- Lipoehape suurendab kollageeni sünteesi ja ladestumist mittediabeetiliste ja diabeetiliste rottide neerudes

Nevena Grdović jt

-Lipoehapet (ALA) kasutatakse laialdaselt toidulisandina ja raviainena diabeedi ravis. ALA väljakujunenud antioksüdantset ja hüpoglükeemilist toimet peeti eriti oluliseks võitluses diabeetiliste tüsistustega, sealhulgasneeru-vigastus. Käesolevas uuringus hinnati ALA potentsiaali mõjutada profibrootilisi sündmusineerudmis võib muuta selle struktuuri ja toimimist. ALA-d manustati intraperitoneaalselt (10 mg/kg) mittediabeetiliste ja streptozototsiini poolt indutseeritud diabeetiliste isastele Wistari rottidele 4 ja 8 nädala jooksul. ALA toimeid hinnati alates struktuursetest/morfoloogilistest muutustest läbi muutuste, mis iseloomustavad profibrootilisi protsesse kuni kollageeni geeniekspressiooni reguleerimiseni.neerud. Siin näitasime, et ALA parandas süsteemset glükoosi ja uurea taset, vähendas selle moodustumistneeru-arenenud glükatsiooni lõpp-produktid (AGE) ja säilitasid diabeetiliste rottide neerude struktuurse terviklikkuse. Siiski ei leevendanud ALA diabeedi korral esilekutsutud profibrootilisi sündmusi, kuna kollageeni süntees/sadestumine ja transformeeriva kasvufaktori - 1 (TGF- 1) ja silelihase aktiini (-SMA) ekspressioon püsisid ALA-s kõrgendatud. ravitud diabeetikutega rotid, eriti pärast 8-nädalast diabeedi algust. Veelgi enam, mittediabeetiliste rottide 8-nädalane ravi ALA-ga viis profibrootiliste tunnuste väljakujunemiseni, mis kajastus kollageeni suurenenud sünteesis/ladestumises. Lisaks TGF- 1 allavoolu signaaliülekandele hõlmab ALA-ga ravitud mittediabeetilistel rottidel kollageeni IV ülesreguleerimise aluseks olev täiendav mehhanism selle promootori vähenenud DNA metüülimist, mis võib tuleneda Tet1 suurenenud ekspressioonist. Need leiud rõhutavad terapeutilist ettevaatust ALA kasutamisel, eriti patsientidel, kellel onneeru-diabeetiktüsistused.

Lisateabe saamiseks: ali.ma@wecistanche.com

Click to Cistanche ekstrakti pulber neeruhaiguse jaoks

1. Sissejuhatus

Diabeetikneerudhaigus (DKD) või diabeetiline nefropaatia on üks mikrovaskulaarsetest tüsistustest, mille esinemissagedus diabeediga patsientide seas on 20-40 protsenti, millega kaasnevad progresseeruvad struktuurimuutused ja neerufunktsiooni kaotus [1]. DKD aluseks olev patofüsioloogiline mehhanism on keeruline ja saab alguse kroonilisest hüperglükeemiast, mis omakorda vallandab oksüdatiivse stressi, arenenud glükatsiooni lõppproduktide (AGE) moodustumise, MAPK/PKC signaaliradade aktiveerimise ja mitmete põletikueelsete ja profibrootiliste vahendajate järgneva ekspressiooni [2, 3]. Nende sündmuste vaheline läbirääkimine põhjustab ekstratsellulaarse maatriksi (ECM) valkude akumuleerumist mesangiumis ja tubulointerstitiumis, millel on klassikaline histopatoloogiline muster.neeru-fibroos. See algab struktuursete muutustega, nagu basaalmembraani paksenemine ja mesangiaalne laienemine, arenedes järk-järgult glomeruloskleroosiks ja interstitsiaalseks fibroosiks, mis lõpuks kulmineerubneeru-ebaõnnestumine[4, 5].

Transformeeriva kasvufaktori - 1 (TGF- 1) allavoolu signaalimine on osa haava paranemisprotsessist, mis pikaajalise põletiku, hüperglükeemia või oksüdatiivse stressi korral, mis iseloomustab diabeeti, muutub patofüsioloogiliseks fibroosiks [6] . TGF- 1 on DKD patogeneesi keskne vahendaja, mis on ECM-i valgu ekspressiooni peamine regulaator diabeediga patsientidel, tõenäoliselt hüperglükeemilise ja häiritud oksüdatiivse keskkonna tagajärjel [7–10]. TGF- 1 indutseerib ECM-i akumulatsiooni I ja IV tüüpi kollageeni, silelihase aktiini (-SMA), laminiini ja fibronektiini sünteesi stimuleerimise ning ECM-i lagundavate ensüümide inhibeerimise kaudu [11].

IV tüüpi kollageen on basaalmembraani kõige rikkalikum koostisosa [12], mis väljendub füsioloogilistes tingimustes glomerulaarsetes ja tubulaarsetes basaalmembraanides [13]. Diabeetilise nefropaatiaga kaasneb aga IV tüüpi kollageeni ebanormaalne ekspressioon, mis hõlmab liigset tootmist ja ebaregulaarset jaotumist interstitsiumi ja mesangiumi kaudu [14–16]. Kuuest IV tüüpi kollageeni (1- 6) isovormist on 1 (IV) ja 2 (IV) üldiselt kõigis basaalmembraanides. Kollageeni 1 (IV) ja 2 (IV) ahelaid kodeerivad geenid Col4a1 ja Col4a2, mille transkriptsiooniregulatsioon sõltub hästi kirjeldatud cis-trans interaktsioonidest [17], kuid hiljutised leiud rõhutavad epigeneetiliste mehhanismide, sealhulgas DNA metüülimise, olulist rolli. nende väljenduse reguleerimine [18–20].

Arvestades DKD taga peituvaid patofüsioloogilisi mehhanisme, on ravistrateegiad sirgjoonelised ja suunatud hüperglükeemiale ja oksüdatiivsele stressile. ALA, mis on üks laialdaselt kasutatavaid antioksüdante, hüpoglükeemiline ja antioksüdantne potentsiaal paraneb.neeru-diabeetilise nefropaatiaga seotud patoloogilised muutused [21–23]. Seoses naha vananemisega teatati aga ALA kasulikest mõjudest I tüüpi kollageeni sünteesi suurenemise kaudu inimese naha fibroblastides [24]. Arvestades DKD patofüsioloogiat, võib ALA sarnane toime olla kahjulik diabeediga patsientidele.neeru-tüsistused. Selle taustal keskenduti käesolevas uuringus ALA mõju hindamisele neerude struktuursetele/morfoloogilistele tunnustele ja profibrootilistele protsessidele, rõhuasetusega IV tüüpi kollageeni geeniekspressioonile diabeetilistel ja mittediabeetilistel rottidel.

2. Materjal ja meetodid

2.1. Loomad, ravi ja katse seadistus.Kõik katsed viidi läbi 2.{1}}kuuste isaste albiino Wistari rottidega, kes kaalusid 220–250 g. Kõik Belgradi Ülikooli Bioloogiauuringute Instituudi Siniša Stan-kovići laboriloomade kasutamise eetikakomitee poolt heaks kiidetud loomprotseduurid olid kooskõlas direktiiviga 2010/63/EL katse- ja katseloomade kaitse kohta. muudel teaduslikel eesmärkidel. Selles uuringus osalenud loomad ohverdati füüsilise eutanaasia meetodil, kasutades giljotiini, vastavalt kõikidele loomade eutanaasia juhistele. Surm saabub silmapilkselt ja loomad ei kannatanud. Eutanaasia viidi läbi operatsioonisaalis, pidamisruumist eraldatuna, üks loom ühekaupa (ülejäänud katses osalenud loomi hoiti katseruumis, mis on eraldatud operatsiooniruumist, kus eutanaasia tehti, et vältida teisele stressi loomad). Eutanaasiat viis läbi hästi koolitatud ja kogenud kraam. Peade eemaldamiseks kasutatud seadmed olid heas töökorras (terade teravuse tagamiseks on hooldused regulaarsed).

Diabeet kutsuti esile streptosotsiini (STZ) (MP Biomedicals) mitme väikese annuse (40 mg/kg) süstimisega viiel järjestikusel päeval; kontrollrottidele süstiti ainult vehiikulit (0,1 M naatriumtsitraatpuhver, pH 4,5). Vere glükoosisisaldust mõõdeti 24 tundi pärast viimast STZ süstimist vere glükomeetriga Accu-Chek Active ja loomi loeti diabeetikuteks, kui tühja kõhu veresuhkru tase ületas 20 mmol/l. Rotid jagati juhuslikult nelja katserühma: kontroll (kontroll, n=8), kontroll, keda raviti ALA-ga (ALA, n=8), diabeetikud (STZ, n=10) ja diabeetikute rühm, keda raviti ALA-ga (STZ/ALA, n=10). ALA-d (Ivančić i synovial, Belgrad, Serbia) süstiti intraperitoneaalselt (10 mg/kg) iga päev 4 ja 8 nädala jooksul alates viimasest STZ-süstist. Pärast ohverdamist ja vere võtmist tehti kõhu sisselõige ja mõlemadneerudeemaldati. Üksneerudkülmutati vedelas lämmastikus, hoiti -80 kraadi juures ja kasutati valkude, DNA ja RNA isoleerimiseks, samas kui teine ​​fikseeriti histoloogiliste uuringute jaoks 10% puhverdatud formaliinis.

2.2.Biokeemiline analüüs.Rotid on enne ohverdamist üleöö paastunud. Vere seerum koguti pärast vere hüübimist ja tsentrifuugimist 2,000 g juures 10 minutit. Seerumit kasutati glükoosikontsentratsioonide määramiseks kaubandusliku komplektiga (Gluco-quant Glucose/HK; Boehringer), seerumi triglütseriidide taseme määramiseks GPO-PAP meetodil ensümaatilise komplekti abil (Randox Laboratories, UK), uurea taseme määramiseks Urea Assay abil. Kit (Abcam, USA) ja kreatiniini kontsentratsioonid, kasutades Caymani kreatiniini analüüsi vastavalt tootja juhistele.

2.3.Histoloogiline analüüs ja immunovärvimine.Formaliini fikseeritudneerudkudesid dehüdreeriti kahanevas ksülooli ja alkoholide seerias, et lisada need parafiiniplokkidesse. Koeplokid lõigati pöörleval mikrotoomil (RM 2125RT; Leica Microsystem) 5 μm. Neerude morfoloogia muutuste jälgimiseks värviti kudede lõigud perioodilise happe-Schiff (PAS) meetodil. Lisaks analüüsiti värvitud lõike, kasutades Olympuse mikroskoopi (BX-51), mis oli varustatud mikroajami, mootoriga staadiumi ja kaameraga, mida juhib uus CAST stereoloogiline tarkvarapakett Visiopharm Integrator System. Torukujulised valendiku alad saadi objektiivi 40-kordse suurendusega ja väljendati protsentides (protsentides) uuritud ala kohta. Mesangiaalse maatriksi fraktsiooni hinnati positiivse PAS-i värvumise pindalana, väljendatuna protsentides kogu glomerulaarpiirkonna kohta (objektiivne suurendus 100x).

Kollageenikiudude tuvastamiseks värviti koelõigud Massoni trikroomvärviga. Pärast värvimist vaadeldi lõike valgusmikroskoobi all (DM RB Photomicroscope Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Saksamaa, varustatud Leica DFC 320 CCD kaameraga; objektiivi suurendus 40x). Pildianalüüsi tegi ImageJ tarkvara (versioon 1.52p, National Institutes of Health). Pildid teisendati RGB-virnadeks ja kollageeni pindala proportsiooni koepinna kohta määrati käsitsi.

Immunohistokeemiline analüüs viidi läbi punktis [25] kirjeldatud viisil, kasutades N(a)-(karboksümetüül)lüsiini (CML) vastu tekitatud polüklonaalset antikeha (lahjendus 1:50) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) ja sekundaarset antikeha mädarõika peroksidaasi (1: 100) (Santa Cruzi biotehnoloogia). Koelõigud värviti 3,3'-diaminobensidiiniga (DAB), värviti hematoksüliiniga ning paigaldati ja vaadeldi valgusmikroskoobi all (Leica DM RB fotomikroskoop; objektiivi suurendus 40x). Pildianalüüsi tegi ImageJ tarkvara (versioon 1.52p, National Institutes of Health). Pilte töödeldi värvidekonvolutsiooniga H DAB vektori valikuga. CML-i signaaliülekanne arvutati DAB-värvimise keskmise halli intensiivsusena, mis oli normaliseeritud tuumade arvuga (saadud, kasutades suvandit Analyze Particles).

2.4.Western blot analüüs.25 ugneerudhomogenaadid eraldati SDS-PAGE abil, kanti polüvinülideendifluoriidmembraanidele ja sondeeriti GAPDH (FL-335) vastaste polüklonaalsete antikehadega ning roti TGF- 1 (3C11) ja SMA (CGA7) vastaste monoklonaalsete antikehadega. Santa Cruzi biotehnoloogia ja kõik lahjendatud vahekorras 1:1,000. Tuvastamine viidi läbi täiustatud kemoluminestsentstuvastussüsteemiga (Santa Cruz Biotechnology). Immunoreaktiivsete ribade kvantifitseerimine viidi läbi TotalLab (Phoretix) elektroforeesi tarkvara abil (versioon 1.10) ja normaliseeriti laadimiskontrollina kasutatud GAPDH-ga.

2.5.Reaalajas kvantitatiivne PCR (RT-qPCR).Kogu RNA eraldatineerudkasutades RNeasy Mini Kit (Qiagen). cDNA sünteesiks töödeldi 1 ug kogu RNA-st DNaas I-ga ja pöördtranskribeeriti RevertAid First-Strand cDNA sünteesikomplektiga (Fermentas, Burlington, Kanada), kasutades juhuslike heksameeri ja oligo (dT) praimerite segu. MRNA tasemed kvantifitseeriti, kasutades 2x Maxima SYBR Green/-ROX qPCR Master Mix (Fermentas) QuantStudio 3 reaalajas PCR süsteemis (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) kasutati praimerite (loetletud täiendavas tabelis S1) kavandamiseks Col4a1, Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b ja Tet1 geeniekspressioonid. Termotsüklid koosnesid esialgsest denaturatsioonist 95 kraadi / 10 min ja 40 kaheastmelise PCR tsüklist 95 kraadi / 15 s ja 60 kraadi / 60 s. Huvipakkuvate geenide mRNA ekspressioonitasemed normaliseeriti 2-dCT meetodil võrdlusgeenina Actb mRNA ekspressioonitasemega.

2.6. Genoomse DNA eraldamine ja DNA muundamine bisulfitidega.Genoomne DNA eraldati, kasutades Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB) meetodit [26], vastavalt imetajate kudedest DNA ekstraheerimise protokollile (saadaval veebis aadressil https://bomb.bio/protocols/). Genoomne DNA allutati BOMB bisulfiidi muundamise protokollile (saadaval veebis aadressil https://bomb.bio/protocols/) [26].

2.7.DNA metüülimise globaalsete tasemete mõõtmine.Globaalseid DNA metüülimise tasemeid mõõdeti 5-mC DNA ELISA komplektiga (Zymo Research, California, USA) vastavalt tootja juhistele. Puhastatud genoomne DNA (100 ng), mis on eraldatudneerudkasutati kõigist katserühmadest ja iga proovi analüüsiti kahes eksemplaris. Statistilist olulisust hinnati blokeerimisega ühesuunalise ANOVA abil, käsitledes iga ELISA plaati plokina.

2.8. Metülatsioonispetsiifiline PCR (MSP).MSP analüüsi jaoks mõeldud praimerite paarid, mis on kavandatud Col4a1 promootorpiirkonnale, mis hõlmab transkriptsiooni algussaiti (TSS), kavandati MethPrimeri abil (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi) (täiendav tabel S2 ). MSP analüüsis kasutatud praimerite asukohad (võrreldes Col4a1 TSS-iga, märgitud pluss 1-ga) on järgmised: M fw (-35, -14), M rev ( pluss 44, pluss 64), U fw (-35, -14) ja U pööre (pluss 45, pluss 69). Kuna iga praimer katab 2 CpG-d, testiti metüülimise olekut praimeripaari kohta kokku 4 CpG-d. MSP reaktsioonisegu sisaldas Maxima SYBR Green/ROX qPCRqRT-PCR Master Mix (Fermentas), 20 ng bisulfitiga muundatud DNA-d ja 0,5 µM iga praimerit, mis on spetsiifiline metüülitud (M) ja metüleerimata (U) DNA jaoks. lõppmahuga 10 μL. MSP viidi läbi QuantStudio 3 reaalajas PCR süsteemis (Applied Biosystems). PCR tsüklitingimused olid järgmised: algsed denaturatsioonietapid 95 kraadi / 10 min ja sellele järgnes 40 denatureerimistsüklit 95 kraadi / 15 s ning lõõmutamine ja pikendamine 58 kraadi / 60 s. Metüleeritud DNA suhtelist taset väljendati metülatsiooniindeksi abil, mis on defineeritud kui 2 (demetüleeritud tsükkel Ct) − (metüleeritud tsükkel Ct) [27].

2.9.Statistiline analüüs.Andmed väljendati kõigi uuritud parameetrite keskmisena ± SD (standardhälve). Kahe rühma vahel normaalselt jaotunud muutujate keskmiste võrdlemiseks kasutati õpilase t-testi. Statistilisi erinevusi rühmade vahel analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes Tukey mitmekordne võrdlustest, kasutades GraphPad Prism Software, ver. 5.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

3. Tulemused

3.1. ALA mõju diabeetiliste rottide biokeemilistele indeksitele.Glükoos, triglütseriidid, uurea ja kreatiniin määrati kontroll-, diabeetiliste ja ALA-ga ravitud mittediabeetiliste ja diabeetiliste rottide seerumis (joonis 1). Diabeediseisundit jälgiti 4 nädalat ja 8 nädalat, et hõlmata kahjulike protsesside avaldumiseks vajalik ajakulu. Mõlemat diabeeti põdevate rottide rühma iseloomustas hüperglükeemia, triglütseriidide ja kreatiniini taseme tõus, kuid ilma statistilise olulisuseta, ning oluliselt suurenenud uurea tase. Diabeediga rottidel põhjustas 4-nädalane ravi ALA-ga seerumi glükoositaseme languse kontrollväärtuseni, samas kui 8 nädala pärast glükoosisisaldus langes, kuid jäi siiski märkimisväärselt kõrgemaks võrreldes kontrollidega. Mõlemas ALA-ga ravitud diabeetikute rühmas ei muutunud triglütseriidid ja kreatiniin märkimisväärselt. Ravi ALA-ga vähendas märkimisväärselt diabeetiliste rottide uurea taset 4 nädala pärast, samas kui 8 nädala pärast vähenes diabeetiliste rottide uurea tase seerumis võrreldes diabeetiliste kontrollidega, kuid ilma statistilise tähtsuseta. ALA manustamine kontrollrottidele ei mõjutanud oluliselt uuritud biokeemilisi parameetreid.

3.2.Neeru struktuuri ja KML-i moodustumise morfoloogiline hindamine pärast ALA-ravi.PAS-i värvimine tõi esile diabeediga seotud iseloomulikud neerude histopatoloogilised tunnused (joonis 2 (a)). Glomerulaarse basaalmembraani paksenemine ilmnes pärast 4-nädalast diabeedi algust, samas kui mesangiaalse maatriksi laienemist ja laienenud valendikuga tuubuleid täheldati pärast 8-nädalast diabeedi algust. Histoloogiline analüüs näitas, et tubulaarse luumeni, glomerulaar- ja mesangiaalse maatriksi alad suurenesid 8-nädalastel diabeetilistel rottidel märkimisväärselt võrreldes kontroll- ja ALA-ga ravitud kontrollrottidega. Kuid pärast ALA-ravi vähenes torukujuline dilatatsioon ja mesangiaalse maatriksi laienemine märkimisväärselt, kuid jäi siiski kontrollväärtustest kõrgemaks, samas kui glomerulaarpiirkond taastati täielikult kontrolltasemetele. ALA-ga ravitud kontrollrottidel leiti, et mesangiaalse maatriksi fraktsioon on suurenenud, mis viitab sellele, et ALA pikaajaline kasutamine võib mõjutada mõningaid ALA struktuurilisi omadusi.neerud(Joonis 2(a)).

AGE-d on patogeensed tegurid, mis soodustavad diabeedi korral neerukahjustusi. Selleks, et kontrollida, kas ALA mõjutab AGE toodete kuhjumistneeruddiabeetiliste rottide CML-i neerusisaldust hinnati immunohistokeemilise värvimisega kontroll-, diabeetiliste rottide (4 ja 8 nädalat) ning ALA-ga ravitud kontroll- ja diabeetiliste rottide (4 ja 8 nädalat) (joonis 2 (b)). KML-i värvumine oli mõlemas diabeetiliste rottide rühmas positiivne, mis näitas, et CML akumuleerub peamiselt tubulointerstitiumis ja vähemal määral glomerulites. Vastavalt CML sisalduse kvantifitseerimisele olid need muutused statistiliselt olulised võrreldes vastavate kontrollidega (joonis 2(b)). Pärast diabeetiliste rottide ALA-ravi (4 ja 8 nädalat) vähenes märkimisväärselt nii tubulointerstitsiaalne kui ka glomerulaarne CML-i immunoreaktiivsus, samas kui ALA-ga ravitud kontrollrottidel jäi CML-i positiivsus tuvastamatuks nagu kontrollidel.

3.3. ALA mõju kollageeni ladestumisele ja Col4a1 geeniekspressioonile.Massoni trikroomvärvimine näitas kollageeni ladestumist tubulointerstitsiaalsetes piirkondades ja glomerulites, eriti diabeetiliste (4 ja 8 nädalat) rottide rühmade mõlema kambri basaalmembraanides (joonis 3 (a)). Mittediabeetiliste rottide ALA-ravi (4 ja 8 nädalat) seostati ka suurenenud kollageeni ladestumisega, mida iseloomustasid glomerulaarsed ja tubulointerstitsiaalsed alad, mis olid hõivatud kollageeniga värvitud maatriksiga, kuid ilma statistilise tähtsuseta. ALA-ga ravitud diabeetilistel rottidel (4 ja 8 nädalat) püsis kollageeni ladestumine püsivalt, kuna võrreldes diabeetiliste rottidega ei tuvastatud olulist vähenemist. Kollageeni sünteesi suurenemise kontrollimiseks hinnati Col4a1 geeniekspressiooni taset RT-PCR abil (joonis 3 (b)). Võrreldes vastavate kontrollidega tuvastati mõlemas katserühmas (4 ja 8 nädalat) ALA-ga ravitud diabeetiliste ja mittediabeetiliste rottide neerudes Col4a1 ekspressiooni märkimisväärne suurenemine mõlemal ajahetkel. .

3.4. Diabeedi ja ALA raviga seotud profibrootilised muutused.Western blot analüüs näitas, et TGF{0}} valgu tase ei muutunud 4 nädala möödudes märkimisväärselt, olenemata ravist (joonis 4(a)). Kuid pärast 8-nädalast diabeeti tuvastati statistiliselt oluline TGF- 1 valgu indutseerimine, mida ALA-ravi veidi vähendas, kuid see jäi kontrolliga võrreldes märkimisväärselt suurenenud. Lisaks täheldati sarnast TGF- 1 indutseerimist ALA-ga ravitud mittediabeetilistel loomadel (joonis 4(a)). Et uurida, kas TGF- 1 indutseerimisega kaasnes fibrootiliste markerite esinemine, analüüsiti SMA olemasolu Western blot meetodil (joonis 4(b)). Diabeetiline seisund vallandas SMA ekspressiooni, mis tuvastati neljandast nädalast pärast diabeedi algust ja edasi. Diabeediga rottide ravi ALA-ga vähendas SMA-d kontrolltasemele 4 nädala pärast, kuid oli 8 nädala pärast ebaefektiivne. ALA-ravi ei mõjutanud SMA-d mittediabeetilistel rottidel 4 nädala pärast, samas kui 8 nädala pärast põhjustas see SMA ekspressiooni suurenemise kontrolli suhtes, kuid see tõus ei olnud statistiliselt oluline (joonis 4 (b)).

Mittediabeetiliste rottide ravi ALA-ga andis profibrootiliste tunnuste osas sarnased jäljed võrreldes diabeetiliste rottidega, mis viitab vajadusele paljastada mehhanismid, mis on ALA-ga ravitud mittediabeetiliste rottide neerudes täheldatud fibroosilaadsete muutuste aluseks. Et uurida võimalust, et epigeneetilised modifikatsioonid kujutavad endast täiendavaid mehhanisme, mis on seotud ALA-indutseeritud profibrootilise maastikuga mittediabeetilistel rottidel, tehti Col4a1 ekspressiooni erilise suurenemise korral kontroll- ja ALA-ga ravitud mittediabeetiliste rottide neerudele täiendavalt DNA metüülimise staatuse analüüs. .

3.5. ALA mõju DNA metüülimise staatusele.DNA metüülimise (Dnmt1, Dnmt3a ja Dnmt3b) ja demetüleerimisega (Tet1) seotud peamiste osalejate DNA metüülimise ja geeniekspressiooni globaalset taset hinnati mittediabeetiliste kontrollrühma ja ALA-ga ravitud rottide neerudes 4 ja 8 nädala jooksul (joonis 5). ). Ainult Tet1 mRNA tase näitas statistiliselt olulist tõusu pärast 8-nädalast ALA-ravi, samas kui Dnmt-de ekspressioon ja DNA metüülimise globaalne tase ei näidanud olulist erinevust pärast 4- või 8-nädalast ALA-ravi võrreldes kontrollidega.

Järgmine katse oli suunatud Col4a1 geeni DNA metüülimise kohaliku taseme uurimisele. Kollageeni IV põhivorm sisaldab kahte 1 (IV) ahelat ja ühte 2 (IV) ahelat, mida kodeerivad geenid Col4a1 ja Col4a2, mis on paigutatud pea-pea-suunas, moodustades ainulaadse transkriptsiooniüksuse ja transkribeeritakse vastastikusest erinevatest suundadest. promootor [17]. Col4a1 transkribeeritakse 130 aluspaari pikkusest intergeensest piirkonnast, mis sisaldab kahte Sp1 saiti, CAAT ja CTC kaste [17] (joonis 6 (a)). Col4a1/Col4a2 promootori DNA metüülimise staatust hinnati MSP analüüsi abil ja praimerite asukoht on näidatud joonisel 6(a). Mõlemad praimeripaarid, mis olid spetsiifilised metüleeritud ja metüleerimata DNA jaoks, katsid 2 CpG-d praimeri kohta. MSP tulemused näitasid, et ALA ei mõjutanud pärast 4-nädalast ravi Col4a1/Col4a2 promootori metüülimise staatust (joonis 6(b)). Kuid pärast 8-nädalast ALA-ravi täheldati DNA metülatsiooniindeksi statistiliselt olulist langust (joonis 6 (b)), mis viitab ALA potentsiaalile moduleerida Col4a1 ekspressiooni kogu selle promootori DNA metüülimismustri muutumise ajal.

4. Arutelu

Diabeedi epideemilise osakaalu tõttu muutub DKD kõige sagedasemaks lõppstaadiumis neeruhaiguse põhjustajaks kogu maailmas ja kõige indikatiivsemaks diabeediga patsientide enneaegse suremuse teguriks [28, 29]. DKD esinemissagedus diabeediga patsientidel ei ole viimastel aastakümnetel vähenenud, hoolimata intensiivsest ravist, mis on suunatud veresuhkru kontrollile [28, 30]. Võimalike ravistrateegiate hulgas, mis on näidanud kasu DKD vastu, on oksüdatiivse stressi sihtimine ja sel ajal tehti kindlaks, et ALA võib diabeedi korral parandada neerufunktsiooni [29, 31, 32]. Käesolevas uuringus saadud tulemused kinnitasid ALA hüpoglükeemilist toimet, kuid näitasid ALA ebaefektiivsust häiritud uurea tasemete suhtes pikaajalise diabeedi korral.

Glükeemia tõus üksi või koos oksüdatiivse stressiga on üks AGE-de moodustumise mehhanismidest, mille akumuleerumine glomerulaar- ja tubulointerstitsiaalsetes osades oli korrelatsioonis neerukahjustuse astmega diabeetilise nefropaatia eksperimentaalses mudelisüsteemis [33, 34]. . KML on üks peamisi AGE in vivo [35], mille tase veres ja elundites, sealhulgas diabeediga patsientide neerudes suureneb [36], mängides olulist rolli diabeetilise nefropaatia patogeneesis [37]. Meie tulemused näitasid, et CML-i ladestumine koguneb peamiselt diabeetilise roti neeru tubulointerstitsiaalsesse ja vähemal määral glomerulaarkambrisse, mis pärast ALA-ravi märkimisväärselt vähenes. Avaldatud andmete kohaselt võivad KML-iga rikastatud tuubulid olla kõige tõsisemalt vigastatud neerukamber [38–40]. Vastupidiselt meie tulemustele on kirjeldatud nii immuunvärvimise kui ka keemilise analüüsiga tuvastatud ALA piiratud mõju CML sisaldusele diabeetilistel rottidel [40] ja see vastuolu võib tuleneda uuringu eksperimentaalsest ülesehitusest.

Neeru struktuuri histoloogiline analüüs PAS-i värvimisega kinnitas ALA kaitsvat toimet diabeedi korral. ALA kasulik antioksüdantne toime diabeedist põhjustatud oksüdatiivsete kahjustuste vastu neerudes oli hästi tõestatud [22, 31, 32]. Leiti, et ravi ALA-ga hoiab ära neerupuudulikkuse ja leevendab neerude struktuurseid patoloogilisi muutusi, sealhulgas glomerulaarse mesangiaalse maatriksi laienemist ja glomeruloskleroosi selle kombineeritud antioksüdantse ja hüpoglükeemilise potentsiaali tõttu [21, 22]. Arvestades, et kõrget glükoosisisaldust, oksüdatiivset stressi ja AGE-de teket peetakse olulisteks teguriteks profibrootiliste muutuste esilekutsumisel neerudes [41], on väljakujunenud antioksüdantsed ja hüpoglükeemilised toimed ning ALA võime vähendada KML-i sisaldust. ALA potentsiaal leevendada fibrootilist protsessi diabeetilistes neerudes. Kuid meie tulemused näitasid, et Massoni värvitud neerukoe lõikudes ei muutunud kollageenkiudude ladestumise määr pärast diabeetiliste rottide ALA-ravi märkimisväärselt. Lisaks näitas ALA-ravi kalduvust suurendada kollageeni sünteesi/sisaldust mittediabeetilistel rottidel. Vastavalt meie leidudele on teatatud ALA kahjulikust mõjust kontrolli all olevatele/tervetele neerudele [42]. Uurides ALA renoprotektiivseid mehhanisme diabeetilise nefropaatia korral, avastasid autorid ootamatult, et ravi ALA-ga oli seotud glomeruloskleroosi, tubulointerstitsiaalse fibroosi ja neerufunktsiooni langusega mittediabeetilistes neerudes. Sõltumatud uuringud näitasid, et ALA suuremad annused põhjustavad eakatel rottidel oksüdatiivseid valgukahjustusi [43] ja diabeedi korral isegi neerufunktsiooni langust [40]. Kooskõlas sellega ei tõestatud ALA prooksüdantset toimet mitte ainult loomkatsetes, vaid ka lõppstaadiumis neeruhaiguse all kannatavatel patsientidel, kes said intravenoosset rauda [44].

Seoses ALA täheldatud mõjuga kollageeni ladestumisele näitasid meie tulemused lisaks, et ALA ei vähendanud kahe fibrootilise markeri, TGF- 1 ja -SMA taset diabeetikutel rottidel pärast 8 nädala möödumist ega indutseerinud isegi TGF-i. - 1 ekspressioon mittediabeetilistel rottidel pärast 8-nädalast ravi. Kooskõlas sellega oli IV tüüpi kollageeni geeniekspressioon nii diabeetikutel kui ka ALA-ga ravitud diabeetilistel ja mittediabeetilistel rottidel võrreldes kontrollidega oluliselt kõrgem. Varem on näidatud, et oksüdatiivne stress indutseerib TGF- 1 ja selle allavoolu sihtgeene, nagu kollageeni tüüpi I, III ja IV, samuti fibronektiini [9, 45] ning et antioksüdandid suruvad alla TGF{{ 10}} avaldis [46]. Vastupidiselt antioksüdantide kaitsva ja antifibrootilise rolli üldisele ideele näitavad meie tulemused, et ALA-l võib olla mitut mõju diabeetiliste neerude fibrootilise protsessiga seotud teguritele. Näib, et ALA indutseerib spetsiifiliselt mõnede fibroosiga seotud geenide, nagu TGFB1 ja eriti Col4a1, ekspressiooni, mille suurenenud ekspressioon tuvastati juba pärast 4-nädalast ALA-ravi diabeetilistes ja mittediabeetilistes neerudes. Inimese naha fibroblastides on pärast ALA-ravi täheldatud I tüüpi kollageeni suurenenud ekspressiooni ja ladestumist [24]. Uuring näitas, et I tüüpi kollageeni ülesreguleerimine tuleneb TGF-retseptori I allavoolu signaaliülekandest, mis viitab ALA uudsele farmakoloogilisele toimele, mis on seotud naha vananemisega. Arvestades siin esitatud tulemusi, võib kollageenide ülesreguleerimine olla pigem tavaline raku vastus ALA-le kui naha fibroblastidele iseloomulik spetsiifiline mehhanism.

IV tüüpi kollageeni sünteesi reguleeritakse väljakujunenud transkriptsiooni-, posttranskriptsiooni- ja translatsioonijärgsetel tasemetel, kuid ilmneb rohkem andmeid DNA metüülimise rolli kohta Col4a1 ekspressioonis. 40 aastat tagasi tehtud uuring näitas, et F9 teratokartsinoomi rakkude ravi DNA demetüleeriva ainega 5-asatsütidiiniga suurendab Col4a1 ekspressiooni, mis viitab esimest korda sellele, et DNA metüülimine võib selle ekspressioonis olulist rolli mängida [47]. Inimese metüloomi ja transkriptoomi uuringud näitasid Col4a1 promootori metüülimise korrelatsiooni selle ekspressiooniga tervetes ja ECM-valkude tootmiseks aktiveeritud maksarakkudes [20, 48]. Sama leiti mesangiaalsetes rakkudes, kus pärast 5-asatsütidiiniga töötlemist tõusis Col4a1 mRNA tase märkimisväärselt [49]. Veelgi enam, kroonilise neeruhaigusega patsientidel leiti, et Col4a1 ja Col4a2 geenide DNA metüülimise tase on tervete isikutega võrreldes oluliselt madalam ning korrelatsioonis suurenenud mRNA ja valgu ekspressiooniga [50]. Meie tulemused kinnitasid tugevaid tõendeid Col4a1 ekspressiooni reguleerimise kohta DNA metüülimise kaudu, kuna leidsime, et Col4a1 ekspressioon korreleerub selle promootori metüülimise staatusega neerus. Tuleb märkida, et täheldatud muutused Col4a1 promootori metüülimise staatuses mõjutavad tõenäoliselt ka Col4a2 ekspressiooni, kuna kahte geeni reguleeritakse vastastikuse kahesuunalise promootori piirkonna kaudu. Meie katsetes kasutatud MSP praimerid kavandati osaliselt kattuma kahe Sp1 sidumissaidiga ja DNA metüülimise vähenemine, mida täheldasime pärast ALA-ravi, võib peegeldada Sp1 paranenud seondumist ja Col4a1 ekspressiooni ülesreguleerimist.

Meie leiud, et Col4a1 ekspressioon ja selle metüülimise staatus on mittediabeetilistel loomadel pärast 8-nädalast ALA-ravi altid ALA toimele, viitavad lisaks sellele, et ALA võib toimida ka epigeneetilise regulaatorina. Meie tulemuste kohaselt mõjutas ALA Tet1 ensüümi pärast 8-nädalast ravi selle suurenenud ekspressiooni suunas, mis näitab võimalust, et geenispetsiifiline demetüleerimine võib toimuda ilma tuvastatava netomõjuta kogu genoomi hõlmavale DNA metüülimisele. Kuigi on olemas seos Col4a1 suurenenud ekspressiooni ja selle promootori vähenenud metüülimise vahel pärast 8-nädalast ALA-ravi, on siiski raske ühemõtteliselt arvata, et DNA demetüleerimine on ainus põhjuslik seos ALA-ravi ja suurenenud kollageeni geeniekspressiooni vahel. 4 nädala pärast ei seostatud Col4a1 suurenenud ekspressiooni selle metüülimise staatuse muutumisega. ALA võimet reguleerida teatud geene epigeneetiliselt on pakutud IL-1 ja IL-6 geenide puhul, mille allareguleeritud mRNA ja valgu tase oli seotud nende promootorpiirkondade hüpermetüleerimisega [51, 52]. Ehkki hüpermetüleerimist pakuti üheks ALA toimemehhanismiks, ei ole ALA poolt juhitud epigeneetilise regulatsiooni üksikasjalikud teed veel välja selgitatud ja ootavad kinnitust ka teiste geenide puhul. Seega nõuab seos kollageeni suurenenud sünteesi / ladestumise vahel, mis võib põhjustada patoloogilist fenotüüpi, ja ALA-ravi poolt esile kutsutud Col4a1 promootori Tet-vahendatud DNA demetüleerimise vahel täiendavat tõestamist ja see peaks olema tulevaste uuringute platvorm.

5. Kokkuvõtted

ALA kaitsvat rolli erinevate organite, sealhulgas neerude, diabeediga seotud talitlushäirete vastu on enamasti omistatud selle antioksüdantsele ja hüpoglükeemilisele toimele. Kuid selles uuringus esitatud tulemused viitavad sellele, et ALA-ga võib neerude kaitse diabeedi korral olla piiratud kollageeni sünteesi / ladestumise suurenemise tõttu neerudes. Analüüsides ALA mõju profibrootilistele protsessidele diabeetiliste rottide neerudes, leidsime, et ALA ei vähendanud ei kollageeni sünteesi ega profibrootilisi markereid. Lisaks aitas ravi ALA-ga kaasa profibrootilistele sündmustele ja kollageeni sünteesile isegi mittediabeetiliste rottide neerudes, mis on osaliselt seotud muutustega Col4a1 geeni DNA metüülimise staatuses. Sellest tulenevalt tuleb neerufibroosiga patsientidel olla ALA kasutamisel ettevaatlik, et vältida olemasoleva neerutüsistuse süvenemist. Lisaks tuleb olla ettevaatlik, kui ALA-d kasutatakse antioksüdantide potentsiaali suurendamiseks tervel inimesel või muude diabeediga seotud tüsistuste ravis, kuna ühe tüsistuse kasulik mõju võib olla teisele kahjulik.

1 Molekulaarbioloogia osakond, Bioloogiauuringute Instituut "Siniša Stanković", Serbia Vabariigi Riiklik Instituut, Belgradi Ülikool, Bulevar Despota Stefana 142, 11060 Belgrad, Serbia

2 Tsütoloogia osakond, Bioloogiauuringute Instituut "Siniša Stanković", Serbia Vabariigi Riiklik Instituut,

Belgradi Ülikool, Bulevar Despota Stefana 142, 11060 Belgrad, Serbia

Kirjavahetus tuleks adresseerida Aleksandra Uskokovićile; auskokovic@ibiss.bg.ac.rs

Saabunud 4. novembril 2020; Muudetud 19. veebruaril 2021; Vastu võetud 27. veebruaril 2021; Avaldatud 12. märtsil 2021

Akadeemiline toimetaja: Alin Ciobica

Autoriõigus © 2021 Nevena Grdović et al. See on avatud juurdepääsuga artikkel, mida levitatakse Creative Commonsi omistamislitsentsi alusel, mis lubab piiramatut kasutamist, levitamist ja reprodutseerimist mis tahes kandjatel, eeldusel, et originaalteosele viidatakse õigesti.

Andmete kättesaadavus

Artiklisse on lisatud kõik selle uuringu tulemuste toetamiseks kasutatud asjakohased andmed.

Huvide konfliktid

Autorid kinnitavad, et käesoleva artikli avaldamisega seoses puudub huvide konflikt.

Autorite kaastööd

Katsete kontseptsioon ja disain: MM, NG, AU; Loomade käitlemine ja ravi: MĐ, JAJ, AU, SD; Tehtud histoloogiline analüüs, immunovärvimine ja tulemuste kvantifitseerimine: JAJ, MĐ, ST. Teostatud Western blot analüüs: AU, SD, NG; Sooritanud RTqPCR katsed: JR, MĐ; Sooritas DNA metüülimise katsed: JR, AT, MV; Statistiline analüüs: NG; Andmete tõlgendamine ja arvude koostamine: NG, MM; Kirjutas referaadi: NG, AU; Käsikirja kriitiline redaktsioon: MV, SD. Kõik autorid kiitsid lõpliku versiooni avaldamiseks heaks.

Tänuavaldused

Seda tööd toetas Serbia Vabariigi haridus-, teadus- ja tehnoloogiaarenduse ministeerium (grandi nr 451-03-9/2021-14/200007).

Täiendavad materjalid

Täiendav tabel S1: praimerite järjestused, mida kasutatakse Col4a1 (IV tüüpi kollageeni alfa 1 ahel), Dnmt1 (DNA metüültransferaas 1), Dnmt3a (DNA metüültransferaas 3 alfa), Dnmt3b (DNA beta metüültransferaas), Tet13 reaalajas kvantitatiivseks PCR analüüsiks (Tet metüültsütosiini dioksügenaas 1) ja Actb (Actin, beeta) geeniekspressioon. Täiendav tabel S2: praimerite järjestused Col4a1 geeni promootorpiirkonna DNA metüülimise MSP analüüsiks. Täiendav joonis S1: immunoblotimise tüüpilised pildid. Kahe fibroosiga seotud valgu TGF- 1 (A) ja SMA (B) valgutasemed ALA-ga ravitud või ravimata, kontroll- ja diabeetiliste rottide neerudes, 4 ja 8 nädalat pärast diabeedi esilekutsumist, määratud Westerniga blot analüüs. (Täiendavad materjalid)

Viited

[1]RC Atkins, "Kroonilise neeruhaiguse epidemioloogia", Kidney International. Täiendus, kd. 67, lk S14–S18, 2005.

[2]AB Oyenihi, AO Ayeleso, E. Mukwevho ja B. Masala, "Antioksüdantide strateegiad diabeetilise neuropaatia ravis", BioMed Research International, vol. 2015, artikli ID 515042, 15 lehekülge, 2015.

[3]M. Lv, Z. Chen, GY Hu ja QB Li, "Diabeetilise nefropaatia terapeutilised strateegiad: hiljutised edusammud ja tulevikuperspektiivid", Drug Discovery Today, vol. 20, nr. 3, lk 332–346, 2015.

[4]A. Karihaloo, "Fibroosivastane ravi ja diabeetiline nefropaatia", Current Diabetes Reports, vol. 12, nr. 4, lk 414–422, 2012.

[5]S. Yamagishi ja T. Matsui, "Täiustatud glükatsiooni lõpptooted, oksüdatiivne stress ja diabeetiline nefropaatia", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 3, ei. 2, lk 414–108, 2010.

[6]F. Genovese, AA Manresa, DJ Leeming, MA Karsdal ja P. Boor, "Neerude ekstratsellulaarne maatriks: neerufibroosi uudsete mitteinvasiivsete biomarkerite allikas?", Fibrogenesis & Tissue Repair, vol. 7, nr. 1, lk. 4, 2014.

[7]S. Chen, SW Hong, MC Iglesias-dela Cruz, M. Isono, A. Casaretto ja FN Ziyadeh, "Muuendava kasvufaktori-beeta süsteemi võtmeroll diabeetilise nefropaatia patogeneesis", Neerupuudulikkus, vol. 23, lk 471–481, 2001.

[8]BB Hoffman, K. Sharma, Y. Zhu ja FN Ziyadeh, "Transkriptsiooniline aktiveerimine transformeeriva kasvufaktori- 1 in mesangiaalses rakukultuuris kõrge glükoosikontsentratsiooniga", Kidney International, vol. 54, nr. 4, lk 1107–1116, 1998.

[9]M. Gonzalez-Ramos, S. de Frutos, M. Griera jt, "Integriiniga seotud kinaas vahendab vesinikperoksiidist sõltuvat transformeerivat kasvufaktori- 1 ülesreguleerimist", Free Radical Biology & Medicine, vol. 61, lk 416–427, 2013.

[10]K. Sharma ja TA McGowan, "TGF- diabeetilise neeruhaiguse korral: uudsete signaaliradade roll", Cytokine & Growth Factor Reviews, vol. 11, nr. 1-2, lk 115–123, 2000.

[11] FJ Lopez-Hernandez ja JM Lopez-Novoa, "TGF-roll kroonilises neeruhaiguses: tubulaarsete, glomerulaarsete ja vaskulaarsete mõjude integreerimine", Cell and Tissue Research, vol. 347, nr. 1, lk 141–154, 2012.

[12] PD Yurchenco ja JJ O'Rear, "Basal lamina assembly", Current Opinion in Cell Biology, vol. 6, nr. 5, lk 674–681, 1994.

[13]A. Nerlich ja E. Schleicher, "Immunohistochemical localization of ekstratsellulaarse maatriksi komponentide kohta inimese diabeetilistes glomerulaarsetes kahjustustes", The American Journal of Pathology, vol. 139, nr. 4, lk 889–899, 1991.

[14] RM Mason ja NA Wahab, "Extratsellulaarne maatriksi metabolism diabeetilises nefropaatias", Journal of the American Society of Nephrology, vol. 14, nr. 5, lk 1358–1373, 2003.

[15] RE Gilbert, A. Cox, LL Wu et al., "Kasvufaktori beeta 1 ja IV tüüpi kollageeni ekspressioon neeru tubulointerstitiumis eksperimentaalse diabeedi korral - ACE inhibeerimise mõjud", Diabetes, vol. 47, nr. 3, lk 414–422, 1998.

[16] MS Razzaque, T. Koji, Y. Horita jt, "Synthesis of type III collagen and type IV collagen by tubular epithelial cells in diabeetic nephropathy", Pathology, Research and Practice, vol. 191, nr. 11, lk 1099–1104, 1995.

[17] JP Grande, DC Melder, DL Kluge ja ED Wieben, "Roti kollageeni IV promootori struktuur", Biochimica et Bio-Physica Acta, vol. 1309, nr. 1-2, lk 85–88, 1996.

[18]E. Verdura, D. Hervé, F. Bergametti jt, "MiR-29 sidumissaidi häire, mis viib COL4A1 ülesreguleerimiseni põhjustab pontiini autosomaalset domineerivat mikroangiopaatiat koos leukoentsefalopaatiaga", Annals of Neurology, vol. 80, nr. 5, lk 741–753, 2016.

[19]M. Grifiths, M. Van Sinderen, K. Rainczuk ja E. Dimitriadis, "miR-29c üleekspressioon ja COL4A1 alareguleerimine viljatus inimese endomeetriumis vähendab endomeetriumi epiteelirakkude kleepuvusvõimet _in vitro_ mis viitab rollidele vastuvõtlikkuses," Scientific Reports, vol. 9, nr. 1, lk. 8644, 2019.

[20]A. El Taghdouini, AL Sørensen, AH Reiner et al., "DNA metüülimise ja geeniekspressiooni mustrite genoomi hõlmav analüüs puhastatud, kultiveerimata inimese maksarakkudes ja aktiveeritud maksa tähtrakkudes", Oncotarget, vol. 6, nr. 29, lk 26729–26745, 2015.