Normaalse ja tsüstilise neeru nefronite kolmemõõtmeline arhitektuur
Mar 06, 2022
Kontakt: emily.li@wecistanche.com
Thomas Blanc1,2,7 , Nicolas Goudin3,7 , Mohamad Zaidan1,4,7 , Meriem Garfa Traore3 , Frank Bienaime1,5, Lisa Turinsky1 , Serge Garbay1 , Cle´ment Nguyen1 , Martine Burtin1 , Ge´rard Friedlander1,6 , Fabiola Terzi1,8 ja Marco Pontoglio1,8
MÄRKSÕNAD: tsüstiline neeruhaigus; neerud; nefroon; nefronoftiis;kudede puhastamine
Neerufunktsioon sõltub suuresti nefronite keerulisest kolmemõõtmelisest struktuurist. Nende kuju mis tahes moonutamine võib põhjustadaneerufunktsiooni häired. Traditsioonilised histoloogilised meetodid seavad kolmemõõtmelise koe rekonstrueerimise jaoks suured piirangud. Siin ühendasime kudede puhastamise, mitme fotoni mikroskoopia ja digitaalse jälgimise üksikute nefronite rekonstrueerimiseks füsioloogilistes ja patoloogilistes tingimustes. Komplektidnefroonidtuvastati asukoha, kuju ja suuruse poolest vastavalt nende funktsioonile. Huvitaval kombel kipuvad nefronid lamama tasapinnaliselt. Kui seda tehnikat rakendati mudeliletsüstiline neeruhaigus, leiti, et tsüstid arenevad ainult konkreetsetes nefroni segmentides. Samal segmendil on tsüstid külgnevad tavalistes laienemata tuubulites. Lisaks varieerusid tsüstide kuju vastavalt nefroni segmendile. Seega pakuvad meie leiud väärtuslikku strateegiat neerude keeruka struktuuri visualiseerimiseks ühe nefroni tasemel ja, mis veelgi olulisem, annavad aluse patoloogiliste protsesside, nagu tsüstogenees, mõistmiseks.
Tõlkeavaldus
Puhastusmeetodid pakuvad ainulaadset vahendit, et mõista, kuidas morfoloogilised muutused põhjustavad patoloogilisi tagajärgi. Neerud on olulised organid, mis säilitavad keha homöostaasi vee, metaboliitide ja elektrolüütide käitlemise kaudu, mis sõltuvad olulisel määral nefronite keerukast 3-mõõtmelisest struktuurist. Kui seda struktuurilist korraldust muudetakse, tekib neerupatofüsioloogia. Käesolevas uuringus oleme välja töötanud võimsa meetodi, mis põhineb optilisel puhastamisel,
multifotonmikroskoopia ja digitaalne jälgimine neerude uurimiseks ühe nefroni tasemel füsioloogilistes ja patoloogilistes tingimustes. Eelkõige pakume polütsüstilise neeru esimest 3-mõõtmelist rekonstrueerimist üksikute nefronite skaalal. Seda meetodit saab rakendada mitmes patoloogilises kontekstis, mis võimaldab meil paremini mõista neerude halvenemise keerulist protsessi ja sellest tulenevalt välja töötada sihipärasemaid ravistrateegiaid.
Neer säilitab keha homöostaasi oma keerulise 3-mõõtmelise (3D) nefronistruktuuri kaudu. Kui seda struktuurilist korraldust muudetakse, tekib neerupatofüsioloogia.Kroonilised neeruhaigusedmida iseloomustab neerukahjustuste areng. Huvitaval kombel on patoloogid teatanud kahjustuste laiaulatuslikust heterogeensusest krooniliste neeruhaiguste korral.1,2 Kas see peegeldab tõsiasja, et konkreetsed nefronisegmendid võivad olla erinevalt kahjustatud või mõnel nefronil on erinev vastuvõtlikkus vigastada tervikuna. , on teadmata. Selle probleemi lahendamiseks on patoloogilistes kontekstides kohustuslik rekonstrueerida nefronite 3D-kuju.
Meie teada,nefroonidon täielikult rekonstrueeritud ainult seeriaviisiliste 2D-lõikude abil.3–5 Kuigi standardne histoloogiline jaotus tagab kõrge eraldusvõime, on 3D-rekonstruktsioonid töömahukad ja raskesti teostatavad. Selle põhjuseks on eelkõige mehaanilised moonutused, mis on viilutamisprotseduuri vältimatu mõju. Lisaks ei võimalda 2D-kujutistest 3D-rekonstrueerimine 3D-struktuuride otsest kujutist tervelt kinnitatud kudedes.
Multifotoonmikroskoopia on parandanud meie võimet tuvastada morfoloogilisi muutusi paksudes lõikudes. Oluliseks piiranguks on aga valguse hajumise tõttu madal ligipääsetav sügavus. Murdumisnäitaja erinevusi minimeerides on puhastusained märkimisväärselt parandanud sügavuse pildistamise võimet.6,7 Hoolimata asjaolust, et esimene puhastusagent võeti kasutusele sajand tagasi,8 on alles hiljuti välja töötatud mitu puhastusprotokolli, peamiselt aju jaoks. .9–17 Hiljutised uuringud on näidanud nende potentsiaali teiste tahkete elundite, näiteks maksa, pankrease või neerude kuvamisel.18–26
cistanche neeruhaiguste korral
Polütsüstiline neeruhaigus, geneetiliselt heterogeenne haigus, mis hõlmab mutatsioone mitmes tsiliaarses geenis, on kõige levinum pärilik neeruhaigus.27,28 Polütsüstilist neeruhaigust iseloomustab tsüstide teke, mis põhjustavad neeru täielikku hävimist.28 Mikrodissektsiooniuuringud näitasid, et tsüstid võivad areneda kas nefronisegmendi "väljatõukamisena", nagu autosomaalse domineeriva polütsüstilise haiguse korralneeruhaigus; nagu kogumiskanalite (CD-de) ektaatiline laienemine, nagu autosomaalse retsessiivse polütsüstilise haiguse korralneeruhaigus; või eranditult medullaarsetes tuubulites, nagu nefronoftiis (NPHP).27,29 Siiski ei ole veel teada, kuidas tsüstid 3D-s arenevad ning üksteise ja normaalsete naabertuubulite vahel organiseeruvad.
Siin ühendasime optilise puhastamise multifotoni mikroskoopiaga, et anda uusi teadmisi selle kohta, kuidasnefroonidon kujundatud ja organiseeritud füsioloogilistes tingimustes ning kuidas need muutuvad haiguse, näiteks tsüstogeneesi ajal. Meie tulemused näitavad, et on olemas 3 tüüpi nefroneid ja et veresooned võivad mõjutada nefroni ruumilist korraldust. Huvitaval kombel täheldasime, et nefronid kipuvad asetsema kindlatel tasapindadel. Kui me seda tehnikat jck-hiirtele rakendasime, märkasime ootamatult, et tsüstid arenesid välja ainult spetsiifilistes nefroni segmentides, kus fusiformsed tsüstid olid segunenud tavaliste tuubulitega.
TULEMUSED
Eksperimentaalne seadistus
Terviku kuju uurimiseksnefroonidseoses nende keskkonnaga võtsime kasutusele optilisel puhastamisel ja multifotoni mikroskoopial põhineva tehnika (täiendav joonis S1A). Erinevate optiliste puhastusprotokollide võrdlemisel tegime kindlaks, et neerude jaoks oli bensüülalkohol / bensüülbensoaat (BABB) efektiivsuse osas kõige sobivam (täiendav joonis S1B ja C ning täiendav tabel S1).
3D rekonstrueerimine ja digitaalne jälgimine nõuavad kvaliteetseid pilte kõrge eraldusvõime ja kõrge signaali-tausta suhtega. Täheldasime, et loomuliku fluorestsentsi poolt pakutav optiline signaal ei olnud neerulõikudel ühtlane. Eelkõige olid medulla kujutised halvasti kontrastsed madala signaali-tausta suhtega (täiendav joonis S2). Signaali ja tausta suhte parandamiseks värvisime lõigud perioodilise happe-Schiffiga (täiendav joonis S1D), sest empiiriliselt märkisime, et see värvimine põhjustas 2- fotoni fluorestsentsi ajal õhukestes osades suure kontrasti. Signaal ei olnud aga paksude perioodilise happe-Schiffiga värvitud neerulõikudes ühtlane (täiendav joonis S1E). Seetõttu värvisime neerulõike flfluorokroomiga seotud lektiinidega: maapähkli aglutiniini ja nisuidu aglutiniiniga, mis värvivad glomeruleid ja torukesi, ning Griffonia simplicifolia aglutiniiniga, mis märgib veresooni.30 Märkimisväärne on see, et nende lektiinide kombinatsiooniga on signaal-to- tausta suhe suurenes järsult tervikunaneeru sektsioonid, mis on oluliselt paranenud nii xy-tasandil kui ka z-teljel (täiendav joonis S1E ja täiendav film S1).
3D nefronisegmendi visualiseerimine
Tervete nefronite kuju visualiseerimiseks jälgisime nende radasid, alustades glomeruli kusepoolusest ja lõpetades CD-ristmikuga (täiendav film S2). Hoolimata asjaolust, et kasutatavad lektiinid seovad globaalselt kõiki nefroni segmente, märkasime, et hoolikalt kontrollides iseloomustas neid lektiine spetsiifiline muster, kuidas nad värvisid erinevates nefroni segmentides basaal- või luminaalseid membraane. Teisisõnu kasutasime erinevate nefroni segmentide tuvastamiseks ära lektiini värvimise stereotüüpset mustrit. Sel viisil saaksime hõlpsasti tuvastada 6 üksust: proksimaalne tuubul (PT), Henle ahela (HL) õhuke jäse (TL), HL-i paks tõusev jäse (TAL), distaalne keerdtuubul (DCT), ühendustoru (CNT) ) ja CD. Üleminekut PT ja TL vahel iseloomustas tüüpilise PT harja piirisignaali järsk kadumine ja luumeni laiuse vähenemine, mis TL-is peaaegu puudus (joonis 1a). Vastupidi, üleminekut TL ja TAL vahel iseloomustas torukujulise välisläbimõõdu märkimisväärne suurenemine ja suhteliselt konstantne valendiku laius (joonis 1b). Kõiknefroonid, leiti süstemaatiliselt TAL-i üleminek DCT-le glomeruluse vaskulaarses pooluses. Seda üleminekut iseloomustas toru välisläbimõõdu järsk suurenemine, mis oli peamiselt tingitud valendiku läbimõõdu olulisest suurenemisest (joonis 1c). Üleminekut DCT ja CNT vahel iseloomustas nii torukujulise läbimõõdu kui ka valendiku vähenemine (joonis 1d). Lõpuks iseloomustas CNT ja kortikaalse CD vahelist ühendust nii torukujulise läbimõõdu kui ka valendiku järsk suurenemine (joonis 1e). Nende morfoloogiliste üleminekute kvantifitseerimine oli statistiliselt oluline (joonis 1f) ja selle asjakohasust kontrolliti spetsiifiliste torukujuliste markeritega värvimisega (täiendavad joonised S3 – S5 ja lisafilm S3 – S5).
PT-de kuju ja suurus erinevad sõltuvalt nende sügavusest
Värvimine paksneeru sektsioonidvõimaldas meil jälgida tervete PT segmentide ruumilise evolutsiooni koordinaate. Huvitaval kombel avastasime, et nende kuju oli äärmiselt muutlik ja selle määras nende glomerulite asukoht ajukoores. Ülemaailmselt tuvastasime 3 mustrit. Esimene kork reageeris kõige pindmistele nefronitele (SN-idele) (joonis 2a; täiendav film S6), mis hõivasid ajukoore kõige välise osa (kõige välisem 30 protsenti neerukapsli lähedal). Nende keerdunud osad moodustasid kompaktsed struktuurid, millel oli ainult 6–7 keerdumist oma glomeruli ümber, hõivates väga väikeseid ja tihedalt pakitud ruume. Nende SN-de keerdumine lõppes pika ja sirge pars rectaga, mis laskus medullasse. Selle spektri teises otsas täheldasime teist mustritnefroonidasub ajukoore sügavaimas osas (40 protsenti rohkem sisemist sügavust), medulla kõrval (juxtamedullaarsed nefronid [JN-id]) (joonis 2a; täiendav joonis S6 ja lisafilm S6). Nende PT-sid iseloomustas esialgne lühike silmus, mis laskus süstemaatiliselt papilla poole ja seejärel pöördus U, et tõusta neerukapsli poole. Erinevalt SN-idest iseloomustasid JN proksimaalseid keerdunud tuubuleid suured mähised, mis arenesid ümber nende enda glomeruli ja hõivasid suuri, lõdvalt pakitud domeene juxtamedullaarses ajukoores. JN-ide PT keerdunud osal oli 10 kuni 15 keerdu, mis moodustasid suured domeenid. Lõpuks hõlmas kolmas muster nefroneid, mis paiknesid ajukoore keskmises osas (keskmised nefronid [MN-id]) (joonis 2a; täiendav film S6). Huvitav on see, et neil tuubulitel oli kuju ja ruumiline orientatsioon, mis kujutasid endast üleminekut SN-de ja JN-ide vahel. Tegelikult sisaldasid need 8–9 keerdumist mähistega, mis olid suuremad kui SN-id, kuid väiksemad kui JN-id. Lisaks oli MN-idel pikem pars recta kui JN-idel. Huvitaval kombel näitas PT-de kujude globaalne võrdlus, et SN-de ja MN-ide muster oli homogeenne, samas kui JN-id olid äärmiselt heterogeensed (täiendav joonis S6). Lisaks näitas mitme nefroni ruumiline rekonstrueerimine, et PT-d ei segune kunagi (täiendav film S6), mis näitab, et iga nefron hõivab ajukoores oma individuaalse ruumi.
Morfomeetrilised analüüsid kinnitasid suuri erinevusi SN-de ja JN-ide suuruses ja kujus, kusjuures MN-ide jaoks oli vahepealne aspekt. JN-de PT oli rohkem kui 2- korda pikem kui SN-de PT (joonis 2b); sirgus oli aga SN-des suurem kui JN-ides (joonis 2c), mis on kooskõlas tähelepanekuga, et JN-tuubulid olid palju käänulisemad (joonis 2a; täiendav joonis S6).
Joonis 1|Morfoloogilised kriteeriumid, mida kasutatakse nefroni segmentide tuvastamiseks. ( a – e ) Kontrollhiirte nefroni erinevate segmentide morfoloogia. Nefroneid jälgiti glomeruluse kusepoolusest kogumiskanalini (proksimaalne tuubul [PT]: türkiis; Henle ahela õhuke haru [TL]: helehall; Henle ahela paks tõusev haru [TAL]: tumehall; distaalne keerdunud tuubul [DCT]: roosa; ühendustuubul [CNT]: kollane; kortikaalne kogumiskanal [CCD]: oranž). Nooled näitavad erinevate nefroni segmentide läbimõõtu. (jätkub)
Joonis 1|(Järg) (f) Erinevate nefronisegmentide torukujulise välisläbimõõdu kvantifitseerimine. Andmed on väljendatud keskmise SEM-ina. Dispersioonanalüüs, millele järgneb Tukey-Krameri test: **P < 0.01,="" ***p=""><>
Joonis 3|Kolmemõõtmeline (3D) nefroni rekonstrueerimine paljastab 3 erinevat tüüpi nefronit. (a) Tüüpilised 3D-kujutised tervest nefronist (vasakpoolsed paneelid) glomerulitest kuni kogumiskanalini kontrollhiirtel pindmises ajukoores (sinine), keskmises ajukoores (roheline) ja juxtamedullaarses piirkonnas (punane). Nefroni segmenteerimine (parempoolsed paneelid) 3 erinevat tüüpi nefroni jaoks. Varras ¼ 150 mm. (b) Henle ahela kahe haru vahelise kauguse kvantifitseerimine kolme tüüpi nefronite puhul. c) Nefroni pikkuse kvantifitseerimine (jätkub)
Joonis 3|(jätkub) 3 tüüpi nefroneid. (d) Nefroni erinevate segmentide pikkuse kvantifitseerimine vastavalt nefroni tüübile. Andmed on väljendatud keskmisena -SEM. Dispersioonanalüüs, millele järgneb Tukey-Krameri test: juxtamedullaarne nefron (JN) versus pindmine nefron (SN): ###P < 0.001;="" jn="" versus="" keskmine="" nefron="" (mn):="" *="" p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001.="" cnt,="" ühendustoru;="" dct,="" distaalne="" keerdunud="" tuubul;="" pt,="" proksimaalne="" tuubul;="" tal,="" henle="" silmuse="" paks="" tõusev="" haru;="" tl,="" henle="" silmuse="" peenike="">
Glomerulaarne suurus varieerub sõltuvalt sügavusest
Seejärel analüüsisime igast kolmest tsoonist juhuslikult valitud glomerulite sügavust ja läbimõõtu. Morfomeetrilised analüüsid näitasid, et glomerulid paiknesid JN-ides ja SN-des keskmiselt vastavalt 783 ja 355 mm kaugusel neerukapslist. Nagu varem teatatud, täheldasime, et glomerulite suurus varieerus vastavalt nende sügavusele. Eelkõige oli JN-de glomerulaarmaht 3 korda suurem kui SN-de ja MN-de maht (joonis 2d).
3D nefroni rekonstrueerimine
Seejärel jälgisime tervete nefronite ruumilist arengut PT-st CNT-ni. Nende 3D-rekonstrueerimise globaalne vaade kinnitas, et nefroni kuju erines SN-de, MN-ide ja JN-ide vahel (joonis 3a; täiendav film S7). See erinevus tulenes peamiselt PT struktuurist. Lisaks täheldasime, et HL-l oli erinev 3D-ruumiline korraldus. Eelkõige olid TL ja TAL JN-ides kaugemal kui SN-ides ja MN-ides (joonis 3b). Morfomeetrilised analüüsid näitasid, et JN-id olid globaalselt 2-korda pikemad kui SN-id (joonis 3c). Suurenenud pikkus jaotati proportsionaalselt kõigis segmentides, välja arvatud TAL ja DCT, millel oli kõigis nefronitüüpides sarnane absoluutpikkus (joonis 3d). See viitas sellele, et nefroni pikenemine on üllatavalt homogeense mustriga protsess.
Kaarjad veresooned mõjutavad juxtamedullaarset PT konvolutsiooni
Et saada terviklikum perspektiivneeru struktuur, kasutasime ära Griffonia simplicifolia aglutiniini värvimist, mis võimaldas meil jälgida kaarekujulisi veresooni ja nende harusid kortikaalsetesse kiirgussoontesse (joonis 4a; täiendav film S8). Huvitaval kombel näitas nefronite ja veresoonte samaaegne 3D rekonstrueerimine, et kaarekujulised veresooned kipuvad olema üllatavas paralleelses ruumilises korralduses lähedal asuvate tuubulitega. Eelkõige täheldasime, et konkreetsete JN-ide (piiratud JN-ide) järgnev tee kipub järgima lähedal asuva laeva teed (joonis 4b; täiendav film S9). Tähelepanuväärne on see, et see eelarvamus (täheldatud ainult JN-i nefronite alamrühmas) põhjustas PT kujude suurt heterogeensust (täiendav joonis S6). Morfomeetrilised analüüsid näitasid, et "piiratud" PT-d olid märkimisväärselt pikemad ja käänulisemad (vähendatud sirgus) kui "piiranguteta" (joonis 4c ja d). Väärib märkimist, et nii SN-de kui ka MN-ide keerdunud osad paiknesid kaarekujuliste veresoonte kohal ega olnud piiratud.
Torukesed kipuvad lebama tasapinnaliselt
Huvitaval kombel näitas nefronite 3D-kujude kontrollimine, et need kipuvad asetsema tasapinnal (joonis 5a; lisafilm S1{5}}). Selle parameetri kvantifitseerimiseks ja selle konformatsiooni võimaliku statistilise nihke hindamiseks mõõtsime tuubulite üldist kalduvust painduda välja nende silmustega määratletud tasapinnast. Meie mõõtmised näitasid, et võrreldes juhusliku kõndimise simuleeritud mudeliga, mis genereeriti sama järjestikuste mõõdetud nurkade ja järjestikuste punktide vahelise pikkusega (joonis 5b), kaldusid tuubulid arenema tasapinnast väiksema kõrvalekaldega (joonis 5c). See näitas, et tuubulid kippusid oma teed piki tasapinda piirama. Täheldatud erinevused olid statistiliselt väga olulised (P <>
cistanche võib parandada neerufunktsiooni
3D-nefroni rekonstrueerimine näitab tsüstide arengu spetsiifilist mustrit
Et teha kindlaks, kas meie protokoll võimaldab tuvastada nefroneid korrastamata patoloogilistes kudedes, iseloomustasime tsüstide kuju ja ruumilist jaotumist jck-hiirtel, mis on laialdaselt kasutatav NPHP ja tsüstilise haiguse mudel.31–33 3D-kujutised näitasid, et vaatamata silmapaistvate tsüstide ilmnemisel ei erinenud nefronite üldine 3D kulg oluliselt kontrollhiirte omast (täiendav film S11). Samamoodi kinnitasid morfomeetrilised analüüsid, et nefronite globaalne pikkus, glomerulaarmaht ja nende pikkusnefronsegmendid olid võrreldavad kontrollhiirte omadega (täiendav joonis S7). Pange tähele, et tsüstide arengu tõttu ei suutnud me HL-is TL-i TAL-ist eristada. Kõigil nefronitel tekkisid fusiformsed tsüstid (täiendavad filmid S11 ja S12). Üks silmatorkavamaid tunnuseid oli tähelepanek, et fusiformsed tsüstilised laienemised toimusid samaaegselt mitmes kohas.nefronsegment (täiendavad filmid S12 ja S13). Huvitaval kombel täheldasime, et PT-des ja HL-i laskuvates jäsemetes ei tekkinud kunagi tsüstid (joonis 6a; täiendav film S12). Seevastu tuvastati need valdavalt HL-i tõusvates jäsemetes, DCT-des, CNT-des ja CD-de ülemises osas koos CNT-ga (joonis 6a; täiendav film S12). Eelkõige täheldasime, et DCT-l ja ka CNT-segmentidel oli tsüstide tekkimise tõenäosus nende vastavates kaugemates osades omapäraselt suurenenud (joonis 6b). 3D-rekonstruktsiooni kujutiste kvantitatiivsed morfomeetrilised analüüsid näitasid, et tsüsti kogumahtnefronoli eriti kõrge CNT-s (joonis 7a). Lisaks täheldasime, et tsüstide suurenemine HL-is ja DCT-s oli JN-ides suurem kui SN-de ja MN-de puhul (joonis 7a; täiendav film S12). Lisaks oli tsüstide esinemissagedus JN-ides märkimisväärselt kõrgem kui muud tüüpi nefronites (joonis 7b). Samuti täheldasime, et keskmine glomerulaarne vahekaugus (arvutatud lähima 5 glomeruli järgi) kippus eriti suurenema tsüstilistel hiirtel, eriti pindmisemas ajukoores (täiendav joonis S8).
Paljude tsüstide 3D-rekonstrueerimine näitas, et nende kuju ja maht olid äärmiselt erinevad (joonis 6c; täiendavad filmid S11 ja S13). HL-i tõusvas jäsemes olid tsüstid väikese läbimõõduga fusiformse kujuga. DCT-s olid tsüstid üsna sfäärilised ja suuremad ning paiknesid laienemata tuubulite vahel. Huvitav on see, et üleminekut DCT ja CNT vahel iseloomustas süstemaatiliselt normaalne mittedilateeritud struktuur. Seevastu CNT-s täheldasime süstemaatiliselt külgnevat laienenud tsüstilist struktuuri, mis oli vahetult kokkupuutes CD-ga. Huvitav on see, et CD-s kahanes see struktuur järk-järgult normaalse tuubuli suuruseni. Distaalsemalt ei tuvastatud CD külgnevas osas täiendavaid tsüste. Veel üks järjekindel tunnus oli tsüstide omapärane ruumiline korraldus HL-i tõusvas jäsemes. Tegelikult, kuigi tsüstid olid SN-des sügavamal ja silmusele lähemal, olid nad JN-ides pealiskaudsemad ja DCT-le lähemal (joonis 6c). Jällegi hõivasid tsüstid MN-ides vahepealse positsiooni (joonis 6c).
Joonis 5|Nefronituubulid kipuvad arenema lamedate struktuuridena. (a) Nefroni proksimaalse tuubuli tüüpiline tee. See tee illustreerib selle kalduvust asuda tasapinnal. Teekonna arengu tasapinnalisust saab paremini näha, kui seda õigesti pöörata ja vaatleja vaatepunktiga joondada (vt sama torukujulise segmendi parempoolset kujutist, mis vasakpoolsel küljel on kujutatud erineval kujul nurk). (b) 4 segmendist koosneva torukujulise tee skemaatiline esitus (5 punkti vahel, mis määratlevad näitena näidatud torukujulise tee). Astet, mil teed kipuvad "oma tasapinnast välja" minema, saab esitada nurgaga, mis on siin näidatud kui "beeta". (jätkub)
Joonis 5|(Järgneb) Seda nurka mõõdetakse lõigu p3-p4 vahel tasapinna suhtes (määratletud vahetult eelnevate punktidega p3, p2 ja p1) ning skeemis kujutatud tumehalli ristkülikuga. Seejärel arvutati beetanurkade arvutamine rekursiivselt kogu torukujulise tee punktide kogumi ulatuses. Nende beetanurkade nihke ulatuse hindamiseks simuleerisime juhuslikku kõndimist (Monte Carlo simulatsioon [MC-d]), kasutades iga torukujulise tee sama järjestikuste alfanurkade komplekti (mõõdetuna kõigi järjestikuste segmentide vahel). See juhuslik kõndimine genereeris tee identsete alfa-nurkade ja juhuslike beetanurkade komplektiga. (c) Viiuli graafikud beetanurkade globaalse jaotuse ja MC-de tulemuste kohta proksimaalses tuubulis (PT), Henle ahela õhukeses jäsemes (TL), Henle ahela paksus tõusvas jäsemes (TAL), distaalses keerdunud tuubulis ( DCT) ja sidetoru (CNT). MCs, P <>
ARUTELU
Traditsioonilised histoloogilised meetodid on piiratud nende võimega tuvastada patoloogilisi muutusi, mis mõjutavad nefronite globaalset kuju. Siin tutvustame võimsat kudede puhastamisel põhinevat lähenemisviisi, mis võib normaalsetes ja patoloogilistes tingimustes lahendada neerude arhitektuuri olulisi küsimusi enneolematu ruumilise detailiga. Meie tulemused kinnitasid kolme tüüpi nefronite olemasolu, mis erinevad oma asukoha, kuju ja suuruse poolest vastavalt nende funktsionaalsetele eripäradele. Lisaks näitasime, et nefronid kipuvad lamama tasapindadel ja kohanema laevade ruumilise korraldusega. Huvitaval kombel, kui me seda tehnikat mudelile rakendasimetsüstiline neeruhaigus, täheldasime, et tsüstid arenevad kõigis
nefronid, kuid ainult teatud segmentides. Huvitaval kombel näitasime, et tsüsti kuju varieerub sõltuvalt nefronisegmendist ja sama nefroni vahel interkaleeruvad tsüstid tavaliste mittedilateeritud tuubulitega. Kokkuvõttes annavad need tulemused nefronite ja veresoonte ruumilise paigutuse esimese 3D-i iseloomustuse ning annavad olulise aluse patoloogilise protsessi, näiteks tsüstogeneesi mõistmiseks.
Neerude optiline puhastamine on kõrge autofluorestsentsi ja rakutiheduse tõttu keeruline. Võrreldes erinevaid kliirimisprotokolle, tuvastasime BABB-s võimsa tehnika, mis võimaldab visualiseerida ja rekonstrueerida struktuure, mis asuvad kõige sügavamas osas.neerud, see tähendab medulla. Lisaks on BABB kiire ja skaleeritav ning pärast tühjendamist saab proove säilitada mitu kuud enne pildi saamist. Selle tehnika teine peamine eelis on selle madal hind. Puhastavad ained võivad põhjustada struktuuride kahanemist või suurenemist.9–17 Kuna need neeru suuruse muutused on aga isotroopsed, ei mõjuta suhtelised mõõtmised eeldatavasti ega moonuta nende tõlgendust. Üks olulisemaid piiranguid on struktuuride annoteerimine, mis on väga aeganõudev. Sellegipoolest kasvab süvaõppel põhinevate tehnikate arv, mis peaksid sellest piirangust kiiresti üle saama.
Kooskõlas klassikaliste tehnikatega saadud tulemustega näitas meie uuring, et nefronid erinevad oma kuju ja pikkuse poolest vastavalt nende asukohale. Eelkõige täheldasime, et JN-idel on rohkem arenenud keerdunud PT-d ja suuremad glomerulid ning need on 2 korda pikemad kui SN-d. Suurenenud pikkus on harmoonilise protsessi tulemus, kuna pikenemine mõjutab proportsionaalselt kõiki nefroni segmente. Samuti täheldasime, et JN-idel on suurem HL. Kokkuvõttes näitavad need andmed selgelt, et SN-de ja JN-ide mikroanatoomia on märkimisväärselt erinev ja et MN-idel on vahepealsed omadused. Huvitaval kombel on füsioloogilised uuringud näidanud, et nefronid on ka funktsionaalselt erinevad.2 Nende erinevuste aluseks olevad morfogeneetilised sündmused ei ole veel teada. Seega on ahvatlev oletada, et JN-ide konkreetne struktuur võib olla tingitud nende funktsioonide spetsiifilisusest.
Huvitaval kombel avastasime esimest korda nefronite ja neid ümbritsevate veresoonte 3D-rekonstrueerimisega ruumilise piirangu kaarekujuliste veresoonte ja nefronite alarühma vahel. Seega on mõeldav arvata, et laevad võivad teed dikteeridanefroonid34,35 Nefronite 3D-kujude kontrollimine koos arvutuslike simulatsioonidega näitas ka, et nefronid ei segune kunagi ja iga nefron kaldub asetsema tasapinnal. Selle tähelepaneku funktsionaalne tähtsus tuleb veel välja selgitada.
Tsüsti areng ajalpolütsüstiline neeruhaiguson endiselt intrigeeriv protsess. NPHP, patoloogiline seisund, mida iseloomustab tsüstide areng, on kõige levinum geneetiline haigus, mis põhjustab lõppstaadiumis neeruhaigust lastel ja noorukitel. Seni on tuvastatud 20 NPHP geeni.36 Nende hulgas kodeerib NEK8 mittemitoosilise A-ga seotud kinaasi perekonna liiget, mis mängib rolli ripsmete funktsioonis ja rakutsükli progresseerumises.37 Nek8 iseloomustati algselt kui geeni, mis on muteerunud jck hiired.32 Eelkõige on näidatud, et mutatsioon samas valgu domeenis põhjustab inimestel NPHP9.{7}}Uuringud näitasid, et tsüstide areng erineb polütsüstilise neeruhaiguse erinevate vormide puhul dramaatiliselt.27,29 Eelkõige , NPHP puhul näivad tsüstid pärinevat eranditult CD-st ja DCT-st.31 Kuigi need immunohistokeemilised uuringud on informatiivsed, ei saa need väita, et spetsiifiliste torukujuliste markerite39 kadumine on selle tähelepaneku kunstlik põhjus. Seega annab meie 3D-uuring esimesed selged tõendid selle kohta, et tsüsti areng on protsess, mis võib hõlmata ainult konkreetseid nefroni segmente. Huvitav on see, et kuigi NIMA (Never In mitosis gene A) – seotud kinaas 8 (NEK8) ekspresseerub kõigi nefronisegmentide tsütoplasmas, on selle ekspressioon ripsmetes piiratud DCT ja CD-ga. Kuna ainult need segmendid on altid tsüstide tekkele,31 võime oletada, et NEK8 tsiliaarse funktsiooni häirimine on tsüstide moodustumise oluline sündmus. Huvitaval kombel oleme ka täheldanud, et fusiformsed tsüstid on järjepidevuses tavaliste mittedilateeritud tuubulitega. Asjaolu, et retsessiivne idutee mutatsioon põhjustab patoloogilist fenotüüpi ainult rakkude alamrühmas, viitab sellele, et teine sündmus võib nendes rakkudes vallandada tsüstide arengu, nagu soovitatakse autosomaalse domineeriva polütsüstilise haiguse korral.neeruhaigus.40,41
Samuti täheldasime, et tsüstide suurenemine on JN-ides domineerivam kui SN-des, vähemalt arvestades tsüstid, mis paiknevad PT ja CNT vahel. Järjekindlalt on teatatud, et glomeruloskleroosi kontekstis leitakse glomerulaarseid kahjustusi JN-del sagedamini kui SN-del.1,21,42 Kas ületöötamine on tingitud suurenenud üksikjuhtumitest.nefronGlomerulaarsete fifiltratsiooni kiiruste ja transpordi / ensümaatilise aktiivsuse tõttu JN-de suurenenud vastuvõtlikkus halvenemisele on huvitav hüpotees, mis väärib edasist uurimist.
Kokkuvõttes kirjeldame uut tehnikat neerude 3D-pildistamiseks piisava molekulaarse spetsiifilisuse ja eraldusvõimega, et salvestada otseselt spetsiifiliselt märgistatud sisemiste struktuuride (nefroonid, veresooned ja tsüstid) ruumiline ja kvantitatiivne jaotus. Arvestades otsese kvantifitseerimise mugavust, kiirust ja võimet, eeldame, et sellest tehnikast saab võimas vahend neeru patofüsioloogia mõistmiseks.
Joonis 6|Kolmemõõtmeline (3D) nefroni rekonstrueerimine näitab, et tsüstid arenevad ainult konkreetsetes nefroni segmentides. (a) Tüüpilised 3D-kujutised terve nefroni (vasakpoolsed paneelid) tsüstimahu renderdamisega glomerulitest kuni kogumiskanalini pindmises ajukoores (sinine), keskmises ajukoores (roheline) ja jck-hiirtel juxtamedullaarses piirkonnas (punane). Nefroni segmenteerimine (parempoolsed paneelid) 3 erinevat tüüpi nefroni jaoks. Varras ¼ 150 mm. ( b ) Tsüstide tekkimise tõenäosus erinevates nefroni segmentides jck hiirtel. (jätkub)
Joonis 6|(Jätkub) Horisontaalne telg on nefronite normaliseeritud pikkus, mis vastab 50 mahutile (proksimaalne tuubul [PT], türkiis; Henle silmus [HL], valge; distaalne keerdtuubul [DCT], roosa; ühendustuubul [CNT], kollane) . (c) Tüüpilised 3D-tsüstide rekonstrueerimiskujutised HL-i (vasakpoolsed paneelid), DCT-de (keskmised paneelid) ja CNT-de ning ajukoore kogumiskanalite (CCD-d) (parempoolsed paneelid) tõusva jäseme tsüstide mahu renderdamisega pindmistes (ülemised paneelid), keskmises osas (keskmised paneelid) ja kõrvutatud (alumised paneelid) nefronid jck hiirtel. Varras ¼ 50 mm.
MEETODID
Loomad
Kõik loomadega tehtavad protseduurid on heaks kiidetud "Services Vétérinaires de la Préfecture de Police de Paris" ja Université Paris Descartes'i eetikakomitee poolt. Kahekuuseid FVB/N hiiri (n¼ 20) kasutati neerude puhastamise katsetingimuste seadistamiseks. Seejärel viidi uuring läbi 2-nädala vanuste jck isaste hiirtega (n ¼ 4) ja kontroll-pesakonnakaaslastega (n ¼ 3).
Neerukudede ettevalmistamine
Enne tapmist perfuseeriti hiiri intrakardiaalse kateteriseerimisega 25 ml hepariniseeritud soolalahusega (1000 RÜ/l), millele järgnes 75 ml 4% paraformaldehüüdi fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS). Katsed viidi läbi ksülasiini (Rompun 2 protsenti, Bayer, Leverkusen, Saksamaa, 6 mg/g kehamassi kohta) ja ketamiini (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Prantsusmaa, 120 mg/g kehakaalu kohta) anesteesia all.
Puhastusuuringute jaoks fikseeriti neerud 4-protsendilises paraformaldehüüdis 4 tunniks ning sisestati 4-protsendilisesse agaroosi ja 1{4}}mm paksused lõigud, mis ümbritsevad neerukivi, lõigati ja säilitati PBS-is 4 °C juures.Neerude sektsioonidesmalt värviti ja seejärel puhastati.
Õhukeste lõikude immunohistokeemilisteks uuringuteksneerudfikseeriti üleöö 4-protsendilises paraformaldehüüdis ning lõigati parafiiniga kaetud ja 4-mm lõigud.
Värvimine
Perioodiline happe-Schiffi värvimine. 15-mm neerulõike inkubeeriti enne puhastamist puhtas või 1:100 PBS-ga lahjendatud perioodilises happes-Schiffis 5 minutit toatemperatuuril.
Immunohistokeemia õhukestel parafiiniga kaetud lõikudel. Parafiiniga manustatud neerude nelja mikromeetriseid sektsioone kuumutati antigeeni leidmiseks ja inkubeeriti üle öö 4 °C juures flfluorokroomiga seotud lektiinidega, et tuvastada tuubulid (rodamiini maapähkli aglutiniin [RL-1072-5] ja rodamiini nisuidu aglutiniin [RL{{aglutiniin 6}}], Vector Laboratories, Burlingame, CA, lahjendatud vahekorras 1:200) ja segmendispetsiifiline primaarne antikeha, mis kujutab erinevaid torukujulisi segmente (biotinüülitud Lotus tetragonolobuse lektiin [B-1325], Vector Laboratories, lahjendatud 1: 100; hiire anti-Calbindin D28K [D-4], Santa Cruz, Heidelberg, Saksamaa, lahjendatud 1:200; kitse anti-AQP2 [C-17], Santa Cruz, lahjendatud 1:200) . Järgmisel päeval inkubeeriti sektsioone sekundaarse antikehaga 1 tund toatemperatuuril (Alexa Fluor 488 konjugaat [S32354], Invitrogen; antikitse Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; hiirevastane Alexa Fluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA; kõik lahjendatud vahekorras 1:500), enne kui värviti 40,6-diamidino-2-fenüülindooliga. Kõik pildid saadi Nikon Eclipse E800 mikroskoobiga (Champigny sur Marne, Prantsusmaa) ja valmistati FiJi tarkvara abil (versioon 1.50).
Lektiini värvumine paksudel lõikudel. 15-mm paksuseid neerulõike inkubeeriti 4 °C juures 1 kuu Texas Red või flfluorestseiini isotiotsüanaadiga seotud lektiinides: maapähkli aglutiniini (RL-1072-5) ja nisuidu aglutiniini (RL{{6}). }), lahjendatud vahekorras 1:1 00 0,1 protsendilise PBS-asiidi ja 0,1 protsendi Triton-X-ga. Seejärel pesti sektsioone enne puhastamist iga päev 2 nädala jooksul PBS-iga.
Optiline puhastus
Katlakivi puhastamiseks inkubeeriti 15-mm neerulõike ScaleA2-s (4 M uurea, 0,1 protsenti Triton X-100, 10 protsenti glütserooli) või ScaleB4-s (8 M uurea, 0,1 protsenti Triton X-100) 2 nädala jooksul kuni 1 aasta temperatuuril 4 °C.
BABB puhastamiseks dehüdreeriti 15- mm suurused neerulõigud toatemperatuuril järjestikuste etanooliloputustega. Seejärel inkubeeriti proove BABB-s (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) vahekorras 1:2 vähemalt 2 päeva temperatuuril 4 °C.
Kahe fotoni mikroskoopia kujutise saamine
Kuded pildistati vesigeeliga ümberpööratud multifotoni mikroskoobiga (LaVision BioTec), mis oli varustatud Mai Tai HP Titanium-Sapphire Laseriga (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) (täiendav joonis S1A). Ergastuse lainepikkus oli 815 nm 8 protsendi võimsusega. Kasutasime 20 vees sukeldusobjektiivi (XLUMPLFL20XW, Olympus [Tokyo, Jaapan]; numbriline ava 0,95; töökaugus 2,0 mm). Fluorestsentsi omandamiseks kasutasime 80-protsendilist skaneerimata detektorit ribapääsfiltriga 593/40 nm.
Esimene samm koosnes 2D-mosaiikkujutise hankimisest keskmises z-virnas, kasutades suboptimaalseid pildistamisparameetreid (400 mm 400 mm ja 1011 1011 pikslit, 10-protsendiline kattuvus ja joon, mille keskmine väärtus oli 2), et juhtida kõige asjakohasemate keskväljade valimist. (Täiendav joonis S9A). Kui huvipakkuvad ruudustiku xy ja z fiväljad olid määratletud, kohandati parameetreid kvaliteetsete piltide saamiseks. Selline lähenemine vähendas huvipakkuvat piirkonda 5 12 fiväljani z-virna kohta. Seejärel hankisime 850 z virna/optilised viilud (1-mm sammu suurus), mis ümbritsesid neerukäärmust neeru keskosas.neerude sektsioon.
Piltide õmblemine, töötlemine ja jälgimine
Iga virn plaaditi vastavalt Preibischi jt 43 väljatöötatud meetodile, mis võimaldab Fidži tarkvara pistikprogrammi "Grid/Collection stitching" (http://fifiji.sc/Fiji) abil kokku liita suure pildikogumi. . Kuna pärast õmblemist täheldasime olulist nihet kahe kõrvuti asetseva pildi vahel, kirjutasime Pythonis kohandatud sobitusprogrammi. See programm kompenseerib pildi nihke, võimaldades meil pilte õigesti joondada (täiendav joonis S9B). Õmmeldud-korrigeeritud pilte analüüsiti Imarise versiooniga 8.4.2 (Bitplane, Zürich, Šveits). Torukesed ja veresooned jälgiti Imarise fifilamentide jälgimispaketi käsitsi režiimis ja ühendati Imaris Xtensioniga, mille arendasime koos MATLABiga (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone{11}}Liitu{12 }} Filament_Tool.zip?dl¼0) (täiendav joonis S9C). Glomerulid ja tsüstid rekonstrueeriti 3D-s, kasutades Imarise pinnapaketi käsitsi režiimi. 3D-glomerulite ruumilist korraldust kuvati Imarise täppide paketi käsitsi režiimis.
Morfomeetria
Torukujulise segmendi pikkus, nefroni pikkus ja sirgus määrati Imarise fifilamentmärgistuspaketi abil. Imarise tarkvara järgi kvantifitseeriti sirgus 2 punkti vahelise kauguse ja nefronisegmendi tee pikkuse suhtena. Kolmkümmend üks PT ja 12 tervet nefronit rekonstrueeriti ja mõõdeti 3 metsiktüüpi hiirel, samas kui 37 PT ja 17 tervet nefroni rekonstrueeriti ja mõõdeti 4 jck hiirel. Tsüst ja
glomerulaarmahud määrati Imarise "pinnapaketi" abil. Metsiktüüpi ja jck hiirtel mõõdeti vastavalt 31 ja 34 glomeruli. Kokku mõõdeti seitsekümmend neli tsüsti.
Torukujuliste pöörete tasapinnast väljas olevaid nurki (tähistatud kui "beeta") mõõdeti tasapinna (määratletud 3 järjestikuse punktiga) ja järgmise järjestikuse neljanda ruumipunktiga suuna vahel (joonis 5b). Täheldatud kõrvalekalde statistilise olulisuse hindamiseks simuleerisime beetanurkade jaotust beetanurkade juhusliku pööramisega (Monte Carlo simulatsioon) struktuurides, mis koosnesid samadest segmentidest samade alfa-nurkade komplektiga.
Tsüstilise kahjustuse tekkimise tõenäosuse arvutamiseksnefronsegmentides kujutasime iga nefroni ruumipunktide komplektina. Iga punkt märgiti tsüsti olemasolu ja normaalse struktuuri ja segmendi tüübi kohta. Tõenäosus igal standardsel pikkusel (määratud 50 salve) arvutati suhtena tsüstilise annotatsiooniga punktide arvu ja prügikasti punktide koguarvu vahel.
Keskmise glomerulaarse vahekauguse arvutamiseks võtsime iga glomeruli puhul arvesse keskmist glomerulaarsete vahekaugust, mis arvutati lähima 5 glomeruli kohta.
Andmete analüüsid ja statistika
Andmed on väljendatud keskmise SEM-ina. Erinevusi katserühmade vahel hinnati dispersioonanalüüsi abil, millele järgnes, kui see oli oluline (P < {0}}.05),="" tukey-krameri="" testiga.="" kui="" võrreldi="" ainult="" 2="" rühma,="" kasutati="" mann-whitney="" testi.="" statistilised="" analüüsid="" viidi="" läbi="" graph="" prism="" tarkvara="" abil="" (san="" diego,="" ca,="" versioon="">
AVALIKUSTAMINE
Kõik autorid ei deklareerinud konkureerivaid huve.
TUNNUSTUS
Täname tehnilise abi eest Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese (LEAT), Federative de Recherche Neckeri struktuuri- ja pildistamisplatvorme. Täname Pierre Isnardit, Marie-Claire Gublerit ja Nicolas Kuperwasserit käsikirja kriitilise lugemise eest. Seda tööd toetasid Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de la Recherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Kes ma olen, Roche Pharma Research and Early Development (Basel) , Šveits) ja Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Pariis, Prantsusmaa).
AUTORI KAASALAD
TB, NG ja MZ kavandasid ja viisid läbi katsed ning analüüsisid andmeid. FB, LT, MGT ja SG viisid läbi ka mõned katsed ja analüüsisid andmeid. MB ja CN viisid läbi hiirekatsed. Käsikirja kirjutamisel aitasid kaasa ka TB ja MZ. GF muutis käsikirja. FT ja MP andsid kontseptuaalse raamistiku ja kavandasid uuringu, juhendasid projekti ja kirjutasid paberi.
cistanche võib neere toniseerida
LISAMATERJAL
Täiendav fail (PDF)
Joonis S1. Eksperimentaalne seadistamine, hankimisprotseduur ja pilditöötlus.
Joonis S2. Autofluorestsentssignaali piirid eraldusvõimetes xy ja z.
Joonis S3. Kahemõõtmeline pilt üleminekust PT ja TL vahel 4- mm parafiiniga manustatud neerulõikudel.
Joonis S4. Kahemõõtmeline pilt üleminekust TAL ja DCT vahel 4- mm parafiiniga manustatud neerulõikudel.
Joonis S5. Kahemõõtmeline pilt üleminekust DCT ja CNT vahel 4- mm parafiiniga manustatud neeruosadel.
Joonis S6. Kolmemõõtmeline rekonstrueerimine paljastab 3 erinevat proksimaalse tuubuli kuju.
Joonis S7. Kolmemõõtmeline rekonstrueerimine näitab, et tsüstid ei mõjuta nefronite pikkust ja segmenteerimist.
Joonis S8. Glomerulite tihedus kontroll- ja tsüstilistes neerudes.
Joonis S9. Omandamisprotseduur ja töötlusjärgne pilditöötlus.
Tabel S1. Arveldusmeetodite võrdlus. Täiendav fail (filmid)
Film S1. Lektiini värvimine parandab märkimisväärselt eraldusvõimet ja signaali-tausta suhet.
Film S2. Torukese teekonna jälgimine.
Film S3. Puhastatud neeru kolmemõõtmeline rekonstrueerimine, mis näitab proksimaalse tuubuli ja Henle ahela õhukese jäseme vahelist ristmikku.
Film S4. Puhastatud neeru kolmemõõtmeline rekonstrueerimine, mis näitab Henle silmuse paksu tõusva jäseme ja distaalse keerdunud tuubuli ühenduskohta.
Film S5. Puhastatud neeru kolmemõõtmeline rekonstrueerimine, mis näitab distaalse keerdunud tuubuli ja ühendava tuubuli vahelist ristmikku.
Film S6. Proksimaalsete tuubulite kuju ja suurus erinevad sõltuvalt nende sügavusest.
Film S7. Kolmemõõtmeline nefroni rekonstrueerimine kontrollhiirtel.
Film S8. Soone teekonna jälgimine kaarekujulisest veresoonest kortikaalsesse kiirgussooneni.
Film S9. Kaarjad veresooned modelleerivad kõrvuti proksimaalsete tuubulite kuju.
Film S10. Nefronid kipuvad lamama tasapinnas.
Film S11. Kolmemõõtmeline nefroni rekonstrueerimine näitab tsüsti arengu spetsiifilist mustrit.
Film S12. Kolmemõõtmeline nefroni segmenteerimine näitab, et tsüstid arenevad spetsiifilistes nefroni segmentides.
Film S13. Nefronite ja veresoonte ruumiline paigutus ja omavaheline seos polütsüstilises neerus
VIITED
1. Rikas AR. Juxtamedullaarsete glomerulite seni kirjeldamata haavatavus lipoidse nefroosi korral. Bull Johns Hopkins Hosp. 1957;100:173–186.
2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. Nefroni anatoomia heterogeensus. Kidney Int Suppl. 1987;20:S25–S39.
3. Christensen EI, Grann B, Kristoffersen IB jt. Roti nefroni kolmemõõtmeline rekonstrueerimine. Am J Physiol Physiol. 2014;306:F664–F671.
4. Zhai XY, Birn H, Jensen KB, et al. Hiire proksimaalse tuubuli digitaalne kolmemõõtmeline rekonstrueerimine ja ultrastruktuur. J Am Soc Nephrol. 2003;14:611–619.
5. Zhai XY, Thomsen JS, Birn H, et al. Hiire nefroni kolmemõõtmeline rekonstrueerimine. J Am Soc Nephrol. 2006;17:77–88.
6. Puelles VG, Moeller MJ, Bertram JF. Nüüd näeme selgelt: optiline puhastus ja neerude morfomeetria. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2017;26:179–186.
7. Seo J, Choe M, Kim SY. Suuremahuliste bioloogiliste kudede puhastamise ja märgistamise tehnikad. Moli rakud. 2016;39:439–446.
8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. Leipzig, Saksamaa: S. Hierzel; 1914. aasta.
9. Hama H, Kurokawa H, Kawano H jt. Skaala: keemiline lähenemine FL-fluorestsentskujutisele ja läbipaistva hiireaju rekonstrueerimiseks. Nat Neurosci. 2011;14:1481–1488.
10. Ertürk A, Becker K, Jährling N jt. Lahustiga puhastatud elundite kolmemõõtmeline pildistamine 3DISCO abil. Nat Protoc. 2012; 7:1983–1995.
11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P jt. ClearT: puhastusaine- ja lahustivaba meetod neuronaalsete ja mitteneuronaalsete kudede jaoks. Areng. 2013;140:1364–1368.
12. Ke MT, Imai T. Fikseeritud ajuproovide optiline puhastamine SeeDB abil. Curr Protoc Neurosci. 2014;66:2.22.1–2.22.19.
13. Chung K, Deisseroth K. CLARITY närvisüsteemi kaardistamiseks. Nat meetodid. 2013;10:508–513.
14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. Advanced CLARITY intaktsete kudede kiireks ja kõrge eraldusvõimega pildistamiseks. Nat Protoc. 2014; 9:1682–1697.
15. Yang B, Treweek JB, Kulkarni RP jt. Üherakuline fenotüüpimine läbipaistvas puutumatus koes kogu keha puhastamise kaudu. Kamber. 2014;158: 945–958.
16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D jt. Kogu aju pildistamine üherakulise eraldusvõimega, kasutades keemilisi kokteile ja arvutusanalüüsi. Kamber. 2014;157:726–739.
17. Alanentalo T, Asayesh A, Morrison H jt. Tomograafiline molekulaarne kujutis ja 3D kvantifitseerimine täiskasvanud hiire elundites. Nat meetodid. 2007;4:31–33.
18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP jt. Puhastatud hiire elundite multifotonmikroskoopia. J Biomed Opt. 2010;15:036017.
19. Renier N, Wu Z, Simon DJ jt. iDISCO: lihtne ja kiire meetod suurte koeproovide immunomärgistamiseks mahu kuvamiseks. Kamber. 2014;159: 896–910.
20. Lee H, Park JH, Seo I jt. Elektroforeetilise koepuhastustehnoloogia CLARITY täiustatud rakendamine tervetele tahketele organitele, sealhulgas ajule, kõhunäärmele, maksale, neerudele, kopsudele ja sooltele. BMC Dev Biol. 2014;14:1–7.
21. Iversen BM, Amann K, Kvam FI jt. Suurenenud glomerulaarkapillaaride rõhk ja suurus vahendavad glomeruloskleroosi SHR-i juxtamedullaarses ajukoores. Am J Physiol Physiol. 1998;274:F365–F373.
22. Angelotti ML, Antonelli G, Conte C, Romagnani P. Neeru pildistamine: valgusest üliresolutsiooniga mikroskoopiani. Nephrol Dial siirdamine. 2021;36:19–28.
23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE jt. Kolmemõõtmelise meetodi valideerimine podotsüütide loendamiseks ja suuruse määramiseks tervetes glomerulites. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3093–3104.
24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. Kolmemõõtmelise arhitektuuri roll roti neeru sisemise medulla uriini kontsentreerimise mehhanismis. Am J Physiol Physiol. 2008;295:F1271–F1285.
25. Saritas T, Puelles VG, Su XT jt. Optiline puhastus neerus näitab kaaliumi vahendatud tuubulite ümberkujunemist. Cell Rep. 2018;25:2668–2675.e3.
26. Schuh CD, Polesel M, Platonova E jt. Neeru kombineeritud struktuurne ja funktsionaalne pildistamine näitab proksimaalsete tuubulite endotsütoosi suuri aksiaalseid erinevusi. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2696–2712.
27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopathies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017;9:a028191.
28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC jt. Polütsüstiline neeruhaigus. Nat Rev Dis Prim. 2018;4:50.
29. Wilson PD. Polütsüstiline neeruhaigus. N Engl J Med. 2004;350:151–164.
30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Muutused glükosüülimise mustris hiire neeru embrüonaalses arengus, mis ilmnes lektiini konjugaatide puhul. J Histochem Cytochem. 1987;35:55–65.
31. Smith LA, Bukanov NO, Husson H jt. Polütsüstilise neeruhaiguse areng juveniilsetel tsüstilistel neeruhiirtel: ülevaated patogeneesist, tsiliaarsetest kõrvalekalletest ja inimeste haiguste ühistest tunnustest. J Am Soc Nephrol. 2006;17:2821–2831.
32. Liu S, Lu W, Obara T jt. Uue Nek-perekonna kinaasi defekt põhjustab hiirtel ja sebrakaladel tsüstilise neeruhaiguse. Areng. 2002;129:5839–5846.
33. Franke M, Baeßler B, Vechtel J jt. Magnetresonantsi T2 kaardistamine ja difusiooniga kaalutud pildistamine tsüstogeneesi ja ravivastuse varaseks avastamiseks polütsüstilise neeruhaiguse hiiremudelis. Kidney Int. 2017;92:1544–1554. 34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B jt. Nefroni veresoonte spetsialiseerumise molekulaarsed determinandid neerudes. Nat Commun. 2019;10: 5705.
35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Endoteeli-epiteeli kommunikatsioon polütsüstilise neeruhaiguse korral: veresoonte endoteeli kasvufaktori signaalimise roll. Kärjesignaal. 2020;72:109624.
36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. Mitu geeni – üks haigus? Nefronoftoosi (NPHP) ja NPHP-ga seotud häirete geneetika. Eesmine Pediatr. 2017;5:287.
37. Fry AM, O'Regan L, Sabir SR, Bayliss R. Rakutsükli reguleerimine proteiinkinaaside NEK perekonna poolt. J Cell Sci. 2012;125:4423–4433.
38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss TÜ jt. NEK8 mutatsioonid mõjutavad tsiliaarset ja tsentrosomaalset lokaliseerimist ning võivad põhjustada nefronoftoosi. J Am Soc Nephrol. 2008;19:587–592.
39. Wilson PD. Apico-basaalne polaarsus polütsüstilise neeruhaiguse epiteelis. Biochim Biophys Acta. 2011;1812:1239–1248.
40. Happé H, Leonhard WN, van der Wal A jt. Pkd1-deletsiooni hiirte toksiline torukujuline kahjustus neerudes kiirendab tsüstogeneesi, millega kaasneb tasapinnaliste rakkude polaarsuse ja kanooniliste Wnt-i signaaliülekandeteed. Hum Mol Genet. 2009;18: 2532–2542.
41. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA jt. Kriitiline arengulüliti määrab neerutsüstide moodustumise kineetika pärast Pkd1 kaotust. Nat Med. 2007;13:1490–1495.
42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. Valmivate neerude sügavate kortikaalsete glomerulite ainulaadse tundlikkuse mehhanism raskele fokaalsele glomerulaarskleroosile. Pediatr Res. 1990;28:270–276.
43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomancak P. Globaalselt optimaalne plaaditud 3D mikroskoopiliste kujutiste õmblemine. Bioinformaatika. 2009;25: 1463–1465.
