Neeru siirdamine

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

SISSEJUHATUS

Neersiirdamineon parim valik kroonilise neeruhaiguse lõppstaadiumis raviks. Praeguseks on kroonilise neerutransplantaadi kahjustuse peamiseks põhjuseks olnud antikehade vahendatud äratõukereaktsioon (AMR), mida iseloomustab inimese leukotsüütide antigeeni (HLA) vastu suunatud doonor-spetsiifilise antikeha (DSA) olemasolu. piirab suuresti siiriku pikaajalist ellujäämist. (1, 2). Olemasolevad skeemid ei ole aga kliinilises valdkonnas paljulubavaid tulemusi andnudAMR-i ravi (1, 3, 4). Seega on kiireloomuline vajadus tuvastada potentsiaalsed biomarkerid ja AMR-i riskifaktorid pärast neerusiirdamist, mis on ravi ja patsiendi tulemuste jaoks kriitilise tähtsusega.

Kogunev tõendusmaterjal viitab sellele, et põletikulistes tingimustes võivad B-rakud diferentseeruda antikehi sekreteerivateks plasmablastideks ja regulatoorseteks B-rakkudeks (Bregs), mis on eriline B-rakkude alamhulk, mis sekreteerib immunosupressiivseid tsütokiine, eriti interleukiini (IL) -10. (1, 5–7). Seega toodavad plasmablastid alloantikehi, mille tulemuseks on AMR, samas kui Bregidel on immunoregulatoorsed funktsioonid ja need aitavad esile kutsuda immuunsüsteemi homöostaasi. Seega on teatatud, et Bregs on pärast neerusiirdamist tihedalt seotud resistentsusega AMR-i suhtes (1, 8, 9).

Kuigi Bregi alamhulkade eristavaid pinnamarkereid pole inimestel veel tuvastatud (1), on varasemad uuringud teatanud neljast levinumast Bregi alampopulatsioonist: mälubregid (mBregid), mis on määratletud CD19 pluss CD24 pluss CD27 plussiga (10), üleminekuperioodi bregid (10). tBregs), mis on määratletud CD19 pluss CD24 pluss CD38 plussiga (10, 11), IL-10-tootvad mälu Bregs (IL-10 pluss mBregs), mis on defineeritud CD19 pluss CD24 pluss CD27 pluss IL-10 plus (12) ja IL{17}}tootmineüleminekulised Bregs (IL-10 pluss tBregs), mis on defineeritud CD19 pluss CD24 pluss CD38 pluss IL-10 plussiga (13). Laguna-Goya et al. teatas, et tBregi ja IL-10 pluss tBregi vähenemine on positiivselt seotud ägeda äratõukereaktsiooniga pärast neerusiirdamist (14). Kuid Zhou et al. teatas, et tBregi asemel vähenes märkimisväärselt viiel ägeda äratõukereaktsiooniga patsiendil pärast maksa siirdamist (10). Lisaks Shabir et al. teatasid, et kolmel AMR-i patsiendil ei seostatud tBrege neeru allotransplantaadi äratõukereaktsiooniga (15). Nende ebajärjekindlate tulemuste valguses on vaja täiendavalt selgitada, milline Bregi alampopulatsioon mängib pärast neerusiirdamist AMR-i patsientidel olulist rolli.

Käesolevas uuringus võrreldi nelja ringlevate Bregi alampopulatsiooni osakaalu tervete, stabiilsete (ST) ja AMR-i rühmade vahel. Seejärel määrati B-rakkude, IL-10 ja kemokiinide biojaotus tervete, ST ja AMR-i patsientide neerutransplantaatides. Lisaks uuriti tsirkuleerivate Bregi nelja alampopulatsiooni dünaamikat ST-patsientidel 90 päeva jooksul pärast operatsiooni. Need praegused tulemused koos varasemate uuringute tulemustega (1) viitavad sellele, et tsirkuleerivad IL-10 pluss mBregs ja IL-10 pluss tBregs on juhtivad Bregi alampopulatsioonid, mis aitavad kaasa AMR-i resistentsusele.

Cistanche tubulosa pulbertakistabneeruhaigused, näidise vaatamiseks klõpsake siin

Märksõnad:Bregi fenotüüpimine, neerusiirdamine, antikehade poolt vahendatud äratõukereaktsioon, homöostaas, dünaamiline

MATERJALID JA MEETODID

Patsiendid ja rühmad

Kõik patsiendid andsid enne uuringut allkirjastatud teadliku nõusoleku. Käesoleva uuringu kiitis heaks Zhengzhou ülikooli esimese sidushaigla (2018-KY-72) eetikakomitee. Kliinilise uuringu registreerimisnumber on ChiCTR1900022501.

Need patsiendid jaotati kolme rühma: (1) terved kontrollrühm (terved, n=9): terved neerudoonorid vanuses 18–55 aastat (haigusvabad), kuhu kuuluvad retsipientide õed-vennad ja abikaasad; (2) stabiilse siiriku funktsioonirühmaga (ST, n=25) retsipiendid: patsiendid vanuses 18–55 aastat, kelle neerufunktsioon oli jälgimise ajal stabiilne (infektsiooni või äratõukereaktsioonita enne ja pärast neerusiirdamist). periood (rohkem kui 6 kuud või sellega võrdne); (3) AMR-i rühm (AMR, n=18): patsiendid vanuses 18–55 aastat, kellel diagnoositi AMR. ST ja AMR-iga retsipientide neerutransplantaadid saaditerve neeru doonors. Vastavalt Banff 2017 konsensusele (3, 16) kinnitasid ST- ja AMR-rühmade vahelise diferentsiaaldiagnoosi kaks neerupatoloogi.

Perifeerne veri, neerukuded ja rakuproovid

Tervete rühma perifeersed vereproovid koguti enne operatsiooni ning 1, 7 ja 14 päeva pärast operatsiooni. ST-rühmast saadud proovid koguti enne operatsiooni ja 1, 7, 14, 30 ja 90 päeva pärast operatsiooni. AMR-rühmast saadud proovid koguti äratõukereaktsiooni ilmnemisel (enne AMR-i äratõukereaktsioonivastast ravi). Perifeerse vere mononukleaarsed rakud (PBMC-d) eraldati

5 ml verd Ficoll-Paque gradienttsentrifuugimisega ja konserveeritud 10% dimetüülsulfoksiidiga (Solarbio Inc., Peking, Hiina) vedelas lämmastikus.

Tervetelt rühmalt saadud südamikunõela neeru biopsia proovid koguti enne operatsiooni null-doonori neeru biopsiate jaoks. ST-rühmast saadud nõelte neerubiopsia proovid koguti 90 päeva pärast operatsiooni pärast seda, kui nende neerufunktsioon stabiliseerus protokolli biopsia tõttu. Arvestades teist neerufunktsiooni punktsioonikahjustust, keeldusid kõik AMR-iga patsiendid pärast AMR-i äratõukereaktsiooni äratõukereaktsiooni äratõukereaktsioonivastast ravi nõela neeru biopsiast. Seega koguti AMR-i rühmast nõela neeru biopsia proovid ainult äratõukereaktsiooni korral (enne AMR-i äratõukereaktsioonivastast ravi). Kokku kolm tervet doonorit, üheksa ST-patsienti ja üheksa AMR-i patsienti andsid enne põhinõela neerubiopsiat allkirjastatud teadliku nõusoleku. Ülejäänud kuus tervet doonorit, 16 ST-patsienti ja üheksa AMR-i patsienti keeldusid nõela neerubiopsiast, kuna kartsid biopsiaga seoses suurt verejooksu. Kolme terve doonori, kolme ST-patsiendi ja kolme AMR-patsiendi nõelte neerubiopsia proovidest eraldati üksikud rakud, kombineerides mehaanilist dissotsiatsiooni rakuvälise maatriksi ensümaatilise lagunemisega, mis säilitab kudede struktuurse terviklikkuse (Multi Tissue Dissociation Kit). 1; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Saksamaa). Neerurakud säilitati 10-protsendilise dimetüülsulfoksiidiga (Solarbio Inc., Peking, Hiina) vedelas lämmastikus ja ülejäänud nõela neerubiopsia proovid sisestati parafiini 4 kraadi juures.

Voolutsütomeetria

Vedelas lämmastikus hoitud rakud sulatati kiiresti 3 minuti jooksul 37 kraadises veevannis. Kokku 2–3 × 106 PBMC-d inkubeeriti Roswell Park Memorial Institute 1640 lahjendusrakkude stimulatsioonikokteiliga (500 ×), mis koosnes PMA-st (Phorbol 12-Myristate 13- Atsetaat), kaltsiumionofoor (ionomütsiin) ja valgu transpordi inhibiitorid Brefeldin A ja Monensin (eBioscience, San Diego, CA), 37 kraadi juures 5% CO2-ga 5 tundi. Surnud rakud välistati värvimise teel 7-aminoaktinomütsiin D-ga (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) ja Bregsi pinnamarkerid värviti fluorokroomiga märgistatud antikehadega (Brilliant Violet 421™ CDery19™ anti-humancoverythrin (PE)/Cy7 inimesevastane CD24, Alexa FluorR647 inimesevastane CD27, Alexa FluorR488

inimesevastane CD38 ja Brilliant Violet 510™ inimesevastane CD45; sobivad isotüübi juhtelemendid: Brilliant Violet 421™ Mouse

IgG1 k isotüübi kontroll, PE/Cy7 hiire IgG2a k isotüübi kontroll, Alexa FluorR647 hiire IgG1 k isotüübi kontroll, Alexa FluorR488 hiire IgG1 k isotüübi kontroll ja briljantlilla

510™ hiire IgG1 k isotüübi kontroll; Biolegend, San Diego, CA,

USA) 30 minutit 4 kraadi juures valguse eest kaitstult. Intratsellulaarseks värvimiseks värviti rakud antikehadega, mis olid suunatud Bregsi rakusiseste tsütokiinide vastu (PE anti-inimese IL-10; sobivad isotüübikontrollid: PE Rat IgG1 k Isotüübi kontroll; Biolegend, San Diego, CA, USA). 30 minutit toatemperatuuril, valguse eest kaitstult. Märgistatud rakke analüüsiti seadmega BD Biosciences Canto II (BD Biosciences, USA). Lümfotsüütide väravas registreeriti kokku 100 000 sündmust. Andmete analüüs viidi läbi FlowJo tarkvara abil (Tree Star, San Carlos, CA, USA).

Immunohistokeemia

Immunohistochemistry staining of CD19, IL-10, and C-X-C motif chemokine 13 (CXCL13) in kidney tissues was performed, respectively. Brieflfly, 4 mm sections obtained from formalin-fifixed, paraffifin-embedded kidney tissue samples were incubated with 1:500-diluted anti-CD19, 1:1000-diluted antiCXCL13 (rabbit anti-human; Abcam, Cambridge, UK), and 1:500-diluted anti-IL-10 (rabbit anti-human; Absin, Shanghai, China) primary antibodies overnight at 4°C, followed by Horseradish Peroxidase-conjugated 1:20,000-diluted goat antirabbit secondary antibody (Abcam, Cambridge, UK) for 1 h at room temperature and then 3,3′-diaminobenzidine for another 10 min. DAPI appears in blue. Immunohistochemistry images were acquired with an Aperio ScanScope AT Turbo (Aperio, Vista, CA). Numbers of CD19, IL-10, and CXCL13 positivities were scored as follows: 0 positivity, score = zero; 1–5 positivities, score = one; 6–10 positivities, score = two; 11–20 positivities, score = three; >20 positiivset, tulemus=neli

Statistiline analüüs

Pesastatud juhtumi-kontrolli uuringus viidi vastuvõtja tööomaduste (ROC) kõvera analüüs läbi MedCalc v18.11.3 abil. Ülejäänud statistilised analüüsid viidi läbi, kasutades IBM SPSS 21.0. Tavaliselt jaotatud dispersiooni homogeensusega mõõtmisandmed väljendati keskmise ± standardhälbena (x ± s) ja analüüsiti sõltumatu valimi t-testi (rühmadevahelised võrdlused) või ühesuunalise dispersioonanalüüsi (rühmadevahelised võrdlused) abil. Mõõtmisandmed, millel ei olnud normaaljaotust või dispersiooni homogeensust, väljendati mediaanina interkvartiilse vahemikuga (IQR) ja analüüsiti Mann-Whitney U testiga (rühmadevahelised võrdlused) või Kruskal-Wallise testiga (rühmadevahelised võrdlused). Loendusandmeid analüüsiti vastavalt vajadusele c2 testiga, korrigeeritud c2 testiga või Fisheri täpse testiga. Ühesuunaline korduvmõõtmiste dispersioonanalüüs

kasutati erinevatel ajahetkedel. P-väärtused<0.05 were="" considered="" statistically="">

TULEMUSED

Patsientide algsed omadused

Käesolevasse uuringusse kaasati kokku üheksa tervet doonorit, 25 ST-patsienti ja 18 AMR-i patsienti. Nagu on näidatud tabelis 1, ei erinenud retsipientide sugu, vanus, kehamassiindeks (KMI), esialgne nefropaatia, HLA mittevastavus, CNI-d, sooja isheemia aeg ja külma isheemia aeg rühmades ega rühmades (P > 0.05, kõigile). Siiski oli nii anti-klassi I kui ka anti-klassi II DSA-positiivsuse esinemissagedus AMR-i rühmas märkimisväärselt kõrgem kui ST-rühmas (P < 0.001="" anti-rühmas).="" -i="" klassi="" dsa,="" p="">< 0,001;="" p="0,001" ii="" klassi="" dsa="" jaoks).="" lisaks="" olid="" amr-iga="" patsientidel="" võrreldes="" st-patsientidega="" oluliselt="" kõrgemad="" skoorid="" tubuliidi="" (t),="" interstitsiaalse="" põletiku="" (i)="" ja="" peritubulaarse="" kapillaariidi="" (ptc)="" korral="" (p="0,012" t="" puhul;="" p="">< 0,001="" i="" ja="" ptc="" korral="" ),="" vastavalt="" banffi="" klassifikatsioonile="" (normaalne,="" skoor="0;" kerge,="" skoor="1;" keskmine,="" skoor="2;" raske,="" skoor="3)" (3,="" 16)="" (="" täiendavad="" tabelid="" 1="" ja="">

cistanche ehhinakosiidjaoks diabeet