Kahjustatud ATG16L-sõltuv autofagia soodustab neerude interstitsiaalset fibroosi kroonilise neerutransplantaadi düsfunktsiooni korral, indutseerides endMT NF-kB signaaliraja abil

Zeping Gui^1,2†, Chuanjian Suo^1†, Zijie Wang ^1†, Ming Zheng¹, Shuang Fei¹, Hao Chen¹, Li Sun¹, Zhijian Han¹, Jun Tao¹, Xiaobin Ju¹, Haiwei Yang¹, Min Gu^2*ja Ruoyun Tan^1*

Kroonilineneeru-siiriku düsfunktsioon (CAD) on põhjustatud mitmetest teguritest, sealhulgas glomerulaarskleroos, põletik, interstitsiaalne fibroos ja tubulaarne atroofia (IF/TA). Kuid kõige silmapaistvamad elemendidCADon IF/TA. Meie uuringud on kinnitanud, et endoteeli-mesenhümaalne üleminek (EndMT) on oluline IF/TA siirdamise allikas. EndMT tunnuseks on endoteeli markeri kadumine ja mesenhümaalsete või fibroblastiliste fenotüüpide omandamine. Autofagia on rakusisene lagunemisrada, mida reguleerivad autofagiaga seotud valgud ja mis mängib olulist rolli paljudes fibrootilistes tingimustes. Siiski, kas autofagia aitab kaasa fibroosi tekkele või mitteneeru-allograft ja kuidas selline mehhanism tekib, on endiselt ebaselge. Autofagiaga seotud 16 sarnane geen (ATG16L) on autofagosoomide moodustamiseks vajalik autofagiaga seotud geen (ARG). Siin analüüsisime esmalt neerusiirdamisega patsientide kudesid Gene Expression Omnibusi (GEO) andmekogumitest ja 60 siirdatud patsienti meie keskusest. Stabiilse neerufunktsiooniga retsipiendid määratleti kui mitte-CADrühma ja kõik patsiendidCADrühmas diagnoositi histopatoloogiliseltCAD. Tulemused näitasid, et ATG16L kui üks oluline diferentsiaal ARG oli vähem väljendunudCADgrupp võrreldes mitte-CAD rühmaga. Lisaks leidsime, et siirdatud neerudes oli vähem autofagosoome ja autolüsosoomeCADpatsientidel ja autofagia alareguleerimine on halb prognostiline tegur. In vitro avastasime, et ATG16L katkestamine suurendas inimese EndMT protsessineeru-glomerulaarsed endoteelirakud (HRGEC). Seejärel tuvastati rottidel in vivo EndMT ja autofagilise voolu muutusedneeru-siirdamise mudelidCAD. Näitasime EndMT esinemist ja näitasime, et ATG16L arvukusega kaasnes dünaamiline autofaagilise voo muutus neerusiirdamise erinevates etappides. Mehhaaniliselt vähendas ATG16L hävitamine, eriti endoteelirakkudes, NF-kB lagunemist ja väljutasid põletikulised tsütokiinid (IL-1b, IL-6 ja TNF-a), mis võivad hõlbustada EndMT-d. Kokkuvõtteks võib öelda, et siirdamisest põhjustatud ATG16L-sõltuv autofagiline voog näitas aja jooksul järk-järgult kaotuse suurenemist.

Sellest protsessist tulenevad põletikulised tsütokiinid soodustasid EndMT-d, põhjustades seeläbi haiguse progresseerumistCAD. ATG16L toimis EndMT ja selle arengu negatiivse regulaatorinaneeru-siiriku fibroosi ja autofagiat saab uurida kui potentsiaalset terapeutilist sihtmärki neerutransplantaadi kroonilise düsfunktsiooni korral.

Märksõnad:krooniline neerutransplantaadi düsfunktsioon, neeru-interstitsiaalne fibroos, ATG16L, autofagia, EndMT, põletikulised tsütokiinid

Lisateabe saamiseks:ali.ma@wecistanche.com

SISSEJUHATUS

Neersiirdamineon üks optimaalseid ravimeetodeid ureemiaga patsientidele, kuna see parandab oluliselt nende elukvaliteeti (1). Siiski esineb pärast siirdamist suhteliselt palju neeru allotransplantaadi düsfunktsiooni, mis on tingitud neerufunktsiooni kroonilisest progresseeruvast halvenemisest, mis on siirdatud neerude pikaajalist ellujäämist mõjutav võtmetegur (2). Krooniline neerutransplantaadi düsfunktsioon (CAD), varem tuntud kui krooniline allotransplantaadi nefropaatia, on multifaktoriaalne seisund, mis on seotud progresseeruva neerude interstitsiaalse fibroosiga. On teada, et neeru allotransplantaadi funktsiooni kadumist soodustavad mitmed tegurid, sealhulgas, kuid mitte ainult, äge ja krooniline äratõukereaktsioon, isheemia ja reperfusioonipõletik ning kudede taastamise protsess ning ravimitega seotud nefrotoksilisus (3).

CADmorfoloogiliselt iseloomustab põletik, progresseeruv interstitsiaalne fibroos ja tubulaarne atroofia (IF/TA) ning glomerulaarskleroos (4). Nende hulgas on IF / TA võtmetegur, mis määrab neeru allotransplantaadi funktsiooni, kuid selle esinemise mehhanismid on endiselt teadmata. On tuvastatud mitmed tegurid, mis aitavad kaasa neerutransplantaadi kaotuse suurele osakaalule. Oma eelmises uuringus kinnitasime ka, et CAD peamine patoloogiline protsess oli neeru allotransplantaadi IF / TA, mida iseloomustab ekstratsellulaarse maatriksi liigne ladestumine siirdatud neerutuubulaarses ja interstitsiaalses koes (5). Uuringud on kinnitanud, et kollageene sekreteerivad peamiselt müofibroblastid ja kollageenide sekretsioon põhjustab rakuvälise maatriksi settimist ja seejärel neeru siirdamise IF/TA. Müofibroblastide moodustumisel osalevad neli peamist rakku: epiteelirakud, endoteelirakud, luuüdist pärinevad fibroblastid ja mikrovaskulaarsed peritsüüdid (6, 7). Nad mängivad olulist rolli neerukoe terviklikkuse parandamisel ja kaitsmisel. Nende hulgas võimaldavad välised stiimulid sisemiste neerurakkude, näiteks epiteelirakkude, diferentseerumist müofibroblastideks, mis võivad toota rakuvälist maatriksit. Seda protsessi nimetatakse epiteeli-mesenhümaalseks üleminekuks (EMT). EMT hõlmas tavaliselt kolme tüüpi: (I) embrüogenees, (II) kudede paranemine ja fibroos, (III) metastaasid (8). II tüüpi EMT molekulaarsete ja rakuliste mehhanismide selgitamiseks organfibroosi korral on tehtud mitmeid uuringuid (9, 10), kuid EMT rollid erinevates primaarsete fibroblastide tekkeprotsessides CAD progresseerumise ajal on endiselt ebaselged.

Neeru siirdamisel on alati suurem tõenäosus kahjustada allografti makro- ja mikroveresoonkonda, kuna allotransplantaadi endoteeli füüsiline asukoht muudab selle siirdamise vigastuse esmaseks sihtmärgiks (11). Allotransplantaadid toimivad immuunvastuse potentsiaalsete sihtmärkidena, mida vahendavad üsna paljud seerumi põletikulised tsütokiinid. Uuringud näitasid, et paljud põletikulised tsütokiinid on seotudCADprotsess (12) ja endoteelirakud neeru allotransplantaadi kohtades ei olnud mitte ainult põletikus osalejad, vaid ka põletiku regulaatorid (11). Meie varasemad uuringud näitasid, et TNF-a ekspresseerub tugevamaltCADkui mitte-CAD grupp. TNF-a hõlbustas ka EMT protsessi inimese proksimaalsetes tubulaarrakkudes (HK2) (13). Arvestades endoteelirakkude ja vere vahelist intiimset kontakti, ründavad ringlevad põletikurakud ja tsütokiinid esmalt allografti endoteeli. Põletikuliste tsütokiinide krooniline stimulatsioon põhjustab endoteelirakkudes rakustruktuuri ja sisekeskkonna häireid, mille tulemuseks on endoteeli kahjustus. Uued uuringud näitavad, et endoteeli kahjustus aitab kaasa rakuvälise maatriksi ladestumisele ja mängib võtmerolli elundi fibroosihaiguste korral. Hiljuti peetakse endoteeli-mesenhümaalset üleminekut (EndMT) peamiseks endoteelikahjustuse põhjuseks ja see soodustab IF/TA progresseerumist neerufibroosi ajal (5, 9). EndMT on EMT eristav tüüp. Seda iseloomustavad rakud, mis kaotavad järk-järgult endoteeli markerid, nagu CD31 ja CD34, ning omandavad mesenhümaalse või müofibroblastilise fenotüübi, nagu a-sile lihasaktiin (a-SMA), kollageen I ja fibronektiin (FN). EndMT reguleerimismehhanism on endiselt keeruline probleem. EndMT esinemist võivad mõjutada paljud tegurid, nagu oksüdatiivne stress, hüpoksilisus ja mitmesugused vigastused (14, 15). Kuid peaaegu kõik need reguleerivad tegurid saavad lõpuks kokku üheks otseseks toimeks, milleks on põletikulised tsütokiinid. Varasemates uuringutes näitasime, et EndMT oli TGF-b / Smad signaaliradade kaudu IF / TA ja CAD patogeneesis oluline tegur (5). Lisaks väitsid teised teadlased, et TNF-a reguleeris TGF-b ekspressiooni üles (16). Seega võivad põletikulised tsütokiinid, nagu TNF-a, olla ka vaskulaarse endoteeli kahjustuse oluline patogeenne tegur, mis iseloomustab CAD progresseerumist. Kuigi EndMT algtegurid olid erinevates mikrokeskkondades erinevad, oli lõpptulemus sama. Seega piisas oletada, et põletikuliste tsütokiinide tootmisel ja EndMT progresseerumisel peab olema keskne regulatsioonimehhanism.

Autofagia on raku rada, mis vastutab valkude ja organellide lagunemise eest (17). Autofagia protsessi tuntakse ka kui autofaagilist voogu ja selle protsessi tugevus esindab sageli autofagia aktiveerimise astet. Autofagia osaleb erinevates neerupatofüsioloogilistes protsessides, sealhulgas glomeruloskleroos, diabeetiline nefropaatia ja tsüstiline neeruhaigus (18). Mõned uuringud teatasid, et autofagia oli tsütoprotektiivne protsess. Selle eelduse klassikaline kaitse on selline, nagu on näha proksimaalse tuubuli ATG5 deletsiooniga hiirtel, kus deletsioon soodustas halvenenud autofagia tõttu raskemat neerufibroosi (19). Teised uuringud on samuti leidnud, et proksimaalsete tuubulite epiteelirakkude tingimuslik knockdown ATG5 süvendas varases staadiumis ägedat neerukahjustust, kuid aeglustas neerufibroosi progresseerumist taastumis- või paranemisprotsessis (20). Autofagia ja EMT või EndMT vaheline spetsiifiline interaktsioon fibroosihaiguse korral on siiski endiselt vastuoluline. Mitmed uuringud näitasid, et autofagia inhibeerimine võib esile kutsuda EMT ja fibroosi, mõjutades idiopaatilise kopsufibroosi ebanormaalset epiteeli-fibroblasti läbirääkimist (21). Teised näitasid, et rapamütsiin soodustab EndMT-d autofagia aktiveerimise kaudu enneaegse vananemise ajal (22). ATG16L geen sisaldab peamiselt ATG16L1 ja ATG16L2. ATG16L2 homo- ja heterooligomeriseerub ATG16L1-ga. Kuid ATG16L2 on vähem seotud autofagiaga (23). ATG16L1 on identifitseeritud kui oluline autofagiaga seotud geen, see soodustab autofagosoomide moodustumist plasmamembraanil ja mängib kriitilist rolli LC3 lipiiditud vormis (23). Siin nimetatakse ATG16L1 ühiselt ATG16L-ks. Kunagi teatati autofagia võtmetegurina ATG16L-st, mis on seotud mitmete põletikuliste haiguste patogeneesiga. Näiteks andis ATG16L mutatsioon tugeva eelsoodumuse Crohni tõve tekkeks (24). Siiski ei ole ATG16L toime ja autofagia mehhanismi sihipärases lähenemisviisis, näiteks neerusiirdamise juhtimises ja prognoosimises, veel hästi uuritud. Seega peab autofagilise voo ja ATG16L-sõltuva autofagia dünaamiline roll olema CAD progresseerumise potentsiaalsete ravimite uurimise keskmes.

Selles uuringus uurisime ATG16L-sõltuva autofagia potentsiaalset rolli CAD progresseerumisel. Avastasime, et ATG16L ja autofagia kadu oli seotud EndMT esinemisega kliinilistel CAD patsientidel ja neeru siirdatud rottidel. Seejärel leidsime, et pärast autofagia aktiivsuse muutmist ATG16L geeni mahalöömisega suurenes EndMT ja neeru allografti interstitsiaalse fibroosi tase. Lisaks uuriti RNA sekveneerimisega ka võimalikke aluseks olevaid mehhanisme, leidsime, et ATG16L kahjustus aitas kaasa tuumafaktori kB (NF-kB) raja aktiveerimisele ja põletikuliste tsütokiinide sekretsioonile, seejärel soodustas EndMT progresseerumist.

MATERJALID JA MEETODID

Eetikaavaldus

Uuringu protokollid vastasid Helsingi ja Istanbuli deklaratsioonile. Inimuuringuid kontrollis ja andis loa Nanjingi meditsiiniülikooli esimese sidushaigla (ID: IACUC-2010020) kohalik eetikakomitee. Teadlik nõusolek saadi kõigilt sellesse uuringusse kaasatud siirdatud retsipientidelt ja nefrektoomiaga patsientidelt.

Rottidega tehtud uuringuid uuris ja andis loa Nanjingi meditsiiniülikooli esimese sidushaigla (ID: IACUC-2010020) kohalik eetikakomitee. Omanikud annavad oma loomade osalemiseks selles uuringus kirjaliku teadliku nõusoleku.

Näidiskogu

Sixty of adults who had received living or deceased donor kidney transplants started to be followed up from January 2010 to December 2017 at First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University. Patients with serum creatinine level consistently < 141.46 mmol/L (1.6 mg/dl) for at least 12 months after kidney transplantation and no other complications such as episodes of significant rejection, drug toxicity injury, and infection were assigned to the non-CAD group. Patients in the CAD group were defined as elevated serum creatinine greater than or equal to 141.46 mmol/L (1.6 mg/dl) for at least three months, and they were diagnosed by two independent pathology experts combined with biopsy results, laboratory indexes, and imaging features. Adjacent normal kidney tissues were obtained from regions outside the tumor margin (>5 cm) radikaalse nefrektoomiaga patsientidel. Vereproovid võeti pärast seda, kui patsiendid olid andnud teadliku nõusoleku. Konkreetsele etapile võib viidata meie varasemates uuringutes (5). CAD-rühma ja mitte-CAD-rühma patsientide algtaseme omadused olid sellised, nagu on näidatud tabelis 1.

Rottide ja loomade mudelid

Täiskasvanud isased F344 ja Lewise rotid (kaal 250 ± 10,3 g) saadi ettevõttest Charles River Laboratories (Peking, Hiina) ja järgisid Nanjingi meditsiiniülikooli institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitee juhiseid. Loomi käideldi vastavalt Nanjingi meditsiiniülikooli normidele ja USA riiklike terviseinstituutide avaldatud juhistele.

Kõik need loomad kogesid ortotoopilist vasaku neeru siirdamist. Retsipientide ja süngeensete doonoritena (Syn-rühm) kasutati Lewise rotte, allogeensete doonoritena F344 rotte (Allo rühm). Parem neer lõigati välja samaaegselt. Keskmine külma isheemia aeg oli alla 20 minuti ja soe isheemia oli alla 35 minuti. Tsüklosporiin A (5 mg/kg, QD, IP; Neoral, Novartis, Šveits) kasutati 14 päeva, et vältida ägedat äratõukereaktsiooni,

Farmatseutiline töötlemine ja kudede kogumine

Rottidelt siirdatud neerud koguti 4., 8., 12. ja 16. nädalal pärast operatsiooni. Histoloogiliseks ja IHC/IF-värvimiseks võeti parafiiniga manustatud formaliiniga fikseeritud (10% neutraalse formaliiniga) neeru allotransplantaadi koeproovid. Ülejäänud neerud hoitakse RNA ja valgu tuvastamiseks külmkapis –80 kraadi juures.

HE ja Massoni trikroomvärvimise test

HE ja Massoni trikroomvärvimise testi protokollidele võib viidata meie varasemates uuringutes (5). CAD raskuse ja fibrootilise piirkonna ulatuse tuvastamiseks kvantifitseeriti neeru allotransplantaadi fibroosi piirkond Massoni trikroomvärvimisega. Iga lõigu jaoks valiti viis juhuslikku nägemisvälja × 400 mikroskoobi all. Massoni trikroomi suhtes positiivset pindala mõõtsid kaks patoloogi, kes olid katseplaanist pimedad, kasutades Image‐Pro Plusi (Media Cybernetics, Rockville, MD).

Immunohistokeemiline värvimisanalüüs

Formaliiniga fikseeritud neerukuded lõigati 3 mm paksusteks parafiinilõikudeks. Parafiinivaba, hüdraatunud ja antigeenide eemaldamise protsess oli kooskõlas meie varasemate uuringutega (5). Antikehad [anti-ATG16L (1:100; Abcam, USA), anti-a-SMA (1:200; Abcam, USA), anti-fibronektiin (1:100; Abcam, USA) ja anti-CD31 (1:100; CST, USA)] inkubeeriti üleöö 4 kraadi juures pärast seda, kui lõigud blokeeriti 10% normaalse eesli seerumiga. Järgmised sammud viidi samuti läbi, nagu varem kirjeldatud, kasutades biotinüülitud kitse hiire/küüliku IgG-d (0,5 mg/ml;

Abcam) ja substraat 3-amino-9-etüülkarbasool või 3,3′

diaminobensidiin (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Värvitud slaidid pildistati Nikon Eclipse 80i mikroskoobiga, mis oli varustatud digikaameraga (DS-Ri1, Nikon, Shanghai, Hiina).

Kaudne immunofluorestsentsvärvimise test

Pärast 4-protsendilise formaldehüüdi lahusega kinnitamist tungiti neeru allotransplantaadi lõikudesse ja rakkude ronimissektsioonidesse 1 tunniks 0,1 protsendi Triton X-100, seejärel blokeeriti 5-protsendilise kitse seerumiga 1 tund. Seejärel inkubeeriti sektsioone ja rakuronimislõike anti-NF-kB p65-ga (1:200; Abcam, USA) 4 kraadi juures üleöö. Sekundaarse antikeha Dapi inkubatsioonitingimused võivad viidata meie varasematele uuringutele (5). Slaide vaadati Nikon Eclipse 80i fluorestsentsmikroskoobiga (DS-Ri1, Nikon, Shanghai, Hiina).

Autofaagilise voo tuvastamine

AAV-mRFP-GFP-LC3 (Hanbio, Shanghai, Hiina) süstiti stereotaktiliselt Lewise rottide vasakusse neeru (3 ml) 14 päeva enne siirdamist. Neer eemaldati 4, 8, 12, 16 nädalat pärast siirdamist ja fikseeriti 4% paraformaldehüüdiga 24 tunniks. Slaide (30 mm) vaadati Nikon Eclipse 80i fluorestsentsmikroskoobiga (DS-Ri1, Nikon, Shanghai, Hiina). Kollased laigud näitavad autofagosoome ja punased laigud autolüsosoome. Kui punane signaal on kollasest tugevam, on autofaagiline voog aktiveeritud. Kui kollaseid signaale on rohkem kui punaseid signaale, on autofaagiline voog häiritud.

Elektronmikroskoopia

Proovid fikseeriti jääkülma glutaaraldehüüdiga (3 protsenti 0,1 M kakodülaatpuhvris, pH 7,4) ja töödeldi edasi Core Facility's (teenistus, Wuhan, Hiina). Vaatlus viidi läbi JEOL JEM-2100 ülekandeelektronmikroskoobiga.

Neerufunktsiooni tuvastamine

Roti vere kreatiniini ja uurea lämmastiku kontsentratsioonide tuvastamiseks vastavalt tootja juhistele kasutasime roti QuantiChrom Creatinine Assay Kit ja QuantiChrom Urea Assay Kit (Jiancheng, Peking, Hiina).

Uria valgu tuvastamine

24-tunnised uriiniproovid koguti metaboolsete puuride abil ja valgu eritumist uriiniga testiti kaubandusliku komplektiga (Mlbio, Shanghai, Hiina) vastavalt tootja juhistele.

Reaalajas PCR hindamine

Lühidalt, kogu RNA puhastati HRGEC-dest, kasutades RNA ekstraheerimiskomplekte (TIANGEN, Peking, Hiina). cDNA (cDNA) sünteesiti nii, nagu eelnevalt kirjeldatud (5). Geeniekspressiooni mõõdeti reaalajas PCR testiga (Vazyme) ja DNA Engine Opticon 2 süsteemiga (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Praimeri järjestusi kirjeldati järgmiselt:

IL-1 b: 5′‐ TTCCTGTTGTCTACACCAATGC‐3′ (F) 5′‐CGGGCTTTAAGTGAGTAGGAGA‐3′ (R);

IL-6: 5′′-TCTCTCCGCAAGAGACTTCCCA-3′ (F)

5′‐ ATACTGGTCTGTTGTGGGTGG‐3′ (R);

TNF-a: 5′‐ CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG‐3′ (F) 5′‐ GAGGACCTGGGAGTAGATGAG ‐3′ (R);

Aktiin: 5′‐ TGACGTGGACATCCGCAAAG‐3′ (F) 5′‐ CTGGAAGGTGGACAGCGAGG‐3′ (R);

Western Blot ja Elisa test

Lühidalt, valgud rakkudest ja kudedest ekstraheeriti RIPA puhvris (Thermo ScientificTM, Chelmsford, MA, USA), mis sisaldas fosfataase ja proteaaside inhibiitorite kokteile (Sigma, St Louis, MO, USA). Valgud (20 mg) kanti üle PVDF membraanile (Millipore, IPVH00010, Massachusetts, USA) pärast SDS-PAGE. Slaide inkubeeriti blokeerivas lahuses (5% rasvavaba piim) 60 minutit ja seejärel inkubeeriti PVDF membraani primaarse antikehaga ilma pesemiseta külmas ruumis üleöö. Pärast seda oli PVDF-i membraani pesemine tris-puhverdatud soolalahuse (TBST) puhvriga, inkubeeritud sekundaarse antikehaga, ECL-tablettimine ja eksponeerimine kooskõlas meie varasemate uuringutega (5). Primaarsed antikehad olid loetletud järgmiselt: anti-GAPDH (1:1000; CST, USA), anti-CD31 (1:1000; CST, USA), anti-a-SMA (1:1000;

Abcam, USA), antifibronektiin (1:1000; BD Biosciences, USA),

anti-LC3 (1:1000; CST, USA), anti-ATG16L (1:1000; CST, USA),

anti-NF-kB p65 (1:1000; CST, USA), anti-Phospho-NF-kB p65 (1:1000; CST, USA). Kvantifitseerimine viidi läbi signaalide intensiivsuse mõõtmisega NIH pildianalüüsi tarkvara abil. MAP1LC3 tuvastati ELISA komplekti (ml000829, Mlbio, Hiina) abil vastavalt tootja juhistele.

Rakukultuur, ravi ja shRNA transfektsioon

Inimese neeru glomerulaarseid endoteelirakke (HRGEC) kasvatati endoteelirakkude söötmes (ECM, ScienCell Research Laboratories Carlsbad, CA, USA), mis sisaldas 5 protsenti veise loote seerumit. Seadmete seadistamine CO2 inkubaator Kultuur HRGEC-d niisutatud atmosfääris, mis sisaldab 5 protsenti CO2 37 kraadi juures. Endoteelirakke säilitati seerumivabas söötmes üleöö ja seejärel töödeldi IL-1b, IL-6 ja TNF-a-ga erinevatel tundidel või erinevatel kontsentratsioonidel.

HRGEC-de stabiilne ATG16L-knockdown ja ATG16L-üleekspressioon konstrueeriti lentiviiruse abil (Jikai, Shanghai, Hiina). HRGEC-d transfekteeriti esmalt lipofektamiiniga 2000, seejärel transfekteeriti 1,5 ml ATG16L shRNA viirustega või 2,0 ml ATG16L üleekspresseerivate viirustega vastavalt tootja protokollile. Seejärel lülitati endoteelirakud ECM-i, mis sisaldas 2, 0 ml polübreeni, ja inkubeeriti veel 6 tundi. Tuvastasime viiruste nakatumise määra Nikon Eclipse 80i fluorestsentsmikroskoobiga (DS-Ri1, Nikon, Shanghai, Hiina). Stabiilsete viirusega nakatunud rakkude valimiseks kasutati puromütsiini (2 µg/ml; Gibco, Thermo Fisher Scientific). Seejärel koguti edasiste katsete jaoks HRGEC-d.

Statistiline analüüs

Statistiliseks analüüsiks kasutati GraphPad Prism 5.{1}} (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Tulemused väljendati keskmisena ± SD (keskmine ± SD) vähemalt kolmest sõltumatust katsest. Võrdlus mitme rühma vahel ja sees viidi läbi, kasutades ühesuunalist dispersioonanalüüsi, millele järgnes Student-Newman-Keulsi test. P väärtused<0.05 were="" considered="">

TULEMUSED

Histomorfoloogia ja patoloogia muutused mitte-CAD- ja CAD-patsientide neerukudedes

Selles uuringus näitas histoloogiline uuring hematoksüliin-eosiiniga (HE) ja Massoni trikroomvärvimine märkimisväärset neeru allotransplantaadi IF/TA-d CAD-ga patsientide kudedes (n=4) võrreldes meie keskusest stabiilse neerufunktsiooniga neerusiirdamisega patsientidega ( mitte-CAD-rühm, n=4) (joonised 1A, B). Materjalide ja meetodite näidiskogu ning tabelis 1 kirjeldatakse üksikasjalikku teavet algsete funktsioonide rühmitamiseks. Inimese neeru biopsia proovide immunohistokeemiline värvimine (IHC) näitas α-SMA ja fibronektiini (FN) kõrgemat ekspressiooni ning märkimisväärselt vähem CD31 ekspressiooni CAD rühmas (joonised 1C–H). CD31 on endoteelirakkude markervalk ja endoteelirakud kaotasid oma tunnuse CD31, kuid omandasid EndMT ilmnemisel mesenhümaalsed tunnused, nagu a-SMA, FN. Need tulemused näitasid, et EndMT-markerite ekspressioonid olid CAD-rühmades märkimisväärselt kõrgemad kui mitte-CAD-rühmades.

ATG16L tõusis pärast neerusiirdamist, kuid ATG16L oli CAD-patsientidel allareguleeritud võrreldes mitte-CAD-patsientidega

RNA-seq ja kliinilised andmed 25 CAD proovist ja 21 mitte-CAD patsiendi neerubiopsia koeproovist laaditi alla saidilt GSE9493. Andmebaasis sisalduv patsientide teave registreeriti Šveitsis Novartise biomeditsiiniuuringute instituutides ja töödeldi histopatoloogia jaoks. Histoloogiline diagnoos ja biopsia klassifikatsioon Banff '05 kriteeriumide alusel. Demograafilised ja kliinilised andmed on esitatud GEO andmebaasis (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc= GSE9493). Analüüside voo skemaatiline diagramm oli näidatud joonisel 2A. P-väärtusega ekstraheeriti 1463 olulist diferentsiaalset geeni<0.05. using="" the="" criteria="" for="" [log2="" fold="" change="" (log2fc)]=""> 1, we selected 92 up-regulated and 115 down-regulated differential genes from the CAD group compared to the non-CAD group (Figure 2B). Then we searched genes associated with autophagy in the GeneCards database. A total of 149 ARGs with a relevance score >7 valiti. CAD-i ja mitte-CAD-patsientide ARG-de hulka kuulus 14 ARG-d. Nende hulgas leidsime, et ATG16L, millel oli kõrgeima asjakohasuse skoori geen, oli CAD-proovides alla reguleeritud (joonis 2C).

Partiiefekti ja populatsiooni erinevuste vältimiseks viisime avaliku andmebaasi tulemuste kinnitamiseks läbi rea katseid, kasutades meie keskusest pärit inimproove. Esimeses komplektis värvisime normaalsete, mitte-CAD- ja CAD-i neeruproovide sektsioone ATG16L-vastase antikehaga ja näitasime, et ATG16L ekspressioon vähenes CAD-ga patsientidel oluliselt võrreldes mitte-CAD-rühmaga (joonis 2E). . Samale järeldusele jõuti Western blot (WB) testiga. FN suurenemine kujutas endast siirdatud neerude fibroosi ägenemist ja üht CAD näitajat. ATG16L WB tendents oli kooskõlas meie IHC plekkide kontrolli tulemustega ja kooskõlas GEO tulemustega (joonis 2D). Need viitasid sellele, et ATG16L ekspressioon vähenes CAD progresseerumisega. Pearsoni korrelatsioonianalüüsi läbiviimisel leidsime, et ATG16L-l oli tugev negatiivne korrelatsioon a-SMA, FN-valkude ekspressioonimustris ja positiivne korrelatsioon CD31 ekspressiooniga. 'r' tähistab Pearsoni korrelatsiooni väärtust ja P väärtused tähistavad korrelatsiooni olulisust (joonised 2F–I).

Autofagia oli CAD-patsientidel alareguleeritud ja MAP1LC3 prognoositud kehva prognoosi allareguleerimine CAD-patsientidel

Eelmises katses tuvastati GEO andmebaasist mitmed autofagiat reguleerivad ARG-d. Nende hulgas osaleb ATG16L autofagia varases etapis, me spekuleerime võimaluse üle, et autofagia võib olla seotud CAD-iga. Inimese neeru allotransplantaadi kudedes autofagia taseme uurimiseks leidsime esmalt transmissioonielektronmikroskoobi (TEM) abil CAD-rühmas vähem autofaagilisi vakuoole, võrreldes mitte-CAD-rühmaga (joonised 3A, B). Lisaks autofagia jälgimise kuldstandardile TEM peegeldavad SQSTM1 taseme langus ja LC3-II ekspressiooni suurenemine autofagia suurenemist. LC3-I (LC3 mittelipidatsioon), LC3-II (LC3 lipiidimine) ja SQSTM1 valgu ekspressioonitasemete sarnaseid suundumusi CAD rühmas kontrolliti WB testiga, nagu on näidatud joonistel. 3C, D. P62/SQSTM1 (SQSTM1) on selektiivne autofagia retseptor ja see laguneb autofagia toimel. Autofagosoomid on seotud LC3 tsütosoolse vormi lipidatsiooniga ja LC3-II moodustumisega. Seega viitasid WB tulemused ka autofagia esinemisele.

Mõned uuringud on näidanud, et neerutransplantaadiga patsientide seerumis esineb ARG-de erinevusi; Seerumi LC3 tase oli tõenäoliselt haiguse raskusastmega korrelatsioonis prognostiline näitaja (25, 26). Autofagia rolli edasiseks uurimiseks CAD protsessis uurisime ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) abil seerumi LC3 kontsentratsiooni 30 mitte-CAD ja 30 CAD patsiendil. Patsientide põhitunnuseid kajastavad demograafilised andmed on esitatud tabelis 1. Juhtumite arvu, patsiendi soo, patsiendi vanuse, paneelireaktiivsete antikehade (PRA), immunosupressiivse raviskeemi, neerufunktsiooni mitte-CAD ja CAD rühmade jaotus on näidatud. tabelis 1. Sugu, vanus ja PRA ei näidanud suuri erinevusi. Seerumi kreatiniini ja vere uurea lämmastiku (BUN) sisaldus kahe rühma vahel oli märkimisväärne erinevus. Seejärel püüdsime määrata autofagia prognostilist väärtust CAD patsientidel. Seerumi ELISA tulemuste põhjal leidsime, et LC3 ekspressioon oli CAD rühmas madalam. Samuti esines progresseeruv CAD ja samaaegne LC3 taseme langus (joonis 3E). Lisaks jagasime LC3 keskmise ellujäämise analüüsi põhjal kõrge ja madala ekspressiooniga rühmadeks, tulemused näitasid, et LC3 madala ekspressiooniga rühmal oli lühem allografti düsfunktsiooni aeg (joonis 3F). Üldiselt oletasime, et autofagia puudulikkusel oli märkimisväärne seos CAD progresseerumisega.

ATG16L alareguleerimine vähendas autofagiat ja soodustas EndMT progresseerumist

Et teha kindlaks, kas ATG16L on seotud autofagia muutumisega, transfekteerisime esmalt HRGEC-d ATG16L lühikese juuksenõela RNA-ga (shRNA). TEM-i kasutati autofagiliste vakuoolide moodustumise otseseks demonstreerimiseks ja leidsime, et ATG16L shRNA-ga transfekteeritud rakkudes on vähem autofagilisi vakuoole võrreldes rüselus-shNC-ga transfekteeritud rakkudega (joonised 4A, B). Nii ATG16L valgu ekspressioon kui ka autofagia aktiivsus olid samuti allareguleeritud ATG16L rühma kukutamisel võrreldes shNC rühmaga (joonis 4C).

Seejärel uuriti ATG16L-sõltuva autofagia rolli EndMT progresseerumisel. HRGEC-d transfekteeriti ATG16L shRNA või shNC-ga. Joonisel fig 4D on näidatud, et ATG16L shRNA transfektsioon võib märkimisväärselt hõlbustada FN ja a-SMA ekspressioone ja vähendada CD31 ekspressiooni võrreldes skrambleeriva shNC-transfekteeritud HRGEC-dega. Seevastu kui ATG16L oli HRGEC-des üleekspresseeritud, ei soodustanud EndMT progresseerumine märkimisväärselt (joonis 4E). IHC värvimise tulemused kinnitasid ka WB suundumusi CD31 ja a-SMA ekspressioonide osas HRGEC-des (joonis 4F).

Neerude interstitsiaalse fibroosi, uriini valgu, neerufunktsiooni ja ajast sõltuva endMT suurenemise muutused kroonilise hülgamisroti mudelis

Järgmisena uurisime muutusi neerude interstitsiaalses fibroosis, uriinivalgus, neerufunktsioonis ja EndMT-s in vivo. Rottidele siirdatud kroonilise äratõukereaktsiooni mudelid loodi neerusiirdamisega F344 rottidest Lewise rottidele. Neeru allotransplantaadid võeti 8., 12. ja 16. nädalal pärast neeru siirdamist. HE värvimise ja Massoni värvimise testid näitasid pärast neerusiirdamist erineva raskusastmega põletikuliste rakkude infiltratsiooni, glomeruloskleroosi, tubulaarset atroofiat ja interstitsiaalset fibroosi. Massoni värvimise tulemused näitasid ka 8., 12. ja 16. nädalal pärast neerusiirdamist glomerulaar- ja neerude interstitsiumis suurt hulka sinise värviga kollageenikiude, võrreldes syn-rühmaga (joonised 5A–C). Allogeense siirdamisega rottide neerufunktsiooni testimiseks eemaldati neerusiirdamise käigus natiivsed parempoolsed neerud. Neli nädalat pärast parema neeru resektsiooni halvenes 24-tunnine uriini valk ja neerufunktsioonid, sealhulgas seerumi kreatiniin ja BUN, järk-järgult kõigis rühmades kuni nende surmani (joonis 5D). IHC testi tulemused näitasid FN ja a-SMA kõrgeid ekspressioone, samas kui CD31 ekspressioon vähenes kõigis rühmades 16 nädala pärast (joonis 5E). Western blot test kinnitas immunohistokeemia testi tulemusi ja näitas, et EndMT progresseerumine intensiivistus pärast neerusiirdamise järgse aja pikenemist (joonis 5F).

Neeru siirdamine aktiveeris autofagia, kuid kahjustatud autofaagiline voog kroonilise hülgamisreaktsiooni hilises staadiumis rotimudeli

LC3, mida peetakse autofagia kindlaksmääratud markeriks, on autofagosoomide moodustumise ja autofaagilise voolu aktiveerimise jaoks kriitiline. Adeno-assotsieerunud viirus (AAV)-mRFP-GFP-LC3 süstiti roti neeru allografti in vivo stereotaktiliselt. Loome mRFP-GFP-LC3 mudeli, et jälgida autofagilist aktiivsust neerusiirdamisel. AAV-mRFP-GFP-LC3 kasutatakse tavaliselt autofaagilise voo jälgimiseks in vivo. GFP signaalil on suurem tundlikkus lüsosomaalse luumeni happeliste tingimuste suhtes kui mRFP. Seega näitasid autofagosoomid kollast fluorestsentsi GFP ja mRFP fluorestsentsi koos paiknemise tõttu ja autolüsosoomid näitasid punast fluorestsentsi. Punase fluorestsentsi suurenemine viitas autolüsosoomide kuhjumisele ja autofagia aktiveerumisele neerudes. Punase fluorestsentsi positiivsed alad suurenesid märkimisväärselt 4., 8., 12. ja 16. nädalal allo rühmas võrreldes syn-rühmaga. Punane puncta nõrgenes aga kiiresti pärast haripunkti saavutamist 8. ja 12. nädalal. Autofagia taseme muutusi täheldati peamiselt glomerulaarsetes ja perifeersetes väikestes veresoontes, mitte distaalsetes tuubulites või kogumiskanalis (joonised 6A, B). Need tulemused näitasid, et autofagia aktiveeriti neerusiirdamise varases staadiumis, kuid mitte hilises staadiumis, ja autofagosoomi kliirens oli umbes 8 nädala pärast kahjustatud. Immunohistokeemiline test näitas, et ATG16L ekspressioon oli 8 nädala jooksul kõrgem kui 16 nädala jooksul (joonis 6C). Western blot tulemused näitasid ka, et LC3-II ja ATG16L tasemed saavutasid haripunkti 8. nädalal ja langesid seejärel järk-järgult kuni 16. nädalani roti siirdamise järel (joonis 6D).

NF-kB rada aktiveeriti ja reklaamiti EndMT pärast ATG16L ekspressiooni katkestamist

Võttes arvesse seost ATG16L allareguleerimise ja EndMT vahel kroonilise äratõukereaktsiooni roti mudelis ja CAD haiguses, oletasime, et ATG16L kadumine võib otseselt viia EndMT progresseerumiseni. Selle progresseerumise võimaliku mehhanismi edasiseks uurimiseks teostasime esmalt ShNC või ShATG16L-ga HRGEC-des täieliku transkriptoomi sekveneerimise (RNA-seq). Kahe rühma vahel saadi kokku 453 diferentsiaalset geeni (DEG). Nende hulgas oli 358 kraadi ülesreguleeritud ja 95 alla reguleeritud (joonis 7A). Seejärel valiti KEGG rikastamisega märkimisväärselt 20 rada. Leidsime, et NF-kB rada oli üks märkimisväärselt aktiveeritud radadest (joonis 7B). NF-kB raja geenide ülesreguleerimist kinnitas ka geenikomplekti rikastamise analüüs (GSEA) (joonis 7C).

NF-kB on põletikuliste signaaliradade üks olulisemaid transkriptsioonifaktoreid ja NF-kB translokeerub aktiveerimisel tsütoplasmast tuuma. NF-kB aktiveerimise ja tuuma translokatsiooni kinnitamiseks teostasime immunofluorestsentsvärvimise testi, kasutades anti-p65 antikeha ja leidsime, et p65 ja tuumavärv olid kolokaliseeritud, mis näitas tuuma translokatsiooni (joonis 7D). Lisaks avastasime, et QNZ, NF-kB signaaliraja inhibiitor, inhibeeris märkimisväärselt NF-kB ekspressiooni tuumas ja muutis ATG16L katkestamisest põhjustatud EndMT-ga seotud valkude ekspressioonid (joonis 7E).

NF-kB raja aktiveerimise spetsiifilise mehhanismi kontrollimiseks viidi läbi ka WB test. Me tuvastasime p65 (kokku NF-kB) ja p-p65 (fosforüülitud NF-kB) kvantifitseerimise HRGEC-des. WB tulemused näitasid, et p65 tase tõusis ShATG16L rühmas võrreldes ShNC rühmaga, samas kui p-p65 järgis sarnast tõusutrendi (joonis 7F). P-p65 taseme tõus HRGEC-des pärast ATG16L katkestamist kaasnes p65 valgu koguekspressiooni suurenemisega, mis tõenäoliselt peegeldas täiendavat mõju p65 ekspressioonile HRGEC-des. Et tuvastada, kas NF-kB stabiliseerumine on tingitud lagunemise vähenemisest või suurenenud sünteesist, lisati rakkudele valgusünteesi inhibiitorit tsükloheksimiid (CHX), et inhibeerida valgusünteesi ja analüüsiti NF-kB valgu taset. Western blot tulemused näitasid, et p65 valgu ekspressioon jätkub CHX juuresolekul (joonis 7G). Samal ajal ei muutnud ShATG16L NF-kB mRNA taset veel oluliselt. NF-kB mRNA tasemete kvantitatiivsed andmed on graafiliselt näidatud joonisel fig 7H. See viitas sellele, et NF-KB tuuma translokatsioon oli tingitud lagunemise vähenemisest, mitte suurenenud sünteesist pärast ATG16L katkestamist HRGEC-des. NF-kB ekspressiooni täiendavaks kinnitamiseks inimkoes teostasime saavutatud inimese neeru allotransplantaadi kudedega immunofluorestsentsvärvimise testi ja leidsime, et CAD-patsiendi neeru allotransplantaatides p65 ekspressioonitase on oluliselt suurenenud (joonised 7I, J).

NF-kB raja aktiveerimise indutseeritud tsütokiinide sekretsioon, sealhulgas IL-1b, IL-6 ja TNF-a, võivad stimuleerida EndMT progresseerumist HRGEC-des

NF-kB signaalimine on põletikulise vastuse peamine regulaator. Seejärel uurisime RT-PCR abil lahustuvaid tegureid, mis vastutavad shATG16L-indutseeritud EndMT eest. Mitmetest tsütokiinidest, mis on olulised autofagia defektide ja põletikulise vastuse jaoks, olid IL-1b, IL-6 ja TNF-a, tüüpilised NF-kB raja poolt indutseeritud allavoolu põletikulised tegurid, märkimisväärsed. kõrgenenud võrreldes shNC-ga transfekteeritud HRGEC-dega autofagia aktiivsuse kahjustuse ajal (joonis 8A). See on kooskõlas meie varasemate leidudega põletikuliste tegurite kohta, nagu TNF-a roti seerumi suurenemine koos kroonilise äratõukereaktsiooniga (27).

IL{{0}}b, IL-6 ja TNF-a poolt stimuleeritud EndMT patogeneesi uurimiseks töödeldi HRGEC-e erinevate IL-1b kontsentratsioonidega ({{ 7}}~20 ng/mL), IL-6 (0~200 ng/mL) ja

TNF-a ({{0}}~20 ng/mL) 24 tunni jooksul. Kõik IL-1b, IL-6 ja TNF-a võivad FN ja a-SMA valgu taset ülesreguleerida, vähendades samaaegselt endoteelirakkude markerite CD31 annusest sõltuvat langust. Need toimed saavutasid haripunkti, kui HRGEC-sid töödeldi vastavalt 10 ng/ml IL-1b, 200 ng/mL IL-6 või 10 ng/ml TNF-a-ga (joonis 8B). EndMT seotud avaldiste kinnitamiseks viidi läbi ka ajasõltuvuste katsed. Nagu on näidatud joonisel 8B, võib 0–48-tunnine ravi IL-1b, IL-6 või TNF-a-ga märkimisväärselt esile kutsuda FN- ja a-SMA ekspressioone ning viia CD31 kadumiseni HRGEC-des. stiimuli aeg pikeneb. Et testida IL-1b, IL-6 ja TNF-a mõju EndMT-le, alustati ATG16L kukkumisel ravi Anakinra, Tocilizumabi ja Infliksimabiga. Anakinra on interleukiini-1 retseptori (IL-1R) antagonist. Totsilizumab on IL-6R-i neutraliseeriv antikeha, mis blokeerib IL-6 seondumist IL-6R-ga. Infliksimab on monoklonaalne IgG1 antikeha, mis seondub spetsiifiliselt TNF-a-ga ja on TNF-a inhibiitor, mida on edukalt kasutatud põletikulise soolehaiguse ravis. WB tulemused näitasid, et Anakinra ja Infliksimab võivad EndMT-d märgatavamalt vähendada (joonis 8C). Need tulemused viitasid sellele, et ATG16L kadu ei vähendanud mitte ainult autofagia aktiivsust, vaid soodustas ka põletikuliste tsütokiinide IL-1b, IL-6 ja TNF-a sekretsiooni, pärssides p65 lagunemist, et aktiveerida NF- kB rada (joonis 8D).

ARUTELU

Selles uuringus näitasime, et neerusiirdamine kahjustas autofagilist voogu, mis oli seotud põletikulise vastuse (EndMT) suurenemisega ja neerude allograftide interstitsiaalse fibroosi raskusastmega. Kuigi autofagiline aktiivsus oli ajutiselt suurenenud allografti siirdamise varases staadiumis, vähenes see järk-järgult ATG16L kadumise tõttu. ATG16L-sõltuv autofagia kui tsütoprotektiivne protsess võib nõrgendada siirdatud neeru interstitsiaalset fibroosi, reguleerides IL-1b, IL-6 ja TNF-a poolt indutseeritud EndMT. Meie teadmiste kohaselt on see esimene uuring, mis selgitab autofagilise voo rolli ja dünaamilist muutust neerusiirdamisel. Selles uuringus uurisime ka molekulaarseid patofüsioloogilisi üksikasju, mis on aluseks sellele, kuidas autofagilise voolu kahjustus põhjustab EndMT ja neeru allotransplantaadi interstitsiaalset fibroosi.

Kuigi mitut tüüpi uuringud on teatanud, et autofagia on seotud neerude interstitsiaalse fibroosi tekke ja progresseerumisega, ei ole ARG-sid põhjalikult analüüsitud, et uurida nende kliinilist väärtust kroonilise neerutransplantaadi äratõukereaktsiooni progresseerumisel. Autofagia protsessiga on seotud sadu valke. Arvestades autofagia tähtsust neerusiirdamisel, on mõistlik oletada, et ARG-del on prognostilise prognoosimise ja terapeutiliste sihtmärkide osas palju lubadusi. CAD-i algsete patogeneetiliste tegurite uurimiseks profileerisime GSE9493 kohordis 149 ARG-i mRNA ekspressioonid ja analüüsisime rõhutatult 14 ARG-d, mis olid kõige enam seotud autofagiaga CAD-i ja mitte-CAD-patsientide vahel. CAD-rühma allareguleeritud ARG-de hulgas olid CAD-rühmas autofagia negatiivsed regulatoorsed geenid, nagu Raptor ja MAPK3 (28, 29). Teisest küljest oli ATG16L ülesreguleeritud ARG-na LC3 lipidatsiooni karkass, lokaliseerides dünaamiliselt oletatavatele lähtemembraanidele ja soodustades autofaagiliste vakuoolide moodustumist (30). Mõned uuringud on siiski näidanud, et ATG16L ei olnud isolatsioonimembraani pikendamiseks vajalik (23). Seetõttu uuriti seost ATG16L ja EndMT autofagiast sõltumatu või autofagiast sõltuva rolli vahel.

ATG16L, autofagia ja EndMT vahelise seose uurimiseks siirdatud neerudes lõime HRGEC-des shRNA-ga maha ATG16L. Meie leiud näitasid, et shATG16L võib vähendada autofagia taset ja indutseerida EndMT. Sarnaselt näitasid in vivo uuringud ja kliinilised proovid, et ATG16L ja autofagilise voolu aktiveerimine neerusiirdamise varases staadiumis vähenes autofagiline voog dünaamilises vahemikus, kuna fibrootilised muutused suurenesid. Võib järeldada, et EndMT progresseerumise põhjus on tõenäoliselt tingitud autofaagilise voo vähenemisest ja ATG16L-sõltuv autofagia mängib EndMT ja neerude allotransplantaadi interstitsiaalse fibroosi progresseerumisel kaitsvat rolli. Kuid mõned leiud näitasid, et rapamütsiini poolt indutseeritud autofagia viis anoksilistes tingimustes HCAEC-des EndMT aktiveerumiseni (22). Tundub, et need erinevad meie tulemustest. Leiame, et autofagia roll võib erinevates rakutüüpides olla erinev. See võib sõltuda raku kontekstist ja ülesvoolu reguleerivatest teguritest. Arvestades, et ATG16L-sõltuv autofagia on enesekaitsevahend, kui EndMT esineb CAD-is, on mõttekas määrata shATG16L-indutseeritud EndMT spetsiifiline mehhanism.

Teostasime järgmise põlvkonna sekveneerimise HRGEC-des ATG16L knockdowni ja kontrollrühma rühmast. KEGG rajad ja GSEA analüüs näitasid, et NF-kB rada oli üks enim rikastatud radu. NF-kB seondub tavaliselt IkB-ga, mis stabiliseerib NF-kB tsütoplasmas. Kui NF-kB rada on aktiveeritud, translokeerub NF-kB heterodimeer p65 tuuma ja seondub selle spetsiifilise promootoriga (31). Üks NF-KB tuuma translokatsiooni kanoonilistest (klassikalistest) radadest on p65 fosforüülimine. Siiski on erinevate haiguste puhul teatatud mittekanooniliste radade arvu suurenemisest. Samuti on teatatud, et allasurutud p62/SQSTM{13}}vahendatud selektiivne autofagia võib vähendada NF-kB raja lüsosomaalset lagunemist (32), autofagia defekt põhjustab ka NF-kB aktivatsiooni, kuna SQSTM1 ekspressioon on püsiv, mis omakorda soodustab tuumorigenees hiiremudelites (33). Meie uuringus täheldasime p65 ja p-p65 valgu taseme tõusu, samas kui mRNA tase ei muutunud. Valgusünteesi inhibiitori CHX juuresolekul jätkub p65 valgu akumuleerumine võrreldes inhibiitori puudumisega. Seetõttu spekuleerisime, et ATG16L katkestamisest indutseeritud NF-KB aktivatsioon tulenes valgu vähenenud lagunemisest ja see protsess võib olla autofaagilisest sõltuvast lagunemise pärssimisest.

Põletikud on tihedalt seotud neerusiirdamise oluliste tagajärgedega kliinilisel ja terapeutilisel tasemel (34). NF-kB p65 on rakuliste põletikuliste tegurite reguleerimise kõige olulisem transkriptsioonifaktor. Selles uuringus avastasime ka, et ATG16L mahalöömine suurendas tsütokiini IL-1b, IL-6 ja TNF-a NF-kB raja kaudu. See ja teised leiud ühtivad paljude teiste uuringutega, näiteks nendega, mis jõudsid järeldusele, et ATG16L kadumine suurendas endotoksiini poolt indutseeritud IL{10}}b tootmist (35) ja TNFAIP3/A20 seob ATG16L1, et kontrollida autofagilist vastust, NF-kB. aktiveerimine (36). Lisaks on mõnes varasemas uuringus teatatud põletikuliste tsütokiinide rollist EndMT-s. Sellegipoolest on tõenäoline, et need põletikulised tsütokiinid mängivad erinevat rolli sõltuvalt aluseks olevast patoloogiast ja selle ümbritsevast tasemest. Dieedist põhjustatud rasvumise hiiremudelis indutseeris endoteeli autofagia puudulikkus IL6--sõltuva EndMT (37). Veresoonte kaltsifikatsioonihaiguse korral indutseerisid IL-1b ja TNF-a inimese primaarsetes aordi endoteelirakkudes EndMT (38). Meie tulemused skriiniti ja tuvastasid IL-1b, IL-6 ja TNF-a kui EndMT-i põletikulisi tsütokiine CAD patoloogilises keskkonnas. Sellega uuriti ATG16L kaotuse ja põletikuliste tsütokiinide vahelisi vastastikuseid seoseid, et rõhutada võimalikke terapeutilisi sihtmärke, et kontrollida ATG16L kadu CAD progresseerumisel.

Meie uuringul on mitmeid piiranguid. Praegune ATG16L mõju EndMT-le ja fibroosi progresseerumisele valideerimine viidi läbi ainult knockdown-rakuliini mudelis, autofagia muutuste keerukust in vivo ja CAD-i arengus on vaevalt võimalik jäljendada ning see rõhutab vajadust endoteeli ATG16L tingimusliku knockout-hiirte järele. . Me loome ATG16L knockout hiire neerusiirdamise mudeli edasiseks mehhanismi uurimiseks. Meie tulemused näitasid, et ATG16L ja autofagia kadumine soodustas EndMT, QNZ inhibeeris NF-kB aktivatsiooni ja IL-1b, TNF-a monoklonaalne antikeha antagoniseeris spetsiifilisi retseptoreid, aeglustades seeläbi allografti fibrootilist protsessi, kuid see ei saanud täielikult muuta see tulemus vastupidiseks. Kas teised mehhanismid mängisid sarnast rolli, jääb teadmata. Lisaks endoteelirakkudele on müofibroblastide allikaks mitmesugused rakud, sealhulgas epiteel-, fibroblastid ja peritsüüdid (39). See, kas ATG16L kadu ja autofagia puudulikkus neid rakke mõjutavad, on endiselt ebaselge.

Kokkuvõttes näitasid praegused uuringud, et ATG16L pärssimine oli siirdatud neeru interstitsiaalse fibroosi progresseerumisel ülioluline IL-1b, IL-6 ja TNF‐a poolt indutseeritud autofaagilise voolu ja EndMT moodustumise kahjustamiseks. . Seda funktsiooni vahendas NF-kB, mis vähendas lagunemist ja raja aktiveerimist. Kokkuvõttes annavad meie uuringu tulemused uudse ülevaate autofagilise voolu ja EndMT dünaamilisest seosest. ATG16L kadumise ja autofagia voo inhibeerimise vältimine võib olla uus võimalus neerude interstitsiaalse fibroosi ja CAD raviks ja progresseerumise ennetamiseks neeru siirdatud retsipientidel.

Cistanche vars hoiab ära neeruhaiguse, proovi saamiseks klõpsake siin

ANDMETE KÄTTESAADAVUSE AVALDUS

Selle artikli järeldusi toetavad algandmed teevad autorid ilma liigsete reservatsioonideta kättesaadavaks.

EETIKAAVALDUS

Inimestest osavõtjatega seotud uuringud vaatas läbi ja kiitis heaks Nanjingi meditsiiniülikooli esimese sidushaigla kohalik eetikakomitee. Patsiendid/osalejad andsid oma kirjaliku teadliku nõusoleku selles uuringus osalemiseks. Loomkatse vaatas läbi ja kiitis heaks Nanjingi meditsiiniülikooli esimese sidushaigla kohalik eetikakomitee. Omanikelt saadi nende loomade osalemiseks selles uuringus kirjalik teadlik nõusolek.

AUTORI KAASALAD

RT ja MG juhendasid ja mõtlesid projekti välja. ZG, CS ja ZW kavandasid ja viisid läbi enamiku katsetest. MZ ja SF kogusid rottide proovid. LS, HC, ZH, JT, XJ ja HY analüüsisid andmeid. ZG ja ZW tegid figuurid. ZG ja RT koostasid ja muutsid paberi. Kõik autorid panustasid artiklisse ja kiitsid esitatud versiooni heaks.

RAHASTAMINE

Seda tööd on toetanud Hiina riiklik loodusteaduste sihtasutus [toetusnumbrid 82070769, 81870512, 81770751, 81570676, 81470981, 81100532].

VIITED

1. Carney EF. Siirdamine: ellujäämise kasu diabeediga surnud doonorneeru vastuvõtmisest. Nat Rev Nephrol (2017), 13(8):444. DOI: 10.1038/nrneph.2017.88

2. El-Husseini A, Aghil A, Ramirez J, Sawaya B, Rajagopalan N, Baz M jt. Neerusiirdamise tulemused esmase, korduva ja neeru-järgse mitterenaalse tahke elundi siirdamise korral: 15-hiljutise UNOS-i andmebaasi aastaanalüüs. Clin Transplant (2017) 31(11). DOI: 10,1111/ctr.13108

3. Schinstock CA, Stegall M, Cosio F. Uued arusaamad kroonilisest antikehade poolt vahendatud äratõukereaktsioonist ja selle progresseerumisest siirdamise glomerulopaatiaks. Curr Opin Nephrol Hypertens (2014), 23 (6): 611–8. doi: 10,1097/MNH. 0000000000000070

4. Goldberg RJ, Weng FL, Kandula P. Äge ja krooniline allotransplantaadi düsfunktsioon neerusiirdamise saajatel. Med Clin North Am (2016) 100 (3): 487–503. doi: 10.1016/j.mcna.2016.01.002

5. Wang Z, Han Z, Tao J, Wang J, Liu X, Zhou W jt. TGF-beeta1 poolt indutseeritud endoteeli-mesenhümaalse ülemineku roll siirdatud neeru interstitsiaalses fibroosis. J Cell Mol Med (2017) 21 (10): 2359–69. doi: 10.1111/ hüpata.13157

6. An C, Jia L, Wen J, Wang Y. Luuüdist pärinevate fibroblastide sihtimine neerufibroosi jaoks. Adv Exp Med Biol (2019) 1165:305–22. doi: 10.1007/978-981- 13-8871-2_14

7. Cruz-Solbes AS, Youker K. Epiteeli üleminek mesenhümaalseks (EMT) ja endoteeli üleminek mesenhümaalseks (EndMT): roll ja tagajärjed neerufibroosi korral. Tulemused Probl Cell Differ (2017) 60:345–72. doi: 10.1007/978- 3-319-51436-9_13

8. Yang J, Antin P, Berx G, Blanpain C, Brabletz T, Bronner M jt. Juhised ja määratlused epiteeli-mesenhümaalse ülemineku uurimiseks. Nat Rev Mol Cell Biol (2020) 21(6):341–52. doi: 10,1038/s41580-020-0237-9

9. Zeisberg EM, Potenta SE, Sugimoto H, Zeisberg M, Kalluri R. Neerufibroosi fibroblastid tekivad endoteeli-mesenhümaalse ülemineku kaudu. J Am Soc Nephrol (2008) 19 (12): 2282–7. doi: 10.1681/ASN.2008050513

10. Di Gregorio J, Robuffo I, Spalletta S, Giambuzzi G, De Iuliis V, Toniato E jt. Epiteeli-mesenhümaalseks üleminek kui võimalik terapeutiline sihtmärk fibrootiliste häirete korral. Front Cell Dev Biol (2020) 8:607483. doi: 10.3389/ langes.2020.607483

11. Kardinal H, Dieude M, Hebert MJ. Endoteeli düsfunktsioon neerusiirdamisel. Front Immunol (2018) 9:1130. DOI: 10.3389/fimmu.2018. 01130

12. Zhao Y, Cooper DKC, Wang H, Chen P, He C, Cai Z jt. Põletikueelsete tsütokiinide (IL-6, TNF-alfa ja IL-17) potentsiaalne patoloogiline roll ksenotransplantatsioonis. Xenotransplantation (2019) 26(3):e12502. doi: 10.1111/Xen.12502

13. Zhao C, Xu Z, Wang Z, Suo C, Tao J, Han Z jt. Kasvaja nekroosifaktor-alfa roll epiteeli-mesenhümaalsel üleminekul siirdatud neerurakkudes kroonilise allografti düsfunktsiooniga retsipientidel. Gene (2018) 642:483–90. DOI: 10.1016/j.gene.2017.11.059

14. Zhang B, Niu W, Dong HY, Liu ML, Luo Y, Li ZC. Hüpoksia kutsub esile endoteeli mesenhümaalse ülemineku kopsuveresoonte remodelleerumisel. Int J Mol Med (2018) 42 (1): 270–8. doi: 10.3892/ijmm.2018.3584

15. Li J, Zhang Q, Ren C, Wu X, Zhang Y, Bai X jt. Madala intensiivsusega impulss-ultraheli takistab inimese aordi endoteelirakkudes oksüdatiivsest stressist põhjustatud endoteeli-mesenhümaalset üleminekut. Cell Physiol Biochem (2018), 45 (4): 1350–65. doi: 10.1159/000487561

16. Guan Q, Nguan CY, Du C. Transformeeriva kasvufaktori beeta1 ekspressioon piirab neeruisheemia-reperfusioonikahjustust. Siirdamine (2010) 89(11):1320–7. doi: 10.1097/TP.0b013e3181d8e9dc

17. Levine B, Kroemer G. Autofagia geenide bioloogilised funktsioonid: haiguse vaatenurk. Cell (2019) 176 (1-2): 11–42. DOI: 10.1016/j.cell.2018.09.048

18. De Rechter S, Decuypere JP, Ivanova E, van den Heuvel LP, De Smedt H,

Levtšenko E jt. Autofagia neeruhaiguste korral. Pediatr Nephrol (2016) 31 (5): 737–52. doi: 10,1007/s00467-015-3134-2

19. Li H, Peng X, Wang Y, Cao S, Xiong L, Fan J jt. Atg5-vahendatud autofagia puudulikkus proksimaalsetes tuubulites soodustab rakutsükli G2/M seiskumist ja neerufibroosi. Autofagia (2016) 12(9): 1472–86. doi: 10.1080/ 15548627.2016.1190071

Baisantry A, Bhayana S, Rong S, Ermeling E, Wrede C, Hermann J jt. Autofagia kutsub esile prosenseerivad muutused proksimaalsetes torukujulistes S3 segmentides. J Am Soc Nephrol (2016), 27 (6): 1609–16. doi: 10.1681/ASN.2014111059