Neeru pildistamine: valgusest ülilahutusega mikroskoopiani

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Maria Lucia Angelotti^1,2, Giulia Antonelli^1,2 Carolina Conte^1,2ja Paola Romagnani^1,2

ABSTRAKTNE

Olulised saavutused aastalneerudfüsioloogilisi ja patofüsioloogilisi mehhanisme võib suures osas seostada mikroskoopia tehnoloogia arenguga. Suur osa sellest, mida me teame selle arhitektuuri kohtaneerudpõhineb anatoomiliste mikroskoopide fundamentaalsetel kirjeldustel, kasutades valgusmikroskoopiat ja hiljem elektronmikroskoopia abil saadud ultrastruktuurianalüüsi. Neid kahte tehnikat kasutati neeruhaiguste esimeste klassifikatsioonisüsteemide jaoks ja nende pidevaks ajakohastamiseks. Hiljuti lisasid mitmed uudsed pildistamistehnikad analüüsi aja ja ruumi edasistes mõõtmetes. Konfokaalne mikroskoopia võimaldas meil järjestikku visualiseerida optilisi lõike piki z-telge ja spetsiifilise analüüsitarkvara kättesaadavus võimaldas paksemate koeproovide kolmemõõtmelist renderdamist. Multifotoonmikroskoopia võimaldas meil samaaegselt uuridaneerudfunktsioon ja struktuur reaalajas. Fluorestsents-eluaegne pildimikroskoopia võimaldas meil uurida metaboliitide ruumilist jaotust. Ülieraldusvõimega mikroskoopia suurendas tundlikkust ja eraldusvõimet kuni nanoskaala tasemeni. Krüoelektronmikroskoopia abil saavad teadlased visualiseerida üksikuid biomolekule aatomitasanditel otse kudedes ja mõista nende koostoimet rakusisesel tasemel. Lõpuks võimaldas maatriksi abil laserdesorptsiooni / ionisatsiooni kujutise massispektromeetria mõõta koelõikudel suure eraldusvõimega sadu erinevaid molekule. See ülevaade annab ülevaate saadaolevatestneerudpildistamise strateegiad, keskendudes uusimate tehnoloogiliste täiustuste võimalikule mõjule.

Märksõnad:immunohistokeemia,neerudbiopsia, podotsüüdid,proksimaalnetuubul, tüvirakud

Cistanche herba neeruhaiguste korral, proovi saamiseks klõpsake siin

SISSEJUHATUS

TheneerudSelle erinevate füsioloogiliste funktsioonide täitmiseks on vaja põnevat struktuurilist keerukust. Alguses uuridesneerudpiirdus makroskoopiliste vaatlustega ja nende panus neeruhaiguste diagnoosimisse oli vaieldamatult piiratud. Kirjeldati kliinilisi ilminguid, kuid nende aluseks olevad patogeneetilised mehhanismid olid teadmata. Neerude füsioloogia ja patofüsioloogia mõistmise saavutusi võib suures osas seostada jätkuva arenguga mikroskoopia valdkonnas. Katsed juuresneerudpildistamine algas kaua aega tagasi [1]. 1666. aastal uuris anatoom Malpighineerudkude valgusmikroskoobiga, mille võimsus oli hinnanguliselt 25–30 ja mis kirjeldas esimest korda glomeruli kui "nääret, milles uriin eraldati verest"[2]. Seda panust eirati kuni 1842. aastani, mil Sir William Bowman nefronistruktuurid 10 korda võimsama valgusmikroskoobiga lahti harutas. Bowman avastas periglomerulaarse kapsli (hiljem nimetati Bowmani kapsliks), mis on anatoomiliselt ühendatud tuubuli esimese osaga [3]. 1862. aastal kirjeldas Jacob Henle tema nime saanud silmusetaolist tuubuli segmenti, mis ühendas kortikaalset tuubulit ja neerupapilli.

Tänu valgusmikroskoopia kasutuselevõtule on histomorfoloogiline klassifikatsioonneerudhaigusedsai võimalikuks [1]. Võimalus jälgida haigete neerudega toimuvat võimaldas mõista, et patoloogilised muutused varieerusid sarnaste kliiniliste ilmingutega patsientidel märkimisväärselt. Esimesed uuringud neerukoe patoloogiliste muutuste kohta tehti aga lahanguproovidega, mis viisid enamasti krooniliste haiguste kirjeldamiseni. Neerupatoloogiate arengu ja autolüütiliste nähtuste tehnilise probleemi kohta teabe puudumine, mis on seotud surmajärgsete kudede kasutamisega, piiras teadmisi inimeste haigustest. 1951. aastal tutvustatineerudbiopsia võimaldas otse jälgida ja uurida mitte ainult kroonilisi, vaid ka ägedaid neeruhaigusi. Vahepeal muutus mikroskoopia järk-järgult keerukamaks, tundlikkuse ja eraldusvõimega suurenes järk-järgult kuni nanoskaala tasemeni. Selles ülevaates anname ülevaate neerude fundamentaalsetest avastustest, mis on tehtud võimalikuks tänu mikroskoopiatehnoloogia edusammudele, keskendudes uusimatest tehnilistest arengutest tulenevatele võimalustele.

NEERI IMMUNOPATOLOOGIA VISUALISEERIMINE

Immunomärgistus ja fluorestsentsmikroskoopia

Võimalus saada eluskoe esinduslik fragment võimaldas rakendada uusi tehnikaid, mis nõudsid kudede maksimaalset säilitamist, näiteks immunohistokeemilisi meetodeid (esmalt fluorestseeruv, seejärel ensümaatiline). Tegelikult töötas Coons 1950. aastal välja meetodi antikehade märgistamiseks fluorestseiini isotsüanaadiga, see tähendab immunofluorestsentsiga, hävitamata võimet reageerida spetsiifiliselt nende koe antigeenidega. Sellest ajast alates on immunofluorestsentsi lisatud külmutatud neerubiopsia proovide hindamise diagnostilisesse protseduuri. Esimest korda võimaldasid need meetodid jälgida glomerulonefriidi põdevatel patsientidel intrarenaalseid immunoglobuliine (Ig) ja komplemendi ladestumist, aidates kaasa teatud mittespetsiifiliste koekahjustuste, näiteks poolkuu glomerulonefriidi, erinevate patofüsioloogiate eristamisele [4]. Lisaks viis võimalus jälgida iseloomulikku värvimismustrit ja fluorestseiini sidumist muude antikehadega peale immunoglobuliin G (IgG) immunoglobuliin A (IgA) ladestumise tuvastamiseni IgA nefropaatia korral, samuti komplemendi ladestumist nakkusjärgse glomerulonefriidi korral. ja membranoproliferatiivne glomerulonefriit [4].

Konfokaalne mikroskoopia

Fluorestsentsmikroskoopia läbis 1980. aastate lõpus konfokaalse mikroskoopia kasutuselevõtuga märkimisväärselt tehnilisi täiustusi. Konfokaalse mikroskoopia põhielemendid on punktvalgustus, mis on fokuseeritud ja skaneeritud proovi kohal, ning detektori ees olev muutuv konfokaalne ava (nõelauk), mis võimaldab koguda valgust ainult õhukesest fookustasandit ümbritsevast osast (nn optiline sektsioon). Konfokaalne mikroskoopia võimaldas teha esimesi in vivo neeruuuringuid eksperimentaalsetes mudelites ning jälgida fluorestseeruvate molekulide omastamist ja transporti puutumatutes tuubulites.neerudpärast mikropunktsiooni. See võimaldas uurida torukujulist funktsiooni füsioloogilistes ja patoloogilistes tingimustes [5].

The possibility to sequentially image optical sections along the z-axis and the availability of specific analysis software permitted a three-dimensional (3D) rendering of thicker tissue specimens, showing the frequent inconsistency and misrepresentations provided by 2D analyses [6, 7] (Figure 1A and a'). In addition, the introduction of genetically encoded fluorescent proteins in transgenic mice permitted the labeling of specific cells and tracing them directly within tissues without immunostaining (lineage tracing strategy) [6, 7, 8]. However, confocal microscopy still did not resolve details >200 nm nähtava valguse difraktsioonipiiri, fotopleegitamise ja fototoksilisuse tõttu.

GLOMERULAARSE FILTRATSIOONITÕKIST ARUSTAMINE: ELEKTRONMIKROSKOOPIA

Esimene katse ületada valgus- ja fluorestsentsmikroskoopide eraldusvõime piir oli 1931. aastal, kui Ernst Ruska ja Max Knoll leiutasid elektronmikroskoobi (EM), mis kasutab ergastusallikana valguskiire asemel kiirendatud elektronide kiirt. ja selle lahutusvõime on suurem kui valgusmikroskoobidel (kuni 0,2 nm). Selle uuenduse eest pälvis Ernst Ruska 1986. aastal Nobeli füüsikaauhinna. Tänu suurenenud eraldusvõimele sai peagi selgeks, et glomerulus ei olnud lihtsalt mehaaniline filter, vaid äärmiselt keeruline organ, mis koosneb kolmest kihist: endoteelirakkudest, glomerulaarsest alusmembraanist (GBM) ja podotsüütidest [9]. Transmissioon EM (TEM) võimaldas visualiseerida glomerulaarrakke seestpoolt [10] ja näitas, et endoteelirakkudel olid õhukesed fenestreeritud rakukehad, samas kui podotsüütidel olid suured rakukehad ning laienevad primaarsed ja sekundaarsed "jala" protsessid, mis olid kinnitatud GBM-i külge ja on omavahel ühendatud. lineaarsed ristmikud (kerge diafragma) (joonis 1B). Lisaks võimaldas EM-i (SEM) skaneerimine, mis püüdis tagasi hajutatud elektrone, visualiseerida glomerulaarrakke nende välispinnalt [10] ja näitas, et naabruses asuvate podotsüütide jalaprotsessid lõikuvad ja katsid GBM-i (joonis 1C). EM on jäänud võimsaks vahendiks mitte ainult normaalse glomerulaarse ultrastruktuuri mõistmisel, vaid ka mõistmisel.neerudfüsioloogia ja patofüsioloogia [11]. Arvukad uuringud, mis on tehtud inimproovidega või eksperimentaalsete mudelitega, on näidanud, et erinevad haigusprotsessid on seotud ultrastruktuursete muutuste iseloomulike mustrite kogumiga, mis eeldab areneva klassifikatsioonisüsteemi edasist uuendamist.neerudhaigused. Tehniline võime visualiseerida neerude ultrastruktuuri edasist keerukust toetas nefropatoloogide spetsialiseerumist.

Hiljutine SEM-tehnika, mis põhineb ülitundlikul detektoril, võimaldas uurida pilumembraani sügavaimat osa ja näitas, et seda iseloomustavad erineva suurusega poorid [12]. Rottidel seostati proteinuuria tekkimist suurte pooridega, mis suurendas võimalust, et pilu diafragma ultrastruktuursed muutused võivad põhjustada muutusi glomerulaarses permselektiivsuses [12]. Täiendava tehnilise edasiminekuna võimaldas plokipinnaga SEM läbida glomerulaarfiltratsiooni barjääri 2D-vaatest 3D-vaatele eraldusvõimega, mis on piisav, et jälgida tervete hiirte, haigete hiirte ja rakkude kõige õhemate protsesside nanostruktuuri.neerudareng [13, 14].

Lõpuks võimaldas EM-i ühendamine röntgenikiirte mikroanalüüsi süsteemiga (röntgenmikroskoopia) rakkude või rakuosade elementaaranalüüsi ultrastruktuuri tasemel. Röntgenmikroskoopia kasutab proovi ergastamiseks skaneerivat TEM-i kitsa elektronkiirega. Kiirelt tulevate suure energiaga elektronide kokkupõrge proovides olevate aatomitega tekitab energiat röntgeni footonite kujul. Seda energiat hajutava pooljuhtdetektoriga kogutud röntgensignaali kasutatakse proovis esinevate elementide tuvastamiseks parimal juhul 30 nm eraldusvõimega. AastalneerudBeck ja Thurau kasutasid röntgenikiirte mikroanalüüsi edukalt transepiteliaalsete tuubulite ioonide transpordi [15] ja rakusiseste elementide kontsentratsiooni uurimiseks tubulaarsetes rakkudes [16].

NEERU FÜSIOLOOGIA VISUALISEERIMINE MULTIFOTONMIKROSKOOPIAGA

Multifotoonmikroskoopia (MPM) andis edasise edusammuneeruduuringud, st võimalus samaaegselt uurida neerufunktsiooni ja struktuuri suhteid reaalajas [17]. Erinevalt tavapärastest valgusmikroskoopidest sõltub kahe footoni ergastus kahe footoni samaaegsest neeldumisest kahekordse ergastuslainepikkusega, mis on vajalik fluorofoori ergastamiseks klassikalises ühefootonilises ergastuses (joonis 1D). Kaubanduslikult saadavate impulss-infrapuna-, madala energiatarbega ergastuslaserite kasutamine suurendas sügavale kudedesse tungimist ja minimeeris fototoksilisust (joonis 1D). See võimaldas teadlastel visualiseerida dünaamilisi rakuprotsesse otse elusloomadel, mis ei olnud varem ühegi teise tehnikaga saavutatav. MPM võimaldab kvantifitseerida põhilisi neerufunktsioone ja patoloogilisi muutusi, nagu glomerulaarne läbilaskvus, veresoonte verevool, ühe nefroni glomerulaarfiltratsiooni kiirus ja tubulaarvool [17] (joonis 1E ja F). Lisaks võimaldab MPM uurida rakusiseseid protsesse vastuseks vigastustele, sealhulgas rakusurma ja rakusurma, leukotsüütide veeremist ning GBM-i värbamist ja häireid [17]. Täiendavad tehnilised täiustused on võimaldanud pikaajalist intravitaalset pildistamist päevade kuni nädalate jooksul [18], mida koos fluorestseeruvaid valke ekspresseerivate transgeensete hiirtega on kasutatud üksikute rakkude saatuse jälgimiseks otse in vivo tervetes ja vigastatud neerudes [19] ja paremini mõista neerurakkude uuenemise ja regenereerimise mehhanisme.

MPM-iga olid võimalikud ka sildivabad pildistamistehnikad, kasutades nikotiinamiidadeniindinukleotiidhüdraadi (NADH) loomulikku autofluorestsentsi, et uurida torurakkude kahjustuse järgset redoksseisundit [20]. Lisaks kasutati neerufibroosi markeri kollageeni ladestumise kvantifitseerimiseks fibrillaarsest kollageenist pärit teist harmoonilist generatsiooni [21]. Teine harmooniline generatsioon on mittelineaarne optiline protsess, mille käigus kaks sama lainepikkusega ergastusfootonit interakteeruvad bioloogiliste kudede mittetsentrosümmeetriliste struktuuridega, nagu kollageen või mikrotuubulid, ja genereerivad uue footoni poole lainepikkusega.

Hiljutine intravitaalse mikroskoopia uuendus oli miniatuurse multifotoni endoskoobi kasutuselevõtt, mida kasutati edukalt neerude pildistamiseks tuimastatud elusate hiirte puhul [22]. See minimaalselt invasiivne MPM võib sillutada teed reaalajas in vivo diagnoosimiseks, ilma kudede eemaldamiseta ja väga lühikese aja jooksul.

NEER 3D-s: KUDE PUHASTAMISE TEHNIKAD JA LAIENDAMIKROKOOPIA

Vaatamata tehnoloogilistele täiustustele on sügavama mahulise pildistamise üheks peamiseks piiranguks neerukoe läbipaistmatus, mis muudabneerudüks optiliselt kõige keerulisemaid organeid. See on põhjus, miks kudede puhastamise tehnikad on äratanud suurt huvi [23]. Nende lähenemisviiside eesmärk on muuta läbipaistmatu kude läbipaistvaks, säilitades valke ja lõpuks fluorestseeruvaid markereid, et kujutada paksu koelõike. Optilise puhastamise ja tipptasemel mikroskoopia kombinatsioon annab võimaluse morfomeetriliseks analüüsiks, näiteks glomerulaarde mahu ja arvu kvantifitseerimiseks paksudes kudedes või isegi terves neerus [24]. Muud rakendused hõlmavad erinevate tuubulite segmentide [25] analüüsi, nende funktsioone [26] ja podotsüütide kadumise kvantifitseerimist [27].

Suurte koekoguste pildistamiseks ja samal ajal peente struktuuridetailide lahendamiseks võeti hiljuti kasutusele uus tehniline lähenemisviis, st ekspansiivne mikroskoopia (ExM). Idee on füüsiliselt laiendada tervet organit 4- kuni 5-voltimiseks, säilitades samal ajal üldise arhitektuuri ja 3D-proteoomi sisu. Kasutades paisuvat polümeeri, mis on otse sünteesitud proovis, eraldatakse valguse difraktsioonipiirile lähemal olevad molekulid isotroopselt ruumis suuremate vahemaadeni ja seetõttu saab neid optiliselt lahutada isegi tavalise fluorestsentsmikroskoobiga. Lisaks pakub ExM suuremat optilist läbipaistvust ja vähendab valguse hajumist, võimaldades visualiseerida suuremat kudede mahtu. Seda lähenemisviisi kasutades saab mitme valgu lokaliseerimist pilu diafragmas ja GBM-is eraldada isegi tavalise konfokaalse mikroskoobiga [28]. Näiteks võib see paljastada proteinuuriliste hiirte jala protsesside tuhmumist nii 2D- kui ka 3D-vormingus nanomeetrilise eraldusvõimega, mida pole kunagi varem saavutatud [29]. Hiljuti on ExM-i kasutatud hematoksüliini ja eosiiniga juba värvitud parafiiniga manustatud proovide kliiniliseks histopatoloogiliseks hindamiseks [30]. Selle tehnika abil saab visualiseerida jalgade protsesside eemaldamist nanoskaala tasemel, mis varem oli võimalik ainult EM-ga. Mahulise pildistamise edusammud võimaldavad kogu elundi kõrge eraldusvõimega 3D-analüüsi nii, et süvapildistamise peamiseks piiranguks on nüüd antikehade võime koesse tungida.

AINEVAHETUSPROFIILI UURIMINE: SAGEDUS-DOMEEENI fluorestsentsi-eluea PILDISE MIKROSKOPIA

Theneerudon suure mitokondrite sisaldusega ainevahetusorgan. NADH ja teiste metaboliitide redutseeritud vorm on loomulikult fluorestseeruv ja seda autofluorestsentsi saab kasutada redoksoleku indeksina [20]. Kuid nende endogeensete fluorofooride emissioonispektrid kattuvad ja nende eraldi tuvastamine oli võimatu. Kuid leiti, et fluorestsentsi eluiga (st fluorestsentsi ajaline vähenemine) on oluliselt erinev. Seega võimaldab fluorestsents-eluaegne kujutismikroskoopia (FLIM) uurida metaboolseid profiile [31]. Hiljuti on MPM-i ja FLIM-i kombinatsiooni abil saanud võimalikuks iseloomustada rakuspetsiifilisi metaboolseid signatuure ja jälgida metaboolseid muutusi in vivo ajal.neerudhaigus [32]. FLIMilt oodatakse täiendavat teavetneerudainevahetus in vivo tervises ja haigustes.

RESOLUTSIOONI LÜKKAMINE ÜLE PIIRIDE: NEERI SUPERLAHUTUSKUJUTUS

Standardse valgusmikroskoopia optilise eraldusvõime piir on üle 200 nm. Uued tehnoloogiad, mida nimetatakse ülieraldusvõimega pildistamiseks, võimaldavad nüüd nanoskoopia ajastu lähtepunktina fluorestsentsmikroskoopia abil pildistada üle difraktsioonipiiri [33]. Need lähenemisviisid ühendavad nanoskoopilise eraldusvõime mitmevärvilise fluorestsentsmärgistuse eelistega. Tunnustades nende uuenduste võimalikku mõju, anti 2014. aasta Nobeli keemiaauhind Eric Betzigile, Stefan Hellile ja William Moernerile ülilahutusega fluorestsentsmikroskoopia väljatöötamise eest. Erinevate bioloogiliste küsimuste lahendamiseks saab rakendada erinevaid ülieraldusvõimega pildistamise strateegiaid. Need lähenemisviisid võib rühmitada kahte põhikategooriasse, olenevalt sellest, kas ülieraldusvõimet kasutatakse üksikute molekulide või ansamblite tasemel [33].

Ansamblipõhised tehnikad

Ansamblipõhised tehnikad rikuvad difraktsioonipiiri, moduleerides ergastava valguskiire ajaliselt ja ruumiliselt. Nende hulgas kasutatakse ülieraldusvõimega stimuleeritud emissiooni kahanemise (STED) pildistamisel kahte laserit, ergastuslaserit ja üksteise peale asetatud punase nihkega ammendumise laserit (STED-laser), millel on sõõriku kuju, et pärssida kõrval asuvate fluorofooride fluorestsentsi emissiooni. ergastuse keskpunkt. See mahasurumine saavutatakse stimuleeritud emissiooni kaudu ja see võimaldab koguda ainult signaali, mis pärineb fookuspunktist, mille mõõde on allpool difraktsioonipiiri (joonis 2A). Pilu diafragma pildistamiseks optiliselt puhastatuna kasutati STED-kujutistneerudkudedes (joonis 2B–c') ja võimaldas lokaliseerida podotsiini ja nefriini ruumilise jaotuse nanomeetri skaalal kuni vähemalt 30 lm sügavusele [34]. Lisaks võib võimalus jälgida ja kvantifitseerida jala protsessi kadumist eksperimentaalses mudelis, et STED-pildistamine oleks kasulik glomerulaarfiltratsiooni barjääri uuringutes [34].

STED-mikroskoopia jaoks on vaja spetsiaalseid protokolle proovide ettevalmistamiseks, spetsiaalseid fluorofoore ja tehnilist koolitust. Sel põhjusel on viimastel aastatel rohkem tähelepanu pööratud teisele ülieraldusvõimega tehnikale, struktureeritud valgustusmikroskoopiale (SIM), mis võib difraktsioonipiiri pikendada kahekordselt nii külg- kui ka aksiaalselt. SIM kasutab laia väljaga mikroskoobi seadistust, millel on peene triibuline valgustusmuster, mis võimaldab hõivata kõrgsageduslikku teavet (mis vastab proovi peentele detailidele) madalamatel ruumisagedustel. Saades mitu erineva faasi ja orientatsiooni valgustusmustriga pilti, saab rekonstrueerida kõrge eraldusvõimega kujutise (joonis 3A). SIM ühildub standardsete fluorofooridega, ei vaja spetsiifilist proovi ettevalmistamist ja võimaldab 3D-visualiseerimist. Arvestades kõiki neid eeliseid, viidi läbi erinevad uuringud, et hinnata võimalust kasutada SIM-i kiirdiagnostika tööriistana [35], näiteks potentsiaalselt lühema tööajaga kui EM. Hiljuti on 3D-SIM-kaarti ja automaatset pilditöötlust kasutatud kiire diagnostilise vahendina jalgade protsesside eemaldamisel, kasutades rutiinseid parafiinilõike minimaalse muutusega haigusega patsientide biopsiatest [36] (joonis 3B ja C). See võime edukalt tuvastada muutusi haigustes, millel on teadaolevalt nanomõõtmeline patoloogia, kinnitas SIM-i kui paljulubavat vahendit rutiinse diagnostika jaoks.

Ühe molekuli lokaliseerimisel põhinevad pildistamismeetodid

Need tehnikad tuginevad võimalusele tsükliliselt sisse ja välja lülitada üksikuid fluorestseeruvaid molekule, mis on lahustamiseks liiga lähedal. Nendes lähenemisviisides saab difraktsioonipiiranguga piirkonnas olevaid molekule aktiveerida erinevatel ajahetkedel, nii et neid saab individuaalselt kujutada ja seejärel nanomeetri täpsusega lokaliseerida, leides arvutuslikult nende keskused (joonis 3D). Nende lähenemisviiside hulgas võeti esmakordselt kasutusele stohhastiline optiline rekonstrueerimismikroskoopia (STORM).neerud2013. aastal koos uuringuga, mis paljastas GBM-i keeruka molekulaarse korralduse nanomeetri täpsusega, sealhulgas molekulide orientatsiooni [37]. Haruldase kaasasündinud nefrootilise sündroomi hiiremudelis näitas STORM laminiini 521 integreerumist ja õiget orientatsiooni GBM-is pärast intravenoosset süstimist, avades patsientidele võimaluse täiustatud ravivõimalustele [38]. Teises uuringus kirjeldati aktiini tsütoskeleti korraldust podotsüütides molekulaarsel skaalal [39] (joonis 3E–I). Uue leiuna sisaldavad podotsüüdid kokkutõmbuvaid aktiini kimpe, mis on jalaprotsessides seotud mittekontraktiilsete aktiini kimpudega. Podotsüüdi vigastuse mudelite korral lagunes aktiini struktuur jalaprotsessides, mis viis põhikeha kontraktiilse struktuuri kokkuvarisemiseni [39].

BIOMOLEKULE ALUSTE 3D STRUKTUURIDE VISUALISEMINE AatomiTASANDIL: KRÜO-ELEKTRONIKROKOOPIA

Kuni viimase ajani piirdus võimalus fundamentaalsete biomolekulide struktuuri uurida elektronmikroskoopiaga, mille lahutusvõime oli paar nanomeetrit. Tehnilised tõkked, nagu proovi kahjustus intensiivse elektronkiire, väikese kujutise kontrastsuse ja molekulide liikumise tõttu pärast interaktsiooni elektronidega või raskused bioloogilistes proovides oleva vee säilitamisel EM-kambri sees olevas vaakumis, mistõttu on võimatu eraldada väiksemaid molekule. . Proovi jahutamine võib vähendada vee aurustumist ja elektronide põhjustatud kahjustusi [40]. Sellest ideest lähtudes võeti 1950. aastatel kasutusele krüo-EM. Mõne aasta eest lükkas uue üheelektronilise loendusdetektori kasutuselevõtt eraldusvõime lõpuks varasematest piiridest kaugemale. 2017. aastal pälvisid Nobeli keemiaauhinna Jacques Dubochet, Joachim Frank ja Richard Henderson „krüoelektronmikroskoopia väljatöötamise eest biomolekulide kõrge eraldusvõimega struktuuride määramiseks lahuses”. Need edusammud võimaldavad nüüd biomolekulide struktuurset määramist lahuses [41].

sisseneeruduuringutes määrati põhivalkude struktuurid aatomitasandil [42, 43]. Nende hulgas on inimese polütsüstiini struktuur-2, mille mutatsioonid põhjustavad autosomaalse domineeriva polütsüstiinineerudhaigus [44] ja transientsete retseptoripotentsiaalide kanooniliste 6 ioonikanalite struktuur, mille mutatsioonid põhjustavad inimestel FSGS-i [43], määrati mõne angströmi eraldusvõimega [44].

NEERUHAIGUSTE MOLEKULAARSE ALUSTE MÕISTMINE: INTEGRATIIVNE NEERI MIKROSKOPIA

Viimastel aastatel on suurenenud huvi etiketivabade lähenemisviiside vastu, mis suudavad spetsiifiliselt ja samaaegselt kaardistada kudede molekulide koguspektrit [45]. Nende hulgas võimaldab maatriksi abil laser-desorptsiooni/ionisatsiooni kujutise massispektromeetria (MALDI-IMS) mõõta sadu erinevaid molekule samaaegselt otse koelõikudel kõrge eraldusvõimega. MALDI-IMS katses kaetakse õhuke külmutatud või parafiiniga kaetud koelõik maatriksiga, mis neelab laserenergiat ja soodustab koe analüütide ionisatsiooni. Massispektromeetri analüüs loob iga x/y koordinaadi jaoks spektri. Pärast MALDI mõõtmist saab sama koeosa värvida traditsiooniliste histokeemiliste ja immunohistokeemiliste protseduuridega, et integreerida molekulaarmuster histoloogiliste detailidega. Neeruuuringutes kasutatakse MALDI-IMS-i ravimite, metaboliitide, lipiidide, peptiidide ja valkude uurimiseks normaalsetes ja haigetes kudedes [45].

Üks MALDI-IMS-i kõige sagedasemaid rakendusi on molekulaarsete markerite tuvastamine neerurakulise kartsinoomi klassifitseerimiseks [46] ning vähi ja normaalse koe vahelise tõelise piiri määramiseks nii molekulaarsel kui ka histoloogilisel tasemel [47]. MALDI-IMS-i on edukalt kasutatud ka neerude ravimite toksilisuse uurimiseks, et tagada toksiliste ainete varane avastamineneerudravimikandidaatide vahendatud kahjustuste mehhanismid [48]. Lisaks kasutatakse MALDI-IMS-i lipiidide ja nende rolli uurimiseks neerupatoloogiates, nagu diabeetiline nefropaatia [49], äge neerukahjustus [50] ja polütsüstiline haigus.neerudhaigus [51] ning paljastada ka endogeensed metaboolsed profiilid haigusega seotud mehhanismide sügavamaks mõistmiseks [52]. Molekulaarsete profiilide tuvastamine viidi lõpule ka võimalike biomarkerite jaoks, mis võiksid olla uued potentsiaalsed diagnostilised ja prognostilised biomarkerid [53, 54].

JÄRELDUSED JA TULEVIKUPERSPEKTIIVID

Pildistamistehnikate pidev täiustamine on järk-järgult lahendanud palju kriitilisi tehnilisi tõkkeidneerudon võimaldanud dünaamiliselt kujutada normaalsete ja haigete neerude struktuuri ja funktsiooni. Tõepoolest, uute mikroskoopiatehnoloogiate tulek on võimaldanud fundamentaalseid teaduslikke avastusi ja seejärel muutnud meie vaadet neerude füsioloogiale ja patofüsioloogiale, mida saab nüüd visualiseerida 3D-s ja isegi filmida videotes, kus aeg esindab neljandat dimensiooni. Hiljutise ülilahutusvõimega mikroskoopia tehnoloogilise innovatsiooni ja molekulaarse pildistamise tehnikate edenemisega saavad teadlased nüüd visualiseerida üksikuid biomolekule otse kudedes ja teha kindlaks, kuidas need raku- ja subtsellulaarsel tasandil interakteeruvad.

Võimalus rakendada neid vahendeid patoloogiliseksneerudproovid, mis keskenduvad kliinilistes biopsiates molekulaarsetele ja subtsellulaarsetele üksikasjadele, peaksid aitama haiguste ümberklassifitseerimisel. Kas ja millal see mõjutab neeruhaiguse diagnoosimist või isegi patsiendi juhtimist, on praegu ebaselge.

RAHASTAMINE

Rahastuse andis Euroopa Teadusnõukogu Euroopa Liidu teadus- ja innovatsiooniprogrammi Horisont 2020 raames (toetusleping 648274).

VIITED

1. Weening JJ, Jennette JC. Neerupatoloogia ajaloolised verstapostid. Virchows Arch 2012; 461: 3–11

2. Malpighi M. De Viscerum Structura exercitatio anatomica. Bologna1666

3. Bowman W. Malpighi kehade ehitusest ja kasutamisestneerud, koos tähelepanekutega selle näärme kaudu vereringe kohta. Philos Trans R Soc A 1842;132:57–80

4. D'Agati VD, Mengel M. Neerupatoloogia tõus nefroloogias: struktuur valgustab funktsiooni. Olen JNeerDis 2013; 61: 1016–1025

5. Ohno Y, Birn H, Christensen EI. In vivo konfokaalne laserskaneeriv mikroskoopia ja mikropunktsioon intaktsetel rottidel. Nephron Exp Nephrol 2005; 99: e17–e25

6. Romoli S, Angelotti ML, Antonelli G. CXCL12 blokaad taastab eelistatavalt kortikaalsetes nefronites kadunud podotsüüdid, sihites sisemise podotsüütide ja eellaste tagasiside mehhanismi.NeerInt 2018; 94:1111–1126

7. Lazzeri E, Angelotti ML, Paired A et al. Endotsükliga seotud tubulaarsete rakkude hüpertroofia ja eellasrakkude proliferatsioon taastavad neerufunktsiooni pärast ägedatneerudvigastus. Nat Commun 2018; 9: 1344

8. LeHir M, Kriz W. Uued arusaamad glomeruloskleroosiga esinevatest struktuursetest mustritest. Curr Opin Nephrol Hypertens 2007; 16: 184–191 9. Tisher CC. Funktsionaalne anatoomianeerud. Hosp Pract 1978; 13

10. Liapis H. Elektronmikroskoopia sisseneeruduurimus: nägemine on uskumine. Ultrastruct Pathol 2013; 37: 340–345

11. Tugev ML, Evers P. Neerudiagnostika kolmas mõõde. Normaalsete ja ebanormaalsete neerude skaneeriv elektronmikroskoopia. S Afr Med J 1979; 55:174–177

12. Gagliardini E, Conti S, Benigni A et al. Glomerulaarse epiteeli filtreerimispilu poorse ultrastruktuuri pildistamine. J Am Soc Nephrol 2010; 21:2081–2089

13. Lausecker F, Tian X, Inoue K et al. Vinculiin on vajalik glomerulaarbarjääri terviklikkuse säilitamiseks.NeerInt 2018; 93: 643–655

14. Ichimura K, Kakuta S, Kawasaki Y et al. Podotsüütide arengu morfoloogiline protsess, mis selgus plokk-näo skaneeriva elektronmikroskoopia abil. J Cell Sci 2017; 130: 132–142

15. Rick R, Dorge A, Beck FX jt. Transepiteliaalse ioonitranspordi elektronsond-röntgenikiirguse mikroanalüüs. Ann N YAcad Sci 1986; 483: 245–259

16. Thurau K, Dorge A, Mason J et al. Intratsellulaarsed elementide kontsentratsioonid neerutuubulite rakkudes. Elektronmikrosondi analüüs. Klin Wochenschr 1979;57: 993–999

17. Peti-Peterdi J, Kidokoro K, Riquier-Brison A. Uudsed in vivo tehnikad visualiseerimiseksneerudanatoomia ja funktsioon. Kidney Int 2015; 88: 44–51

18. Schuh CD, Haenni D, Craigie E jt. Pika lainepikkusega multifotoni ergastus on kasulik intravitaalseksneerudpildistamine.NeerInt 2016; 89: 712–719

19. Hackl MJ, Burford JL, Villanueva K et al. Glomerulaarsete epiteelirakkude saatuse jälgimine in vivo, kasutades seeriaviisilist multifotonpilti uutes fluorestseeruvate liinimärgistega hiiremudelites. Nat Med 2013; 19: 1661–1666

20. Hall AM, Unwin RJ, Parker N jt. Multifotooniline kujutis näitab erinevusi nefroni segmentide mitokondriaalses funktsioonis. J Am Soc Nephrol 2009; 20: 1293–1302