistabneerudvigastus kõrge soolasisaldusega dieedist põhjustatud hüpertensiooni mudelis, vähendades oksüdatiivset stressi. J. Pineal Res. 2016, 60, 48–54. [CrossRef] [PubMed]

17. Hawkins, P.; Morton, DB; Burman, O.; Dennison, N.; Ausus, P.; Jennings, M.; Lane, S.; Middleton, V.; Roughan, JV; Wells, S. et al. Laboriloomade heaolu hindamise protokollide määratlemise ja rakendamise juhend: BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW täiustamise ühise töörühma üheteistkümnes aruanne. Lab. Anim. 2011, 45, 1–13. [CrossRef]

18. Simko, F.; Reiter, RJ; Paulis, L.Melatoniinratsionaalse alternatiivina resistentse hüpertensiooni konservatiivses ravis.Hypertens Res. 2019, 42, 1828–1831. [CrossRef] [PubMed]

19. Rapp, JP Dahli soolale vastuvõtlikud ja soolale vastupidavad rotid. Hüpertensioon 1982, 4, 753–763. [CrossRef]

20. Dahl, LK; Knudsen, KD; Heine, MA; Leitl, GJ Kroonilise liigse soola allaneelamise tagajärjed. Eksperimentaalse hüpertensiooni muutmine rottidel dieedi variatsioonidega. Circ. Res. 1968, 22, 11–18. [CrossRef] [PubMed]

21. Rapp, JP; Dene, H. Dahli soolatundlike ja soolaresistentsete rottide sisearetatud tüvede areng ja omadused. Hüpertensioon 1985, 7, 340–349. [CrossRef]

22. Brower, M.; Grace, M.; Kotz, CM; Koya, V. Erinevatest allikatest saadud Sprague Dawley rottide kasvuomaduste võrdlev analüüs. Lab. Anim Res. 2015, 31, 166–173. [CrossRef]

23. Talbot, SR; Biernat, S.; Bleich, A.; van Dijk, RM; Ernst, L.; Häger, C.; Hilgers, SOA; Koegel, B.; Koska, I.; Kuhla, A.; et al.Kehakaalu vähendamise määratlemine humaanse lõpp-punktina: kriitiline hinnang. Lab. Anim 2020, 54, 99–110. [CrossRef] [PubMed]

24. Geschka, S.; Kretschmer, A.; Sharkovska, Y.; Jevgenov, OV; Lawrenz, B.; Hucke, A.; Hocher, B.; Stasch, J.-P. Lahustuva guanülaattsüklaasi stimulatsioon hoiab ära fibrootilise koe ümberkujunemise ja parandab soolatundlike Dahl-rottide ellujäämist. PLoS ONE 2011, 6, e21853. [CrossRef] [PubMed]

25. Wang, Y.; Mu, JJ; Liu, FQ; Ren, KY; Xiao, HY; Yang, Z.; Yuan, ZY Soola poolt indutseeritud epiteeli-mesenhümaalne üleminek dahlsoolatundlikel rottidel sõltub kõrgenenud vererõhust. Braz. J. Med. Biol. Res. Rev. Bras. Pesquisa Med. E Biol. 2014, 47, 223–230.[CrossRef]

26. Holmes, SW; Sugden, D. Proceedings: The Effect of melatonin on pinealektoomiast põhjustatud hüpertensioon rottidel. Br. J. Pharm.1976, 56, 360P–361P.

27. Zanoboni, A.; Zanoboni-Muciaccia, W. Eksperimentaalne hüpertensioon pinealektoomiaga rottidel. Life Sci. 1967, 6, 2327–2331. [CrossRef]

28. Zanoboni, A.; Forni, A.; Zanoboni-Muciaccia, W.; Zanussi, C. Pinealektoomia mõju arteriaalsele vererõhule ning toidu ja vee tarbimisele rottidel. J. Endocrinol. Uurige. 1978, 1, 125–130. [CrossRef] [PubMed]

29. Pechánová, O.; Zicha, J.; Paulis, L.; Zenebe, W.; Dobesová, Z.; Kojsová, S.; Jendeková, L.; Sládková, M.; Dovinová, I.; Simko, F. et al. N-atsetüültsüsteiini ja melatoniini toime täiskasvanud spontaanselt hüpertensiivsetel rottidel, kellel on väljakujunenud hüpertensioon. Eur. J. Pharmcol. 2007, 561, 129–136. [CrossRef] [PubMed]

30. Leibowitz, A.; Peleg, E.; Sharabi, Y.; Šabtai, Z.; Shamiss, A.; Grossman, E. Rollmelatoniinhüpertensiooni patogeneesis metaboolse sündroomiga rottidel. Olen. J. Hypertens 2008, 21. [CrossRef] [PubMed]

31. De Miguel, C.; Das, S.; Lund, H.; Mattson, DL T lümfotsüüdid vahendavad hüpertensiooni janeerudkahjustused Dahli soola suhtes tundlikel inimestel. Olen. J. Physiol. Regul. Täisarv. Comp. Physiol. 2010, 298, R1136–R1142. [CrossRef] [PubMed]

32. Evans, LC; Petrova, G.; Kurth, T.; Yang, C.; Bukowy, JD; Mattson, DL; Cowley, AW Suurenenud perfusioonirõhk põhjustab neerude T-rakkude infiltratsiooni Dahli soolatundlikul rotil. Hüpertensioon 2017, 70, 543–551. [CrossRef]

33. Abais-Battad, JM; Alsheikh, AJ; Pan, X.; Fehrenbach, DJ; Dasinger, JH; Lund, H.; Roberts, ML; Kriegel, AJ; Cowley, AWJ; Kidambi, S.; et al. Dieedi mõju Dahli soolatundlikule hüpertensioonile, neerukahjustustele ja T-lümfotsüütide transkriptsioonile. Hypertens 2019, 74, 854–863. [CrossRef] [PubMed]

34. Fehrenbach, DJ; Dasinger, JH; Lund, H.; Zmaj, J.; Mattson, DL Splenotsüütide ülekanne süvendab soolatundlikke hüpertensioonrotte. Exp. Physiol. 2020, 105, 864–875. [CrossRef] [PubMed]

35. Ren, W.; Liu, G.; Chen, S.; Yin, J.; Wang, J.; Tan, B.; Wu, G.; Bazer, FW; Peng, Y.; Li, T.; et al. Melatoniini signaaliülekanne T-rakkudes: funktsioonid ja rakendused. J. Pineal Res. 2017, 62. [CrossRef]

36. Álvarez-Sánchez, N.; Cruz-Chamorro, I.; López-González, A.; Utrilla, JC; Fernández-Santos, JM; Martínez-López, A.; Lardone, PJ; Guerrero, JM; Carrillo-Vico, A. Melatoniin kontrollib eksperimentaalset autoimmuunset entsefalomüeliiti, muutes T-efektori/regulatiivse tasakaalu. Aju käitumine. Immun. 2015, 50, 101–114. [CrossRef]

37. Chen, S.-J.; Huang, S.-H.; Chen, J.-W.; Wang, K.-C.; Yang, Y.-R.; Liu, P.-F.; Lin, G.-J.; Sytwu, H.-K.Melatoniinsuurendab interleukiin 10 ekspressiooni ja pärsib kemotaksist, et pärssida põletikku in situ ja vähendada eksperimentaalse autoimmuunentsefalomüeliidi raskust. Int. Immunopharmacol. 2016, 31, 169–177. [CrossRef] [PubMed]

38. Griffith, JW; Sokol, CL; Läige, ADKemokiinidja kemokiini retseptorid: rakkude positsioneerimine peremeesorganismi kaitseks ja immuunsuseks.Annu. Rev. Immunol. 2014, 32, 659–702. [CrossRef] [PubMed]

39. Alsheikh, AJ; Dasinger, JH; Abais-Battad, JM; Fehrenbach, DJ; Yang, C.; Cowley, AWJ; Mattson, DL CCL2 vahendab varajast neeru leukotsüütide infiltratsiooni soolatundliku hüpertensiooni ajal. Olen. J. Physiol. Ren. Physiol. 2020, 318, F982–F993. [CrossRef][PubMed]

40. Liu, L.; Callahan, MK; Huang, D.; Ransohoff, RM kemokiini retseptor CXCR3: ootamatu mõistatus. Curr. Üles. Dev. Biol.2005, 68, 149–181. [CrossRef] [PubMed]

41. Peigmees, JR; Läige, AD CXCR3 ligandid: üleliigsed, koostöö- ja antagonistlikud funktsioonid. Immunol. Cell Biol. 2011, 89 207–215. [CrossRef] [PubMed]

42. Van Raemdonck, K.; Van den Steen, PE; Liekens, S.; Van Damme, J.; Struyf, S. CXCR3 ligandid haiguses ja ravis. Cytokine Growth Factor Rev. 2015, 26, 311–327. [CrossRef] [PubMed]

43. Youn, J.-C.; Yu, HT; Lim, BJ; Koh, MJ; Lee, J.; Chang, D.-Y.; Choi, YS; Lee, S.-H.; Kang, S.-M.; Jang, Y.; et al. Immunosestseeruvad CD8 pluss T-rakud ja CXC kemokiini retseptor tüüp 3kemokiinidon suurenenud inimese hüpertensiooni korral. Hypertens 2013, 62, 126–133.[CrossRef] [PubMed]

44. Stumpf, C.; Auer, C.; Yilmaz, A.; Lewczuk, P.; Klinghammer, L.; Schneider, M.; Daniel, WG; Schmieder, RE; Küüslauk, CD Seerumi Th1 kemoatraktandi interferoon-gamma-indutseeritava valgu (IP) 10 tase on essentsiaalse hüpertensiooniga patsientidel kõrgenenud. Hypertens Res. 2011, 34, 484–488. [CrossRef] [PubMed]

45. Rudemiller, NP; Lund, H.; Priestley, JRC; Endres, BT; Prokop, JW; Jacob, HJ; Geurts, AM; Cohen, EP; Mattson, DL SH2B3 (LNK), genoomi hõlmava hüpertensiooniuuringu kandidaadi, mutatsioon nõrgendab Dahli soolatundlikku hüpertensiooni põletikulise modulatsiooni kaudu. Hüpertensioon 2015, 65, 1111–1117. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Wade, B.; Petrova, G.; Mattson, DL Immuunfaktorite roll angiotensiin II-indutseeritud hüpertensioonis ja neerukahjustuses dahlsoolatundlikel rottidel. Olen. J. Physiol. Regul. Täisarv. Comp. Physiol. 2018, 314, R323–R333. [CrossRef] [PubMed]