Raseduse madala valgutarbimise mõju embrüonaalse neeru mikroRNA ekspressioonile ja isasloote nefroni eellasrakkudele
Mar 08, 2022
Sissejuhatus
Toitainete puudus võib loote erinevatel arenguetappidel põhjustada muutusi pöördelistes radades, mis võivad täiskasvanueas põhjustada pöördumatuid elundite ja süsteemide häireid [1]. Loote programmeerimine viitab mis tahes solvamisele arengu ajal, mis põhjustab pikaajalisi mõjusid organismi struktuurile või funktsioonile [2]. Loote programmeerimise häired põhjustavad madalat sünnikaalu, vähem nefroneid ning suurenenud kardiovaskulaarsete janeeru-häired täiskasvanueas [3–6]. Teiste autorite ja meie uuringud on näidanud väiksemat sünnikaalu, 28 protsenti vähem nefroneid, vähenenudneeru-soola eritumine, kroonilineneerupuudulikkusja arteriaalne hüpertensioon gestatsioonilise madala valgusisaldusega (LP) tarbimisel võrreldes täiskasvanueas standardse (NP) valgutarbimisega järglastega [3–7]. Nefrogenees hõlmab geeniekspressiooni, valkude sünteesi ja kudede remodelleerumise ranget kontrolli. Uuringud on näidanud, et nefronite arvu määravad interaktsioonid kusejuha pungade (UB) ja metanefrosmesenhüümi (MM) eellasrakkude vahel [8–10]. MM-i signaalid kutsuvad esile UB-stimuleeritud tuubulite süsteemi kasvu ja hargnemise. MM-i proliferatsiooni ja diferentseerumist, mis moodustab mesenhümaalse korgi (CM), vahendavad omakorda UB otsad [11].
CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST
Tõsine huvi on olnud epigeneetiliste muutuste rolli vastu, mis puudutavad sünnieelse stressi pikaajalist mõju loote arengule [12]. MikroRNA-d (miRNA-d) on genoomiga kodeeritud väikesed umbes 22 nukleotiidi pikkused mittekodeerivad RNA-d ja neil on oluline roll sihtgeeni ekspressiooni transkriptsioonijärgses regulatsioonis [13–16]. miRNA-d kontrollivad geeniekspressiooni transkriptsioonijärgselt, reguleerides mRNA translatsiooni või stabiilsust tsütoplasmas [17, 18]. Funktsionaalsed uuringud näitavad, et miRNA-d osalevad arengu ajal kriitilistes bioloogilistes protsessides ja rakufüsioloogias [13, 16]. Muutusi nende ekspressioonis on täheldatud mitme patoloogia puhul [16, 19]. Seega on miRNA-de iseloomustamine aidanud mõista geeniregulatsiooni ja rakkude proliferatsiooni, diferentseerumist ja apoptoosi ning selgitada patofüsioloogilisi häireid, sealhulgasneerudhäired [20–22]. Uuringud on näidanud, et ajalneerudontogeneesi miRNA-d on nefroni arenguks hädavajalikud [23–26]. Veelgi enam, mõnede miR NA-de alaekspressioon MM-i eellasrakkudes vähendab rakkude proliferatsiooni, mille tulemuseks on varajane diferentseerumine ja sellest tulenevalt vähenes nefronite arv [27, 28]. Seda nähtust iseloomustab suurenenud apoptoos ja kõrge Bim ekspressioon eellasrakkudes [27]. Seega moduleerivad miRNA-d nende metanefriliste primaarsete rakkude apoptoosi ja proliferatsiooni vahelist tasakaalu [29].
Me oletasime, et tundmatud epigeneetilised muutused ja miRNA ekspressiooniprofiil on seotudneerudema valgusisaldusega piiratud järglaste arenguhäired. Seega püüdsime hinnata miRNA mustreid ja ennustatud geeniekspressiooni lootelneerud17. raseduspäeval (17-DG) piiratud valgusisaldusega isasjärglased, et teha kindlaks molekulaarsed rajad ja häired, mis on seotudneeru-rakkude proliferatsiooni ja diferentseerumise ajalneerudarengut.
Märksõnad:neerupuudulikkus; neerutorukujuline; neeruhäired; neerude areng; neerud
Materjal ja metoodika
Loomad ja dieedidKatsed viidi läbi nii, nagu eelnevalt on üksikasjalikult kirjeldatud [5, 6], õdede-vendadega paaritatud Wistar HanUnib rottide (250–300 g) emas- ja isasrottidel, kes olid pärit CEMIB/UNICAMPi aretuskarjast. , Campinas, SP, Brasiilia. Keskkond ja eluase pakkusid katseprotseduuri ajal õigeid tingimusi nende tervise ja heaolu juhtimiseks. Vahetult pärast võõrutamist kolme nädala vanuselt hoiti loomi kontrollitud temperatuuril (25˚C) ja valgustingimustes (07:00–19:00) ning neil oli vaba juurdepääs kraaniveele ja standardsele laboratoorsele näriliste toidule (Purina Nuvital). , Curitiba, PR, Brasiilia: Na plus sisaldus: 135 ± 3 μEq/g; K pluss sisaldus: 293 ± 5 μEq/g), 12 nädalat enne aretamist. São Paulo osariigi ülikooli loomade kasutamise institutsionaalne eetikakomitee (nr See määrati raseduse 1. päevaks päevaks, mil tupemäärimisel ilmnes sperma. Seejärel hoiti emasid ad libitum kogu tiinuse vältel isokalorilisel laboratoorsel närilistel kas standardse valgusisaldusega [NP, n=36] (17 protsenti valku) või madala valgusisaldusega [LP, n=51 ] (6 protsenti valku). NP ja LP emade toidutarbimine määrati iga päev (järgnevalt normaliseeriti kehakaalu järgi) ja emade kehakaal registreeriti mõlemas rühmas kord nädalas. 17. raseduspäeval (17-DG) tuimastati emad ketamiini (75 mg/kg) ja ksülasiiniga (10 mg/kg) ning emakas paljastati. Looted eemaldati ja surmati koheselt pea maharaiumisega. Looted kaaluti ning saba ja jäsemed koguti soo määramiseks. Metanefros koguti järgmise põlvkonna järjestuse (NGS), RT-qPCR ja immunohistokeemia analüüside jaoks.
CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEerupuudulikkust
Seksuaalne otsustavusKäesolev uuring viidi läbi ainult isastel 17-DG järglastel ja sugu määrati Sry tavapärase PCR (polümeraasi ahelreaktsiooni) järjestuse analüüsiga. DNA ekstraheeriti ensümaatilise lüüsi teel proteinaas K ja fenool-kloroformiga. Reaktsiooniks kasutati Master Mix Colorless-Promegat tootja tsüklitingimustega. Integrated DNA Technologies (IDT) sünteesis järgmised praimerid: Edasi: 5'-TACAGCCTGAGGACATATTA-3'Tagurpidi: 5'-GCACTTTAACCCTTCGATTAG-3'.
RNA täielik ekstraheerimineRNA ekstraheeriti tervelt NP-st (n=4) ja LP-st (n=4)neerudkasutades Trizol reaktiivi (Invitrogen) vastavalt tootja juhistele. RNA üldkogus määrati neeldumise järgi 260 nm juures, kasutades nanoVue spektrofotomeetrit (GE Healthcare, USA). RNA terviklikkus tagati RNA terviklikkuse numbri RIN > 8 saamisega Agilent 2100 Bioanalyzeriga (Agilent Technologies, Saksamaa) [30].
miRNA-Seq ja andmete analüüsSekveneerimine viidi läbi MiSeq platvormil (Illumina). Protokoll järgis tootja juhiseid, mis olid saadaval aastalLühidalt, sekveneerimine hõlmab raamatukogu konstrueerimist ja selleks kasutati 1 ug kogu RNA-d. Selles etapis ühendatakse adapterid, 3 ja 5. Pärast adapterite ligeerimist viidi cDNA loomiseks läbi pöördtranskriptsioonireaktsioon. Seejärel amplifitseeriti seda standardse PCR-reaktsiooniga, mis kasutab proovi tuvastamiseks järjestuse indeksit sisaldavaid praimereid - see cDNA raamatukogu, mis allutati miRNA eraldamiseks agaroosgeelelektroforeesile. Pärast kvantifitseerimist normaliseeriti raamatukogu kontsentratsioon 2 nM-ni, kasutades 10 nM Tris-HCl, pH 8,5, ja transkriptoomide sekveneerimine viidi läbi MiSeq Reagent Kit v2 abil (50 tsüklit).
Andmete analüüs viidi läbi koostöös Ph.D Tao Cheniga. riikliku toksikoloogiliste uuringute keskuse geneetilise ja molekulaarse toksikoloogia osakonnast, Jefferson, AR, USA. MiRNA-de järgmise põlvkonna järjestuse (NGS) andmed genereeriti FASTA-vormingus ja imporditi saidi BaseSpace.com (Illumina, USA). Andmete kvaliteeti hinnati tootja (Illumina) poolt välja töötatud CASAVA baastarkvara abil. Analüüsid viidi läbi BaseSpace miRNA analüüsi abil (Torino ülikoolist, Kanadast) ja erinevate miRNA-de järjestuste kaardistamiseks Small RNA (Illumina, USA) abil roti genoomi jaoks. Diferentsiaalselt ekspresseeritud miRNA uuringut analüüsiti tarkvara Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity, USA) abil.
miRNA ekspressiooni valideerimineIgas rühmas kasutati miRNA jaoks nelja isast järglast erinevatest pesakondadest (miR{{0}}p, -144-3p, -298-5p, let-7a{{ 4}}p, -181a-5p, -181c-3p ja -199a-5p) avaldise analüüs. Lühidalt, 450 ng RNA-d pöördtranskribeeriti ilma eelneva amplifikatsioonita, kasutades TaqMan1 Micro RNA pöördtranskriptsioonikomplekti vastavalt tootja juhistele. Komplementaarne DNA (cDNA) amplifitseeriti, kasutades TaqMan MicroRNA Assays (Life Technologies, USA) koos TaqMan1 Universal PCR Master Mix, No AmpErase1 UNG (2x) StepOnePlusTM Real-Time PCR süsteemis (Applied BiosystemsTM), vastavalt tootja juhistele. Andmete analüüs viidi läbi suhtelise geeniekspressiooni abil, mida hinnati võrdleva kvantifitseerimismeetodi abil (Pfaffl, 2001). Stabiilsusanalüüsi põhjal kasutati võrdlusgeenina U6 snRNA-d ja U87 scaRNA-d. Kõiki suhtelisi kvantifitseerimisi hinnati DataAssist tarkvara v 3.0 abil, kasutades ΔΔCT meetodit. miRNA andmed on genereeritud järgides MIQE juhiseid [31].
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU FUNKTSIOONI
Ennustatud sihtgeenide RT-qPCRcDNA sünteesiks kasutati High Capacity cDNA pöördtranskriptsiooni komplekti (Life Technologies, USA). RT-qPCR reaktsioonid Baxi, Bim, kaspaas-3, kollageen 1, GDNF, PCNA, TGF -1, Bcl-2, Bcl-6, c-Myc, c jaoks -ret, tsükliin A, Map2k2, PRDM1, Six-2, Ki-67, MTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2, NOTCH1 ja IGF1 geen teostas SYBR Green Master Mix (Life Technologies, USA ), mille pakub IDT1 Integrated DNA Technologies (tabel 1). Reaktsioonid viidi läbi kogumahus 20 μL, kasutades 2 μL cDNA-d (lahjendatud 1:30), 10 μL SYBER Green Master Mix (Life Technologies, USA) ja 4 μL iga konkreetset praimerit (5 nM). Amplifitseerimine ja tuvastamine viidi läbi StepOnePlusTM Real-Time PCR süsteemi (Applied BiosystemsTM) abil. Ct väärtused teisendati suhtelisteks ekspressiooniväärtusteks, kasutades ΔΔCt meetodit, kusjuures järglaste metanefroosi andmed normaliseeriti võrdlusgeenina GAPDH-ga [32].
immunohistokeemia,Loode (n {0}} rühma kohta) eemaldati ja fikseeriti kohe 4% paraformaldehüüdis (0,1 M fosfaat, pH 7,4). Materjalid dehüdreeriti, diafeeriti ja lisati paraplasti ning plokid lõigati 5-μm paksusteks osadeks. Histoloogilised lõigud deparafineeriti ja töödeldi immunofluorestsentsi ja immunoperoksidaasi jaoks. Sektsioonid olid
inkubeeriti blokeeriva lahusega (8 protsenti veise loote seerumit, 2,5 protsenti veise albumiini ja 2 protsenti lõssipulbrit PBS-s). Seejärel lisage primaarne antikeha (anti-Six-2), mis on lahjendatud PBS-is, mis sisaldab 1 protsenti kooritud piima, üleöö jahedas. Pärast PBS-ga pesemist inkubeeriti sektsioone spetsiifilise sekundaarse antikehaga, mis oli konjugeeritud Alexa 488 fluorofooriga, lahjendati samas puhvris, mis sisaldas 1 protsenti piima, 2 tundi toatemperatuuril. Pärast järjestikust pesemist PBS-ga paigaldati slaidid katteklaasidega, kasutades Vectashield fluorestseeruvat montaažikeskkonda (Vector Laboratories, Inc. Burlingame). Proovi fluorestsents tuvastati laserkonfokaalse mikroskoopia abil. Pildid saadi Focus Imagecorder Plus süsteemi abil. c-Myc, Ki-67, Bcl-2, TGF -1, - kateniini, ZEB1, ZEB2, kaspaas 3 lõhustatud, tsükliin A ja WT1 valkude jaoks viidi läbi immunohistokeemia. Objektiklaasid hüdreeriti ja pärast 5-minutilist pesemist PBS-s pH 7,2, antigeenne taastamine tehti tsitraatpuhvriga pH 6.{23}} 25 minuti jooksul kiirkeedul. Slaidid pesti PBS-is. Seejärel viidi läbi endogeense peroksidaasi blokaad vesinikperoksiidi ja metanooliga 10 minutit pimedas. Sektsioone pesti uuesti PBS-is. Seejärel järgnes mittespetsiifilise seondumise blokeerimine ja slaide inkubeeriti blokeeriva lahusega (5% lõssipulber PBS-s) 1 tund. Sektsioone inkubeeriti üleöö külmkapis primaarse antikehaga (tabel 2), mis oli lahjendatud 1% BSA-ga. Pärast PBS-ga pesemist eksponeeriti sektsioone toatemperatuuril 2 tundi spetsiifilise sekundaarse antikehaga. Slaidid pesti PBS-ga. Viilud paljastati DAB-ga (3,3'-diaminobensidiintetrahüdrokloriid, Sigma-Aldrich CO1, USA). Pärast järjestikust pesemist voolavas vees värviti slaidid hematoksüliiniga, dehüdreeriti ja paigaldati katteklaasiga, kasutades Entellan1. Kujutised saadi fotomikroskoobi (Olympus BX51) või Zeiss LSM 780-NLO konfokaalse Axio Observer Z.1 mikroskoobiga (Carl Zeiss AG, Saksamaa) rakkudele rakendatava fotoonika riikliku teadus- ja tehnoloogiainstituudi poolt. bioloogia (INFABIC) Campinase osariigi ülikoolis.
Morfoloogia kvantifitseerimineParafiin 5 μmneerudsektsioone analüüsiti fotomikroskoobi (Olympus BX51) tarkvara CellSens Dimension abil. Theneerudviiludele saadi juurde nefrogeense piirkonna, CM- ja UB-valgu ja rakkude arvu ning 17-DG LP lootel (n=5) värvunud hematoksüliin-eosiini määramiseks, võrreldes vanuses sobiva NP järglastega (n {{4). }}) erinevatelt emadelt. Kvantifitseerisime iga analüüsitud metanefroosi (erinevatelt emadelt 4NP ja 4LP) kõik CM ja UB ning statistiline analüüs viidi läbi t-testiga ja väärtused väljendati keskmisena ± SD. P�0.05 peeti oluliseks. GraphPad Prism v01 Software, Inc., USA, kasutati statistiliseks analüüsiks ja jooniste koostamiseks.
Statistiline analüüsKasutati t-testi ja väärtused väljendati kui keskmine ± standardhälve (SD). P�0.05 peeti oluliseks. Statistiliseks analüüsiks ja jooniste koostamiseks kasutati GraphPad Prisma v. 01 tarkvara (GraphPad Software, Inc., USA).
Tulemused
MiRNA-de ekspressioon miRNA-Seq abilEt mõista ema madala valgusisaldusega seotud mikroRNA muutusineeru-programmeerimisel teostasime globaalse miRNA profiilianalüüsi ekspressiooni. Tuvastati 44 dereguleeritud miRNA-d (p � 0,05), millest vastavalt 19 ja 25 miRNA-d olid üles- või allareguleeritud (tabel 3). Parimad ekspresseeritud miRNA-d ja nende funktsioonid, teed ja võrgud tuvastati tarkvara Ingenuity abil (tabel 4).
MiRNA ekspressiooni valideerimineLP-rühma loomadel olid Let{0}}a-5p, miR-181a-5p, miR-181c-3p ülesreguleeritud, samas kui miR-127-3p, miR-144-3p ja miR-199a-5p olid NP loomadega võrreldes allareguleeritud. Tulemused ei näita erinevusi miR{10}} avaldises, kui võrrelda mõlemat rühma (joonis 1). Tabelis 5 on näidatud väärtused, mis saadi miRNA-de sekveneerimisel RT-qPCR valideerimisandmetega. Kuigi LP-s täheldati olulist miRNA ekspressiooni erinevust võrreldes NP järglastega, oli valideeritud miRNA-de kordne muutus (FC) sarnane mõlema tehnikaga.
miRNA-geeni sihtmärgid
Erinevate miRNA-de, nagu Six-2, Bcl-2, PRDM1, tsükliin A, PCNA, GDNF, kollageen 1, kaspaas 3 ja Bim, ekspressioonigeenid LP-s ei erinenud oluliselt NP-st lootele. Kuid Baxi, TGF -1 Bcl-6, c-ret, Map2k2, Ki-67, mTOR, -kateniini, ZEB1, ZEB2 ja IGF1 geeniekspressioon olid {{15} ülereguleeritud. }}DG LP rühm võrreldes vanuselise kontrolliga. Vastupidi, c-Myc ja NOTHC1 olid emavalguga piiratud järglastel alareguleeritud (joonis 2).
Loote kehamass ja metanefrose morfomeetria17-DG LP kehamass ei erinenud vanuses sobiva NP järglaste omast. Siiski näitas LP metanefrosmesenhüümi pindala 7,6 protsenti ja ajukoore paksuse vähenemist 29 protsenti kui NP rühmas (joonis 3).ImmunohistokeemiaKäesolevas uuringus näitas LP-loote Six-2 cap fluorestsentsi olulist vähenemist (umbes 69 protsenti) kui NP järglastel (joonis 4).
Kuue -2 immunoperoksidaasi analüüs näitas LP CM-i rakkude arvu vähenemist (14 protsenti), mis on seotud 28% vähenenud Six-2 pluss rakkudega, võrreldes NP järglastega (joonis 4). Käesolev uuring näitas ka c-Myc CM ja UB immunovärvitud rakkude olulist protsenti vähenemist (vähem 14 protsenti) LP-s võrreldes NP järglastega (joonis 4). Lisaks oli Ki -67 märgistatud ala protsent CM-s LP-s 48 protsenti väiksem kui NP lootel, samas kui Bcl-2 ja lõhustatud kaspaas-3 immunoreaktiivsus ei erinenud mõlemast rühmast (joonised fig. 5 ja 6). Käesolev uuring näitas ka c-Myc CM ja UB immunovärvitud rakkude olulist protsenti vähenemist (vähem 14 protsenti) LP-s võrreldes NP järglastega (joonis 4). Lisaks oli Ki -67 märgistatud ala protsent CM-s LP-s 48 protsenti väiksem kui NP lootel, samas kui Bcl-2 ja lõhustatud kaspaas-3 immunoreaktiivsus ei erinenud mõlemast rühmast (joonised fig. 5 ja 6). Teisest küljest suurenesid LP-s CM ja UB-kateniiniga märgistatud alad vastavalt 154 ja 85 protsenti võrreldes NP järglastel saadaolevaga (joonis 7). Samal ajal oli mTOR-i immunoreaktiivsuse jaotus ka LP CM (139 protsenti) ja UB (104 protsenti) puhul oluliselt ulatuslikum kui NP-lootel (joonis 7). LP järglastel suurenes TGF -1 UBS-rakkude värvumisel (umbes 30 protsenti), samas kui CM-i puhul ei erinenud immunovärvitud rakud NP-rühmaga võrreldes (joonis 8). CM-i tuumarakkudes paiknev ZEB1 metanefrosiga värvitud aine võimendus LP-s 30 protsenti võrreldes NP-lootega (joonis 8). Samal ajal oli ZEB2 immunofluorestsents, kuigi see esines tervetes metanefrosstruktuurides, mõlemas katserühmas sarnane (joonis 8). Käesolev uuring, võttes arvesse miRNA ja mRNA ekspressiooni ja valke
Arutelu
Teadmised nefrogeneesi rakulistest ja molekulaarsetest mehhanismidest on suurenenud [33–37]. Siiski on sellega seotud paljud regulatiivsed tegurid ja signaalimisrajadneeru-ontogenees jääb ebaselgeks [38]. miRNA-d mängivad olulist rolli geeniekspressiooni reguleerimiselneeru-areng [25, 39–41]. Meile teadaolevalt ei ole miRNA ja mRNA ekspressioonianalüüse emade LP tarbimise 17-DG isaste mesenhüümirakkudes tehtud. Pakume välja uudse molekulaarse mehhanismi, mis on seotud varajase nefrogeneesi pärssimisega, mille tulemuseks on nefronite arvu vähenemine. Kasutasime miRNA ekspressiooni hindamiseks NGS-i ja leidsime, et 19 miRNA-d olid 17-DG LP-s üles- ja 25 allareguleeritud võrreldes NP metanefrosega. Kümne parima dereguleeritud miRNA hulgast valisime 7 miRNA-d bioloogiliste sihtmärkidega, mis on seotud proliferatsiooni, diferentseerumise ja raku apoptoosiga. Nii miRNA-Seq kui ka TaqMan andmete analüüs näitas järjekindlaid ja spetsiifilisi muutusi miRNA ekspressioonis LP loomadel võrreldes kontroll-NP vanusega sobivate loomadega.
Perekond miR-181 koosneb neljast väga konserveerunud liikmest, nimelt miR-181a, miR-181b, miR-181c ja miR-181d [ 42]. Neoplastilistes rakkudes toimib miR{6}a kasvaja supressorina, inhibeerides rakkude proliferatsiooni ja migratsiooni ning kutsudes esile raku apoptoosi [43]. See uuring näitas miR-181a-5p suurenenud ekspressiooni 17-DG LP-s võrreldes vanusega sobivate NP järglastega. Kuigi kaspaasi mRNA ekspressioon ei muutunud, viitab Bax/Bcl-2 mRNA suhte kahekordne suurenemine LP-s võrreldes NP järglastega suurenenud apoptoosile CM-s, mis näitab, et apoptoosi reguleeritakse transkriptsioonijärgselt. Uuringud on näidanud, et BCL-i perekond soodustab tsütokroomi vabanemist mitokondritest ja pärsib seejärel Casp3 aktivatsiooni, inhibeerides seeläbi raku apoptoosi [44]. Li et al. kasutas ägeda kopsukahjustuse mudelit, et paljastada, et üleekspresseeritud miR-181a on seotud Bcl-2 valgu taseme langusega; vastupidi, miR-181a inhibeerimine suurendas Bcl-2 taset [45]. See uuring kinnitas Lv jt tulemusi, kes näitasid, et miR-181c reguleerib Six-2 ekspressiooni ja rakkude proliferatsiooni negatiivselt, paralleelselt mesenhümaalsete rakkude fenotüübi kadumisega.neerudareng LP 17-DG järeltulijates [25].
Xiang et al. näitas, et suurenenud miR{0}} ekspressioon pärsibneeru-kartsinoomi proliferatsioon, mille tulemuseks on lühem G2/M faas. Veelgi enam, Xiang et al. näitas, et miR-144 üleekspressioon inhibeerib mTOR geeni ja valgu ekspressiooni [46]. Nijland et al. näitasid, et mTOR-i signaaliülekande suurenemine on otsustava tähtsusega nefronite arvu määramisel embrüodes, mille emad olid allutatud toitainete piiramisele [47]. Imetajate rapamütsiini kompleks 1 (mTORC1) on embrüo arenguks hädavajalik; Siiski jääb teadmata, kuidas see kompleks reguleerib tasakaalu kasvu ja autofagia vahel füsioloogilistes tingimustes ja keskkonnastressis [48]. Seetõttu võib mTOR-i signaalimine olla seotud rakuliste vastustega loomadel, kes puutuvad tiinuse ajal LP-ga; autofagia tajumisel, esilekutsumisel ja lõpetamisel; ja vastusena intratsellulaarsele toitainete kättesaadavusele [46]. Hüpoteetiliselt võib tõsise valgupiirangu ajal miR-144-3p vähenenud ekspressioon olla seotud suurenenud mTOR ekspressiooniga, vastavalt ligikaudu 139% ja 104% CM-rakkudes ja UB-s, et kompenseerida nefronite kadu {{ 11}}DG LP järglased Chen et al. defineeris miR-127 rakkude vananemise uue regulaatorina Bcl-6 kaudu [49]. Pan et al. teatas, et miR-127 alaekspressioon korreleerub rakkude suurenenud proliferatsiooniga maksarakkudes [50]. See uuring näitas rakkude proliferatsiooni vähenemist ja Ki{17}}-ga positiivselt märgistatud rakkude arvu olulist vähenemist piiratud valgusisaldusega loomade CM-s. Lisaks täheldati LP järglaste nefrogeense piirkonna ja proliferatsiooni vähenemist, mis oli kooskõlas Menendez-Castro jt tulemustega. 8,4 protsendil valgupiiranguga järglastel [51, 52]. Seega võib suurenenud Ki-67 ja Bcl-6 mRNA ekspressioon koos vähenenud miR-127-3p ekspressiooniga 17-DG LP cap-is olla seotud vasturegulatiivsete mehhanismidega, et säilitada. levik.
Sun et al. näitasid, et miR-199a-5p üleekspressioon vähendab tsüstiliste rakkude proliferatsiooni ja indutseerib apoptoosi, lisaks kontrollib rakutsüklit [53]. Selles uuringus väheneb miR-199a-5p ekspressioon 17-DG LP-s, millega kaasneb rakkude proliferatsioonimarkeri Ki-67 ja Map2k2 suurenenud transkriptsioon. on seotud Ki-67 reaktiivsuse vähenemisega LP 17-DG metanefroses. Seega soodustab rasedusaegne alatoitumus diferentseerumist transkriptsioonijärgse mehhanismi kaudu. Eelkõige näitavad meie tulemused tsink-sõrme E-kasti siduva homeobox 1 (ZEB1), EMT indutseerija repressiivset rolli, mis säilitab tüvirakkude pluripotentsuse embrüonaalsete tüvirakkude diferentseerumise ajal. On teada, et kateniin aktiveerib tuuma ZEB1 transkriptsiooni, mille tulemuseks on ZEB1 ekspressioon [34]. TGF-i signaalirada, üks paremini uuritud radu, võib embrüonaalse arengu ajal esile kutsuda EMT-d. Embrüonaalseks arenguks on vaja mitmeid TGF-i sarnaseid ligande. Kuid mitte kõik TGF-vahendatud mõjud EMT-le ei sõltu ZEB1/2-st, knockout-rakud võivad indutseerida mesenhümaalsete geenide fibronektiini ja N-kadheriini ekspressiooni. Kuid E-kadheriin ei ole enam alla reguleeritud ja moodustuvad ka aktiinikiud [54]. Karner et al. teatas, et ajalneeru-arengut, Wnt9b/-kateniini
signaalirada, mida väljendatakse nii UB-s kui ka CM-is, on vajalik nii nefroni eellasrakkude uuenemiseks kui ka diferentseerumiseks, mis on oluline nefronite moodustumiseks embrüogeneesi ajal [55]. Evolutsiooniliselt konserveerunud Wnt9b / -kateniini rada mängib kriitilist rolli organite, kudede arendamisel ja vigastuste parandamisel mitmerakulistes organismides. Uuring näitas, et c-Myc on -kateniini transkriptsiooniline sihtmärk, reguleerides selle proliferatsiooni ja diferentseerumist.neeru-torukujuline epiteel [56]. -kateniini ekspressioon geeni ja valgu tasemel suurenes uuritud perioodidelneeru-areng 17-DG LP lootel. Pan et al. teatas, et Myc teeb koostööd -kateniiniga, et soodustada nefroni eellasrakkude uuenemist [10]. Võrreldes vanusega sobitatud NP järglastega näitas LP madalamat c-Myc ekspressiooni. Seetõttu võib nendel loomadel olla väiksem taastuvate rakkude reserv, mis on vajalik proliferatsiooniks ja ellujäämiseks ning need võivad kajastada väiksemat nefronite arvu LP-mudelis. Enamgi veel,
Wnt/-catenin ja Notch signaaliteed võivad koordineerida Six-2 ekspressiooni reguleerimist ja on seotud Six-2 ekspressiooni allareguleerimisega nefroni eellasrakkudes. Uuringud on näidanud, et Six-2 ekspressiooni ja CM-i eellasrakkude diferentseerumata olekus säilitamiseks võib olla vajalik madal -kateniini tase; pealegi määrab kateniini kõrgenenud tase nefroni eellasrakkude saatuse [57, 58]. Seega oletame, et vähenenud cMyc ja Notchi signaaliülekanne, millega kaasnes suurenenud -kateniini ekspressioon, vähendas Six-2 ekspressiooni 17-DG LP järglastel 28 protsenti ning korreleerus varajase CM-rakkude diferentseerumisega ning vähenenud tüvirakkude ja nefronite arv täiskasvanueas. Lisaks võivad meie andmed kinnitada, et LP järglaste MM-rakkudes võivad suurenenud Let-7a-5p ja -kateniini ekspressioon ning vähenenud Notch-signaal moduleerida c-Myc, Six-2, ja Ki-67 ekspressioon, mis viib eellasrakkude eneseuuendamise vähenemiseni. Ülejäänud CM-i eellasrakkude ammendumine viib nefronite arvu vähenemiseni ning arteriaalse hüpertensiooni janeeru-häired täiskasvanueas (joonis 10). Kooskõlas Boivini jt omadega näitavad meie tulemused, et suurenenud CM-kateniinisisaldus häirib UB kasvu ja nefrogeneesi [59]. Uuringud on näidanud, et kasvufaktori gliiast tuletatud neurotroofne faktor (GDNF), mis on UB kasvu oluline regulaator, annab signaale c-Ret türosiinkinaasi retseptori ja Gfra1 kaasretseptori kaudu [60, 61]. 17-DG LP järglaste hulgas on märkimisväärne
c-Ret retseptorit kodeeriva mRNA suurenemine tooks teoreetiliselt kaasa UB kasvu tõusu. Kuid selles uuringus ei muutunud GDNF ekspressioon, mis viitab sellele, et hoolimata cRet mRNA suurenemisest, vähenes UB hargnemine. Varem täheldasime kusejuhade okste vähenemist 28,3 protsenti pärast 14,5-päevast gestatsioonivalgu piiramist [4], mida võib seostada MM-rakkude Six-2 märgistamise vähenemisega 28 protsenti, vaatamata sellele, et GDNF ei muutunud. transkriptsioon. -kateniin interakteerub tõenäoliselt c-ret retseptoriga ja transporditakse UB-raku tuuma, soodustades TGF -1 ekspressiooni epiteelirakkudes, inhibeerides UB hargnemist ja põhjustades CM-i eellasrakkude enneaegset diferentseerumist, nagu on näha {{11} }DG LP järglased [62–64]. Seetõttu ei pruugi GDNF olla oluline mesenhümaalsete signaalide vahendamisel kuseteede pungale; mehhanism tuleb aga veel välja selgitada. Tõepoolest, oleme näidanud, et 17-DG LP järglaste MM näitas Let-7 miRNA ekspressiooni spetsiifilist suurenemist, mille tulemuseks oli märkimisväärselt halvenenudneerudarengut, kinnitades seeläbi nende geenide moduleerivat rolli nefrogeneesi arengu ajastuses [65].
Esialgsetes insuliinitaolise kasvufaktori (IGF) uuringutes selgitati IGF-1 ja -2 domineerivat rolli loote kasvus rohkete, kuid enamasti kaudsete tõenditega. Leiti, et IGF-id toimivad kultiveeritud looterakkudes ja implantatsioonieelsetes embrüodes proliferatsiooni- ja diferentseerumisfaktoritena. Lisaks leiti, et kultiveeritud looterakud ja eksplantaadid sekreteerivad IGF-e in vitro [66]. Kasvufaktorid, sealhulgas IGF, võivad põhjustada osalist või täielikku epiteeli-mesenhümaalset üleminekut. IGF-i radade aktiveerimine põhjustab EMT ülesreguleerimist, indutseerides ZEB1 ekspressiooni [67]. Kuigi sellega on seotud mitmed kandidaatide kasvufaktoridneerudei ole teada, kas nad on seotud nefrogeneesiga. Erinevatel aegadel võib vaja minna erinevaid kasvufaktoreid. Mõned kasvufaktorid võivad selles kontekstis olla üleliigsed. Embrüonaalse arengu ajal on spetsiifiliste rakutüüpide eristamiseks ja kolmemõõtmelise struktuuri loomiseks vaja järjestikuseid EMT ja MET ringe. Selles uuringus leiti, et mesenhümaal-epiteeli interkonverteeritavus säilitab raku plastilisuse, mis viitab embrüo LP-tingimustes väga indutseeritava süsteemi olemasolule. Let-7 miRNA perekonna ekspressiooni on laialdaselt uuritud erinevates loote kudedes. Let-7 miRNA ekspressiooni suurenemine on seotud vähenenud proliferatsiooni ja MM-rakkude diferentseerumise varajase suurenemisega ning sellest tulenevalt vähenenud nefronite arvuga [27, 15, 68–71]. Kõrgemat Let-7 ekspressiooni on demonstreeritud kõrgemates organismides näriliste ajuembrüogeneesi viimases faasis [72, 73]. Nagalakshmi jt. näitas, et Let-7 miRNA ekspressioon muutis UB epiteelirakkude saatust prekursorist diferentseerunud olekusse [71]. Seevastu Yermalovich et al. näitasid, et RNA-d siduva valgu Lin28b üleekspressioon on seotud supresseerivate Let-7 miRNA-dega. Kuigi lin28 ja Let-7 on selgrootute ontogeense ajastuse regulaatorid, ei mõisteta nende rolli imetajate elundite arengus [65]. Selles uuringus võib Let-7a-5p miRNA ekspressiooni suurenemist LP-lootel seostada vähenenud CM-rakkude proliferatsiooniga, mis ohustab nefrogeneesi võrreldes NP-rühmaga. Seega oletame, et suurenenud Let-7 miRNA-st põhjustatud CM-rakkude proliferatsiooni pärssimine ja nefrogeneesi varajane peatumine võib toimuda otseselt või kaudselt Lin28b ajutise vähenemise kaudu 17-DG LP-s. See mõju võib oluliselt halvenedaneerudarengut 17-DG LP-s, mis kinnitab, et see geen reguleerib nefrogeneesi ajal arengu ajastust. Selles uuringus langeb suurenenud Let-7a-5p miRNA ekspressioon kokku c-Myc ekspressiooni vähenemisega. Myc osaleb proliferatsioonis, kasvus, apoptoosis ja rakkude diferentseerumisesneeru-organogenees [74–76]. LP 17-DG järglastel vähenes MM c-Myc geeni ekspressioon ja CM c-Myc immunoreaktiivsuse pindala oli 14 protsenti väiksem kui NP järglastel. Samal ajal täheldati CM-rakkude arvu 14-protsendilist vähenemist, mis vähendab Ki-67-immunoreaktiivsust LP-s võrreldes NP-järglastega 48 protsenti. Järjekindlalt on uuringud näidanud, et c-Myc mängib olulist rolli UB hargnemise lõppfaasis ja CM-i eellasrakkude proliferatsiooni stimuleerimisel [74].
CISTANCHE PARANDAB NEeru-/NEERUNEKTSIOONI
vähenenud tase tüvirakkudes, säilitades need diferentseerimata olekus. Kuid selles uuringus vähendas Let-7a-5p miRNA tugev ekspressioon CM-is c-Myc ekspressiooni, vähendades seeläbi eellasrakkude proliferatsiooni ja varajast rakkude diferentseerumist LP 17-DG-s. järglased (joonis 10). Uuringud teemalneerudc-Myc transgeensete hiirte uuringud näitasid c-Myc ja S-ix-2 immunopositiivsete CM-rakkude samaaegset vähenemist, mis on seotud tüvirakkude proliferatsiooni vähenemisega [74]. See uuring näitab kuue -2 positiivse raku märkimisväärset (28 protsenti) vähenemistneeru-tüvirakkude marker, nagu nefronite arvu vähenemine, 17-DG LP järglaste CM-s võrreldes NP järglaste omaga. 2009. aastal tegid Fogelgren jt. näitasid, et kuue{2}} geeni ekspressioon väheneb loote ontogeneesi ajal, kui see on seotud nefronite arvu vähenemise, hüpertensiooni ja krooniliseneerupuudulikkus[77]. Seega näitab Six-2 geeni vähenenud ekspressioon CM-i eellasrakkudes signaali poolt indutseeritud diferentseerumise pärssimistneeru-areng 17-DG LP järglastes. Sellegipoolest tuleks liiasust kasutada ettevaatusega – üksikasjalikuma analüüsi käigus või erinevatel tingimustel võivad ilmneda peened nefrogeneesi defektid. IGF1 mRNA tase oli kõrgeim metanefrilise arengu algperioodil, transkripte tuvastati kogu MM-is, samas kui nende tase langes edasise arengu ajal. Siiski ajalneerudembrüogenees, õrn tasakaal nefroni soodustavate kasvufaktorite (IGF1) ja inhibeerivate kasvufaktorite (TGF -1) vahel reguleerib UB hargnemist.
Järeldus
Kuigi mitmed autorid on uurinud nefrogeneesi [34, 37, 78], on nefronite arvu määravate mehhanismide kohta vähe teada. See uuring näitab, et paljud MM-i eellasrakkude miRNA-d, mRNA-d ja valgud on 17-DG LP järglastes muutunud, mis viib proliferatsiooni vähenemiseni ja rakkude varase diferentseerumiseni (joonis 11). See õrn tasakaal nefroni eellasrakkude uuenemise ja diferentseerumise vahel on olulineneerudareng, sest suutmatus saavutada piisavat arvu nefroneid on kroonilise riskitegurneeru-häire.
