Makrofaagide ammendumine vähendab haiguspatoloogiat faktorist H sõltuva immuunkompleksi poolt vahendatud glomerulonefriidi korral

TäiendustegurH (FH) on inimese ja hiire alternatiivse komplemendi raja võtmeregulaator. Varasemad uuringud näitasid, et FH puudumine muudab C57BL6 hiire vastuvõtlikukskrooniline seerumtõbi(CSS) koos suurenemiseganeerude sisseÜhendusmakrofaagide ltreeriminevõrreldes kontrollidega. Et mõista, kas makrofaagide suurenenud värbamine (Mϕs) neerule sõitis sisseFlammatsiooni ja leviva vigastuse korral uurisime eFfjne Mϕ ammendumine klodronaadiga CSS-iga FH knockout hiirtel. Kaheksa nädala vanuseid FHKO hiiri raviti apoferritiiniga (4 mg hiire kohta) 5 nädalat ja kas vehiikuliga (PBS) või klodronaadiga (50 mg/kg ip, 3 korda nädalas viimase 3 nädala jooksul). Haldamineklodronaat vähendas monotsüüte ja Mϕs neerudeskõrval>80%. 

NeerufunktsioonBUN-i poolt hinnatud ja albumiin jäi M ammendumisel normaalsele lähemaleϕs. Klodronaatravi takistas tsütokiinide (TNF) muutusi ja IL{0}} ning sidekoe kasvufaktori (CTGF) geeniekspressiooni suurenemine, TGF -1, maatriksi metalloproteinaas-9 (MMP9),Ühendusbronektiin, laminiin ja kollageen CSS-iga FHKO hiirtel (P < 0:05). Klodronaatravi tõi kaasa suhtelise kaitseimmuunkompleks- (IC-) vahendatud haiguspatoloogia CSS-i ajal, mida hindassigniÜhendusoluliselt vähenenud glomerulaarpatoloogia(GN) ja rakuväline maatriks. Meie tulemused näitavad, et komplemendi aktiveerimine on üks mehhanisme, mis reguleerivad makrofaagide maastikku ja seeläbiÜhendusbrosis. Täpne mehhanism tuleb veel lahti mõtestada. Lühidalt, meie andmed näitavad, et Mϕs mängivad olulist rolli FH-sõltuvates ICGN-is ja Mϕ ammenduminevähendab haiguse progresseerumist.

25% EHHINAKOSIIDI JA 9% AKTEOSIIDI NEERUTUNGIMISEKS LOODUSLIKU ORGAANILISE TASTANHEKSTRAKTI SAAMISEKS KLIKI SIIA

1. Sissejuhatus

Krooniline neeruhaigus(CKD) on ülemaailmne terviseprobleem; 10% sellest on immuunkompleksi (IC-) vahendatud ja esineb seerumihaiguse, infektsioonide ja autoimmuunhaiguste korral. [1]. USA neeruandmete süsteemi aastaaruanne väidab, etkroonilise neeruhaigusega isikud"on ilmselgelt suur surmaoht", mille esinemissagedus on kolme aastakümne jooksul 10-kordi suurenenud, mille käigus haiged patsiendid kaotasid 70% oma elueast. NIDDK andmetel on ligikaudu 14% täiskasvanud elanikkonnast diagnoositud neeruhaigus, mis teeb sellest 9. peamise surmapõhjuse [2]. Neerud on komplemendi poolt vahendatud kahjustuste suhtes väga vastuvõtlikud, eriti autoimmuunsete ja põletikuliste seisundite korral [3, 4].

Komplemendi süsteem osaleb kaasasündinud ja adaptiivsetes immuunvastustes ning tagab esimese kaitseliini mikroorganismide vastu [5, 6]. See koosneb kolmest unikaalsel viisil käivitatud aktiveerimisteest, mis koosneb enam kui 30 plasma ja rakuga seotud valgust [7]. Alternatiivne rada on pidevalt valvel ja seda reguleerivad valgud, nagu komplemendi faktor H (FH). FH on ringlev valk, mida sünteesib enamasti maksas [8]. FH-puudulikel (fh-/-) hiirtel, keda raviti apoferritiiniga, areneb 5 nädala jooksul pärast ravi krooniline seerumtõbi (CSS), mis põhjustab difuusset proliferatiivset glomerulonefriiti (GN), samas kui pesakonnakaaslastel C57BL/6 hiirtel, kellel on piisav H-faktor (FH) glomerulaarne põletik [9]. F4/80+ makrofaagide infiltratsioon toimub neerudes ja seda täheldatakse fh-/- hiirte IC ladestumise ümbruses. Komplemendi aktiveerimine tekitab anafülatoksiine C3a ja C5a, mis osalevad Mϕs kaubitsemises põletikukohta. C5a/C5aR1 signaaliülekande pärssimine vähendas Mϕ-d neerudes [10]. Selles seadistusesneerukahjustuson seotud neerude infiltratsiooniga, vaid mehhanismid, mis võivad olla selle põhjustamisega seotudneerukahjustustundmatuks jääda.

Joonis 1: FH muudab makrofaagide markergeene FH-sõltuva ICGN-ga hiirte neerudes. Reaalajas kvantitatiivne PCR CD204 ja CD206 jaoks, kasutades neerudest eraldatud mRNA-d pärast 5-nädalast soolalahust või apoferritiini. Avaldis normaliseeritakse GAPDH-ks (n=6/rühm). ∗P < 0:01. Graafikud kujutavad geenide voltide muutust apoferritiiniga töödeldud fh-/- hiirtel (n=6) võrreldes soolalahusega töödeldud fh-/- hiirtega (n=6).

Hematopoeetiliste rakkude [11] tekitatud monotsüüdid (Mo) migreeruvad läbi endoteeli kudedesse, kus nad diferentseeruvad Mϕ-deks. Markerid nagu F4/80, CD11b, CD68 ja Fc retseptorid suudavad tuvastada Mϕs. Mϕ-d on neeruhaiguse erinevates eksperimentaalsetes mudelites kriitiliselt seotud neerukahjustuse, paranemise ja fibroosiga [12, 13]. Hiljuti näitasid meie uuringud, et FH-sõltuva ICGN-i neerukahjustus on seotud Mϕs neerude infiltratsiooniga. Lisaks on varasemad uuringud näidanud, et neerude Mϕ infiltratsiooni pärssimine vähendab arteriaalset rõhku ja hoiab ära glomerulaarkahjustuse ja fibroosi mitmesugustes nefropaatia loommudelites [14, 15]. Kuid meile teadaolevalt ei ole käsitletud Mϕ ammendumise mõju FH-sõltuva ICGN-iga seotud neerukahjustuse ajal. Seetõttu uuriti käesolevas uuringus Mϕ-i rolli FH-sõltuva ICGN-ga seotud neerukahjustusel, kasutades liposoomi klodronaadi. Klodronaat (klodroonhape) on bisfosfonaat, mis metaboliseeritakse mittehüdrolüüsitavaks ATP analoogiks [16]. Meie katsed näitavad, et Mϕ-d mängivad võtmerolli neerufunktsiooni kaotuses reguleerimata komplemendi aktiveerimise tingimustes. Seetõttu võib Mϕ-de vähendamine või Mϕ-de juhendamine eeldada parandusfenotüüpi vähendada haiguse patoloogiat ja seda saab terapeutiliselt ära kasutada.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Katseloomad.

Fh-/- hiiretüve genereeris ja pakkus lahkelt Drs. Matthew Pickering ja Marina Botto (Londoni Imperial College) ning ristusid meie laboris pidevalt C57BL/6 tüvega üle 10 põlvkonna. Kontrollidena toimisid pesakonnakaaslased, kellel on piisavalt FH-d (n=8/rühm) Genotüpiseerimine viidi läbi PCR-põhiseid meetodeid kasutades. Hiiri hoiti temperatuuril 20–22 kraadi C 12-tunnise valguse ja 12-tunnise pimeda valgustuse tsüklis steriilsetes ventileeritavates puurides koos toidu ja veega ad lib. Chicago ülikooli ja Buffalo ülikooli institutsionaalsed loomade hooldamise ja kasutamise komiteed kiitsid kõik uuringud heaks.

2.2. Kroonilise seerumihaiguse protokoll.

CSS indutseeriti 6–8-nädalastel fH−/− või metsikut tüüpi hiirtel, manustades 5 nädala jooksul igapäevaselt intraperitoneaalselt 4 mg hobuse põrna apoferritiini (Calzyme Laboratories) ilma adjuvandita [10, 17, 18]. Pesakonna kontrollid said samaaegselt intraperitoneaalselt soolalahust

2.3. Neerufunktsiooni hinnangud.

Vere uurea lämmastiku (BUN) kontsentratsioonid määrati Beckman Autoanalyzeriga (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Albumiini kontsentratsioon uriinis mõõdeti hiire albumiini ELISA komplektiga (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) ja normaliseeriti kolorimeetriliselt mõõdetud uriini kreatiniiniks (Stanbio Laboratory, Boerne, TX), nagu eelnevalt kirjeldatud [19].

Joonis 2: Klodronaat vähendab FH-sõltuva ICGN-ga hiirtel üha enam neerude makrofaage. Antud on F4/80+ monotsüütide/Mϕs voolutsütomeetria profiilid tüüpiliselt 0, 2., 4. ja 7. päeval. F4/80+ rakkude ekspressioon määrati voolutsütomeetria abil. Andmeid analüüsiti FlowJo V10 tarkvara abil. F4/80+ lahtreid vähendatakse märkimisväärselt igal ajahetkel, jõudes 7. päevaks alla 10%. Iga ajahetk n=6.

2.4. Histoloogia.

Neerud sisestati parafiini ja fikseeriti malin-fiksatsiooniga ning genereeriti nelja mikromeetri pikkused sektsioonid. Lõigud värviti Periodic Acid-Schiffiga ja uuriti neerupatoloogi (AC) poolt pimedal viisil. Iga slaidi puhul hinnati proliferatiivset glomerulonefriiti ja glomeruloskleroosi astmelt 0 kuni 4, nagu eelnevalt kirjeldatud [20]. Immunofluorestsentsmikroskoopia jaoks külmutati neerukude kiirkülmutatud 2-metüülbutaanis, mis oli eeljahutatud kuivas jääs. Immunofluorestsentsvärvimiseks (IF) töödeldi nelja mikroni krüostaadi sektsioone. Sektsioonid fikseeriti 4% paraformaldehüüdis ja värviti Alexa{12}}konjugeeritud hiirevastase C3 (Cappel) ja Alexa 555 hiirevastase IgG-ga. Värvimise intensiivsuse ja jaotuse poolkvantitatiivne skoor vahemikus 0 kuni 4 esitati pimendatud viisil, nagu eelnevalt kirjeldatud [19].

2.5. qRT-PCR.

Neerud koguti ja kogu RNA ekstraheeriti kudedest, kasutades TRIzol reagenti vastavalt tootja juhistele (Invitrogen, USA). cDNA sünteesiti SuperScript III pöördtranskriptaasi (Invitrogen) abil. qRT-PCR viidi läbi, kasutades Power SYBR Green PCR Master segu järjestusdetektoril ABI 7700 (Applied Biosystems). PCR amplifikatsioon viidi läbi kogumahus 25 ul, mis sisaldas 12,5 ul 2x TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 6,25 ul nukleaasivaba vett, 5 ul cDNA-d ja 1,25 ul sobivaid praimereid (IDT). Kõik qPCR praimerid (tabel 1) kavandati spetsiifilisuse ja tundlikkuse tagamiseks tarkvara Primer3 (Whitehead Institute for Biomedical Research) abil. MRNA taseme kvantifitseerimiseks normaliseerisime sihtgeenide ekspressiooni glütseraldehüüd-3- fosfaatdehüdrogenaasiks. Suhtelised mRNA ekspressioonitasemed arvutati 2-ΔΔCt meetodil ja normaliseeriti GAPDH ekspressioonitasemetega.

2.6. Statistika.

Kõik tulemused on keskmised ± SD igas rühmas vähemalt {{0}} hiirelt. Kahe rühma võrdlemiseks GraphPad Prism 5 abil kasutati paaristamata kahepoolset testi (andmed normaaljaotusega) või Mann-Whitney U testi (andmed ilma normaaljaotuseta).0. Statistilist olulisust väljendatakse järgmiselt: ∗P < 0:05; ∗∗P < 0:01; ja ns: ei ole oluline.

Wecistanche'i tugiteenus - Hiina suurim tsistanšeksportija:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Lisateabe saamiseks ostke:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop