Ginsenoside Rh23, uue anti-melanogeense ühendi eraldamine ja kvantifitseerimine Panax ženšenni lehtedest

Abstraktne:

Uus ginsenosiid, nimega ginsenosiid Rh23 (1) ja 20-O- -D-glükopüranosüül-3,6, 12,20,25-pentahüdroksüdammar{10}} (2) eraldati hüdropoonilise Panaxi ženšenni lehtedest. Ühendid eraldati erinevate kolonnkromatograafiaga ja nende struktuurid määrati spektroskoopiliste meetoditega, sealhulgas kõrglahutusega kvadrupool/lennuaeg massispektromeetria (HR-QTOF/MS), tuumamagnetresonantsi (NMR) spektroskoopia ja infrapunaspektroskoopia (IR) põhjal. . Melanogeense aktiivsuse määramiseks testiti identifitseeritud ühenditega töödeldud Melan-a rakkude melaniinisisalduse muutust.

Lisaks uurisime sebrakala in vivo mudelis ginsenosiidi Rh23 melaniini inhibeerivat toimet pigmentatsioonile. Ühend 1 inhibeeris tugevat melanogeneesi melan-a rakkudes 37.0 protsendiga melanogeneesi inhibeerimisega 80 µM juures ning inhibeeris ka keha pigmentatsiooni sebrakala mudelis. Kuigi ühend 2 näitas veidi madalamat inhibeerivat aktiivsust kui ühend 1, näitas see ka märkimisväärselt vähenenud melanogeneesi Melan-a rakkudes ja sebrakala mudelis. Need tulemused näitasid, et hüdropoonilisest P. ženšennist eraldatud ühendeid võib kasutada uute nahka valgendavate ühenditena in vitro ja in vivo süsteemides. Lisaks näitas see uuring MS-põhise ühendi 1 kasulikkust kvantitatiivse analüüsi jaoks. Ginsenoside Rh23 (1) leiti hüdropoonilise P. ženšenni lehtedest tasemel 0,31 mg/g.

Melaniini puhul avastasime, et Cistanche võib oluliselt alandada türosinaasi aktiivsust, mis on peamine kiirust piirav ensüüm naha melaniini biosünteesis ning vase ja valgu kompleks. See võib hüdroksüleerida türosiini, peamist toormaterjali melaniini tootmiseks organismis, et toota L-dopat ja seejärel oksüdeerida dopa dopakinooniks. Dopakinoon läbib rea metaboolseid protsesse, korraldab ümber ja polümeriseerub ning lõpuks ühineb valkude kombinatsiooniga, et tekiks rida melaniini pigmente, mis põhjustavad pruunistumist. Melaniin on kõige olulisem tegur, mis määrab inimese keha nahavärvi. Liigne süntees võib põhjustada pigmenteerunud nahahaiguste teket, nagu tedretähnid, kloasmid, vanuselaigud ja melanoom. Seetõttu saab türosinaasi aktiivsuse pärssimise uuringute kaudu välja sõeluda tõhusad koostisained naha pigmentatsiooni pärssimiseks, mistõttu on näha, et Cistanche deserticola koguglükosiididel on naha pigmentatsiooni pärssiv ja ilu valgendav toime.

Klõpsake tsüstanche annustamistoode

Märksõnad:

ginsenosiid Rh23; Panaxi ženšenn; NMR; UPLC-QTOF/MS; sebrakala; kvantitatiivne analüüs.

1. Sissejuhatus

Panax ginseng CA Meyer on Aasia riikides väga kuulus traditsiooniline ravimtaim. Panax pärineb "imerohist", mis tähendab kõigi haiguste rohtu. P. ženšenn on mitmeaastane rohttaim, mis kuulub perekonda Araliaceae [1]. Peamiselt kasutatakse ravi eesmärgil P. ženšenni nelja- kuni kuueaastaseid juuri. Lilled õitsevad juunis ja lehed on suulae kujuga. P. ženšenni on peamiselt kasvatatud Ida-Aasias, sealhulgas Koreas, Hiinas ja Jaapanis [2]. Praeguseks on tehtud palju uuringuid ženšenni juurte, lehtede ja marjade keemiliste koostisosade kohta; on eraldatud enam kui 100 liiki ginsenosiidi. Teatati P. ženšenni erinevatest bioaktiivsustest, nagu immunomoduleeriva aktiivsuse tugevnemine, toiteväärtuse tugevdamine, maksafunktsiooni paranemine, diabeedi-, vähivastane, apoptootiline ja antioksüdantne toime [3–10].

Praegu kasvab järk-järgult huvi heaoluga seotud kvaliteetsete põllumajandustoodete vastu, mis viib ženšenni hüdropoonilise kasvatamiseni. Hüdropoonilise harimise eeliseks on lihtne harimisprotsess ja lühem kasvuperiood kui mullaharimisel. Hüdropooniline ženšenn vajab ainult 2–4 kuud süsteemis, mis kontrollib temperatuuri, on pestitsiidivaba, niiske, kerge, sisaldab orgaanilisi koostisosi jne [11]. Mullaharimise ženšenni lehti ei kasutata meditsiinilistel eesmärkidel ja funktsionaalseks köögiviljaks, samas kui hüdropoonilise ženšenni lehti saab kasutada.

In a previous study, the contents and composition of ginsenosides in different parts, such as leaves, roots, and fruits of ginseng, were investigated after a short-term hydroponic system [12]. The total ginsenoside content of the ginseng leaves was found to be significantly higher at 15.30%, while the content of the ginseng roots was at 1.27%. Additionally, the contents of the major ginsenosides components produced in the ginseng leave cultured in the hydroponic system were observed in the order of Rg1 > Rd > Re > Rc > Rb2 > Rg2 >Rb1 > Rh1 > Rf [11]. Kokkuvõttes tõid hüdropoonilised tingimused kaasa kõrge ginsenosiidisisalduse ja lehtede kogusisaldus oli oluliselt kõrgem kui juurtes, mis viitab sellele, et ženšenni lehed võivad olla hea funktsionaalsete köögiviljade ja ravimtaimede allikas.

Mitmete teadaolevate valgendavate ühendite, nagu arbutiin ja kojiinhape, tõhusust melanogeneesi vähendamisel on uuritud [13]. Kahjuks on vaja leida ohutumaid ja tõhusamaid nahka valgendavaid aineid, kuna kojichape on kantserogeenne ning arbutiini ohutus ja kõrvalmõjud [14]. Seetõttu on pidevalt palju tähelepanu pööratud uute loodustoodete väljatöötamisele kosmeetikatööstuses [15,16]. Mitmed uuringud on teatanud pinnases kasvanud P. ženšenni melaniini sünteesi pärssimisest [17–20].

Nendest uuringutest teatati aga tuntud ühenditega, nagu kaneelhape ja fenoolühendid, ning hüdropoonilise P. ženšenni (HPGL) lehtede valgendavat toimet ei ole täheldatud. Meie käimasolev töö viis väiksemate ginsenosiidide eraldamiseni HPGL-st. Tavaliselt ei saa HPLC abil tuvastada ginsenosiide väikestes kogustes või väikestes kogustes. Vastasel juhul on analüüsiaeg väga pikk, mis ei ole ženšenni vürtsides sisalduvate ginsenosiidide kvalifitseerimiseks mugav [21,22]. Uute ühendite kiireks kvantifitseerimiseks tuleks luua kiire ja tundlik meetod, mis võimaldab põhjalikult tuvastada uudsete ühendite jälgi. Käesolevas uuringus loodi uue ühendi kvantifitseerimiseks tundlik ülikõrge jõudlusega vedelikkromatograafia koos kvadrupooli/lennuaja massispektromeetria (UPLC-QTOF-MS) meetodiga.

Ülaltoodud kirjelduse põhjal avastati käesolevas töös spektroskoopiliste meetoditega uue ühendi isoleerimine ja identifitseerimine, sealhulgas füüsikalised omadused ja kvantifitseerimine, ning nende melanogeenset toimet uuriti in vitro ja in vivo süsteemide kaudu.

2. Tulemused ja arutelu

Hüdropoonilise Panaxi ženšenni (HPGL) lehti ekstraheeriti MeOH vesilahusega ja jaotati vastavalt etüülatsetaadi (EtOAc), n-butanooli (n-BuOH) ja H2O fraktsioonideks. Korduv n-BuOH fraktsiooni SiO2 ja ODS kolonnkromatograafia andis ühe uue ginsenosiidi (1) ja üks haruldane ginsenosiid (2) eraldati HPGL EtOAc fraktsioonist.

Ühend 1, valge pulber (metanool), andis TLC-l 1 0 protsenti H2SO4 pihustamisel ja kuumutamisel lillat värvi. Molekulaarvalemiks määrati C37H64O10 kvaasimolekulaarse iooni piigi m/z 713,44723 [M pluss COOH]− – negatiivse QTOF/MS korral. IR-spekter viitas hüdroksüülrühma (3377 cm-1) ja kaksiksideme (1647 cm-1) olemasolule. 1H-NMR spekter (tabel 1 ja lisamaterjalid) näitas kahte olefiinmetiini prootoni signaali (δH 6,02, 5,64), kolme hapnikuga küllastunud metiini prootoni signaali (δH 4,38, 4,03, 3,49), ühte metoksüprootoni signaali (δH 3). singlett-metüülprootoni signaalid (δH 1,94, 1,55, 1,43, 1,33, 1,31, 1,14, 1,04, 0,92), mis näitavad, et ühendil 1 on tetratsükliline triterpeenfragment, sealhulgas üks transkonformatsiooniga kaksikside ja kolm hüdroksüülrühma.

Lisaks kinnitati, et ühend 1 on protopanaksatriooli (PPT) tüüpi metüülprootoni signaali keemilise nihke tõttu δH 1,94 (H-28) juures. H-28 keemilist nihet protopanaksadiooli (PPD) tüüpi puhul täheldatakse tavaliselt ca δH 1,30 juures [23]. Lisaks täheldati suhkruosa signaalidena poolatsetaalset prootoni signaali (δH 5, 15) ja mitut hapnikuga rikastatud metiinide ja metüleenprootoni signaali δH 4, 45–3, 95 juures. Anomeeri prootoni signaali sidestuskonstandi (J=7,6 Hz) põhjal olid nii suhkruosa poolatsetaalne prooton kui ka H-2 aksiaalses paigutuses. Ülalmainitud andmete kombinatsioon näitas, et ühend 1 on protopanaksatrioolaminoglükosiid. 13C-NMR spekter näitas 37 süsiniku signaali, mis olid tingitud triterpeeni-, metoksü- ja heksoosiosadest. Kaks olefiinmetiini süsinikku (δC 138,5 (C-24), 126,8 (C-23)), üks hapnikuga rikastatud kvaternaarne süsinik (δC 74,9 (C{32}})), kolm hapnikuga rikastatud metiini süsinikku (δC 78,5 (C-3), 7{{90}},3 (C-12), 67,7 (C-6)), üks metoksüsüsinik (δC 50,2 () 25-OCH3)) ja kaheksa metüülsüsinikku (δC 31,9 (C-28), 26,3 (C-27), 26,1 (C-26), 23,0 (C{{) 57}}), 17,6 (C-18), 17,4 (C-19), 17,3 (C-30), 16,4 (C-29)) signaale. aglükooni osa. Ühendi 1 TMR andmed olid sarnased ühendi 2 omadega, välja arvatud hapnikuga küllastunud kvaternaarse süsiniku keemiline nihe, st C-25. Lisaks tuvastati suhkur glükopüranoosina süsiniku signaalide poolatsetaali (δC 98,3, (C-10 )), nelja hapnikuga rikastatud metiini (δC 78,9 (C-30), 78,2 (C{82) põhjal. }}), 75,2 (C-20), 71,6 (C-40)) ja üks hapnikurikas metüleen (δC 63,0 (C{91}})). Gradiendi heteronukleaarsete mitmiksidemete korrelatsiooni (gHMBC) spektrites täheldati kaugkorrelatsiooni anomeerse prootoni signaali (δH 5,15 (H-10 )) ja aglükooni hapnikuga küllastunud kvaternaarse süsiniku signaali (δC 83,0 (C) vahel. -20)), mis näitab, et -glükopüranoos oli seotud C-20 hüdroksüülrühmaga (joonis 1).

Lisaks näitas korrelatsioon metoksüprootoni signaali (δH 3,18 (25-OCH3)) ja hapnikuga küllastunud kvaternaarse süsiniku signaali (δc 74,9 (C-25)) vahel, et metoksü on seotud C{{ 7}} (joonis 1). Ülaltoodud andmete põhjal määrati ühendi 1 keemiline struktuur 20-O- -D-glükopüranosüül-3 ,6 ,12 ,20 -tetrahüdroksü-25- metoksüdammar-23-een ja seda nimetatakse ginsenosiidiks Rh23. Ühend 2 identifitseeriti kui 20-O- -D-glükopüranosüül-3,6,12,20,25-pentahüdroksüdammar-23-, võrreldes TMR-i ja MS andmed koos kirjanduses avaldatutega [23,24] (joonis 1). Ühendid 1 ja 2 eraldati esimest korda HPGL-st.

Ginsenosiidi Rh23 puhtus määrati UPLC analüüsiga tuvastatud piikide pindalade normaliseerimisel üle 99 protsendi. Kuna UPLC-OTOF/MS on osutunud sobivaks vahendiks ginsenosiidi Rh23 tuvastamiseks, eraldati HPGL ekstraktis olevad koostisosad negatiivsete ioonide režiimis UPLC-OTOF/MS abil. Joonisel 2 on kujutatud ginsenosiidi Rh23 ja ekstrakti tüüpiline koguioonkromatogramm (TIC) koos massituvastusega.

Ginsenosiidi Rh23 jaoks saadi erinevatel kontsentratsioonitasemetel lineaarne kalibreerimiskõver. Kalibreerimisgraafikute omadused on kokku võetud tabelis 2. Nagu tabelist näha, on ginsenosiidil Rh23 suurepärased korrelatsioonikoefitsiendid. Detektorite arv (suhteline piigi pindala) sõltus lineaarselt proovi kontsentratsioonist vahemikus 0.02–0,8 µg/mL ginsenosiidi Rh23 puhul. Ginsenosiidi Rh23 LOD oli 0.002 ppm. UPLC-QTOF/MS määras negatiivse iooni režiimis ginsenosiidi Rh23 LOQ-ks 0,005 ppm. Ginsenosiidi Rh23 kogus HPGL-is, mis saadi valideerimismeetoditega (tabel 2), oli 0,319 mg/g.

Anti-melanogeense toime määramiseks uuriti melaniinisisalduse muutust melan-a rakkudes, mida töödeldi puhastatud ja identifitseeritud ühenditega. Melan-a rakke töödeldi 72 tundi ühenditega 1 ja 2 kontsentratsioonides vahemikus 0 kuni 80 µM ja rakkude elujõulisust hinnati CCK-8 rakkude elujõulisuse analüüsikomplekti abil. Ühendite 1 ja 2 rakkude elujõulisus melaan-a raku kontsentratsioonil 80 uM oli vastavalt üle 98,1% ja 97,8% (andmeid pole näidatud). Need tulemused näitasid, et ühenditel 1 ja 2 on mittetsütotoksiline iseloom. Ühendite melanogeense vastase toime mõju on näidatud joonisel 3. Ühendi 1 melaniini sünteesi inhibeerimine kontsentratsioonidel 20, 40 ja 80 uM oli 8,4%, 15,6% ja 37,0% võrreldes kontrolliga. Ühendil 2 oli kontsentratsioonidel 20, 40 ja 80 uM vastavalt 7,6%, 12,8% ja 17,8% veidi madalam inhibeeriv toime kui ühendil 1. Mõlemad ühendid inhibeerisid melaniini sünteesi annusest sõltuval viisil.

Nimelt näitas ühend 1 suurimat melaniini inhibeerivat aktiivsust, 37.0 protsenti 80 µM kontsentratsiooni juures. Teadaolevalt ei inhibeerinud radix ženšenni ekstrakt kontsentratsioonis 0–1000 µg/ml melaniini märkimisväärset inhibeerimist [19] ja kaneelhape, peamiselt P. ženšennis leiduv valgendav aine, inhibeeris 675 µM juures 29 protsenti melaniini sünteesi. [20]. Võrreldes juure ženšenni ja kaneelhappe ekstraktiga näitas ühend 1 tugevat melaniini sünteesi inhibeerivat toimet ja isegi 1,{12}} korda kõrgemat melaniini sünteesi inhibeerivat aktiivsust kaheksa korda väiksema kontsentratsiooniga võrreldes kumarhappega [ 17,20].

Sebrakala on inimesega sarnaste organsüsteemide ja geenijärjestuste tõttu väga kasulik selgroogne mudelorganism [25]. Lisaks pööratakse järjest suuremat tähelepanu sebrakala embrüote kasutamisele, kuna neid peetakse loomkatsete asendusmeetodiks [26]. Sebrakala pinnal on melaniini pigmendid, mis võimaldavad pigmentatsiooniprotsessi lihtsalt jälgida ilma keeruliste katseprotseduurideta [27].

Seega uurisime ühendi 1 melaniini inhibeerivat toimet sebrakala pigmentatsioonile. Positiivse kontrollina kasutasime PTU-d (N-fenüültiouurea; väävlit sisaldav türosinaasi inhibiitor) (joonis 4B), mida kasutatakse laialdaselt sebrakala uuringutes [28, 29]. Nagu on näidatud joonisel 4C, D, 40 ja 80 uM töötlemine ühendiga 1 põhjustas sebrakala keha pigmentatsiooni märkimisväärse pärssimise, mis vähendas märkimisväärselt melaniini kogusisaldust võrreldes kontrollvehiikuliga (joonis 4A).

Selles uuringus eraldasime hüdropoonilistest P. ženšenni lehtedest uudse ginsenosiidi Rh23 (1). Siiani on ženšenniliikidest teatatud enam kui 100 ginsenosiidist. Kuid 25-hüdroksüülitud ginsenosiide esineb looduses harva, sealhulgas ženšennitaimedes. Lisaks ei olnud valgendavast aktiivsusest teatatud. Ginsenosiidi Rh23 inhibeeriv toime näitas kontsentratsiooni juures 80 uN 37 protsenti ilma raku tsütotoksilisuseta melaan-a rakkudes, samas kui ginsenosiidi Rh23 puhul ei täheldatud seente türosinaasi aktiivsuse inhibeerimist in vitro (andmeid ei ole näidatud). Hiljuti on ženšenni juurte ja lehtede ekstraktidel või puhastatud ginsenosiididel laialdaselt antioksüdantsed omadused (30, 31), samas kui vesi või ženšenni orgaaniline ekstrakt on avaldanud DPPH, superoksiidi aniooni ja hüdroksüülradikaali (32) eemaldavat toimet. Seetõttu võib meie uudsel ginsenosiidil Rh23, mis on eraldatud hüdropoonilise P. ženšenni lehtedest, olla türosinaasi antioksüdatiivse toime tõttu allareguleeritud. Selle melanogeneesi rolli pole aga veel uuritud. Seetõttu on edasistes uuringutes vaja kindlaks määrata ginsenosiidi Rh23 toime täpsed mehhanismid melaniini sünteesi reguleerimisel.

3. Eksperimentaalne

3.1. Kindral

Kolonnkromatograafias kasutati Kieselgel 60 ja LiChroprep RP-18 vaiku (Merck, Darmstadt, Saksamaa). TLC katses kasutati tahkete faasidena Kieselgel 60 F254 (Merck) ja RP-18 F254S (Merck). Plekkide tuvastamine TLC plaadil viidi läbi vaadeldes UV-lambi all (Spectroline, mudel ENF-240 C/F, Spectronics Corp., New York, NY, USA) või pihustades 10-protsendilist H2SO4 vesilahust. plaat, millele järgneb kuumutamine. Optilisi pöördeid mõõdeti digitaalse polarimeetri JASCO P{10}} abil (Tokyo, Jaapan). Sulamistemperatuurid saadi Fisher-Johns Melting Point Apparatus'i (Fisher science company, Pittsburgh, PA, USA) abil mikroskoobiga. Ultraviolettspektreid mõõdeti Shimadzu mudeli UV-1601 spektrofotomeetriga (Shimadzu Corp., Kyoto, Jaapan). IR-spektrid saadi Perkin Elmer Spectrum One FT-IR spektromeetrist (Buckinghamshire, UK). NMR spektrid registreeriti Varian Inova AS 400 spektromeetriga (400 MHz, Varian, Palo Alto, CA, USA). UPLC-QTOF/MS analüüs viidi läbi, kasutades negatiivsete ioonide režiimis töötavat Waters Xevo G2-S-seeriat (Waters Corp., Milford, MA, USA).

3.2. Taimsed materjalid

Hüdropoonilist Panaxi ženšenni kasvatati Chungbuki provintsis Eumseongis asuvas taimsete põllukultuuride uurimise osakonna kasvuhoones vastavalt Korea Vabariigi maaelu arengu administratsiooni väljatöötatud ženšenni GAP standardse viljelusjuhendi protokollile [11,33]. Üheaastased ženšenni seemikute juured, mis kaaluvad 0,8–1 g, osteti maaelu arengu administratsiooni (RDA) riikliku aiandus- ja taimeteaduse instituudi (NIHHS) taimsete põllukultuuride uurimise osakonnast ja neid säilitati enne kasutamist kambris madalal temperatuuril (1–2 ◦C). Ženšenni seemikute juured siirdati toitainevannidesse ja kasvatati hüdropoonilises süsteemis. Pärast kolmekuulist kultiveerimist tõmmati hüdropoonilised ženšennid koristamiseks välja. Koristatud hüdropoonilised ženšennitaimed pesti veega tolmust puhtaks ja sorteeriti lehtedeks ja juurteks, mida seejärel kuivatati 72 tundi külmkuivatis (FD8512, Ilshin Biobase Co., Yangju, Korea). Vautšeri näidis (NIHHS14-03) deponeeriti Korea Vabariigis Eumseongis, NIHHSi, RDA taimsete põllukultuuride uurimise osakonna herbaariumis.

3.3. Ekstraheerimine ja isoleerimine

Kuivatatud ja pulbristatud hüdropoonilise P. ženšenni lehti (HPGL, 6 kg) ekstraheeriti 80% MeOH-ga (30 L × 3) toatemperatuuril 24 tundi. Ekstraktid filtriti läbi filterpaberi ja aurustati alandatud rõhul temperatuuril 45 °C, saades 1,4 kg ekstrakti. Ekstrakt valati vette (3 l) ja ekstraheeriti järjestikku EtOAc (3 l x 3) ja n-BuOH-ga (2,6 l x 3). Iga kiht kontsentreeriti alandatud rõhul, et saada EtOAc (75 g), n-BuOH (470 g) ja H2O (855 g) fraktsioonid.

N-BuOH fraktsioon (HPGLB, 130 g) kanti silikageelikolonnile (φ 13 × 17 cm) ja elueeriti CHCl3-MeOH-H2O-ga (8:3:1, 9{42}). } L → 6:4:1, 110 L), et saada 20 fraktsiooni (HPGLB1 kuni HPGLB20). Fraktsioonid HPGLB3 ja HPGLB4 kombineeriti (18,9 g, Ve/Vt=0.05–0,12) ja fraktsioneeriti edasi silikageelikolonnis (φ 8 × 15 cm, CHCl3–MeOH–H2O=12:3:1, 14 L), et saada 14 fraktsiooni (HPGLB3-1 kuni HPGLB3-14). Fraktsioonid HPGLB3-4 ja HPGLB3-5 kombineeriti (1,27 g, Ve/Vt {{40}},09–0,16) ja fraktsioneeriti edasi ODS-kolonnis (φ 4 × 7 cm, MeOH-H2O=2: 1, 2,6 L), et saada üheksa fraktsiooni (HPGLB3-4-1 kuni HPGLB3-4-9). Fraktsioon HPGLB3-4-3 (119,4 mg, Ve/Vt=0,14–0,26) fraktsioneeriti täiendavalt ODS-kolonnis (φ 2,5 × 7 cm, MeOH-H2O=1: 1, 1). L), et saada üheksa fraktsiooni (HPGLB3-4-3-1 kuni HPGLB3-4-3-9), sealhulgas ühend 1 (HPGLB3-4-3-7, 10,5 mg, Ve/Vt=0,42–0,55, TLC Rf=0.40 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0,50 (Kieselgel 60 F254, CHCl3–MeOH–H2O {{90} }:3:1)). Fraktsioonid HPGLB5 kuni HPGLB7 ühendati (24,0 g, Ve/Vt=0,12–0,22) ja fraktsioneeriti edasi silikageelikolonnis (φ 7 × 12 cm, CHCl3–MeOH–H2O=10): 3:1, 10 l → 6:4:1, 9 l), et saada 16 fraktsiooni (HPGLB5-1 kuni HPGLB5-16). Fraktsioon HPGLB5-6 (323,1 mg, Ve/Vt=0,28–0,31) fraktsioneeriti täiendavalt ODS-kolonnis (φ 3 × 14 cm, MeOH-H2O=3: 2, 1,2). L → 3:1, 1,5 L), et saada kümme fraktsiooni (HPGLB5-6-1 kuni HPGLB5-6-10), sealhulgas ühend 2 (HPGLB5-6-5, 10,1 mg, Ve/Vt=0 0,21–0,23, TLC Rf=0,50 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0,45 (Kieselgel 60 F254, CHCl3– MeOH–H2O=7: 3:1)).

3.4. Spektroskoopilised andmed

Ühend 1. Valge pulber, st°: 138–140 ◦C; [ ] 25 D pluss 17,4◦ (c=0,39, MeOH); IR (CaF2 aken): 3377, 2932, 1382 cm-1; negatiivne QTOF/MS m/z 713,44723 [M pluss COOH]− (arvutatud C37H64O10 jaoks, 668,4499); 1H- ja 13C-NMR andmed, vt tabel 1.

Ühend 2. Valge pulber, st°: 133–136 °C; [ ] 25 D pluss 20,2◦ (c=0,50, MeOH); IR (CaF2 aken): 3359, 2929, 1384 cm-1; negatiivne QTOF/MS m/z 699,48311 [M pluss COOH]− (arvutatud C36H62O10 jaoks, 654,4323);1H- ja 13C-NMR andmed, vt tabel 1.

3.5. Uue ühendi 1 kvantitatiivne analüüs, kasutades UPLC-QTOF/MS

Ühendi 1 standardne põhilahus valmistati lahustades 1.00 mg kumbki 1 ml metanoolis, saades kontsentratsiooniks 1.00 mg/ml, ja seda hoiti temperatuuril 4 °C. Standardne põhilahus (1) lahjendati metanooliga, et saada kalibreerimislahused vahemikus 0.{{10}}2–0,8 µg/mL. Üks gramm HPGL ekstrakti kaaluti täpselt ja lahustati fikseeritud kogustes (10 ml) metanoolis, filtreeriti läbi 0,20 mm filterpaberi ja jahutati temperatuurile 4 ◦C. . UPLC viidi läbi, kasutades Waters ACQUITY H-klassi UPLC-d (Waters Corp., Milford, MA, USA) ACQUITY BEH C18 kolonniga (2,1 × 100 mm, 1,7 µm). Liikuvad faasid koosnesid veest (A) 0,1% sipelghappega (maht/maht) ja atsetonitriilist (B) 0,1% sipelghappega (maht/maht). Elueerimisgradient oli järgmine: 0–4 min, B 10–30 protsenti; 4–15 min, B 30–60 protsenti ; 15–16 min, B 60–100 protsenti ; 16–19 min, B 100–10 protsenti . Voolukiirus oli 0,45 ml/min ja süstimismaht oli 2 µL iga katse kohta.

Järgmisena viidi läbi HR-MS analüüs, kasutades negatiivsete ioonide režiimis töötavat Waters Xevo G2-S QTOF MS-i (Waters Corp., Milford, MA, USA). Massispektromeetrid viisid läbi vaheldumisi suure ja madala energiatarbega skaneeringuid, mida tuntakse MSE hankimisrežiimina. Täpsed massimõõtmised saadi, kasutades automaatset kalibreerimissüsteemi, mis sisaldas sisemise võrdlusalusena leutsiin-enkefaliini, m/z 554,262 (ESI negatiivne režiim). Optimaalsed tööparameetrid määrati tabelis 3 näidatud viisil.

3.6. Rakukultuur

Melan-a melanotsüüdid on kõrge pigmentatsiooniga, immortaliseeritud normaalne hiire melanotsüütide rakuliin, mis on saadud C57BL/6 hiirtelt. Selles uuringus kasutatud melaan-a rakud saadi dr Dorothy Bennettilt (St. George'i haigla, London, Ühendkuningriik). Rakke kultiveeriti 37 °C juures 95-protsendilise õhu, 10-protsendilise CO2-ga keskkonnas RPMI 1640 söötmes, millele oli lisatud lõppkontsentratsioonini 10 protsenti kuumaga inaktiveeritud veise loote seerumit, 1 protsenti penitsilliini/streptomütsiini ja 200 nM PMA-d. Rakkude elujõulisus määrati CCK{14}} rakkude loenduskomplektiga-8 (Dojindo Lab., Kumamoto, Jaapan).

3.7. Melaniini analüüs

Melan-a rakke töödeldi ühenditega 72 tundi ja seejärel lahustati rakud 1 N NaOH-s temperatuuril 60 °C 30 minutit. Seejärel mõõdeti lüsaate spektrofotomeetriga 450 nm juures. Andmed normaliseeriti rakulüsaatide valgusisaldusega. Seejärel töödeldi rakulüsaate valgu kontsentratsiooni määramiseks, kasutades BCA valguanalüüsi komplekti (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA).

3.8. Vanemakalade päritolu ja hooldus

Täiskasvanud sebrakalad saadi kaubanduslikult edasimüüjalt ja 10–15 kala hoiti 5-liitrises akrüülpaagis järgmistes tingimustes: 28,5 ◦C, valguse/pimeduse tsükliga 14/10 h. Sebrakalu toideti kolm korda päevas kuus päeva nädalas TetraMini helvestoiduga, millele oli lisatud elusaid soolvees krevette (Artemia salina). Embrüod saadi loomulikust kudemisest, mis kutsuti esile hommikul valguse sisselülitamisega. Embrüote kogumine viidi lõpule 30 minuti jooksul. Kõik katseprotokollid ja protseduurid kiideti heaks ja viidi läbi Chungnami riikliku ülikooli loomaeetika komitee (CNU-00866) ​​heakskiidetud juhiste ja eeskirjade kohaselt.

3.9. Ühendite ravi ja fenotüübipõhine hindamine

Sünkroniseeritud embrüod koguti ja järjestati pipetiga (7–9 embrüot süvendi kohta 24-süvendiplaatidel, mis sisaldasid 1 ml embrüosöödet). Testitavad ühendid lahustati 0,1 protsendilises DMSO-s ja lisati seejärel embrüosöötmele üheksa kuni 72 tundi pärast viljastamist (hpf) (63 tundi kokkupuudet). Mõju sebrakala pigmentatsioonile täheldati stereomikroskoobi all. Aeg-ajalt segati ja söödet vahetati iga päev, et tagada ühendite ühtlane jaotumine. Kõigis katsetes kasutati 0,2 mM 1-fenüül-2-tiouureat (PTU) läbipaistva sebrakala tekitamiseks ilma arenguprotsessi sekkumata [33] ja seda peeti standardseks positiivseks kontrolliks. Keha pigmentatsiooni fenotüübipõhised hinnangud eemaldati tangidega, anesteseeriti trikaiinmetaansulfonaadi lahuses (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), paigaldati 3% metüültselluloosi 35 mm taldrikule (SPL Lifesciences, Pocheon, Korea). ja pildistati stereomikroskoobiga MZ16 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Saksamaa).

4. Järeldused

Selles uuringus eraldati ginsenosiid Rh23 (1) hüdrofoonilistest Panaxi ženšenni lehtedest koos 20-O- -D-glükopüranosüüliga-3 ,6 ,12 ,20 ,25- pentahüdroksüdammar{10}}een (2). Oleme üldiselt edukalt püüdnud saavutada hüdropoonilise P. ženšenni ühendite hüpopigmendiefekti. Ginsenosiid Rh23 ja 20-O- -D-glükopüranosüül-3,6,12,20,25-pentahüdroksüdammar23- omavad melaniini biosünteesi inhibeerivat toimet ilma tsütotoksilise toimeta melan-a rakus. Lisaks suurendas ginsenosiid Rh23 sebrakala depigmentatsiooni alternatiivse loomamudelina. Melaniinisisalduse ja pigmentatsiooni vähenemine organismis võib põhjustada valgendavat toimet ja mittetsütotoksiline toime on soodsam punkt, sest ohutus on kosmeetikatoodete valgendusainete puhul esmatähtis.

Seega on meie praeguste tulemuste põhjal oluline, et uudseid hüdrofoonilisi P. ženšenni ühendeid saaks kasutada potentsiaalse tõhusa nahavalgustava vahendina. Edasised uuringud selgitavad välja ginsenosiidi Rh23 toime täpsed mehhanismid melaniini sünteesi reguleerimisel ning seos ginsenosiidi Rh23 struktuuriomaduste ja melanogeneesi vahel, et teha kindlaks, kas see on potentsiaalne valgendav aine kosmeetikatööstuses. Hübriidse Q-TOF massispektromeetria eelised hõlmavad mitte ainult kvaliteedi tuvastamise võimet ja tundlikkust, vaid ka täpset mõõtmist, mis muudab struktuuri selgitamise lihtsamaks. Seda saab kasutada vähemtähtsate või uudsete ühendite kvalitatiivseks ja kvantitatiivseks määramiseks, mis aitab parandada ženšenni vürtside kvaliteedikontrolli.

Täiendavad materjalid:

1H-NMR ja 13C-NMR spektrid 1 on saadaval lisamaterjalides.

Tänuavaldused:

See töö viidi läbi Korea Vabariigi maaelu arengu administratsiooni "Põllumajandusteaduse ja -tehnoloogia arendamise ühisuuringute programmi" (PJ01136203) toetusel. Täname Cheol-Hee Kimi (Chungnami riiklik ülikool) sebrakala rajatise jagamise eest.

Autori kaastööd:

DYL ja N.-IB kavandasid ja kavandasid katsed; H.-GK ja Y.-GL eraldasid ühendid; DYL selgitas struktuure; I.-BJ aitas kaasa taimsete materjalide ettevalmistamisele; JHK viis läbi bioloogilise analüüsi ja aitas kaasa käsikirja koostamisel; JWL ja B.-RC viisid läbi proovide NMR ja UPLC-QTOF/MS; G.-SK aitas käsikirja revideerida; ja DYL kirjutasid töö ja juhtisid uurimisprojekti. Kõik autorid lugesid lõpliku käsikirja läbi ja kiitsid selle heaks.

Huvide konfliktid:

Autorid ei deklareeri huvide konflikti. Asutajasponsoritel ei olnud uuringu kavandamisel mingit rolli; andmete kogumine, analüüsimine või tõlgendamine; käsikirja kirjutamine; või otsus tulemuste avaldamise kohta.

Viited

1. Ben, EW; Michael, W. Maailma ravimtaimed. In Shinilbooks; Timber Press Inc.: Portland, OR, USA, 2007.

2. Park, JD; Rhee, DK; Lee, YH Panax ginseng CA Meyeri saponiinide bioloogiline aktiivsus ja keemia. Phytochemistry 2005, 4, 159–175. [CrossRef]

3. Kwon, SJ; Chung, DK Mägimantli ženšenni, mägedes kasvatatava ženšenni ja Panaxi ženšenni immuunsust tugevdav toime. J. Orient. Neuropsychiatry 2004, 15, 89–101.

4. Gillis, CN Panaxi ženšenni farmakoloogia: lämmastikoksiidi seos? Biochem. Pharmacol. 1997, 54, 1–8. [CrossRef]

5. Kang, KS; Yamabe, N.; Kim, HY; Yokozawa, T. Päikese ženšenni metanooliekstrakti mõju lipopolüsahhariidist põhjustatud maksakahjustusele rottidel. Phytomedicine 2007, 14, 840–845. [CrossRef] [PubMed]

6. Jiang, S.; Ren, D.; Li, J.; Yuan, G.; Li, H.; Xu, G.; Han, X.; Du, P.; An, L. Ühendi K mõju hüperglükeemiale ja insuliiniresistentsusele II tüüpi suhkurtõvega rottidel. Fioteraapia 2014, 95, 58–64. [CrossRef] [PubMed]

7. Kim, HS; Lee, EH; Ko, SR; Choi, KJ; Park, JH; Im, DS Ginsenoside Rg3 ja Rh2 mõju eesnäärmevähi rakkude proliferatsioonile. Arch. Pharm. Res. 2004, 27, 429–435. [CrossRef] [PubMed]

8. Nocerino, E.; Amato, M.; Izzo, AA Ženšenni afrodisiaakumid ja adaptogeensed omadused. Fitoteraapia 2000, 71, S1–S5. [CrossRef]

9. Keum, YS; Park, KK; Lee, JM; Chun, KS; Park, JH; Lee, SK; Kwon, HJ; Surh, YJ Kuumtöödeldud ženšenni metanooliekstrakti antioksüdant ja kasvajavastane toime. Cancer Lett. 2000, 150, 41–48. [CrossRef]

10. Kim, GS; Lee, SE; Ei, HJ; Kwon, H.; Lee, SW; Kim, SY; Kim, YB Looduslike bioaktiivsete toodete mõju aeropoonilises süsteemis kasvatatud Panaxi ženšenni kasvule ja ginsenosiidi sisaldusele. J. Ginseng Res. 2012, 36, 430–441. [CrossRef] [PubMed]

11. Choi, SY; Cho, CW; Lee, YM; Kim, SS; Lee, SH; Kim, KT Ginsenosiidi ja fenoolsete koostisosade sisalduse võrdlus hüdropooniliselt kultiveeritud ženšenni lehtedes, puuviljades ja juurtes. J. Ginseng Res. 2012, 36, 425–429. [CrossRef] [PubMed]

12. Matsuda, H.; Nakamura, S.; Kubo, M. Looduslikest allikatest pärit küünenaharavimite uuringud. II. Prunuse taimede pärssiv toime melaniini biosünteesile. Biol. Pharm. Bull. 1994, 17, 1417–1420. [CrossRef] [PubMed]

13. Duncan, CL; Foster, EM Naatriumnitriti, naatriumkloriidi ja naatriumnitraadi mõju anaeroobsete eoste idanemisele ja väljakasvule. Rakendus Microbiol. 1968, 16, 406–411. [PubMed]

14. Shimizu, K.; Yasutake, S.; Kondo, R. Chlorophora uus türosinaasi inhibeeriva toimega stilbeen paistab silma. Chem. Pharm. Bull. 2003, 51, 318–319. [CrossRef] [PubMed]

15. Park, SH; Kim, DS; Kim, töörühm; Ryoo, IJ; Lee, DH; Huh, CH; Youn, SW; Yoo, ID; Park, KC Terrin: uus melanogeneesi inhibiitor ja selle mehhanism. Kamber. Mol. Elu 2004, 61, 2878–2885. [CrossRef] [PubMed]

16. Kong, YH; Jo, YO; Cho, CW; poeg, DW; Park, SJ; Rho, JH; Choi, SY Kaneelhappe pärssiv toime melaniini biosünteesile nahas. Biol. Pharm. Bull. 2008, 31, 946–948. [CrossRef] [PubMed]

17. Hwang, EY; Choi, SY Panax ginseng CA Meyeri erinevates osades fenoolsete ühendite kvantitatiivne analüüs ja selle pärssiv toime melaniini biosünteesile. Korea J. Med. Crop Sci. 2006, 14, 148–152.

18. Im, SJ; Kim, KN; Yun, YG; Lee, JC; Mun, YJ; Kim, JH; Woo, WH Radix ginseng ja radix trichosanthis mõju melanogeneesile. Biol. Pharm. Bull. 2003, 26, 849–853. [CrossRef] [PubMed]

19. Hwang, EY; Kong, YH; Lee, YC; Kim, YC; Yoo, KM; Jo, YO Valge ja punase ženšenni fenoolsete ühendite sisalduse võrdlus ja nende pärssiv toime melaniini biosünteesile. J. Ginseng Res. 2006, 30, 82–87.

20. Zhang, YC; Pi, ZF; Liu, CM; Song, FR; Liu, ZQ; Liu, SY Madala polaarsusega ginsenosiidide analüüs aurutatud Panaxi ženšennis kõrgel temperatuuril HPLC-ESI-MS/MS abil. Chem. Res. Lõug. Univ. 2012, 28, 31–36.

21. Xie, YY; Luo, D.; Cheng, YJ; Ma, JF; Wang, YM; Liang, QL; Luo, GA Aurutamisel indutseeritud keemilised muutused ja Panaxi ženšennist saadud punase ženšenni terviklik kvaliteedihindamine, kasutades HPLC-ESI-MS/MSn-põhist mitmekomponendilist kvantifitseerimissõrmejälge. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 8213–8224. [CrossRef] [PubMed]

22. Liu, GY; Li, XW; Wang, NB; Zhou, HY; Wei, W.; Gui, MY; Yang, B.; Jin, YR Kolm uut dammaraani tüüpi triterpeensaponiini Panax ginseng CA Meyeri lehtedest. J. Asian Nat. Prod. Res. 2010, 12, 865–873. [CrossRef] [PubMed]

23. Xing, Q.; Liang, T.; Shen, G.; Wang, X.; Jin, Y.; Liang, X. Põhjalik HILIC x RPLC koos massispektromeetria tuvastamisega saponiinide analüüsimiseks Panax notoginsengis. Analüütik 2012, 137, 2239–2249. [CrossRef] [PubMed]

24. Armastus, DR; Pichler, FB; Dodd, A.; Copp, BR; Greenwood, DR tehnoloogia suure läbilaskevõimega ekraani jaoks: olevik ja tulevik, kasutades sebrakala. Curr. Arvamus. Biotehnoloogia. 2004, 15, 564–571. [CrossRef] [PubMed]

25. Uwe, S.; Stefan, S.; Pobert, G.; Petra, G.; Henner, H.; Sepand, R.; Aksel, S.; Ingrid, S.; Carsten, W.; Hilda, W.; et al. Sebrakala embrüod alternatiivina loomkatsetele – kommentaar kaitstud eluetapi definitsiooni kohta loomade heaolu eeskirjades. Reprod. Toksikool. 2012, 33, 128–132.

26. Chio, TY; Kim, JH; Ko, DH; Kim, CH; Hwang, JS; Ahn, S.; Kim, SY; Kim, CD; Lee, JH; Yoo, TJ Zebrafish kui uus mudel melanogeensete regulatoorsete ühendite fenotüübipõhiseks skriinimiseks. Pigment Cell Res. 2007, 20, 120–127. [CrossRef] [PubMed]

27. Elsalini, OA; Rohr, KB Fenüültiouurea häirib kilpnäärme funktsiooni sebrakala arenemisel. Dev. Geenid Evol. 2003, 212, 593–598. [PubMed]

28. Lee, DY; Cha, BJ; Lee, YS; Kim, GS; Ei, HJ; Kim, SY; Kang, HC; Kim, JH; Baek, NI Panaxi ženšenni lehtedest eraldatud väiksemate ginsenosiidide potentsiaal melanogeneesi inhibiitoritena. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 1677–1690. [CrossRef] [PubMed]

29. Li, J.; Huang, M.; Teoh, H.; Mees, RY Panax quinquefolium saponiinid kaitsevad madala tihedusega lipoproteiine oksüdatsiooni eest. Life Sci. 1999, 64, 53–62. [CrossRef]

30. Li, TSC; Mazza, G.; Cottrell, AC; Gao, L. Ginsenosiidid Ameerika ženšenni juurtes ja lehtedes. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 717–720. [CrossRef]

31. Jung, CH; Seog, HM; Choi, IW; Park, MW; Cho, HY Metsikute ženšenni lehtede erinevate lahustiekstraktide antioksüdantsed omadused. LWT 2006, 39, 266–274. [CrossRef]

32. Riiklik põllukultuuride instituut. ženšenni GAP standardne viljelusjuhend; Riiklik põllukultuuride instituut, maaelu arengu administratsioon: Suwon, Korea, 2009.

33. Karlsson, J.; Von Hofsten, J.; Olsson, PE Läbipaistva sebrakala genereerimine: rafineeritud meetod geeniekspressiooni tuvastamise parandamiseks embrüonaalse arengu ajal. Märts Biotechnol. 2001, 3, 522–527. [CrossRef] [PubMed]

Näidiste saadavus:

Ühendite 1 ja 2 proovid on saadaval autoritelt.

Dae Young Lee 1 ID, Hyoung-Geun Kim 2, Yeong-Geun Lee 2, Jin Hee Kim 3, Jae Won Lee 1 ID, Bo-Ram Choi 1, In-Bae Jang 1, Geum-Soog Kim 1 ja Nam-In Baek 2,*

1 Taimsete põllukultuuride uurimise osakond, Riiklik Aiandus- ja Taimeteaduse Instituut, RDA, Eumseong 27709, Korea; dylee0809@gmail.com (DYL); jaewon3@gmail.com (JWL); bmcbr@korea.kr (B.-RC); ikanet@korea.kr (I.-BJ); kimgs0725@korea.kr (G.-SK)

2 Kyung Hee ülikooli idamaise meditsiini biotehnoloogia osakond, Yongin 17104, Korea; zwang05@naver.com (H.-GK); lyg629@nate.com (Y.-GL)

3 College of Herbal Bio-industry, Daegu Haany University, Gyeongsan 38610, Korea; gonogo1@nate.com

Saabunud: 28. november 2017; Vastu võetud: 26. jaanuar 2018; Avaldatud: 29. jaanuaril 2018

For more information:1950477648nn@gmail.com