Neeru epiteelile suunatud mitokondriaalse transkriptsioonifaktori A puudulikkus põhjustab progresseeruvat mitokondriaalset ammendumist, mis on seotud raske tsüstilise haigusega
Mar 23, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Ken Ishii, Hanako Kobayashi, Kensei Taguchi jt.
SISSEJUHATUS
Mitokondriaalne (mt) düsfunktsioon on levinud neeruhaiguste hästi tunnustatud patoloogiline tunnus, mis võib vallandada rakukahjustuse, põletiku ja fibroosi. Neerudes sõltuvad torukujulised epiteelirakud suurel määral oksüdatiivse fosforüülimise (OXPHOS) tulemusel tekkivast adenosiintrifosfaadist (ATP), kuna nad täidavad mitmeid energiat tarbivaid epiteeli transpordifunktsioone. Seetõttu on efektiivse mt ATP tootmise säilitamine normaalse neerufunktsiooni ja süsteemse elektrolüütide homöostaasi jaoks hädavajalik. Lisaks näitavad hiljutised tõendid, et mitokondritel on oluline roll geeniregulatsioonis, rakkude signaaliülekandes ja rakkude diferentseerumises vahemetaboliitide ja reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tekke kaudu.2 Vaatamata nendele edusammudele on mt signaaliülekande roll patogeneesis. tavalisi neeruhaigusi ei mõisteta hästi.
Mt funktsiooni uurimiseks neeru homöostaasis ja patogeneesis, mesuunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A(TFAM). TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)on tuumaga kodeeritud faktor, mis on oluline mt funktsiooni, mt koopiate arvu säilitamise ja mt DNA struktuurse stabiilsuse jaoks, kuna see reguleerib mt genoomi replikatsiooni ja transkriptsiooni promootor-DNA painutamise teel.3 Imetajate mt DNA sisaldab 37 geeni, millest 13 kodeerivad hingamisahela kompleksi valgu subühikut, 22 kodeerivad ülekande-RNA-d ja 2 ribosomaalset RNA-d. SeegaTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)osaleb otseselt mt elektronide transpordi ja ATP sünteesi reguleerimises selliste geenide transkriptsiooni kaudu nagu mitokondriaalselt kodeeritud tsütokroom b (MT-CYB), mitokondriaalselt kodeeritud tsütokroom c oksüdaasi subühik 1 (MT-CO1) ja mitokondriaalselt kodeeritud ATP subühiku membraani süntaasi 6 (MT-ATP6).3IlmaTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A), kaotavad rakud võime toota ATP-d OXPHOS-i kaudu, ei suuda tekitada märkimisväärses koguses mt ROS-i ja nende mitokondrid vähenevad järk-järgult. - Geneetilised uuringud on näidanud, etTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)on normaalse embrüogeneesi jaoks hädavajalik, kuna on globaalne homosügootneTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)inaktiveerimine põhjustas emakasisese letaalsuse 10.5. embrüonaalseks päevaks, samas kui heterosügootne puudulikkus, kuigi see vähendas mt koopiate arvu -40 protsenti ja põhjustas hingamisahela puudulikkuse, ei põhjustanud embrüonaalset letaalsust. Seega geneetiline sihtimineTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A) on kasulik eksperimentaalne strateegia progresseeruva mt düsfunktsiooni rolli uurimiseks rakkude diferentseerumises ja kudede homöostaasis. Rakutüübispetsiifiline tingimuslik inaktiveerimineTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)viitas sellele, et OXPHOS-i ja/või mt-ROS-i genereerimine on rakkude diferentseerumise, funktsiooni ja normaalse füsioloogia jaoks ülioluline.{0}}o
Tuuma- või mt-geenimutatsioonidest tingitud primaarsed mt-häired võivad kaasneda neeruhaigusega, mis avaldub kõige sagedamini tubulointerstitsiaalse kahjustusena või isoleeritud tubulaarse düsfunktsioonina.1,12 Kuigi need on seotud teatud inimeste haiguste, näiteks neurodegeneratiivsete häirete, patogeneesiga, on TFAM-i spetsiifilised mutatsioonid.(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)neeruhaigust põhjustavat ei ole teatatud. Viimasel ajal vähendatudTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)ekspressiooni on seostatud kroonilise neeruhaigusega. Mt terviklikkuse kaotuse tõttuTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)inaktiveerimine põhjustas hiirtel tubulointerstitsiaalset haigust ja neerupuudulikkust, mis oli osaliselt tingitud mt DNA stressist põhjustatud tsüklilise GMP-AMP süntaasi (cGAS) - interferoonigeenide (STING) sõltuvate põletikuliste reaktsioonide stimulaatori aktiveerimisest.
Siin teatame, et hiirtel on tingimuslikTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A) inaktiveerimine sine okulisega seotud homeobox 2 (SIX2) ekspresseerivates nefroni eellasrakkudes tekitab raske tsüstilise haiguse ja sureb enneaegselt neerupuudulikkuse tõttu noorte alaealiste hiirtena.TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/-hiirtele olid iseloomulikud nefronite küpsemise defektid, mis olid seotud mt ammendumise, OXPHOS-i vähenemise ja metaboolse nihkega glükolüüsi suunas.TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-7-neeru epiteel. Arvestades tsüstilise haiguse tõsidustTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-7-hiirtel analüüsisime kahte polütsüstilise neeruhaiguse (PKD) hiiremudelit, mis tulenevad polütsüstiini-1 (Pkd1) või tsüstiini-1 (Cys1) mutatsioonidest, aga ka inimese autosomaalse domineeriva polütsüstilise neeruhaigusega (ADPKD) patsientide kudesid. Me tuvastame selleTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)on nii hiire kui ka inimese PKD kudede tsüstides düsreguleeritud. Kokkuvõttes näitavad meie uuringud, et TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)düsregulatsioon ja mt ammendumine on neerutsüstiliste haiguste iseloomulikud tunnused ja võivad nende patogeneesis kaasa aidata.
TULEMUSED
TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)inaktiveerimine SIX2 liinirakkudes põhjustab rasket tsüstilise haiguse, mille tulemuseks on neerupuudulikkus
Mt funktsiooni uurimiseks neeruepiteelis inaktiveerisimeTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)KUUES{0}}ekspresseerivates eellasrakkudes, millest tekivad kõik nefronisegmendid, välja arvatud kogumiskanal (CD).15Selleks ületasimeTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)flokseeritud alleel bakteriaalsete tehiskromosoomi transgeensete hiirtega, kes ekspresseerivad Six2 promootori transkriptsiooni kontrolli all täiustatud rohelist fluorestseeruvat valku/Cre rekombinaasi (eGFP/Cre) (joonis la)."Hiired on homosügootsedTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)floxed alleeli ja heterosügootseid eGFP/Cre transgeeni (Six2-eGFP/Cre plus ; T fam) nimetatakse edaspidi kuueks2-Tfam-/- mutandiks. Kuus 2-Tfam-/- hiirt sündisid eeldatava Mendeli suhtega ja neid ei eristatud sünnihetkel visuaalse kontrolliga Cre-pesakonnakaaslaste kontrollidest. Siiski on kuue kehakaalu erinevused2-TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A){{0}}mutandid ja pesakonnakaaslaste kontrollid ilmnesid sünnijärgsel päeval(P)14 (5,7±0,3 g mutantide puhul vs. 7,5± 0,3 g kontrollide puhul, n{{11} } iga, P=0,004; lisatabel S1). Kuus2-TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A) mutantsete hiirte neerud olid võrreldes kontrollrühmaga suurenenud (neerude ja kehamassi suhe 1,45% ± 0,19% mutantide puhul vs.0,60% ±0,02% kontrollrühma puhul , n=4 igaüks, P<0.001; figure="" lb,="" supplementary="" table="" s1)and="" died="" between="" age="" p20="" and="" p30(figure="" lb).="" juvenile="" lethality="" in="" the="" mutant="" cohort="" was="" associated="" with="" renal="" failure="" from="" severe="" cystic="" disease="" with="" blood="" urea="" nitrogen="" levels="" of="" 68.40±5.32="" mg/dl="" for="" mutant="" mice="" versus="" 16.8±2.0mg="" dl="" for="" controls(n="6" and="" 7,="" respectively;=""><0.0001; figure="" lb="" and="" c).="" furthermore,="">TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-7- mutantidel tekkis märkimisväärne albuminuuria (uriini albumiini/kreatiniini suhe=362,4 ± 75,18 mg/g kuues2-TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)--mutandid vs. 43,58±3,39 mg/g kontrollides vastavalt P14, n=6 ja 10 juures;P<0.0001). this="" is="" consistent="" with="" the="" expression="" pattern="" of="" cre="" recombinase="" in="" six2="" nephron="" progenitor="" cells,="" which="" give="" rise="" to="" cap="" mesenchyme-derived="" renal="" tubules="" and="" podocytes.="" in="" contrast="" to="">TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-'mutandid, heterosügootsusega hiiredTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)normaalselt arenenud SIX2 eellasrakkude puudulikkus olid viljakad ja neil ei tekkinud ilmset neeruhaigust (täiendav joonis S1).
Joonis 1|Tfami inaktiveerimine SIX2 liini rakkudes põhjustab raske tsüstilise haiguse ja neerupuudulikkuse.(a) Skeem, mis illustreerib eksperimentaalset lähenemist ja sihtjärjestuste asukohta Tfam floxed alleelis. Polümeraasi ahelreaktsiooni analüüs pesakonnakaaslaste kontrollist (Cre ) ja kuuest {{0}}sünnijärgsest päevast (P) kuuest sugukonnast eraldatud kogu genoomse neeru DNA polümeraasi ahelreaktsiooni analüüs; mitterekombineeriv Tfam floxed alleel on tähistatud 2-lox (2); rekombineeritud alleel 1-lox, metsiktüüpi alleel wt; þ või – näitavad Six2-eGFP/Cre transgeeni olemasolu või puudumist. (b) Vasakpoolsed paneelid, fotod Cre kontrolli neerudest ja kuuest 2-Tfam hiirest vanuses P20. Neerude kaal (KW) on väljendatud protsendina kehamassist (BW) (n ¼ 4–14). Parempoolsed paneelid, vere uurea lämmastiku (BUN) tase Cre pesakonnakaaslaste kontrolli (co) ja kuue{11}}Tfam hiirte vanuses P7 (n ¼ vastavalt 7 ja 6) ning Kaplan-Meieri ellujäämiskõverad Cre kontrolli ja kuue{11} {16}}Tfam hiired võrreldes log-rank testiga (n ¼ 10–13). (c) Formaliiniga fikseeritud, parafiiniga manustatud neerulõikude tüüpilised kujutised Cre kontrollist ja kuuest 2-Tfam hiirest vanuses P7 ja P29, värvitud hematoksüliini ja eosiiniga (H&E) ning analüüsitud immunohistokeemia abil silelihase aktiini suhtes. (ACTA2) ja klastri diferentseerumise (CD) antigeen 31. Numbrimärgid kujutavad tsüstilisi struktuure ja tärnid glomeruleid. Vardad ¼ 1 mm terve neeru ristlõigete jaoks, 100 mm suure võimsusega H&E kujutiste ja 50 mm IHC kujutiste jaoks. Andmed on väljendatud keskmise SEM-ina ja neid analüüsiti 2-sabaga Studenti t-testiga. ***P < 0,001.="" selle="" pildi="" vaatamise="" optimeerimiseks="" vaadake="" selle="" artikli="" veebiversiooni="">www.kidney-international.org.
cistanche meessoost eelised
Kuue analüüs2-TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/-hiired, mis ekspresseerisid ka ROSA26-ACTB-tdTomato,-eGFP Cre reporteralleeli, mida siin nimetatakse kuueks2-mT/mG;TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-7 hiirt, mis näitab, et valdav enamus tsüstilistest struktuuridestTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/- neerud (täiendav joonis S3). Need leiud on kooskõlas suurenenud fosforüülitud ekstratsellulaarse signaaliga reguleeritud kinaasi (p-ERK) ja -kateniini tasemega kuues{6}}TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/- neerukude (täiendav joonis S3). Kokkuvõttes näitavad meie andmed, et kuus2-TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/ neerudel on molekulaarsed tunnused, mida sageli seostatakse neerutsüstiliste haigustega.
Kuues on nefroni küpsemine defektne2-TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/hiired Kuna koespetsiifiliste hiirte ilmnemiseni võib kuluda kuni mitu nädalatTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)inaktiveerimisel tekkinud patoloogiat, uurisime järgmisena kuues neeruhaiguse arengu ajalist kulgu2-TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A){{0}}hiired. Kogusime kontroll- ja mutanthiirtelt neerud vanuses P0, P7 ja P14 ning kasutasime hindamiseks histoloogilisi meetodeid, immunofluorestsentsvärvimist (IF) ja geeniekspressiooni analüüsi tervete neeruekstraktides. IF-i värvimine SIX2 ja E-kadheriiniga vanuses P0 näitas, et kontroll- ja Sic-i neerud{7}}TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/- olid histoloogiliselt sarnased. Kortikaalsete nefrogeensete tsoonide struktuuride, nagu SIX2 pluss korkmesenhüüm, E-kadheriini ekspresseerivad kusejuhaotsad ja tekkivad nefronistruktuurid, nagu neerupõiekesed ning koma- ja S-kujulised kehad, teket ei blokeeritud kuues{{7} }TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-7- neerud (joonis 2a). Need histoloogilised leiud olid kooskõlas nefrogeenseid markereid kodeerivate geenide ekspressioonitasemetega. Six2, paariskasti 2 (Pax2), LIM homeoboksi valgu 1 (Lhx1) ja spalt-like transkriptsioonifaktori 1 (Sall) mRNA tasemed ei erinenud oluliselt kontrolli ja kuue vahel2-TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/hiired kogu neerus homogeneeruvad P0 neerudest (joonis 2b). See viitas selleleTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)inaktiveerimine SIX2 nefroni eelgenitorites ei mõjutanud oluliselt nefrogeensete struktuuride moodustumist.
Joonis 2|Kuuel2-Tfam-7hiirel on nefronite küpsemine defektne.(a) Tüüpilised kujutised formaliiniga fikseeritud, parafiiniga manustatud lõikudest Cre~ kontrollist ja kuuest 2-Tfam-/neerust sünnitusjärgsel päeval (P) 0. Neerulõigud värviti toluidiinsinisega ja analüüsiti immunofluorestsentsi abil siinuse silmaga seotud homeobox 2 (SIX2) ja E-kadheriini (ECAD) ekspressiooni suhtes. Kusepõie puud on piiritletud valgete katkendlike joontega. Märgitud on kaane mesenhüüm (CM), komakujuline keha (CSB), S-kujuline keha (SSB) ja ureteritipp (UT). (b) Vasak paneel, arengumarkerite suhtelised mRNA ekspressioonitasemed kvantitatiivse polümeraasi ahelreaktsiooni alusel kuue 2-Tfam-/mutandi kogu neeruhomogenaadis vanuses PO võrreldes Cre pesakonnakaaslaste kontrollidega (igaüks n =6) ). Parempoolne paneel, suhteline glomerulaarne (glom) ja nefronisegmendispetsiifiline geeniekspressioon neerude koguhomogenaadis kuuest 2-Tfam7-mutandist vanuses P7 võrreldes Cre-pesakonnakaaslaste kontrollidega (mõlemad n =4). PT, proksimaalne tuubul; mTAL, Henle jäme tõusev haru; DT, distaalne tuubul; CD, kogumiskanal. (c) Alcian sinise/perioodhappe-Schiffi (AB-PAS) värvitud neerulõigud vanuses P0, P7 ja P14. Nooled tähistavad PAS-positiivseid tuubuleid pintsli äärisega, tärnid tähistavad glomeruleid ja numbrimärgid tsüstilisi tuubuleid, tulbad=100 um AB-PAS kujutiste ja 50 um toluidiini sinise värviga kujutiste ja IF-kujutiste jaoks. Andmed on väljendatud keskmisena ± SEM;2-sabaga Studenti t-test;*P<><><0.001.agp1,aquaporin 1;agp2,aquaporin="" 2;lhx1,lim="" homeobox1;napi2a,="" sodium-phosphate="" cotransporter="" 2a;="" ncc,="" thiazide-sensitive="" sodium-chloride="" cotransporter;="" nkcc2,="" sodium-potassium-chloride="" cotransporter="" 2;pax2,="" paired="" box="" 2;="" sall1,="" spalt="" like="" transcription="" factor="" 1;="" scnn1a,="" epithelial="" sodium="" channel="" 1="" alpha="" subunit;="" trpv5,="" transient="" receptor="" potential="" cation="" channel="" subfamily="" v="" member="" 5;="" umod,="" uromodulin.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">www.kidney-international.org.
cistanche arvustused
Kuigi tekkiva nefronistruktuuri moodustumist ei pärsitud, näitas värvimine Alcian Blue/Periodic acid-Schiffi ja lootose tetragonolobuse lektiiniga terminaalse nefroni defektset küpsemist kuues2-TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A){{0}}hiired vanuses P0. Alcian sinine / perioodiline hape-Schiff, mis värvib torukujulisi alusmembraane ja harja piire, ja lootose tetragonolobuse lektiin, mis tuvastab spetsiifilisi oligosahhariide proksimaalsete tuubulite rakkude harja piiril, vähenesid mutantsetes neerudes. Joonisel fig 2c on kujutatud alcian blue/perioodic acid-Schiffi värvimist ajapunktides P0, P7 ja P14. Lotus tetragonolobuse lektiini histokeemia ja IF-värvimine Wilmsi kasvaja 1 valgu jaoks ajapunktides P0, P7 ja P14 on näidatud lisajoonisel S4. PO vanuses oli lootose tetragonolobuse lektiiniga positiivselt värvunud suhteline pindala 2,10 protsenti ±0,51 protsenti ja 0,39 protsenti ± 0,1 protsenti vanus P7 versus 6,25 protsenti ± 0,28 protsenti ja 6,2 protsenti ±1,1 protsenti kontrollide puhul (vastavalt n=3-4, P=0,0004 ja 0,0007; lisajoonis S4). Kooskõlas nende histoloogiliste leidudega on glomerulaar- ja nefronisegmendispetsiifilisi markereid podotsiini, nefriini, akvaporiini 1 (Agp1), naatriumfosfaadi kotransporterit 2a (NaPi2a), uromoduliini, naatrium-kaaliumkloriidi kaastransporterit 2 kodeerivate geenide ekspressiooni oluline vähenemine. (Nkcc2) ja tiasiidi suhtes tundlik naatriumkloriidi kaastransporter (Ncc) kuues2-TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/ hiired (joonis 2b). Kokkuvõttes näitavad need andmed, et kuus2-TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/- neerudes on küpsete proksimaalsete nefronisegmentide ja glomerulite arv järk-järgult vähenenud.
Sest Six{0}}eGFP/Cre tegevus toob kaasaTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)- puudulikud korgi mesenhüümist pärinevad nefronisegmendid, prognoosisime, et kuseteede pungadest pärinevate CD epiteelirakkude küpsemine ei mõjuta kuues 2-TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/ neerud. Selle arusaamaga on kooskõlas see, et värvimine Dolichos biflorus aglutiniiniga, mis reageerib N-atsetüül-D-galaktoosiga distaalses tuubulis ja CD-s, viitas Dolichos biflorus aglutiniini positiivsete struktuuride suhtelisele üleesitamisele kuues2-TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/- neerud. Vanuses P7 moodustasid Dolichos biflorus aglutiniini positiivselt värvunud alad mutantide kogupindalast 13,91 protsenti ±0,9 protsenti võrreldes 1,93 protsenti ± 0,1 protsenti kontrolliga (n {{11} }, P=0.0002; täiendav joonis S4). Naatriumkanali epiteeli 1-alfa subühiku (Scnnla) või akvaporiin 2 (Agp2) mRNA ekspressioon, mis mõlemad ekspresseeruvad CD epiteelirakkudes, ei vähenenud oluliselt võrreldes kontroll(joonis 2b). Vastupidiselt kuuele2-TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/- neerud,TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)inaktiveerimine homeobox B7 (HOXB7) eellasrakkudes, mis tekitavad CD epiteelirakke, mille tulemuseks on CD nefronimarkeri ekspressiooni kadumine ja kerge tubulaarne laienemine, kuid mitte tsüstogenees (täiendav joonis S5). Kokkuvõttes näitavad meie andmed, et kaotusTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)funktsioon SIX2 eellasrakkudes ei blokeeri tekkivate nefronistruktuuride arengut, vaid pärsib terminaalset nefroni küpsemist.
TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/-tsüstidel on tavaliste nefronisegmendi markerite puudujääk
Iseloomustada histogeneetiline päritoluTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-7neerutsüstid, tegime IF-analüüseTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/kidneys at age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter(distal tubule), and aquaporin 2(CD). The majority of cysts with a maximal diameter of>50 um did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation(Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 um iseloomustasid uromoduliini intraluminaalsed ladestused, mis viitasid proksimaaltorukesest distaalsetest nefroni segmentidest ja Henle laskuvast ahelast (joonis 3b).
Joonis 3ITfam-/tsüstid ei väljenda ühiseid nefronisegmendispetsiifilisi markereid.(a)Representative images of formalin-fixed, paraffin-embedded kidney sections from Six2-mT/mG; Tfam-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2(AQP2)by immunofluorescence (IF). 4'6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 um. (b) Formaliiniga fikseeritud, parafiiniga manustatud neerulõikude representatiivsed kujutised Six{3}}mT/mG-st; Tfam-7hiired vanuses P14 värviti IF-ga eGFP ja uromoduliini suhtes. Tärnid kujutavad intraluminaalse uromoduliiniga tsüste. Intraluminaalse uromoduliini olemasolu uuriti tsüstides, mille maksimaalne läbimõõt oli 50-100 um, või tsüstides, mille maksimaalne läbimõõt oli üle 100 um. Baarid =(a,b)100 um. Selle pildi vaatamise optimeerimiseks vaadake selle artikli veebiversiooni aadressil www neeru-international.org.
Progresseeruvad kõrvalekalded mt funktsioonis ja morfoloogiasTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-7-epiteelirakud
Iseloomustada metaboolsete tagajärgede aja kulguTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)deletsioon, uurisime kõigepealt mRNA tasemeidTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)jaTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-reguleeritud mt-Col, mt-Cyb ja mt-Atp6 inTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/- neerud vanuses PO, P7 ja P14. Ootuspäraselt,TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A), mt-Col, mt-Cyb ja nt-Atp6 mRNA tasemed vähenesid oluliselt (joonis 4a). eGFP-ga märgistatud T fam-7- epiteelirakud (kuus2- mT/mG; Tfam-7 hiirt) näitasid MT-CO1 valgu ekspressiooni olulist vähenemist (täiendav joonis S7). Mt DNA koopiate arv vähenes 63 protsenti, mis on kooskõlas mt ammendumisega, mis onTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)puudus (joonis 4a). Seevastu nikotiinamiidadeniindinukleotiidi kodeerivate tuumageenide ekspressioon: ubikinoonoksidoreduktaasi tuumasubühik 3 (Ndufs3) ja suktsinaatdehüdrogenaasi kompleksi flavoproteiini subühik A (Sdha) ei olnud vanuses P0 mõjutatud, kuid P14 P7-aastaselt vähenes. (Joonis 4a). Need mt geeni ja valgu analüüsi tulemused on kooskõlas mt koopiate arvu järkjärgulise kadumisega Tfam-/-epiteelis.
Järgmisena uurisime metaboolset mõjuTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)inaktiveerimine primaarsetes proksimaalsetes tuubulite epiteelirakkudes (PTEC), mis on eraldatud vanuses P7.TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-7 PTEC-de baashapnikutarbimise määrad vähenesid oluliselt (40,77 ± 4,10 mutantide puhul vs. 61,75 ± 5,18 pmol/min/10 rakku kontrollide puhul, n=3 igaüks, P= 0.034 ),ATP-seotud hingamine (33,11 ± 3,91 mutantide puhul vs. 46,92 ± 4,91 pmol/min/10* rakku kontrollide puhul, igaüks n=3, P=0,093), maksimaalne hingamine (116,8 ± 4,91 14,19 mutantide puhul vs. 225,5 ± 13,55 pmol/min/10* rakku kontrollide puhul, igaüks n= 3, P=0,005) ja vaba hingamismaht (76,05 ± 10,18 mutantide puhul vs. 163,7 ± 10,18). 8,61 pmol/min/10* rakku kontrollide jaoks, n=3 igaüks, P= 0,003; joonis 4b).
cistanche reddit
Mt ammendumise ja kahjustuse astme täiendavaks iseloomustamiseks uurisimeTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/- neerud ülekandeelektronmikroskoopia ja 3-mõõtmelise struktureeritud valgustusmikroskoopia (3D SIM) abil. P7 vanuses ilmnesid mitokondritel ebakorrapärased kujud ja õhupallid, mis on kooskõlas varasemate leidudegaTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)knockout hiired. Transmissioonelektronmikroskoopiline analüüs näitas, et mitokondrite struktuursed kõrvalekalded, nagu suurenenud suurus ja ebanormaalsed kristallid, progresseerusid postnataalselt, kuna mutantide ja kontrolli morfoloogilised erinevused olid vanuses P0 vähem ilmsed ja muutusid vanuse kasvades raskemaks (joonis 4c). ).3D SIM-kaarti kasutati mt helitugevuse ja võrgu suuruse uurimiseks kuues2- mT/mG;TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/ mutandid võrreldes kuue2-mT/mG kontrollhiirega vanuses P7; mt ruumala mõõdeti 5–8 tuubuli ristlõigetes sektsiooni kohta, uurides 25–40 eGFP-positiivset kortikaalset epiteelirakku, mis olid värvitud pingest sõltuva anioonselektiivse kanali 1 suhtes IF-värvimisega. Leidsime, et mt kogumaht eGFP-positiivse raku kohta vähenes oluliselt (62,66 ± 16,46 um raku kohta mutantide puhul vs. 177,4 ± 30,17 μm' raku kohta kontrollide puhul, igaüks n=3 , P= 0.0289) ja see oli seotud muutusega kogu rakkude kogumahu ja rakkude kogumahu suhte suhtes 0,230 ±0,01-lt kontrollidel 0,089±0,016-le kuues. 2-TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-7 mutandid (igaüks n= 3, P=0.0017; joonis 4c). Maksimaalset mt-võrgu suurust, mis mõõdab kõigis uuritud eGFP-positiivsetes rakkudes leitud suurimat mt-võrku, vähendati kuues 2-TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/ neerud (143,2 ± 23,2 μm² mutantide puhul vs. 318,3 ± 49,45 um² kontrollide puhul, igaüks n= 3, P= 0,0327). Kokkuvõttes on ultrastrukturaalsed ja SIM-leiud ning mt geeni- ja valguanalüüsi tulemused kooskõlas mt koopiate arvu järkjärgulise kadumisegaTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-7-epiteel.
Joonis 4| Tfam-/neeru epiteeli iseloomustab progresseeruv mitokondriaalne ammendumine.(a) Mitokondriaalse (mt) geeni ekspressioon kvantitatiivse polümeraasi ahelreaktsiooni teel sünnijärgsel päeval (P) {{0}}, P7 ja P14 (kordne muutus kontrolliga võrreldes, kumbki n =6) ja mt DNA sisaldus (P7) kogu neeruhomogenaatides Cre~ pesakonnakaaslase kontrollist (co) ja kuuest 2-Tfam-/hiirest. (b) Hapnikutarbimise määr (OCR) primaarsetes proksimaalsetes tubulaarsetes epiteelirakkudes (PTEC), mis on eraldatud Cre pesakonnakaaslase kontrollist ja kuuest 2-7perekonna neerust vanuses P7 Seahorse XFe24 platvormil. Tüüpilised OCR-i mõõtmised kontroll- ja Tfam{11}}PTEC-des, mida on töödeldud oligomütsiin A-ga (oligo A, adenosiintrifosfaadi [ATP] süntaasi inhibeerimine), karbonüültsüaniid-p-trifluorometoksüfenüülhüdrasooniga (FCCP, lahtiühendaja) ja oksüdatiivse rotenooni inhibiitoritega ja antimütsiin A(AA). Samuti on näidatud arvutatud basaal- ja maksimaalne hingamine, ATP-ga seotud hingamine ja vaba hingamismaht (mõlemad n =3). (c) Mitokondrite ultrastruktuurne analüüs ülekandeelektronmikroskoopia abil. Cre-controli ja kuue 2-Tfam-7hiire neerulõikude tüüpilised transmissioonielektronmikroskoopilised kujutised vanuses P0 ja P7, punased nooled kujutavad mitokondreid. Riba=500 nm. (d) Six2-mT/mG (co) ja Six2-mT/mG neerulõikude kolmemõõtmelised struktureeritud valgustusmikroskoopilised kujutised; Tfam-/-hiired vanuses P7. Immunofluorestsentsiga tuvastati tõhustatud roheline fluorestseeruv valk (eGFP), tsütokroom c oksüdaasi subühik 4 (COXⅣ) ja pingest sõltuv anioonselektiivne kanal 1 (VDAC). ) kasutati tuuma värvimiseks (sinine fluorestsents). Valged katkendlikud jooned kujutavad kontroll- neerutorukest ja mutantse neeru tsüsti valendikku ning numbrimärgid kujutavad tubulaarset luumenit kontroll- või tsüstivalendikku mutantses neerus. Mt-ala kvantifitseeriti Imarisega. tarkvara (Oxford Instruments, Abingdon, Ühendkuningriik; n =3 kumbki). Mt kogumaht (kogumaht (maht) eGFP-positiivse raku kohta (25-40 rakku analüüsitud proovi kohta), Mt kogumahu suhe kärje kogumahu kohta ja mt võrgu maksimaalne (maksimaalne) suurus kärje kohta. Mt võrgu suurus määrati torukujulise ristlõikega, 5 rakku ristlõike kohta. Tulbad =4 um. Andmed on esitatud keskmisena ± SEM ja neid analüüsiti Studenti t-testiga<><><0.001, mt-atp6,="" mitochondrially="" encoded="" atp="" synthase="" membrane="" subunit="" 6;="" mt-co1,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" c="" oxidase="" 1;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b;="" ndufs3,="" nadh:="" ubiquinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" sdha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a;="" tfam,="" mitochondrial="" transcription="" factor="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)defitsiit nihutab neerude epiteeli metabolismi glükolüüsi suunas
Neerude PTEC-d kasutavad ATP genereerimiseks rasvhapete oksüdatsiooni ja OXPHOS-i ning on glükoneogeneetilised. aste Tam inaktiveerimisega seotud metaboolsete muutuste kohta täiendava ülevaate saamiseks viisime läbi kuue neerude RNA järjestusanalüüsi2-TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/- ja Cre~ pesakonnakaaslaste kontrollhiired vanuses P7. Leidsime, et glükolüüsis osalevad peamised regulatoorsed geenid, nagu heksokinaas 2 (Hk2) ja enolaas 2 (Eno2), olid ülesreguleeritud. Seevastu vähenes enamiku trikarboksüülhappe tsüklis osalevate geenide ekspressioon (nt isotsitraatdehüdrogenaas 1[Idh1), nagu ka rasvhapete oksüdatsioonis osalevate geenide, nagu atsetüülkoensüüm A atsüültransferaas 1B (Acaalb), ekspressioon. keskmise ahelaga atsüül-koensüüm A dehüdrogenaas (Acadm) (joonis 5a ja b, täiendav joonis S8). Kooskõlas trikarboksüülhappe tsükli kontrollis osalevate geenide ja mutantsete neerude ekspressiooni vähenemisega vanuses P7, kasutades Seahorse XFe24 platvormi (Agilent, Santa Clara, CA). Mutantseid PTEC-e iseloomustas basaalglükolüüsi märkimisväärne suurenemine (prootonite väljavoolu kiirus=117,4 ± 12.07 pmol/min mutantide puhul ja 73,34 ± 6,33 pmol/min kontrolli puhul, n{{25 }}, P=0.{{30}}032) ja mt hapnikutarbimise määra ja glükolüütilise prootoni väljavoolu kiiruse suhte vähenemist 0,73 ± 0,08-lt kontrollrühmas kuni 0,34 ± 0,02 mutantsetes PTEC-des (n=3,P=0,0074). Kokkuvõttes näitavad need andmed sedaTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/- epiteelirakud olid läbinud metaboolse nihke OXPHOS-lt ja rasvhapete oksüdatsioonilt glükolüüsi suunas (joonis 5d).
Joonis 5] Neeru epiteeli mitokondriaalse transkriptsioonifaktori A (TFAM) puudulikkus on seotud suurenenud glükolüüsi ja ebanormaalse rasvhapete metabolismiga.(a) Kuuest 2-Tfam-/- ja Cre-pesakonnakaaslase kontrollhiirtest 7. sünnijärgse päeva (P) vanuses (P) 7 (n {{6) eraldatud kogu neerukoore RNA sekveneerimise analüüs metaboolse geeniekspressiooni abil }} iga). Näidatud on erinevalt reguleeritud metaboolsed geenid, mis osalevad glükolüüsis ja trikarboksüülhappe tsüklis. Statistiliselt olulise mRNA ekspressiooni suurenemisega geene näidatakse punasega ja vähenenud ekspressiooniga geene rohelisega.(b) Valitud erinevalt reguleeritud geenide mRNA ekspressioonitasemed kvantitatiivse polümeraasi ahelreaktsiooni abil (n=4-6). (c) Muutunud rasvhapete metabolism kuuel 2-7Tfam-7mutantsel hiirel. Tüüpilised kujutised kuue 2-Tfam-7ja Cre-pesakonnakaaslase kontrollhiirte õlipunase O-värviga neerulõikudest vanuses P14. Nooled osutavad õlipunasetele O-positiivsetele lahtritele ja number siaan tähistab maksumust. Tulp=10 um.(d) Cre pesakonnakaaslaste kontrollist eraldatud primaarsete proksimaalsete tubulaarsete epiteelirakkude (PTEC-de) glükolüütiline voo analüüs ja kuus 2-Tfam-/neeru vanuses P7 (igaüks n=4) ) Seahorse XFe24 platvormil. Näidatud on glükolüütilise prootoni väljavoolu kiiruse (glüko PER) mõõtmised kontroll- ja Tfam{21}}PTEC-des, mida on töödeldud 2-desoksüglükoosi (2-DG) ja oksüdatiivse fosforüülimise inhibiitorite rotenooni ja antimütsiin A(AA) abil. . Samuti on näidatud keskmine glükoosi PER algtasemel ja mitokondriaalse (mt) hapnikutarbimise määra (OCR) ja glüko PER suhe. Andmed on esitatud kui keskmine ± SEM ja neid analüüsiti Studenti t-testi abil. (jätkub)
VähendatudTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)ekspressioon hiire ja inimese PKD kudedes on seotud mt vähenemisega
Sest kuus2-TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/ neerud sarnanesid tugevalt PKD neerudega, hindasime järgmisena, kasTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)oli PKD kudedes düsreguleeritud. Kõigepealt uurisimeTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)ja TFAM-reguleeritud geeniekspressioon kahes väljakujunenud geneetilises PKD hiiremudelis.TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)mRNA tase vähenes oluliselt Pkd1-/- ja Cyspk/pk hiirte kogu neeru homogenaatides, mis kannavad mutatsioone kas Pkd1 või Cys1. Seda seostati mitokondriaalselt ja tuumaga kodeeritud mt geenide ekspressiooni vähenemisega, samuti glükolüütilise geeni düsreguleeritud ekspressiooniga. Sarnane kuuele2-TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)-/neerud, Pkd1-7 ja CysPkpk neerud iseloomustasid kõrgenenud Eno2 ja Hk2 ning oluliselt vähenenud fosfoglütseraatkinaasi (Pkg)1, püruvaatdehüdrogenaasi kinaasi (Pdk)1 ja Pdk4 transkripti taset (joonis 6a).TFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)IF-värvimisega hinnatuna vähenes valgu ekspressioon tsüsti vooderdavates epiteelirakkudes võrreldes külgnevate mittetsüstiliste tuubulite epiteelirakkudega (joonis 6b). Seda seostati mt-Co1 ja mt-Atp6 ekspressiooni vähenemisega RNA fluorestsentsi in situ hübridisatsiooni abil (joonis 6b, täiendav joonis S9); 3D SIM-iga määratud mt maht vähenes 55 protsenti võrreldes kas külgnevate mittetsüstiliste tuubulite epiteelirakkude või normaalsete kontrollneerude PTEC-dega. Tavaliste kontroll-PTEC-de ja mittetsüstiliste tuubulite PTEC-de mt-mahu erinevusi ei leitud (joonis 6c).
Joonis 6| Mitokondriaalse transkriptsioonifaktori A (TFAM) ekspressioon on vähenenud Pkd1-7- ja CysPkepk neerutsüstides.(a) Mitokondriaalselt ja tuumaga kodeeritud mitokondriaalsete ja glükolüütiliste geenide suhtelised mRNA ekspressioonitasemed Pkd1-7 ja Cyskidneys (n=3-5) (b) Neeru tüüpilised kujutised lõigud Pkd1-7ja pesakonnakaaslaste kontrollhiirtelt, mida analüüsiti sünnitusjärgsel päeval (P)22. Näidatud on immunofluorestsentsvärvimine (IF) TFAM-i ja RNA fluorestseeruva in situ hübridisatsiooni (RNA-FISH) jaoks mitokondriaalselt kodeeritud tsütokroom c oksüdaasi 1 (mt-Co1) ja mitokondriaalselt kodeeritud ATP süntaasi membraani subühiku 6 (mt-Atp6) transkriptide jaoks. Valged nooled tähistavad tsüsti vooderdavaid epiteelirakke, millel on tugevalt vähenenud TFAM, mt-Co1 või mt-Atp6 ekspressioon. Glomeruli märgib gl. TFAM-i ekspresseerivad torukujulised struktuurid identifitseeritakse punase fluorestsentsi abil. Tärnid kujutavad tubulaarseid epiteelirakke tuvastatavate mt-Co1 ja mt-Atp6 transkriptidega. Tuuma värvimiseks (sinine fluorestsents) kasutati 4', 6-diamidino-2-fenüindooli (DAPI). Tulbad=25 um IF-piltide jaoks ja 10 μm RNA-FISH-piltide jaoks. (c) Kolmemõõtmeline struktureeritud valgustusega mikroskoopia. Kuvatud on kujutised Pkd1-7-neerudest pärinevatest neerulõikudest, mida on histokeemia abil analüüsitud lootose tetragonolobuse lektiini (LTL) ja IF-ga tsütokroom c oksüdaasi subühiku 4 (COXIV) ja pingest sõltuva anioonselektiivse kanali 1 (VDAC) ekspressiooni suhtes. Mitokondriaalne (mt) maht määrati Imarise tarkvaraga COXIV värvimise põhjal. Nooled kujutavad tsüsti vooderdavaid epiteelirakke, numbrimärgid kujutavad tsüsti valendikku ja tärnid kujutavad mittetsüstilisi tuubuleid. Tsüsti vooderdavad epiteelirakud on piiritletud katkendlike joontega. Tulbad=10 μm vasaku paneeli ja 3 μum parema paneeli jaoks. Andmed on esitatud kui keskmine ± SEM ja neid analüüsiti Studenti t-testi *P abil<><0.01, and=""><0.001.eno2, enolase="" 2;="" hk2,="" hexokinase="" 2;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b:="" ndufs3.="" nadhubiguinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" pdk1,="" pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 1;="" pdk4.pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 4;="" ppargc1a,="" peroxisome="" proliferator-activated="" receptor="" gamma="" coactivator="" 1-alpha:="" pgk1,="" phosphoglycerate="" kinase="" 1:="" ptec,="" proximal="" tubule="" epithelial="" cell;="" sudha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
Et uurida, kas kaotusTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)ekspressioon on inimese PKD tavaline molekulaarne tunnus, analüüsisime 5 ADPKD patsiendi nefrektoomia proove immunohistokeemia, IF-värvimise, RNA fluorestsentsi in situ hübridisatsiooni ja 3D SIM-i abil. VähendatudTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)ekspressiooni täheldati 75,2 protsendil ± 7,5 protsendil immunohistokeemiaga analüüsitud neerutsüstidest. Seda seostati MT-CO1 ja MT-ATP6 ekspressiooni vähenemisega RNA fluorestsentsi in situ hübridisatsiooni tõttu (joonis 7a, täiendav joonis S10); 3D SIM-iga hinnates vähenes mt maht tsüsti vooderdavates epiteelirakkudes ligikaudu 70 protsenti (joonis 7b). Kokkuvõttes näitas 2 PKD hiiremudeli ja inimese ADPKD kudede analüüs sedaTFAM(suunatud mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A)defitsiit ja mt ammendumine on PKD kudedes tavalised leiud ja tõenäoliselt mõjutavad neerutsüstilise haiguse patogeneesi.
Joonis 7| Mitokondriaalse transkriptsioonifaktori A (TFAM) ekspressioon polütsüstilise neeruhaigusega patsientide neerutsüstides on vähenenud.a) Formaliiniga fikseeritud parafiiniga manustatud lõikude tüüpilised kujutised normaalsetest inimese neerudest ja polütsüstilise neeruhaiguse (PKD) patsientide neerudest, mida analüüsiti immunohistokeemia abil TFAM-i ekspressiooni suhtes, immunofluorestsentsi (IF) abil pingest sõltuva aniooniselektiivse kanali 1 (VDAC) jaoks ) ekspressiooni ja RNA fluorestseeruva in situ hübridisatsiooni abil mitokondriaalselt kodeeritud tsütokroom c oksüdaasi 1 (MT-CO1) ja mitokondriaalselt kodeeritud ATP süntaasi membraani subühiku 6 (MT-ATP6) mRNA ekspressiooni jaoks. Nooled identifitseerivad tsüsti vooderdavaid epiteelirakke, arvumärke on kujutatud. ja tärnid tähistavad glomeruleid. Riba=100 μm madala suurendusega kujutiste ja 10 um suure suurendusega kujutiste jaoks (b) Tüüpilised 3-mõõtmelised struktureeritud valgustusega mikroskoopilised kujutised inimese PKD neerulõikudest, mida analüüsiti IF-ga VDAC ekspressiooni jaoks.4',{ Tuuma värvimiseks (sinine fluorestsents) kasutati {17}}diamidino-2-fenüülindooli (DAPl). Katkendjooned tähistavad tuubuleid ja numbrimärgid kujutavad torukujulist või tsüstide valgust. Mitokondriaalne (mt) maht määrati Imarise tarkvara abil (n=5). Tulp =4 μm. Andmed on esitatud kui keskmine ± SEM ja neid analüüsiti Studenti t-testi abil.*P<0.05. to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
