Neerude selge pildistamine ja kvantifitseerimine 3D-s
Feb 27, 2022
Aastakümneid, mõõtmisedneerud2-mõõtmelisi sektsioone kasutav mikroanatoomia on andnud meile üksikasjalikud teadmised neerud morfoloogia füsioloogilistes ja patoloogilistes tingimustes. Kudede puhastamise meetodite kiire areng viimastel aastatel koos uudsete 3-dimensioonilise pildistamise meetodite väljatöötamisega on aga andnud uusi teadmisineerudstruktuur ja funktsioon. See ülevaateartikkel kirjeldab mitmesuguseid uudseid teadmisineerudnende uute metoodiliste lähenemisviiside abil hiljuti saadud areng ja haigus. Näiteks arenevasneerudneed lähenemisviisid on andnud uusi arusaamu kusejuhade hargnemise morfogeneesist, nefroni eellasrakkude proliferatsioonist ja seotusest, kusitiotsa rakkude ja nefroni eellasrakkude vastastikmõjudest ning nefronite segmentatsiooni loomisest. Tervel täiskasvanud hiirelneerud, võib kudede puhastamine koos valguse lehtmikroskoopiaga pildistada ja kvantifitseerida glomerulite koguarvu, mis on selles valdkonnas oluline läbimurre. Sarnased lähenemisviisid on andnud uusi teadmisi neerude veresoonkonna struktuurist ja innervatsioonist, tubulointerstitsiaalsest remodelleerumisest, podotsüütide kadumisest ja hüpertroofiast, tsüstide moodustumisest, rakuliste poolkuude arengust ja glomerulaarfiltratsiooni barjääri struktuurist. Veel palju edusamme selle mõistmiselneerudbioloogiat ja patoloogiat võib eeldada, kuna rohkem uurijaid on välja töötanud ja kasutusele võtnud täiendavaid puhastus- ja pildistamistehnikaid.
Märksõnad:3D-pildistamine; glomerulus; neerude areng; nefropatoloogia; kudede puhastamine; torukesed; neeru-
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU FUKTSIOONI
Nefronite koguarv igas normaalses inimesesneerudulatub ligikaudu 200,000 kuni enam kui 2 miljonini, 1 keskmiselt ligikaudu 1 miljon. Need nefronid ja ka muud komponendidneerudsealhulgas kogumiskanalid, veresooned, interstitsiumid ja närvikiud on paigutatud suurepärase mikroanatoomilise täpsusega. 2 See täpne muster toetab normaalsetneerufunktsioonja tervis, mis võib olla tõsiselt häiritud, kui koe arhitektuur on muutunud glomerulaarse või tubulaarse hüpertroofia või kahanemise, nefroni kaotuse, kaasasündinud kõrvalekallete, veresoonte hõrenemise ja interstitsiaalse fibroosi tõttu. Mitmed pildistamisviisid on aidanud kaasa meie igakülgsele arusaamiseleneerudmikroanatoomia arengu ajal ning tervel ja haigel täiskasvanulneerud. Enamasti on see arusaam saadud 2-mõõtmeliste (2D) lõikude analüüsist, olgu need siis valgus- või elektronmikroskoopilised füüsilised lõigud või konfokaalsed optilised lõigud. Selle mikroanatoomia kvantifitseerimine on enamasti sõltunud sektsioonide stereoloogilistest analüüsidest, mis on andnud hinnanguid glomerulite, tuubulite, veresoonte, interstitsiumide ja nende rakuliste komponentide arvu, pikkuste, pindalade ja mahtude kohta. 3,4 Kuni viimase ajani 3D visualiseerimineneerudmikrostruktuur piirdus suuresti konfokaalse mikroskoopiaga, mis võimaldab optilist sektsiooni ja 3D-rekonstrueerimist kuni 50–80 m m sügavusele. Kahjuks hajutavad koes sisalduvate valgu- ja lipiidikomponentide murdumisomadused valgust ja vähendavad järsult pildikvaliteeti, kui sügavus suureneb. Viimastel aastatel on välja töötatud terve rida puhastusmeetodeid koe lipiidide ja pigmendisisalduse eemaldamiseks ning koe ja kinnitusmeediumi murdumisomaduste sobitamiseks, et muuta kude läbipaistvaks. 5 Puhastusmeetodite keerukus ulatub koe inkubeerimisest erinevates lahustes tundide jooksul kuni pikendatud protseduurideni, mis hõlmavad kohandatud elektrokeemilisi seadmeid. Juhime lugejad praeguste meetodite üksikasjaliku ülevaate saamiseks hiljutiste ülevaadete 5, 6 juurde ning konkreetsete meetodite ja kasutusjuhtude kohta siin viidatud paberitele.
Subtsellulaarseid struktuure ja terveid rakupopulatsioone saab lahutada puhastatud tervetes elundites või paksudes osades. Puhastatud koe täpsete pildistamisfunktsioonide jaoks on vaja spetsiaalseid mikroskoope ja pilditöötlust, et koguda ja rekonstrueerida proovide mahuandmeid, mille suurus võib ulatuda sadadest mikronitest kuni sentimeetriteni. Punkt skaneerivaid ja pöörlevaid ketta konfokaalseid mikroskoope on tõhusalt kasutatud tühjendatud objektide pildistamiseksneerudkoe, kuid kannatavad Z-telje eraldusvõime vähenemise ja fluorestsentsi intensiivsuse järkjärgulise vähenemise tõttu sügavusel ühe valgustuse ja pildistamise telje tõttu. Valguslehtmikroskoopia tehnikad sobivad eriti hästi puhastatud kudede pildistamiseks, kuna need võimaldavad kiiresti omandada suuri 3D-mahtusid ning võivad hõlmata mitmenurga valgustamist ja pildistamist. Optiline projektsioontomograafia on veel üks lähenemisviis, mis hõlmab mitme nurga kujutist ja digitaalset rekonstrueerimist, et saada andmeid, milles iga voksli X-, Y- ja Z-telg on sama eraldusvõimega. Sõltumata konkreetsest lähenemisviisist pakuvad kudede puhastamine ja kogu mount pildistamine uue võimaluse uurida kaardistamata raku mikrokeskkondi ja kõrgemat järku koe struktuuri. Selles ülevaates toome esile mõned uued arusaamadneerudareng, täiskasvanuneerudstruktuur ja patoloogia, mis on tingitud kudede puhastamisest, millele järgnes 3D-kvantitatiivne analüüs.
Uued arusaamad neerude arengustAastakümneid kestnud geeniekspressiooni profiilide koostamise ja väljalülitamise uuringud on viinud imetajate kontrolli all olevate rakutüüpide, geeniregulatsioonivõrkude ja signaaliradade üksikasjaliku mõistmiseni.neerudarengut. Need teadmised aitasid kaasasündinud haiguse diagnoosimisel ja võimaldasid tootaneerudrakutüübid pluripotentsetest tüvirakkudest. 7 Kuid arenduse suurus, läbipaistmatus ja keerukusneerudkujutas endast olulist takistust selle organi morfogeneesi ja selles sisalduvate rakkude ja valkude 3D-jaotuse täpseks mõõtmiseks. Kudede puhastamise ja mitmemõõtmelise pildistamise rakendamineneerudon võimaldanud visualiseerida ja kvantitatiivselt analüüsida kusejuhade hargnemise morfogeneesi, eellasrakkude populatsioone ja nefronite kogust tervetes elundites (joonis 1). 8 Need lähenemisviisid toetavad uut täpsuse fenotüüpimise võimet ja avavad võimalusi analüüsida rakulisi ja molekulaarseid tegureid.neerudareng ja kaasasündinud haigus.
Hargnevate morfogeneesi kujutamine ja analüüs 3D-s.Kusejuhapuu rajamine on selle määravaks tunnuseksneerudarengut ja seda on põhjalikult uuritud hiire geneetika abil ja lamestatudneerudeksplanteerida kultuure. Kuid selleks, et mõista, kuidas üksikud geenid aitavad kaasa selle hargnenud epiteeli kanali struktuuri kasvule, vormile ja mustrile in vivo, oli vaja seda keerulist võrku pildistada ja analüüsida paljudes proovide suurustes. Short et al. 8 käsitles neid probleeme, kasutades kogu immunofluorestsentsi, lahustipõhist puhastamist (bensüülalkoholi bensoaat) ja tervete elundite pildistamist optilise projektsioontomograafiaga. Selle lähenemisviisi kasutamine 3D-hetktõmmiste jäädvustamiseks varasest keskpaiganineerudarendustöö käigus töötas meeskond välja kohandatud analüüsitarkvara, et saada enneolematuid üksikasju kuseteede puu kohta, sealhulgas tipu number, okste nurgad ja pikkus, okste maht ja tervete kuseteede puude hargnemise põlvkondade arv (joonis 1c ja d). 8 Algselt kasutati neerude hargnemise uudsete aspektide iseloomustamiseks ja tuvastamiseks, 910 käimasolevate jõupingutustega püütakse määratleda põhimõtted ja peamised regulaatorid, mis reguleerivad harude mustrit in vivo. 1
Eellasdünaamika sidumine elundi morfogeneesiga mitmetasandilise pildistamise abil.Molekulaarsed interaktsioonid kusejuhade ja nefroni eellasrakkude vahel mängivad olulist rolli nefronite komplemendi loomisel, mis hõlbustab nefronite moodustumist.neerufunktsioontäiskasvanueas. Indutseerimata nefroni eellased toodavad tegureid, mis soodustavadneerudkasv kusejuha hargnemise kaudu, samas kui ruumiliselt piiratud märguanded kusejuha otsas säilitavad nii nefroni eellasseisundi kui ka indutseerivad nende eellaste alamhulga diferentseerumist varajaseks nefroniks. Need interaktsioonid juhivad hargnemise ja nefroni induktsiooni tsüklit, mis lakkab sündides, kui ülejäänud nefroni eellased diferentseeruvad. Enne kudede puhastamise meetodeid oli meie arusaamine dünaamikastneerudmorfogenees ja eellasrakkude populatsioonide suhteline arvukus aja jooksul oli tõsiselt piiratud. See muutus koos mitmemõõtmeliste kuvamismeetodite väljatöötamisega, mis kasutasid kvantifitseerimiseks laiendatud immunofluorestsentsprotokolle, kudede puhastamist ja pildistamismeetodeid.neerudareng raku (konfokaalne) ja kogu elundi tasandil (optiline projektsioontomograafia, valgusleht). 9,10 Selgus, et määradneerudkasv varieerub dramaatiliselt, kuna algselt kiire hargnemis- ja proliferatsioonikiirus väheneb faasides, mis on korrelatsioonis nefrogeense niši eellasrakkude arvu vähenemisega. 10 Puhastatud terve inimese loote kolmemõõtmeline konfokaalne kujutisneerud(11. nädal) või proovidneerudcortex (nädalad 11–23) kinnitavad, et see niši suuruse vähenemine on liikide lõikes säilinud. 12 Inimese ja hiire nefrogeense niši täiendav võrdlev analüüs puhastatud koes viis uudse ajapõhise nefroni moodustumise värbamismudelini, kus eellasrakud lisatakse järk-järgult varasele nefronile ja omandavad segmendi identiteedi vastavalt nende saabumise järjekorrale. . 13 Teises uuringus, mis keskendus nefroni eellasrakkude sidumisele, kasutati hüdrogeelil põhinevat kudede puhastamise meetodit (passiivne selge lipiidiga vahetatud akrüülamiidiga hübridiseeritud jäik kujutis/immunovärvimine/in situ hübridisatsiooniga ühilduv koe-hüdrogeel [CLARITY] 14 ). võime säilitada endogeense tdTomato reporteri fluorestsentsi. TdTomato-märgistuse analüüs puhastatud koes näitas, et varakult siduva nefroni rakud võivad naasta eellasseisundisse, kus varasemad tulemused näitasid, et pühendumine oli ühesuunaline. 15 Seega on kudede puhastamine parandanud meie arusaamist dünaamilistest arenguprotsessidest skaalade ja liikide lõikes.
Täpne fenotüüpimine. Kudede puhastamise ja kvantitatiivse analüüsi edusammud on võimaldanud uue täpsuse fenotüüpimise võime. Peente fenotüüpidega hiiremudelites nagu Ret þ/? ja Six2 þ/? hiired (joonis 2), mis olid varem klassifitseeritud "normaalseteks". 10,16 Kõrge eraldusvõimega konfokaalne kujutis puhastatud Wnt11 ?/?neerudtuvastas uudse raku fenotüübi, kus nefroni eellased näivad olevat organiseerimata, kuna nad ei suuda moodustada stabiilseid rakulisi kinnitusi kusejuha otsaga ja enneaegselt diferentseeruda. 17 Neid meetodeid on kasutatud ka selleks, et kvantifitseerida, kuidas mõjutavad uued nefroni eellasrakkude oleku regulaatorid, nagu DNA metüültransferaas 1, mikroRNA-d Lin28 ja Let7 ning TSC1.neerudareng ja nefronite arv. 18–20 Täpne fenotüüpimine muutub tõenäoliselt oluliseks vahendiks meie püüdlustes mõista geneetiliste ja keskkonnategurite aditiivset mõju, mis aitavad kaasa madalale nefronite arvule ja eelsoodumusele kroonilisele arengule.neeruhaigus.
Matemaatiline modelleerimineneerudmorfogenees. Andmed toodetakse kustutatud arendusestneerudõhutavad pildipõhise matemaatilise modelleerimise lainet, mis püüab mõista, kuidas koe makroskoopiline vorm ja funktsioon tulenevad eellasrakkude populatsioonide molekulaarsetest interaktsioonidest. 11,21–23 Terve elundi pildistamise edasine rakendamine puhastatud koes on kriitilise tähtsusega, et mõista 3D-koe mustrite molekulaarseid ja rakulisi tegureid ning see võib olla võtmeks tüvirakkude mudelite struktuuri ja täpsuse parandamiseks.neerud.
Täiskasvanu neeru 3D morfoloogia ja patoloogiaTäiskasvanu keeruline morfoloogianeerudpiirab 2D-morfoloogiliste tööriistade kasutamist, kuna need võivad edastada 3D-struktuuri mittetäielikke või eksitavaid ettekujutusi. Siin käsitleme mõningaid olulisi metoodilisi edusamme viimastel aastatel, mis võimaldavad nüüd täiskasvanute struktuuride tugevat 3D-analüüsi.neerud, ulatudes tervestneerudkuni glomerulaarfiltratsiooni barjääri komponentideni (joonis 3). 2
CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEerupuudulikkust
Nefronite arv ja suurus.Inimeneneerudnäitab nefronite arvu ja mahu kõrget intra- ja intersubjektide varieeruvust, mida on kirjeldatud lahkamise uuringutes isikutel, kellel pole ilmsetneeruhaigused1,30,31 ja seda on seostatud arenguhäiretega. Aastakümneid on kullastandardi tööriist nefroniarvu kvantifitseerimiseks eksperimentaalsetes ja inimproovides olnud disektori-/fraktsioneerimismeetod, disainipõhine stereoloogiline meetod. 3,4 Kuigi see lähenemisviis on täpne ja täpne, on see ka praktiline, aeganõudev ja nõuab märkimisväärset koolitust. Sel põhjusel on pakutud välja alternatiivsed lähenemisviisid tõhusate meetodite väljatöötamiseks, mis võivad anda kvaliteetseid lõpp-punkte: 32 näiteks optiliste puhastusmeetodite kombinatsioonid, sealhulgas hüdrofoobsed (varem tuntud kui lahustipõhised), hüdrofiilsed või hüdrogeelipõhised ja täiustatud meetodid. valgusmikroskoopia (nt konfokaalne, multifoton või valgusleht).
Meile teadaolevalt avaldasid Klingberg jt esimese aruande, mis ühendas optilise kliiringu ja valguse lehe mikroskoopia nefronite arvu ja suuruse analüüsimiseks. 24 märgilises paberis, mis sisaldas mitmeid olulisi edusamme. Esiteks tutvustati selles aruandes etüültsinnamaati, mitteohtlikku lahustit, mis võib asendada mürgiseid kemikaale, nagu bensüülalkohol-bensüülbensoaat, mida seni kasutati regulaarselt hüdrofoobsetes puhastusprotokollides. Teiseks viisid uurijad läbi terve hiire nefroniloenduseneerud in agressiivne ja progressiivne immuunvahendatud mudelneeruhaigus, tuvastades nefroni kadu haiguse käigus. Lisaks võeti kasutusele olulised sammud kujutiste segmenteerimise algoritmide arvutipõhise automatiseerimise suunas, mis annab võimaluse tõhususe oluliseks parandamiseks. Hiljuti on Østergaard jt. 25 esitles sarnast hüdrofoobset puhastusmeetodit koos valguse lehemikroskoopia ja automaatse kujutise segmenteerimisega, mis tagab diabeetilise nefropaatia hiiremudelis nii nefronite koguarvu kui ka üksiku glomerulaarmahu. Lisaks näitas see uuring proksimaalsete tubulite elegantset funktsionaalset märgistamist in vivo albumiini süstimise teel, et visualiseerida glomerulaartuubulaarset ristmikku, ja lihtsat korrelatiivse histopatoloogia protokolli samades optiliselt puhastatud proovides. See aruanne näitab nende protokollide paindlikkust, mis on muutumas mitmekihilisteks torujuhtmeteks kõikehõlmava koeprofiili koostamiseks.
Neerude veresoonkond ja innervatsioon.Täiskasvanu veresoonkonna või närvikiudude hargnemise jälgede järgimineneerudon 2D tavapärases histoloogias peaaegu võimatu, kuna elundi suurus ja struktuurse jaotuse keerukus nõuavad ulatuslikku ja asjatundlikku jadalõikamist. Hiljuti Huang et al. 33 teatas katioonsest lähi-infrapuna fluorestsentsvärvist (MHI148-PEI), et spetsiifiliselt märgistada veresooni, mida saab kombineerida etüültsinnamaadil põhineva modifitseeritud ja kiirendatud puhastusprotokolliga, et lühendada kudede töötlemise aega. See lähenemisviis avab veresoonkonnauuringuteks uusi võimalusineerud,eriti kui on vaja kõrglahutusega 3D-pildistamist. Samamoodi on Hasegawa et al. 26 kasutasid selgeid takistusteta aju/keha pildistamise kokteile ja arvutusanalüüsi (CUBIC) koos eritellimusel ehitatud kerge lehtmikroskoopia süsteemiga, et tuvastada sümpaatilise innervatsiooni jaotus terves hiire neerus. Sümpaatilised närvid jagunesid peamiselt arterite ümber. Pärast 10-päevast isheemiat või reperfusioonikahjustust vähenes sümpaatilise innervatsiooni tihedus märkimisväärselt, mis on korrelatsioonis norepinefriini taseme languseganeerukude. Need muutused püsisid osaliselt 28 päeva pärast esialgset vigastust, mis viitab sellele, et kroonilise haiguse progresseerumisel võib esineda pidevaid sümpaatilisi muutusi.neeruhaigus.
Tubulointerstitsiaalne remodelleerimine.Neerutuubulite süsteemi on 3D-pildis eriti raske analüüsida. Keeruline ja keeruline morfoloogia seab tavapärastele jadalõikamisel ja standardsel valgusmikroskoopial põhinevatele meetoditele mitmeid väljakutseid. Optiline puhastamine võimaldab aga analüüsida terveid torukesi ja neid ümbritsevat mikrokeskkonda. Saritas jt. 34 viis läbi hüdrogeelipõhise ja hüdrofoobse optilise puhastamise kombinatsiooni, millele järgnes täiustatud valgusmikroskoopia ja poolautomaatne 3D-analüüs, et iseloomustada distaalset torukujulist ümberkujundamist, mis on tingitud toidust tingitud kaaliumipuudusest. Uurijad kvantifitseerisid tubulaarse hüperplaasia ja tuvastasid prolifereeruvate rakkude suurenemise tubulointerstitiumis. Selles uuringus kasutati nii optilise kliiringu kui ka
Joonis 3| Kolmemõõtmeline (3D) morfomeetria täiskasvanud neerudes. a ) Nefronite loendamine tervetes neerudes, kasutades endoteelirakkude CD31 märgistamist. Paneel näitab 3D-rekonstruktsiooni (vasakul), optilist lõiget kahemõõtmelises (2D) vaates (keskel) ja spetsiaalseid alasid, mis näitavad üksikuid glomeruleid, võrreldes valguslehtmikroskoopia (LSFM) ning konfokaalse ja 2- foton (2P) mikroskoopia. Kohandatud Ameerika Nefroloogiaühingu loal, ajakirjast Journal of the American Society of Nephrology, Fully Automated Evaluation of the Total Glomerula Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys using Lightsheet Microscopy, Klingberg A, Hasenberg A, Ludwig-Portugall I, et al. ., köide 28, number 2, 2017; 24 (b) Glomerulite suuruse määramine ruumilise registreerimisega – värvikoodiga tähistatakse glomerulaari suurust, kus punane on suurim objekt ja roosa väikseim. Kohandatud Ameerika Nefroloogiaühingu loal, Neer360, Automated Image Analyzes of Glomerulary Hypertrophy in a Mouse Model of Diabetic Nephropathy, Østergaard MV, Sembach FE, Skytte JL jt, köide 6, number 6 , 2020; 25 (c) Veresoonkonna ja innervatsiooni jälgimine, mis sisaldab terve neeru 3D-rekonstruktsiooni sümpaatiliste närvide (roheline), veresoonkonna (magenta) ja ühendatud (vasakul) immunomärgistusega. Kohandatud ajakirjast Kidney International, köide 96, number 1, Hasegawa S, Susaki EA, Tanaka T jt, Põhjalik kolmemõõtmeline analüüs (CUBIC-neer) visualiseerib ebanormaalseid neerude sümpaatilisi närve pärast isheemiat/reperfusioonikahjustust, lk 129–138, Autoriõigus ª 2019, rahvusvahelise nefroloogiaühingu loal. 26 (d) podotsüütide morfomeetria üksikutes glomerulites, kasutades immunomärgistamist podotsüütide spetsiifilise markeri p57 (roheline) ja DNA markeri 4 0, 6-diamidino-2-fenüülindooli (DAPI) jaoks. Paneelid näitavad (vasakul) 3D-rekonstruktsiooni ja (paremal) renderdatud pindu. Kohandatud Ameerika Nefroloogiaühingu loal, ajakirjast Journal of the American Society of Nephrology, kolmemõõtmelise podotsüütide loendamise ja suuruse määramise meetodi valideerimine terves glomeerulis, Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE jt, köide 27, number 10, 2016; 27. e) Rakkude dünaamika, kasutades liini jälgimist, mis näitab podotsüütide (äärmisel vasakul), parietaalseid epiteelirakke (PEC-sid), mis moodustavad raku poolkuud 3D-s (vasakul keskel), 2D-vaade sissetungivatest PEC-idest glomerulaarpool vaskulaarse vigastusega (parem keskel) ja torukujulise väljalaskeava 2D visualiseerimine (paremal ääres). Kohandatud ajakirjast Kidney International, köide 96, number 2, Puelles VG, Fleck D, Ortz L et al., Uudne 3D analüüs, kasutades optilist kudede puhastamist, dokumenteerib hiire kiiresti progresseeruva glomerulonefriidi arengut, lk 505–516, autoriõigus ª 2019, International Society of Nephrology, CC BY-NC-ND litsentsi alusel (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 28 (f) Pilu diafragma visualiseerimine suureneva suurendusega vasakult paremale. Kohandatud ajakirjast Kidney International, köide 99, number 4, Unnersjö-Jess D, Butt L, Höhne M, et al., Kiire ja lihtne puhastamise ja paisumise protokoll neerude 3D-in-situ pildistamiseks üle skaala, lk 1010–1020 , Autoriõigus ª 2021, International Society of Nephrology, CC BY-NC-ND litsentsi alusel (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 29 Selle pildi vaatamise optimeerimiseks vaadake selle artikli veebiversiooni aadressilwww.kidney-international.org.
valgusmikroskoopia, et teha torukujuline analüüs puutumata neerudes, kasutades hüdrogeel-kinnitus- ja valguslehtmikroskoopiat, samuti üherakuline kvantifitseerimine neerulõikudes, kasutades hüdrofoobset puhastamist ja konfokaalset mikroskoopiat, kuna iga kombinatsioon sobis konkreetse uurimisküsimusega paremini. Tahaei jt kasutasid optilise puhastamise ja täiustatud valgusmikroskoopia kombinatsioone. 35, kes iseloomustasid seksuaalset dimorfismi distaalse keerdunud tuubuli pikkuses, mis võib määrata selle võime kohaneda füsioloogilise stressiga, ja Schuh et al. 36, kes näitasid aksiaalseid erinevusi proksimaalsete tuubulite ligandi omastamises ja endolüsosomaalses funktsioonis, rõhutades, et S1 segment on väga spetsialiseerunud valkude reabsorbeerimiseks retseptor-vahendatud endotsütoosi kaudu. Hiljutises uuringus on Blanc jt. 2 analüüsis tsüstide moodustumise mudelit, näidates, et tsüstid arenesid ainult spetsiifilistes nefroni segmentides, mis määrasid nende kuju ja paiknesid külgnevalt normaalsete mittedilateerunud tuubulitega. Üldiselt on meil nüüd mitu näidet optilise puhastuse otsesest rakendamisest tubulointerstitsiaalse sektsiooni süstemaatiliseks analüüsiks.
Podotsüütide kadu ja hüpertroofia.Glomerulus on ainulaadne näide elundi tervete funktsionaalsete üksuste analüüsimiseks. Eelkõige on podotsüütide kahanemise uurimine nendest tehnoloogilistest edusammudest otsest kasu saanud, kuna kullastandardi disainipõhised metoodikad nõuavad märkimisväärseid aja- ja ressursside investeeringuid. 37 Esimene tööriist hiire intaktsete glomerulite kombineeritud immunomärgistamise 3D podotsüütide morfomeetriliseks analüüsiks.neerudviilud, kasutades kaudse immunofluorestsentsi, hüdrofoobse optilise puhastamise ja konfokaalse mikroskoopia modifitseeritud protokolli, mis hõlbustas podotsüütide koguarvu kvantifitseerimist tervetes teadaoleva mahuga glomerulites. Usume, et see lähenemisviis on ideaalne selliste protsesside uurimiseks, mis mõjutavad teatud struktuuride alamhulka (nt podotsüütide kadu, mis põhjustab fokaalset ja segmentaalset glomeruloskleroosi). 27 Sama tehnikat kasutati hiljem podotsüütide hüpertroofia rolli iseloomustamiseks kompenseeriva vastusena pärast podotsüütide kadu, mehhanismi, mida vahendab rapamütsiini signaaliraja imetaja sihtmärk. 38 Kuigi need kaks uuringut keskendusid glomerulaarsete podotsüütide analüüsile, saab seda tavapärasel immunomärgistamisel põhinevat torujuhet kasutada mis tahes rakutüübi morfoloogiliste muutuste iseloomustamiseks suure ruumilise eraldusvõimega.
Rakuliste poolkuude areng.Veel üks oluline tööriist, mis tuli edukalt integreerida 3D tööriistakastineerudmorfomeetria on geneetilise päritolu jälgimine. Enamik optilisi puhastusmeetodeid kipuvad kutsuma esile teatud fluorestsentsi summutamise (mis varieerub kergest kuni raskeni). 6 Hiljuti esitlesime protokolli, mis ühendab põlvnemise jälgimise, optilise puhastamise ja multifotoni mikroskoopia podotsüütide kadumise ja parietaalsete epiteelirakkude aktiveerimise põhjalikuks analüüsiks. 28 Selles uuringus tuvastati podotsüütide kadu eksperimentaalse poolkuu nefriidi tunnusena, kasutades podotsüütide metaboolset märgistamist täiustatud rohelise fluorestseeruva valguga. Rakuliste poolkuude areng visualiseeriti ja kvantifitseeriti parietaalsete epiteelirakkude proliferatsiooni ja migratsiooni põhjal, mida iseloomustas ka täiustatud roheline fluorestseeruv valk ja mida jälgiti poolkuu nefriidi eksperimentaalse mudeli käigus. Tervete glomerulite analüüs võimaldas tuvastada fokaalsete podotsüütide kadu ja kahjustuste moodustumist, mis arenes parietaalsete epiteelirakkude poolt tubulaarseteks oklusioonideks, mis viis torukujuliste glomerulite moodustumiseni. See uuring sillutab teed tulevasteks uuringuteks terviklike immuun-epiteeli interaktsioonide kohtaneerud.
CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEEREDIALÜÜSI
Glomerulaarfiltratsiooni barjäär.Glomerulaarhaiguste rutiinse hindamise oluline diagnostiline vahend on neerubiopsiate ultrastruktuurne analüüs elektronmikroskoopia abil. Alternatiivi elektronmikroskoopiale võib leida paisutusmikroskoopia valdkonnast, mille eesmärk on definitsiooni järgi suurendada optilist eraldusvõimet koe mõõtmete suurendamise kaudu. Aastate jooksul on Unnersjo-Jess jt. 39,40 on esitanud mitu protokolli nanomõõtmeliste struktuuride visualiseerimiseks riigisneerud.Hiljuti teatasid need uurijad kiirest ja lihtsast protseduurist 3D-visualiseerimiseksneerudmorfoloogia, kombineerides optilise puhastamise ja kudede laiendamise kontseptsioone, et lahendada nanomõõtmelised struktuurid, kasutades tavalist konfokaalset mikroskoopiat. 29 Seda protokolli rakendati hiire ja inimese mitmete patoloogiliste tunnuste visualiseerimiseks ja kvantifitseerimiseksneerudbiopsiad, sealhulgas jala protsessi kadu, muutused glomerulaarses basaalmembraanis, pilu diafragma pikkus, IgG ladestused ja klassikalised patoloogia tunnused (nt glomeruloskleroos, tubulointerstitsiaalne fibroos ja tubulaarne atroofia). Kokkuvõtteks võib öelda, et see meetod võimaldab neerupatoloogia mitmetasandilist visualiseerimist ja kvantifitseerimist, kasutades lihtsat meetodit ja juurdepääsetavaid pildianalüüsi tööriistu. Selle lähenemisviisi mastaapsuse ja rakendamise kliinilises praktikas määrab tõenäoliselt vajadus täiustatud valgusmikroskoopia seadmete järele ja automatiseeritud pildianalüüsi tööriistade väljatöötamine.
Järeldus
Praegune koepuhastusmeetodite spekter sisaldab lihtsaid tehnikaid, mida saab enamikus laborites rakendada, et parandada 3D-kujutist üldkasutatavates mikroskoopides. Kuna nende uute lähenemisviiside pakutavad võimalused ilmnevad, eeldame spetsiaalsete mikroskoopiasüsteemide laiemat kasutuselevõttu, et tõhusalt kujutada puhastatud kudesid suure eraldusvõimega, ning konkreetsete küsimuste lahendamiseks kohandatud uuringute ja kliiniliste töövoogude väljatöötamist. Neuroteaduse valdkond on olnud puhastatud koe kujutise meetodite ja rakenduste katsepolügooniks. Selles kontekstis on välja töötatud automatiseeritud kujutise analüüs, uudsed lähenemisviisid rakulise ühenduvuse uurimisele ning koeülesed geeni- ja valguekspressiooni atlase projektid. On tõenäoline, et sarnased lähenemisviisid annavad uusi teadmisi raku anatoomiast ja rakupopulatsioonide vastastikusest sõltuvusest arenevatel ja täiskasvanutel.neerud.
Nende edusammude praktilised piirangud hõlmavad pildistamise riistvara kulusid ning raskusi suurte andmekogude käsitlemisel, salvestamisel ja analüüsimisel. Muud piirangud tulenevad värvimise reprodutseeritavuse puudumisest kudedega, mida mõjutavad fikseerimistingimused ja antikehade märgistamine. Sellest tulenevalt on vajadus uute 3D analüüside järele, mida kriitiliselt hinnata ja väljakujunenud meetoditega võrrelda. Vaatamata muljetavaldavatele edusammudele hindamiselneerudareng ja täiskasvanuneerudSelles ülevaates esile tõstetud struktuuri ja haiguse tõttu usume, et parimad kudede puhastamise ja 3D-kujutamise võimalused on alles ees ning tõenäoliselt on see põnev kasvuvaldkond.neerudaastakümneid.
