Cistancheon ka funktsioonsoodustades kollageeni tootmist, mis võib suurendada naha elastsust ja läiget ning aidataparandada kahjustatud naharakke. CistancheFenüületanooli glükosiididneil on märkimisväärne türosinaasi aktiivsust vähendav toime ning mõju türosinaasile on konkureeriv ja pöörduv inhibeerimine, mis võib anda teadusliku aluse Cistanche valgendavate koostisosade väljatöötamiseks ja kasutamiseks. Seetõttu on tsistansil nahas võtmerollvalgendamine. See võibpärsib melaniini tootmistvähendada värvimuutust ja tuhmust; ja soodustab kollageeni tootmist, et parandada naha elastsust ja sära. Tänu cistanche'i nende mõjude laialdasele tunnustamisele on paljud nahka valgendavad tooted hakanud lisama taimseid koostisosi, nagu Cistanche, et rahuldada tarbijate nõudlust, suurendades seeläbi Cistanche'i kaubanduslikku väärtust nahka valgendavates toodetes. Kokkuvõttes on tsistanši roll naha valgendamisel ülioluline. Selleantioksüdantmõju jakollageeni tootva toimegavõib vähendada värvimuutust ja tuhmust, parandada naha elastsust ja läiget ning saavutada seeläbi valgendava efekti. Samuti näitab Cistanche laialdane kasutamine nahka valgendavates toodetes, et selle rolli kaubanduslikus väärtuses ei saa alahinnata.

Valgendamiseks klõpsake nuppu Organic Cistanche

Lisateabe saamiseks:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Türosinaas on melaniini tootmise kiirust piirav ensüüm ja seega on see hüperpigmentatsiooni pärssimise kõige olulisem sihtmärk. On tuvastatud arvukalt türosinaasi inhibiitoreid, kuid enamikul neist puudub kliiniline efektiivsus, kuna nende tuvastamisel kasutati sihtmärgina seene türosinaasi. Seetõttu kasutasime rekombinantset inimese türosinaasi 50, 000 ühendist koosneva raamatukogu skriinimiseks ja võrdlesime aktiivseid skriinimise tulemusi tuntud valgendavate koostisosadega. Hüdrokinoon ja selle derivaat arbutiin inhibeerisid inimese türosinaasi vaid nõrgalt, poolmaksimaalsest inhibeerivast kontsentratsioonist (IC50) millimolaarses vahemikus, ja kojichape näitas nõrka efektiivsust (IC50 > 500 mmol/L). Selles uuringus tuvastatud inimese türosinaasi kõige tugevamad inhibiitorid olid resortsinool-tiasooli derivaadid, eriti äsja tuvastatud tiamidol (Beiersdorf AG, Hamburg, Saksamaa) (isobutüülamido-tiasolüülresortsinool), mille IC50 oli 1,1 mmol/l. Seevastu tiamidool inhibeeris seene türosinaasi vaid nõrgalt (IC50 =108 mmol/L). Melanotsüütide kultuurides inhibeeris tiamidool tugevalt, kuid pöörduvalt melaniini tootmist (IC50 =0,9 mmol/L), hüdrokinoon aga pöördumatult melanogeneesi (IC 50 = 16,3 mmol/L). Kliiniliselt vähendas tiamidool nähtavalt vanuselaikude teket 4 nädala jooksul ja 12 nädala pärast ei olnud mõned vanuselaikud tavalisest külgnevast nahast eristatavad. Tulevaste uuringute käigus tuleb uurida tiamidooli täielikku potentsiaali inimese naha hüperpigmentatsiooni vähendamisel.

SISSEJUHATUS

Melasma, aktiinilised ja seniilsed lentigiinid ning põletikujärgne hüperpigmentatsioon on peamised kosmeetilised probleemid, mille lahendamiseks pöörduvad paljud patsiendid arsti poole. Üldiselt mõjutavad need häired sagedamini tumedama nahavärviga populatsioone (Stratigos ja Katsambas, 2004). Hüperpigmenteeritud häirete raviks on saadaval palju paikselt kasutatavaid tooteid ning need sisaldavad erinevaid toimeaineid, mis vähendavad melaniini tootmist ja/või jaotumist. Kuigi naha hüperpigmentatsiooni saab vähendada erinevate mehhanismidega (Briganti et al., 2003), on türosinaas, melaniini tootmist kiirust piirav ensüüm, hüperpigmentatsiooni inhibiitorite ilmne sihtmärk (Kanteev et al., 2015; Lee et al., 2014; Ramsden ja Riley, 2014). Kirjanduses on paljusid aineid kirjeldatud türosinaasi inhibiitoritena, kuid enamikul neist puudub kliiniline efektiivsus ning praegu kasutatakse paiksetes dermatoloogilistes toodetes vaid väheseid ühendeid (Chang, 2009; Kim ja Uyama, 2005; Rescigno et al., 2002). ). Nende hulgas on kõige levinumad kojichape, hüdrokinoon ja arbutiin (Solano et al., 2006).

Praegu kasutatavate türosinaasi inhibiitorite ebarahuldav kliiniline efektiivsus on suur, kuna neid ühendeid testiti ainult seenest Agaricus bisporus (mTyr) eraldatud türosinaasiga (Espin et al., 2000; Garcia-Molina et al., 2005), mis on ainus. aktiivne türosinaas, mis on kaubanduslikult kergesti kättesaadav. mTyr katalüütiline aktiivsus ja substraadi spetsiifilisus erinevad oluliselt imetaja ensüümist (Hearing et al., 1980). Hiljuti lahendati mitmete türosinaaside kolmemõõtmelised struktuurid, sealhulgas mTyr (Ismaya et al., 2011) ja kahe bakteriaalse ensüümi struktuurid Streptomyces castaneoglobisporusest (Matoba et al., 2006) ja Bacillus megateriumist (Sendovski et al. , 2011). Seevastu inimese türosinaasi (hTyr) kohta on saadaval väga vähe kineetilist või struktuurilist teavet, peamiselt seetõttu, et looduslikest allikatest või heteroloogse ekspressiooni abil on raske saada piisavas koguses hTyr. hTyr on ajutiselt ekspresseeritud erinevates loomarakuliinides (Olivares et al., 2002; Schweikardt et al., 2007; Tripathi et al., 1992; Wendt, 2006), kuid saagised olid alati liiga väikesed, et tulemust üksikasjalikult kirjeldada. hTyr preparaadid. Hiljuti on mitmed rühmad välja töötanud tõhusamad ekspressioonisüsteemid hTyr jaoks (Cordes et al., 2013; Fogal et al., 2015; Lai et al., 2016), kuid andmed hTyr kolmemõõtmelise struktuuri või hTyr kineetiliste andmete kohta. hTyr inhibiitorid olid endiselt puudu.

TULEMUSED

hTyr inhibeerimine

A screen of 50,000 compounds in the library, which spans a wide chemical space, yielded several hit series of active and effective hTyr inhibitors. Among them, derivatives of thiazolyl-resorcinol were the most promising group. This lead compound was then optimized to develop derivatives with high activity and physicochemical properties compatible with topical formulations. Thiamidol (isobutyl amido thiazolyl resorcinol, compound 1) (Figure 1) was identified as one of the most potent derivatives. In addition to Thiamidol, 4-butyl resorcinol (compound 2) and the classical tyrosinase inhibitors kojic acid (compound 5), hydroquinone (compound 6), and arbutin (compound 7), as well as rhododendron (compound 9), were also tested as inhibitors of the diphenols (L-dopa oxidase) activity of hTyr over a wide range of concentrations (up to 4 orders of magnitude). The results are summarized in Figure 2a and Table 1. Among these actives, Thiamidol was by far the most efficient inhibitor of hTyr, with a half-maximal inhibitory concentration (IC50) of 1.1 mmol/L, with almost complete enzyme inhibition of hTyr occurring at concentrations above 10 mmol/L. The resorcinol derivatives 4-butylresorcinol, 4-hexylresorcinol, and 4-phenylethylresorcinol had IC50 values of 21mmol/L, 94mmol/L, and 131 mmol/L, respectively (Table 1). With an IC50 of about 500 mmol/L, kojic acid was 500 times less potent than Thiamidol. Hydroquinone and arbutin were both very poor inhibitors of hTyr, with IC50 values in the millimolar range. Kojic acid, arbutin, and hydroquinone were not able to completely inhibit hTyr in the concentration range tested. Racemic rhododendron was also rather ineffective as an inhibitor of L-dopa oxidation, with an IC50 >1200 mmol/L (joonis 2a).

Tiamidooli poolt põhjustatud hTyr inhibeerimise üksikasjalik kineetiline analüüs andis rangelt konkureeriva inhibeerimise tüübi, mille inhibiitori konstandi (Ki) oli 0,25 mmol/L (joonis 2b, tabel 1). See väärtus on kooskõlas IC50 väärtusega, mis on hinnatud annuse-vastuse kõverate põhjal (1,1 mmol/L) (vt joonis 2a), mis konkureeriva inhibeerimise korral peaks olema ligikaudu 3 korda suurem kui Ki. 4-butüülresortsinooli (9 mmol/L), 4-heksüülresortsinooli (39 mmol/L) ja 4- fenüületüülresortsinooli (24 mmol/L) Ki väärtused olid samuti märgatavalt kõrgemad kui Tiamidooli Ki väärtus (tabel 1). Need andmed näitavad, et tiamidooli tiasolüülamiidi osa inhibeerib hTyr palju paremini kui süsivesinike kõrvalahelad, mis esinevad kolmes teises resortsinooli derivaadis (4-butüül-, 4-heksüül- ja {{ 21}}fenüületüülresortsinool). Nagu märgitud, on tõhusus mTyr puhul selgelt erinev, kus 4-butüülresortsinool, 4-heksüülresortsinool ja 4-fenüületüülresortsinool ning isegi kojiinhape on ensüümi inhibeerimisel tiamidoolist paremad (tabel 1). Seega ei oleks tiamidooli mTyr-i kasutanud sõeluuringul tuvastatud positiivsena ja 4-fenüületüülresortsinooli efektiivsus oleks olnud tugevalt üle hinnatud.

Garcia-Jimenez et al. (2016) teatasid hiljuti, et mTyr oksüdeerib aeglaselt teatud resortsinoole, eeldusel, et ensüümi domineeriv metvorm on eelnevalt muudetud kas oksü- või desoksüvormiks lisanditega, nagu H2O2 ja askorbaat, ning et reaktsiooni toetavad o-difenoolid. . Seetõttu kasutasime kvantitatiivset kõrgjõudlusega vedelikkromatograafia analüüsi (Ito ja Wakamatsu, 2015), et teha kindlaks, kas tiamidool võib olla ka hTyr substraat. Meie tavalistes testitingimustes (st Garcia-Jimenez et al., 2016 mainitud lisandite puudumisel) ei toimunud tiamidooli tuvastatavat oksüdeerumist mitme tunni jooksul pärast hTyr-ga inkubeerimist, samas kui rododendron oksüdeerus selle aja jooksul kergesti. (vt lisajoonist S1 võrgus). Seega eeldame, et Garcia-Jimenez et al. ei ole füsioloogilistes tingimustes tiamidooli ja hTyr puhul asjakohane.

Melaniini tootmise pärssimine

Seejärel testisime nende ühendite potentsiaalset inhibeerivat toimet, kasutades inimese naha kolmemõõtmelist mudelit. Nagu täheldati puhastatud hTyr puhul, näitas arbutiin MelanoDermi (MatTek Corporation, Ashland, MA) nahamudelites (IC50 > 4,000 mmol/L) melaniini tootmise pärssimisel vaid tühist efektiivsust (joonis 2c) . Kojichape inhibeeris melaniini tootmist IC50 väärtusega w400 mmol/L, näidates üllatavalt järsku annuse-vastuse kõverat, kusjuures kontsentratsioonid alla 200 mmol/l inhibeerisid melaniini tootmist vaid veidi (st 5 protsenti 150 mmol/l juures). Rododendronil oli ainult marginaalne mõju melanogeneesile, näiv IC50 inhibeerimiseks oli w1200 mmol/l. Hüdrokinoon inhibeeris melaniini tootmist MelanoDermi nahamudelites IC50-ga 15 mmol/L, mis viitab sellele, et sellel on türosinaasi inhibeerimisest erinev mehhanism. 4-Butüülresortsinool inhibeeris melaniini sünteesi IC50-ga 13,5 mmol/L. Jällegi oli tiamidool MelanoDermi nahamudelites ülekaalukalt kõige tugevam melaniini tootmise inhibiitor, mille IC50 oli 0, 9 mmol / l, ja ühekihilistes kultuurides vähendas tiamidool nähtavalt melaniini moodustumist (joonis 3a).

Seejärel testiti hüdrokinooni ja tiamidooli pikaajalistes melanotsüütide ühekihilistes kultuurides, et kontrollida inhibeerimise võimalikku pöörduvust. Kuigi 1 mmol/l tiamidool vähendas melaniini tootmist 2 nädala pärast alla 60 protsendi, vähendas 1 mmol/l hüdrokinoon melaniini tootmist vaid ligikaudu 85 protsendini (joonis 3b). Kuid edasisel kultiveerimisel ilma aktiivsete ühenditeta alustasid tiamidooliga inhibeeritud melanotsüüdid kiiresti oma melaniini tootmist, saavutades ravieelse taseme 1 nädala jooksul. Seevastu hüdrokinooniga töödeldud rakud ei taastunud 2-nädalase kultiveerimisperioodi jooksul täielikku melaniini tootmisvõimet ja melaniini tootmine jätkus 85 protsendil eeltöötluse tasemest.

Molekulaarne modelleerimine

Tiamidooli võimalikke seondumisviise hTyr-ga uuriti virtuaalse dokkimisuuringute abil. Joonisel 4a on kujutatud hTyr homoloogiamudeli aktiivne sait met-vormis koos dokitud tiamidooli ligandiga madalaima energiaga konformatsioonis. Vasakpoolses servas on näha vasest keskosa koos sildhapnikuga. Näidatud on ainult seotud inhibiitoriga vahetult külgnevad aminohappejäägid. (Jääkide nummerdamine hõlmab signaalpeptiidi). Sidetasku sisepind on värvitud vastavalt hüdrofoobsusele skaalal sinisest hüdrofiilsuse jaoks kuni pruunini hüdrofoobseks. Kuigi di-vasktsentri keskkond on selgelt hüdrofiilne, moodustavad tugevalt hüdrofoobse alamtasku peamiselt I368, V377 ja F347 külgahelad. Näidatud ruumilises orientatsioonis on ligandi aromaatse ringi 1-hüdroksürühm ulatuslikud kontaktid di-vasktsentriga ja 3-hüdroksürühm osaleb vesiniksidemetes külgahelaga. S380 ja M374 põhikarbonüül. Tiasolüültsüklit hoiavad paigal hüdrofoobsed interaktsioonid mittepolaarse taskuga (joonis 4b), mille moodustavad aminohapete külgahelad, millest enamik erinevad mTyr ja hTyr vahel (joonis 4c).

Võrreldavad tulemused saadi, kui tiamidool ühendati hiljuti avaldatud struktuurilt sarnase TRP1, Zn2þ-sisaldava melanogeense ensüümi, millel on inimestel veel tundmatu funktsioon (Ghanem ja Fabrice, 2011; Lai et al., 2017), röntgenstruktuuriga, mis viitab sellele, et et TYRP1 ensüümi inhibeerib ka tiamidool (vt lisajoonist S2 võrgus).

Kliinilised uuringud

Seejärel uuriti tiamidooli in vivo efektiivsust kliinilistes uuringutes, kus eakad isikud ravisid oma nahal vanuselaike kaks korda päevas valemiga, mis sisaldas {{0}},2 protsenti tiamidooli, või kasutati vehiiklit ainult kontrollina. Juba pärast 4-nädalast ravi olid töödeldud vanuselaigud oluliselt heledamad kui töötlemata kontrollvanuse laigud (joonis 5a). Paranemine jätkus kogu raviperioodi vältel ja 12 nädala pärast olid mõned vanuselaikud ümbritsevast normaalselt pigmenteerunud nahast eristamatud (joonis 5b). EpiFlashi (Canfifield Scientifific Inc., Parsippany, NJ) fotod näitasid nähtavat vanuselaikude väljanägemise paranemist ja töötlemata kontrollvanuse laigud jäid muutumatuks (pole näidatud). Järeluuring näitas, et tiamidooli kontsentratsioonid kuni 0,1 protsenti vähendasid tõhusalt vanuselaikude nähtavust (vt veebis lisajooni S3).

ARUTELU

Kõige ohutum ja tõhusaim viis naha hüperpigmentatsiooni raviks on melaniini tootmise vähendamine türosinaasi aktiivsuse pärssimise teel. Kuid enamikul kirjanduses kirjeldatud türosinaasi inhibiitoritel puudub kliiniline efektiivsus, kui need on lisatud paiksetesse ravimitesse. Peaaegu kõiki neid testiti ainult mTyr vastu (Espin et al., 2000; Garcia-Molina et al., 2005) ja seega, kuigi need olid tõhusad mTyr vastu, osutusid nad hTyr halvaks inhibiitoriteks. Kaubanduslikult saadav mTyr ei ole homogeenne preparaat, vaid pigem segu mitmest türosinaasi isoensüümist ja väikesest kogusest täiendavatest ensüümiaktiivsustest, mis võivad inhibeerimisuuringuid ettearvamatult mõjutada (Pretzler et al., 2017). Isoensüümidel AbPPO3 ja AbPPO4, mis on kaubanduslikult saadava mTyr põhikomponendid, on aktiivse saidi piirkonnas aminohappejärjestused, mis erinevad oluliselt hTyr-st (joonis 4c). Mõlemad mTyr isoensüümid sisaldavad lisasilmuseid Asn371 (üks hTyr glükosüülimissaitidest) ja Gly372 vahel. Mitmed tiamidooliga interakteeruvad jäägid hTyr-s (vt joonis 4b) ei ole mTyr-s konserveerunud, näiteks Ile368, Ser375 ja Ser380. Phe207 on mTyr-s struktuurselt konserveerunud, samas kui Phe347 mitte. Kuna isegi väikesed muutused ensüümi-ligandi interaktsioonides võivad avaldada dramaatilist mõju sidumisafiinsusele, ei tulnud hTyr ja mTyr mitmekesised inhibeerimisprofiilid (kokkuvõtlikult tabelis 1) üllatusena.

Selle uuringu põhieesmärk oli võrrelda arbutiini, hüdrokinooni ja kojichappe mõju erinevate resortsinooli derivaatidega hTyr katalüütilisele funktsioonile ja melaniini tootmisele in vivo. Kõiki testitud aineid, välja arvatud tiamidool, on kirjeldatud kui türosinaasi inhibiitoreid (Kim et al., 2012); nende teatatud inhibeeriv toime on aga äärmiselt erinev. Meditsiinilises kirjanduses peetakse hüdrokinooni naha hüperpigmentatsiooni ravi kriteeriumiks, kuigi selle ohutuse pärast on tõsine mure. Hüdrokinooni kasutamine kosmeetikas on Euroopa Liidus keelatud, kuid USA-s müüakse seda endiselt käsimüügiravimina kuni 2 protsenti hüdrokinooni sisaldavates preparaatides. Hiljuti väljendas USA Toidu- ja Ravimiamet (2006) muret hüdrokinooni pärast; lõplik otsus on siiski pooleli. mTyr hüdrokinooni inhibeerimise avaldatud IC50 väärtused hõlmavad vahemikku 1,1 mmol/L (Kang et al., 2003) kuni 680 mmol/L (Abu Ubeid et al., 2009). Meie analüüsis oli hüdrokinoon hTyr vastu märkimisväärselt ebaefektiivne, inhibeerides seda vaid veidi, jõudes ligikaudu 4,000 mmol/L juures vaid 50 protsendini. Kuigi hüdrokinooni on peetud türosinaasi inhibiitoriks alates 1990. aastate algusest (Palumbo et al., 1991), näitavad meie tulemused, et selle tsütotoksilised omadused on olulisemad mitte ainult melanotsüütidele avalduva kahjuliku mõju, vaid ka melanogeneesi inhibiitori efektiivsuse tõttu. (Jimbow et al., 1974; Penney jt, 1984; Smith et al., 1988). Seda seisukohta ei kinnita mitte ainult meie tulemused hTyr kohta ja asjaolu, et hüdrokinoon vähendas oluliselt melaniini tootmist nahamudelites, vaid ka meie katsed melanotsüütide kultuuridega. Siin vähendas hüdrokinoon melaniini tootmist, kuid töödeldud rakud ei taastunud pärast toimeaine eemaldamist täit melaniini tootmise võimet.

Although arbutin is generally considered an effective tyrosinase inhibitor, the published IC50 values of arbutin for mTyr range from 40 mmol/L (Ying et al., 1999) to more than 30,000 mmol/L (Sugimoto et al., 2005). In our test system, we found very high IC50 values (>4,000 mmol/L) arbutiini puhul nii puhastatud hTyr kui ka MelanoDermi nahamudeliga. Andmed nii a-arbutiini kui ka b-arbutiini efektiivsuse kohta on avaldatud (Garcia-Jimenez et al., 2017). Mõlemad ühendid on aga hüdrokinooni eelravimid, mille bioloogiline aktiivsus sõltub hüdrokinooni vabanemisest molekulist (Briganti et al., 2003). Euroopa Liidu tarbekaupade teaduskomitee (2008) avaldas arbutiini kohta kriitilise arvamuse. Arvestades hüdrokinooni vabanemist molekulist, ei ole arbutiini kasutamine kosmeetikatoodetes ohutu.

Kojihappe poolt põhjustatud türosinaasi inhibeerimise avaldatud IC50 väärtused on vahemikus 6 mmol/L (Curto et al., 1999) kuni enam kui 100 mmol/L (Jeon et al., 2005). HTyr inhibiitorina on kojic hape palju vähem efektiivne, IC50 on umbes 500 mmol/l. Kojinhape inhibeerib segatüüpi, Ki on 145 mmol/L, mis näitab, et see seondub türosinaasi desoksüvormiga (Sun et al., 2014). Kui seda kasutatakse MelanoDermi mudeli ravis, näitab kojichape erakordselt järsku annuse-vastuse kõverat, suhteline inhibeerimine suureneb 5 protsendilt 150 mmol/L juures enam kui 75 protsendini 900 mmol/L juures (vt joonis 2c). See asjaolu võib olla peamiseks põhjuseks, miks kojichape on in vivo väga piiratud efektiivsusega. Seoses kojichappe ohutusega peab Euroopa tarbijaohutuse teaduskomitee (2012) nüüd kosmeetikatoodetes tervele nahale kandmisel kuni 1,0 protsendilist kojhapet ohutuks. Seda seisukohta jagab ka kosmeetikatoodete koostisosade ülevaate ekspertrühm ( Burnett et al., 2010).

Rododendronile omistati Jaapanis kvaasiravimi staatus 2008. aastal ja seda kasutati kosmeetikatoodete valgendava koostisosana. Eeldati, et see on türosinaasi konkureeriv inhibiitor. 2013. aastal kutsuti aga rododendronit sisaldavad tooted tagasi kümnes Aasia riigis, kui peaaegu 20,{6}} tarbijal tekkis pärast toodete kasutamist leukoderma. Näidati, et rododendron ei ole mitte ainult inhibiitor, vaid on ka nii hTyr (Ito et al., 2014a) kui ka mTyr (Ito et al., 2014b) substraat. Endoplasmaatilise retikulumi stressi türosinaasist sõltuv akumuleerumine ja/või apoptootilise raja aktiveerimine võib kaasa aidata rododendroni melanotsüütide tsütotoksilisusele (Sasaki et al., 2014).

4-Asendatud resortsinooli motiiv on juba mõnda aega tuntud kui tõhus keemiline osa, mis inhibeerib türosinaasi (Khatib et al., 2005). Paljud looduslikud ühendid, mis on identifitseeritud valgendavate ainetena, peamiselt flavonoidid, sisaldavad seda motiivi (Shimizu et al., 2000, 2011). Kuna flavonoidide biosaadavus on üldiselt madal, oli meie eesmärk tuvastada resortsinooli derivaadid, millel on parem efektiivsus ja biosaadavus. 4-Butüülresortsinool oli juba tuvastatud hiire ja inimese türosinaasi (Kim et al., 2005; Kolbe et al., 2013) ja hiire TYRP1 dihüdroksüindoolkarboksüülhappe oksüdaasi aktiivsuse inhibiitorina (Katagiri et al. , 2001) ja see on kaubanduslikult saadaval hüperpigmentatsiooni meditsiiniliseks ja kosmeetiliseks raviks (Bohnsack et al., 2012; Jimenez ja Garcia-Carmona, 1997; Kim et al., 2005). Sellele vaatamata puudusid 4-butüülresortsinooli üksikasjalikud kineetilised andmed. hTyr testis leidsime 4-butüülresortsinooli poolt rangelt konkureeriva inhibeerimise tüübi Ki väärtusega 9,1 mmol/L, mis on suurepäraselt kooskõlas määratud IC50 väärtusega (tabel 1).

Meie in vitro katsetes oli tiamidool, mille IC50 oli hTyr ensüümi testis 1,1 mmol/L ja MelanoDermi nahamudelis 0,9 mmol/L, kõigist testitud ainetest kõige tõhusam. Täiendavad katsed kinnitasid, et tiamidool on rangelt konkureeriv inhibiitor (joonis 2b), mitte türosinaasi substraat (vt lisajoonis S1), ja seega ei muudeta tiamidool mürgiseks ja potentsiaalselt leukodermat indutseerivaks kinooniks. Seetõttu valiti tiamidool kliinilisteks uuringuteks, et hinnata selle efektiivsust in vivo. Tiamidooli uuring täpiaplikaatoriga näitas vanuselaikude pidevat paranemist kogu 12-nädalase raviperioodi jooksul, saavutades statistilise olulisuse juba 4 nädala pärast. Need tulemused näitavad Thiamidol testtoote tugevat pigmenti vähendavat efektiivsust ja selget kliinilist kasu naha hüperpigmentatsiooni ravis.

MATERJALID JA MEETODID

Inimese türosinaas

hTyr kärbitud His-märgistatud vormi (hTyr-DHis), mis sisaldab hTyr katalüütilist domeeni, ekspresseeriti HEK 293 rakkudes ja puhastati metalliafiinsuskromatograafiaga Ni2þ-Sepharose'il (GE Healthcare, München, Saksamaa), nagu on kirjeldatud mujal ( Cordes et al., 2013). Saadud preparaadil olid samad katalüütilised omadused kui metsiktüüpi hTyr.

Inhibiitorite allikad

Evoteci ühendite raamatukogust (Evotec, Hamburg, Saksamaa) valiti 50,000 ühendit, mis katavad laia keemilise ruumi, et viia läbi hTyr inhibiitorite HTS, mida hinnati järgmises jaotises kirjeldatud Tyr testi abil. Seejärel sünteesiti edasiseks optimeerimiseks paljutõotavate pliiühendite derivaadid. Teised inhibiitorid osteti erinevatelt tarnijatelt (üksikasju vaadake veebis olevatest lisamaterjalidest).

Türosiini analüüs ja HTS-protseduur

Täielikud üksikasjad L-dopa oksüdaasi aktiivsuse ja kasutatud HTS-i sõelumisprotseduuride kohta leiate lisamaterjalidest.

Molekulaarne modelleerimine

In silico dokkimine põhines hTyr uuel homoloogiamudelil, mida on kirjeldatud mujal (Mann et al., 2017). Simulatsioonid viidi läbi kasutades Molegro Virtual Dockerit (Molegro, Aarhus, Taani). Visuaalseks andmete analüüsiks ja esitamiseks kasutati Discovery Studio Visualizer 4.0 (Accelrys, San Diego, CA). Järjestused võeti UniProti andmebaasist (UniProt Consortium, 2017).

Nahamudeli analüüsid

Täielikud üksikasjad nahamudelina kasutatavate MelanoDermi kudede ja nende melaniinisisalduse n kohta leiate lisamaterjalidest.

Melanotsüütide kultuurid

Täielikud andmed melanotsüütide kultuuride ja nende melaniinisisalduse kvantifitseerimise kohta leiate lisamaterjalidest.

Kliinilised uuringud

Viidi läbi kaks randomiseeritud in vivo uuringut (pimedad katsetoodete jaoks, avatud töötlemata kontrolli jaoks). Ühes uuringus osales 18 naissoost isikut (vanuses 56–71 aastat), kusjuures uuringu lõpetas 17 katsealust. Teine uuring viidi läbi 19 isikuga (18 naist, 1 mees; 58e7{{10}} aastat vana), kõik 19 katsealust lõpetasid uuringu. Iga katsealune kasutas täpiaplikaatorit kasutades kahte erinevat preparaati kaks korda päevas, et eemaldada vananemislaike oma küünarvarredel. Preparaadid erinesid ainult toimeaine poolest: 0,2% tiamidool versus vehiikul esimeses uuringus ja 0,1% tiamidool versus kandja teises uuringus. Üks vanuselaik iga subjekti kohta töödeldi toimeainet sisaldava valemiga ja kontrolllaiku töödeldi ainult vehiikuliga. Vanuselaikude pigmentatsiooni analüüsiti nii, nagu on kirjeldatud lisamaterjalides. In vivo uuringud viidi läbi vastavalt Helsingi deklaratsiooni praeguse versiooni soovitustele ja hea kliinilise tava harmoniseerimise rahvusvahelise konverentsi juhistele. Kõik nendes uuringutes osalejad andsid kirjaliku teadliku nõusoleku. Lisaks kiitis uuringud heaks ja kiitis heaks Beiersdorf AG (Hamburg, Saksamaa) institutsionaalne hindamisnõukogu.

HUVIDE KONFLIKT

LISAMATERJAL

Täiendav materjal on lingitud paberi veebiversiooniga.

VIITED

1. Abu Ubeid A, Zhao L, Wang Y, Hantash BM. Lühikese järjestusega oligopeptiidid, mis inhibeerivad seente ja inimese türosinaasi. J Invest Dermatol 2009;129:2242e9.

2. Bohnsack K, Koop U, Hiddemann S, Kolbe L, Rippke F. Pigmentatsiooni vähendav efektiivsus ja kuue uue näohoolduspreparaadi taluvus, mis sisaldavad 4-n-butüülresortsinooli, plakat nr. P864. Plakat esitleti EADV 21. kongressil, september 27-30, 2012; Praha, Tšehhi Vabariik.

3. Briganti S, Camera E, Picardo M. Keemilised ja instrumentaalsed lähenemisviisid hüperpigmentatsiooni raviks. Pigment Cell Res 2003;16:101e10.

4. Burnett CL, Bergfeld WF, Belsito DV, Hill RA, Klaassen CD, Liebler DC jt. Kosmeetikatoodetes kasutatava Koji happe ohutushinnangu lõpparuanne. Int J Toxicol 2010, 29 (6 lisa). 244Se73.

5. Chang TS. Türosinaasi inhibiitorite värskendatud ülevaade. Int. J. Mol. Sci., 2009; 10: 2440-75.

6. Chen QX, Ke LN, Song KK, Huang H, Liu XD. Heksüülresortsinooli ja dodetsüülresortsinooli pärssiv toime seente (Agaricus bisporus) türosinaasile. Protein J 2004;23:135e41.

7. Cordes P, Sun W, Wolber R, Kolbe L, Klebe G, Ro¨hm KH. Ekspressioon mittemelanogeensetes süsteemides ja inimese türosinaasi lahustuvate variantide puhastamine. Biol Chem 2013;394:685e93.

8. Curto EV, Kwong C, Hermersdo¨rfer H, Glatt H, Santis C, Virador V jt. Imetajate melanotsüütide türosinaasi inhibiitorid: gentisiinhappe alküülestrite in vitro võrdlus teiste oletatavate inhibiitoritega. Biochem Pharmacol 1999;57:663e72.

9. Espin JC, Varon R, Fenoll LG, Gilabert MA, Garcia-Ruiz PA, Tudela J jt. Seene türosinaasi substraadi spetsiifilisuse ja mehhanismi kineetiline iseloomustus. Eur J Biochem 2000;267:1270e9.

10. Fogal S, Carotti M, Giaretta L, Lanciai F, Nogara L, Bubacco L, Bergantino E. Insektrakkudes toodetud inimese türosinaas: orientiirid selle aktiivsust käsitlevate uute ravimite skriinimiseks. Mol Biotechnol 2015;57:45e57.

11. Garcia-Jimenez A, Teruel-Puche JA, Berna J, Rodriguez-Lopez JN, Tudela J, Garcia-Canovas F. Türosinaasi toime alfa- ja beeta-arbutiinile: kineetiline uuring. PLoS One 2017;12:e0177330.

12. Garcia-Jimenez A, Teruel-Puche JA, Berna J, Rodriguez-Lopez JN, Tudela J, Garcia-Ruiz PA, Garcia-Canovas F. Türosinaasi toime iseloomustus resortsinoolidel. Bioorg Med Chem 2016;24:4434e43.

13. Garcia-Molina F, Hiner AN, Fenoll LG, Rodriguez-Lopez JN, Garcia-Ruiz PA, Garcia-Canovas F jt. Seene türosinaas: katalaasi aktiivsus, inhibeerimine ja enesetapu inaktiveerimine. J Agric Food Chem 2005;53:3702e9.

14. Ghanem G, Fabrice J. Türosinaasiga seotud valk 1 (tyrp1/gp75) inimese naha melanoomi korral. Mol Oncol 2011;5:150e5.

15. Kuulavad VJ Jr, Ekel TM, Montague PM, Nicholson JM. Imetajate türosinaas. Stöhhiomeetria ja reaktsiooniproduktide mõõtmine. Biochim Biophys Acta 1980; 611:251e68.

16. Ismaya WT, Rozeboom HJ, Weijn A, Mes JJ, Fusetti F, Wichers HJ, Dijkstra BW. Agaricus bisporuse seene türosinaasi kristallstruktuur: tetrameeri subühikute identsus ja interaktsioon tropolooniga. Biochemistry 2011;50:5477e86.

17. Ito S, Gerwat W, Kolbe L, Yamashita T, Ojika M, Wakamatsu K. Inimese türosinaas võib oksüdeerida rododendroni mõlemat enantiomeeri. Pigment Cell Melanoma Res 2014a;27:1149e53.

18. Ito S, Ojika M, Yamashita T, Wakamatsu K. Rododendroni türosinaasi poolt katalüüsitud oksüdatsioon tekitab 2-metüülkromaani-6,7-diooni, mis on oletatav lõplik toksiline metaboliit: mõju melanotsüütide toksilisusele . Pigment Cell Melanoma Res 2014b;27:744e53.

19. Ito S, Wakamatsu K. Mugav sõelumismeetod fenoolsete nahka valgendavate türosinaasi inhibiitorite eristamiseks leukodermat indutseerivatest fenoolidest. J Dermatol Sci 2015;80:18e24.

20. Jeon SH, Kim KH, Koh JU, Kong KH. Türosinaasi l-Dopa oksüdatsiooni pärssiv toime nahka valgendavate ainetega. Bull Korean Chem Soc 2005;26:1135e7.

21. Jimbow K, Obata H, Pathak MA, Fitzpatrick TB. Hüdrokinooni depigmentatsiooni mehhanism. J Invest Dermatol 1974;62:436e49.

22. Jimenez M, Garcia-Carmona F. 4-asendatud resortsinoolid (sulfiidi alternatiivid) kui türosinaasi katehkolaasi aktiivsuse aeglaselt seonduvad inhibiitorid. J Agric Food Chem. 1997;45:2061e5.

23. Kang HH, Rho HS, Hwang JS, Oh SG. Alkoksübensoaatide või alkoksütsinnamaadi depigmenteeriv aktiivsus ja madal tsütotoksilisus kultiveeritud melanotsüütides. Chem Pharm Bull (Tokyo) 2003;51:1085e8.

24. Kanteev M, Goldfeder M, Fishman A. Struktuuri-funktsiooni korrelatsioonid türosinaasides. Prot Sci 2015;24:1360e9.

25. Katagiri T, Okubo T, Oyobikawa M, Futaki K, Shaku M, Kawai M jt. 4-n-butüülresortsinooli pärssiv toime melanogeneesile ja selle nahka valgendavale toimele. J Soc Cosmet Chem Jpn 2001;35:42e9.

26. Khatib S, Nerya O, Musa R, Shmuel M, Tamir S, Vaya J. Kalkoonid kui tugevad türosinaasi inhibiitorid: 2,4-asendatud resortsinooli osa tähtsus. Bioorg Med Chem 2005;13:433e41.

27. Kim DS, Kim SY, Park SH, Choi YG, Kwon SB, Kim MK jt. 4-n-butüülresortsinooli pärssiv toime türosinaasi aktiivsusele ja melaniini sünteesile. Biol Pharm Bull 2005;28:2216e9.

28. Kim H, Choi HR, Kim DS, Park KC. Paikselt kasutatavad hüpopigmenteeritud ained pigmendihäirete ja nende toimemehhanismide jaoks. Ann Dermatol 2012;24:1e6.

29. Kim YJ, Uyama H. ​​Türosinaasi inhibiitorid looduslikest ja sünteetilistest allikatest, struktuur, inhibeerimismehhanism ja tulevikuperspektiiv. Cell Mol Life Sci 2005;62:1707e23.

30. Kolbe L, Mann T, Gerwat W, Batzer J, Ahlheit S, Scherner C jt. 4-n-butüülresortsinool, ülitõhus türosinaasi inhibiitor hüperpigmentatsiooni paikseks raviks. J Eur Acad Dermatol Venereol 2013;27: 19e23.

31. Lai X, Soler-Lopez M, Wichers HJ, Dijkstra BW. Inimese türosinaasi laiaulatuslik rekombinantne ekspressioon ja puhastamine, mis sobib struktuuriuuringuteks. PLoS One 2016;11:e0161697. 32. Lai X, Wichers HJ, Soler-Lopez M, Dijkstra BW. Inimese türosinaasiga seotud valgu 1 struktuur näitab melanogeneesi jaoks olulist binukleaarset tsingi aktiivset saiti. Angew Chem Int Ed Engl 2017;56:9812e5.

33. Lee SY, Baek N, Nam TG. Looduslikud, poolsünteetilised ja sünteetilised türosinaasi inhibiitorid. J Enzyme Inhib Med Chem 2014;31:1e13.

34. Mann T, Gerwat W, Wenck H, Ro¨hm KH, Kolbe L. Isobutylamido tiazolyl resorcinol a new strong inhibitor of human tyrosinase. Pigment Cell Melanoma Res 2017: e85.

35. Matoba Y, Kumagai T, Yamamoto A, Yoshitsu H, Sugiyama M. Kristallograafilised tõendid selle kohta, et türosinaasi kahetuumaline vasekeskus on katalüüsi ajal FL paindlik. J Biol Chem 2006;281:8981e90.

35. Nesterov A, Zhao J, Minter D, Hertel C, Ma W, Abeysinghe P jt. 1-(2,4- dihüdroksüfenüül)-3-(2,4-dimetoksü-3-metüülfenüül)propaan, uudne tugeva depigmenteeriva toimega türosinaasi inhibiitor. Chem Pharm Bull (Tokyo) 2008;56:1292e6.

36. Olivares C, Garcia-Borron JC, Solano F. Imetajate türosinaasi metalli kofaktori sidumises ja stereospetsiifilise substraadi äratundmises osalevate aktiivse saidi jääkide tuvastamine. Mõju katalüütilisele tsüklile. Biochemistry 2002;41:679e86.

37. Palumbo A, d'Ischia M, Misuraca G, Prota G. Melanogeneesi inhibeerimise mehhanism hüdrokinooniga. Biochim Biophys Acta 1991; 1073:85-90.

38. Penney KB, Smith CJ, Allen JC. Hüdrokinooni depigmenteeriv toime sõltub põhiliste rakuprotsesside katkemisest. J Invest Dermatol 1984;82:308e10.

39. Pretzler M, Bijelic A, Rompel A. Funktsionaalse seente türosinaasi (AbPPO4) heteroloogiline ekspressioon ja iseloomustus. Sci Rep 2017;7:1810.

40. Ramsden, CA, Riley PA. Türosinaas: aktiivse saidi neli oksüdatsiooniolekut ja nende olulisus ensümaatilise aktiveerimise, oksüdatsiooni ja inaktiveerimise jaoks. Bioorg Med Chem 2014;22:2388e95.

41. Rescigno A, Sollai F, Pisu B, Rinaldi A, Sanjust E. Türosinaasi inhibeerimine, üldised ja rakenduslikud aspektid. J Enzyme Inhib Med Chem. 2002;17:207e18.

42. Sasaki M, Kondo M, Sato K, Umeda M, Kawabata K, Takahashi Y jt. Rododendron, depigmentatsiooni indutseeriv fenoolühend, avaldab türosinaasist sõltuva mehhanismi kaudu melanotsüütide tsütotoksilisust. Pigment Cell Melanoma Res 2014;27:754e63.

43. Schweikardt T, Olivares C, Solano F, Jaenicke E, Garcia-Borron JC, Decker H. Imetajate türosinaasi aktiivse saidi kolmemõõtmeline mudel, mis arvestab funktsioonimutatsioonide kadumist. Pigment Cell Res 2007;20: 394e401.

44. Tarbekaupade teaduskomitee. Arvamus b-arbutiini kohta; 2008 (vaadatud 21. novembril 2017).

45. Tarbijaohutuse teaduskomitee. Arvamus kojichappe kohta; 2012 (vaadatud 21. novembril 2017).

46. ​​Sendovski M, Kanteev M, Ben-Yosef VS, Adir N, Fishman A. Aktiivse bakteriaalse türosinaasi esimesed struktuurid näitavad vase plastilisust. J Mol Biol 2011;405: 227e37.

47. Shimizu K, Kondo R, Sakai K. Türosinaasi inhibeerimine flavonoidide, stilbeenide ja nendega seotud 4-asendatud resortsinoolide poolt: struktuuri-aktiivsuse uuringud. Planta Med 2000;66:11e5.

48. Shimizu MM, Melo GA, Brombini Dos Santos A, Bottcher A, Cesarino I, Arau´jo P jt. Polüfenooloksüdaasi ensüümide iseloomustamine, eraldamine ja cDNA kloonimine kolme kaubanduslikult olulise liigi palmi südames. Plant Physiol Biochem 2011;49:970e7.

49. Smith CJ, O'Hare KB, Allen JC. Hüdrokinooni selektiivset tsütotoksilisust melanotsüütidest pärinevate rakkude suhtes vahendab türosinaasi aktiivsus, kuid see ei sõltu melaniini sisaldusest. Pigment Cell Res 1988;1:386e9.

50. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem G. Hüpopigmenteerivad ained: uuendatud ülevaade bioloogilistest, keemilistest ja kliinilistest aspektidest. Pigment Cell Res 2006;19:550e71.

51. Stratigos AJ, Katsambas AD. Hüperpigmentatsiooni tõrksate häirete optimaalne juhtimine tumedanahalistel patsientidel. Am J Clin Derm 2004; 5: 161e8.

52. Sugimoto K, Nomura K, Nishimura T, Kiso T, Sugimoto K, Kuriki T. A-arbutiin-a-glükosiidide süntees ja nende inhibeeriv toime inimese türosinaasile. J Biosci Bioeng 2005;99:272e6.

53. Sun W, Wendt M, Klebe G, Ro¨m KH. Türosinaasi inhibeerimise kineetika tõlgendamise kohta. J Enzyme Inhib Med Chem 2014;29:92e9.

54. Tripathi RK, kuulmine VJ, Urabe K, Aroca P, Spritz RA. Inimese türosinaasi katalüütilise aktiivsuse mutatsiooniline kaardistamine. J Biol Chem. 1992; 267: 23707 e12.

55.UniProti konsortsium. UniProt: universaalne valkude teadmistebaas. Nucleic Acids Res 2017;45:D158e69.

56. USA toidu- ja ravimiamet, tervishoiu- ja inimteenuste osakond. Käsimüügis kasutatavad nahka pleegitavad ravimid; pakutud reegel. 71 Federal Register 51146-5115521 (kodifitseeritud 21 CFR osa 310 juures); 2006.

57. Vielhaber G, Schmaus G, Jacobs K, Franke H, Lange S, Herrmann M jt. 4-(1-fenüülmetüül)1,3-benseendiool: uus ülitõhus valgustusaine. Int J Cosmet Sci 2007;29:65e6. 58. Wendt M. Neuer tyrosinase-inhibitoren kavandamise põhjendused. Ph.D. lõputöö. Marburg, Saksamaa: Marburgi ülikooli meditsiinikool; 2006.

59. Ying YH, Lee SJ, Chung MH, Ying HJ, Suk JL, Myung HC jt. Aloesiin ja arbutiin inhibeerivad sünergistlikult türosinaasi aktiivsust erineva toimemehhanismi kaudu. Arch Pharm Res 1999;22:232e6.

Lisateabe saamiseks: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501