Inimese alfa-defensiin 5 ekspressioon inimese neerudes ja kuseteedes

Lisateabe saamiseks: ali.ma@wecistanche.com

John David Spencer et al

Abstraktne

Taust:Kuseteede steriilsust säilitavad mehhanismid pole täielikult mõistetavad. Hiljutised uuringud on näidanud antimikroobsete peptiidide (AMP) tähtsust kuseteede kaitsmisel infektsioonide eest. Siin kirjeldame AMP inimese alfa-defensiin 5 (HD5) ekspressiooni ja olulisust inimeses.neerudja kuseteedes normaalsetel ja nakatunud isikutel.

Metoodika/peamised järeldused:Kasutades inimeselt eraldatud RNA-dneerud, kusejuha ja põie koe, teostasime kvantitatiivse reaalajas PCR-i, et näidata, et HD5 kodeeriv geen DEFA5 ekspresseerub konstitutiivselt kogu kuseteedes. Püelonefriidi korral suurenes DEFA5 ekspressioon oluliseltneerud. Immunoblotanalüüsi kasutades suurenes HD5 tootmine ka püelonefriidi korral. Immunovärvimine HD5 lokaliseeris põie ja kusejuha uroteeli. Neerudes toodeti HD5 peamiselt distaalses nefronis ja kogumistorukestes. Immunobloti ja ELISA analüüse kasutades ei tuvastatud HD5-d rutiinselt nakatumata inimese uriiniproovides, samas kui HD5 tootmine uriinis suurenes E.coli kuseteede infektsiooniga.

Järeldused/olulisus:DEFA5 ekspresseerub nakatumata isikutel kogu kuseteedes. Täpsemalt, HD5 ekspresseerub kogu alumiste kuseteede uroteelis ja kuseteede kogumistorukestes.neerud. Nakkuse korral suureneb HD5 ekspressioonneerudja tasemed muutuvad uriinis tuvastatavaks. Meie teadmiste kohaselt on meie leiud esimene, kes kvantifitseeris HD5 ekspressiooni ja tootmist inimese neerudes. Lisaks on see esimene aruanne HD5 esinemise tuvastamiseks nakatunud uriiniproovides. Meie tulemused näitavad, et HD5-l võib olla oluline roll kuseteede steriilsuse säilitamisel.

Cistanche kõrvaltoimed ja Cistanche tubulosa jaoksneerudhaigus, proovi saamiseks klõpsake siin

Sissejuhatus

Kuseteed, välja arvatud kusiti luu, on tavaliselt steriilsed, hoolimata sellest, et see on fekaalifloora läheduses. Täpsed mehhanismid, mille abil kuseteede steriilsust säilitavad, ei ole hästi teada. Kuseteede kaitset toetavateks kavandatavateks mehhanismideks on uriinivool, uriini pH ja osmolaarsuse muutused, regulaarne põie tühjenemine, uroepiteeli keemilised kaitsekomponendid ja efektorimmuunrakkude epiteeli eraldumine/sissevool koos bakteriaalse stimulatsiooniga [1]. Lisaks on hiljuti näidatud, et antimikroobsetel peptiididel (AMP) on oluline roll kuseteede steriilsuse säilitamisel [2]. AMP-d, mis toimivad looduslike antibiootikumidena, mida toodavad peaaegu kõik organismid, on kaasasündinud immuunsüsteemi üldlevinud komponent. AMP-d on katioonsed molekulid, mida ekspresseerivad fagotsüütilised valged rakud ja epiteelirakud. Inimestel ja teistel imetajatel on defensiinid AMP-de peamine perekond. Defensiinidel on tavaliselt laia spektriga antimikroobne toime grampositiivsete ja gramnegatiivsete bakterite, viiruste, seente ja algloomade vastu [2,3]. Defensiinid sünteesitakse algselt preproproteiinidena ja neid töödeldakse küpseteks bioloogiliselt aktiivseteks peptiidideks [4]. Inimestel liigitatakse defensiinid ühte kahest perekonnast sõltuvalt nende disulfiidsilla mustrist – alfa-defensiinid või beeta-defensiinid [5].

Kuseteedes ekspresseeruvad beeta-defensiinid laialdaselt kogu uroepiteelis. Epiteelirakud vooderdavadneerudHenle silmus, distaalne tuubul ja kogumiskanal ekspresseerivad konstitutiivselt inimese beeta-defensiini 1 (hBD1). Kuigi hBD1 tase uriinis ei ole sissetungivate bakterite hävitamiseks piisav, tagab hBD1 torukujulistele luumenitele kiiresti toimiva antimikroobse katte ja hoiab ära nakkuse, inhibeerides bakterite kinnitumist uroteeli külge [6]. Hiljutised uuringud näitavad, et hBD1 redoksseisund mõjutab oluliselt antimikroobset toimet, nii et redutseeritud peptiid on palju tugevam kui disulfiidiga seotud oksüdeeritud vorm [7]. Selle tähtsust uroteeli pinnal ei ole kindlaks tehtud. Teine defensiin, inimese beeta-defensiin 2 (hBD2) ei ekspresseeru konstitutiivselt terves neerukoes; hBD2 ekspressiooni indutseerib aga infektsioon [8].

Erinevalt beeta-defensiinidest ei ole epiteelist pärinevate alfa-defensiinide rolli kuseteedes hästi kirjeldatud. Alfa-defensiinide HD5 ja HD6 ekspressiooni ja funktsiooni on enamasti kirjeldatud peensooles, kus Panethcells eritavad neid soolestiku krüptidesse ja aitavad kaasa soolestiku mikrobiota tasakaalule [9]. HD5 on lokaliseeritud ka meeste ja naiste suguelundites ning tõendid viitavad sellele, et see on indutseeritav ja oluline nakkuse likvideerimisel [10, 11, 12]. Uriini HD5 on tuvastatud patsientidel, kellel on tehtud niudesoole neopõie rekonstrueerimine ja niudesoole kanalite uriini suunamine, kusjuures HD5 tootmise allikaks loeti peamiselt niudesoole Panethi rakud [13, 14]. HD5-l on antibakteriaalne toime tavaliste uropatogeensete grampositiivsete ja gramnegatiivsete bakterite vastu [15]. HD5-l on ka antimikroobne toime uropatogeensete viiruste, nagu adenoviirus ja BK viirus, vastu [16, 17, 18]. Selles uuringus anname inimese HD5 ekspressiooni esialgse kirjelduse ja kvantifitseerimiseneerudja täpsemalt määratleda selle ekspressioon alumistes kuseteedes steriilsuse ja infektsiooni ajal.

Tulemused

DEFA5 mRNA ekspresseerub konstitutiivselt inimese põies, kusejuhas ja neerus

Kvantitatiivne reaalajas PCR näitab, et kõik testitud põie, kusejuha janeerudproovid ilma infektsioonita, mis ekspresseerisid konstitutiivselt DEFA5. DEFA5 ekspressioon oli alumistes kuseteedes oluliselt suurem kui ülemistes kuseteedes (p= 0.014). Põies (n=4) oli keskmine DEFA5 ekspressioon 4656637 transkripti 10 ng RNA kohta ja kusejuhas (n=4) oli DEFA5 keskmine ekspressioon 41126170 transkripti 10 ngRNA kohta (joonis 1A). . Neerudes (n=6) oli keskmine DEFA5 ekspressioon 2 9376274 transkripti 10 ng RNA kohta. DEFA5 ekspressiooni analüüsiti eraldi neerukoores, medullas ja vaagnas. DEFA5 ekspressioon ei erinenud neerupiirkondade lõikes oluliselt (p= 0,45).

DEFA5 ekspressioon ja HD5 peptiidi ekspressioon suurenevad püelonefriidi korral

Kvantitatiivne reaalajas PCR analüüs teostatudneerukuded koospüelonefriit näitas DEFA5 ekspressiooni olulist suurenemist võrreldes nakatumata neerukudedega. Püelonefriidi (n= 6) korral suurenes keskmine DEFA5 ekspressioon 7 82961 052 transkriptini 10 ng RNA kohta (p= 0,019) (joonis 2A).

Selle ekspressiooni suurenemise edasiseks hindamiseks püelonefriidi korral viisime läbi sama immunoblotanalüüsineerudkude, mida kasutati reaalajas PCR analüüsiks, et hinnata samaaegset HD5 peptiidi produktsiooni suurenemist (joonis 2B, keskmine paneel). Immunoblotanalüüs, milles kasutati polüklonaalset HD5 antiseerumit, näitas oluliselt suuremat HD5 peptiidi tootmist püelonefriidiga neerukudedes (n {{5} }) võrreldes nakatumataneerudkudedes(n=6). Mittenakatunudneerudkudedes väljendati 300625 ng HD5/grammi niiske koe massi kohtaneerudpüelonefriidiga koe ekspresseeritud 600621 ng HD5 grammi niiske koe massi kohta (p,0,0001). Blotte sondeeriti uuesti GAPDH-ga, et neid kasutada laadimiskontrollina (joonis 2B, keskmine paneel) ja valgu võrdse koormuse kinnitamiseks tehti ka hõbedane plekk (joonis 2B, ülemine paneel).

HD5 peptiidi toodetakse kogu inimese neerudes ja kuseteedes

HD5 tootmise lokaliseerimiseks kuseteedes viidi läbi immunovärvimine. Immunohistokeemia (IHC) näitas, et HD5 immunoreaktiivsus esines kõigi uuritud proovide kusejuhi ja põie uroteelis (n=4, joonis 3). IHC näitas ka, et HD5 toodeti kõigi neerukoore ja medulla tuubulites. isendid (n= 6, joonis 4). Immunofluorestsents (IF) näitas, et HD5 ekspressioon oli suurim distaalses nefronis ja kogumistuubulites (joonis 5). Interstiitium ja glomeruli ei näidanud HD5 immunoreaktiivsust. Joonistel 3, 4 ja 5 näidatud immunovärvimine viidi läbi hiire monoklonaalse HD5-vastase antikehaga (8C8), mis tunneb ära HD5 propeptiidi (Abcam, Cambridge, MA). Tulemused olid sarnased, kui kasutati küüliku polüklonaalset HD5-vastast antikeha, mis tunneb ära HD5 propeptiidi ja küpse peptiidi (andmeid pole näidatud), mis viitab sellele, et HD5 säilitatakse propeptiidina.

Püelonefriidi korral suurenes HD5 immunoreaktiivsus märkimisväärselt. HD5 immunoreaktiivsus suurenes kogu proksimaalses nefronis, distaalses nefronis ja kogumistuubulites (joonis 4 ja joonis 5). Nagu nakatumata proovide puhul, ei ilmnenud glomerulites ja interstitsiumis infektsiooniga HD5 ekspressiooni. Negatiivsed kontrollid ei näidanud HD5 immunoreaktiivsust.

Nakatunud inimese uriin sisaldab HD5 peptiidi mõõdetavas kontsentratsioonis

Immunoblotanalüüs, milles kasutati küüliku polüklonaalset antiseerumit, mis tuvastab proHD5 prekursori ja edasi töödeldud vorme, tuvastas HD5 mõõdetavad tasemed 15-st testitud uriiniproovist 13-s, mis olid nakatunud uropatogeense E.coli-ga (joonis 6A ja B). Kui see oli olemas, oli HD5 tase, normaliseeritud uriini kreatiniiniks, vahemikus 299,8–669,7630 ng HD5/mg uriini Cr (110,67 ng/mL–276,67 ng/mL), mis vastab 11,10–27,67 nmol/l. Inno-nakatunud uriiniproovid (n=15), HD5 oli avastamispiiril (,50 ng) või alla selle. Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA) samadel uriiniproovidel, kasutades hiire monoklonaalset antikeha (8C8), mis tuvastab ainult prekursori proHD5, tuvastas proHD5 mõõdetavad tasemed 13-s 15-st testitud nakatunud proovist. ProHD5 kontsentratsioon uriinis jäi vahemikku 122,78–490,060,03 ng HD5/mg uriini Cr (30,02 ng/mL–200,5 ng/mL), kui see oli olemas (joonis 7).

Arutelu

Selles uuringus pakume HD5 esialgset iseloomustust inimeselneerud, kusejuha ja põis. On näidatud, et HD5 on oluline AMP, mis hoiab ära invasiivse infektsiooni soolestikus ja on nakatumise ajal genitaaltraktis ülesreguleeritud[11,18,19,20,21]. Epiteelist pärinevad AMP-d, nagu HD5, on osutunud oluliseks kuseteede steriilsuse säilitamisel [8, 22, 23, 24]. Nende kaasasündinud limaskesta kaitsemehhanismide puudused võivad põhjustada ägedat ja/või kroonilist infektsiooni [25,26].

Meie kvantitatiivsed reaalajas PCR tulemused näitavad, et DEFA5 ekspresseerub inimeses konstitutiivseltneerud, kusejuhad ja põis. DEFA5 ekspressioon suureneb ülemistest kuseteedest alumiste kuseteede suunas – järgides uriinivoolu ja mikrobiota invasioonipunkti läheduse suurenemist. Meile teadaolevalt on see esimene uuring DEFA5 ekspressiooni kvantifitseerimiseks inimese neerudes ja põies. Hiljuti näitasid Townes jt, et normaalne distaalne kusejuha võib ekspresseerida DEFA5 [14]. Meie tulemused viitavad ka sellele, et DEFA5 ekspresseeritakse konstitutiivselt distaalses kusejuhas. Kuigi DEFA5 ekspressioon kuseteedes on peaaegu 100- korda madalam kui seedetrakti kudedes, on DEFA5 basaalne uroepiteliaalne ekspressioon võrreldav eelnevalt kirjeldatud kuseteede amprite ekspressiooniga nagu katelitsidiin, hBD-1, hBD -2 ja ribonukleaas 7[6,8,22,24,27].

Erinevalt küpsest seedetraktist, kus DEFA5 ekspresseerub kõrgel tasemel nii tervisliku seisundi kui ka infektsiooni/põletiku korral, näitavad meie kvantitatiivsed reaalajas PCR-andmed, et DEFA5 ekspressioonneerudon infektsiooniga oluliselt ülesreguleeritud [27, 28, 29]. See indutseeritav ekspressioonimuster on analoogne DEFA5 ekspressiooniga naiste reproduktiivtraktis, kus DEFA5 ekspressioon suureneb koos salpingiidiga [30]. Kuseteedes on Townes jt ​​näidanud DEFA5 suuremat ekspressiooni kuseteedes UTI-ga patsientidel, kes on läbinud niudesoole kuseteede suunamise [14].

Meie immunoblotanalüüs täiendab reaalajas PCR andmeid, näidates, et HD5 peptiidide tootmine suureneb püelonefriidi korral. See HD5 produktsiooni indutseeritav muster on sarnane mõne beeta-defensiini perekonna liikmete omaga. hBD2-l on indutseeritav tootmismuster kuseteede infektsiooni ja/või kroonilise püelonefriidi korral [8,31,32]. On näidatud, et HD5 peptiidi tootmine suureneb naiste suguelundite ülemises osas ja meeste kusitis koos põletikuga [11, 30].

Immunovärvimise abil demonstreerime, et HD5 toodetakse ühtlaselt kogu kusejuha ja põie uroteelis. Kuna valdav enamus UTI-dest tulenevad fekaalsest floorast, mis tõuseb põide, viitavad need tulemused sellele, et HD5 ekspressioon esineb kohtades, kus mikroobidega kokkupuude esineb kõige sagedamini [33]. Seetõttu on HD5 ideaalne asend, et vältida kasvavat mikroobset infektsiooni. AastalneerudHD5 toodetakse peamiselt distaalses nefronis ja kogumistuubulis. Need leiud viitavad sellele, et HD5 toodetakse kohtades, kus sellel on optimaalne antimikroobne toime. Varasemad uuringud on näidanud, et defensiinide antimikroobsed omadused sõltuvad soola kontsentratsioonist – kõrgem soolakontsentratsioon vähendab antimikroobset toimet [23,34,35]. Spekuleerime, et distaalse nefroni ja kogumistuubulite madalad soolakontsentratsioonid pakuvad HD5 antimikroobse aktiivsuse jaoks soodsat miljööd.

Immunoblot ja ELISA analüüs näitavad ka, et HD5 eritub uriiniga madalal tasemel. Arvestades proHD5 ja täielikult töödeldud HD5 suurust (8,1 kDa ja 3,7 kDa) ja positiivset laengut, on võimalik, et mõni uriini HD5 peptiid pärineb vähemalt osaliselt plasmafiltraadist. Siiski on vähe tõendeid selle kohta, et HD5 püsib plasmas [27]. Lisaks peaks HD5 uriinis ilmumiseks põgenema tõhusate peptiidide absorptsioonimehhanismide eest proksimaalses tuubulis [6, 36]. Lõpuks tsentrifuugiti kasutatud uriiniproove enne analüüside läbiviimist, eemaldades HD5 rakulised allikad.

Tuvastatud kontsentratsioonide juures ei ole uriini HD5 tõenäoliselt otseselt antimikroobne uropatogeensete mikroorganismide vastu, kuna täielikult töödeldud HD5 minimaalne inhibeeriv kontsentratsioon (MIC) on 6–10 mg/ml tavaliste gramnegatiivsete uropatogeensete bakterite suhtes [15]. Limaskesta pinnakontsentratsioonid on aga tõenäoliselt suuremad. Lisaks näitab immunoblotanalüüs, et HD5 kontsentratsioonid on oluliselt suuremadneerud. Need tulemused viitavad sellele, et HD5 osaleb kuseteede limaskesta kaitses. Analoogne muster on näha hBD1-ga, kus hBD1 kontsentratsioon uriinis ei ole antimikroobse toime avaldamiseks piisav, kuid neerutuubulite läheduses tuvastatakse kõrgemad peptiidide kontsentratsioonid [6, 31].

Kuna IHC näitab, et proHD5 on HD5 peamine vormneerudja kuna uriinis tuvastatakse nii küps kui ka proHD5, oletame, et HD5 eritub peamiselt prekursormolekuliks ja seejärel läbib proteolüütilise töötluse küpsete vormide genereerimiseks – sarnaselt seedetrakti ja urogenitaaltraktiga [11,30,37]. Peensooles toodavad Panethi rakud trüpsiini, mis lõhustab HD5 propeptiidi nii, et täielikult töödeldud peptiid on soolestiku luumenis domineeriv vorm [37]. Meeste ureetras on HD5 peamisteks töötlemis- ja aktiveerimisensüümideks neutrofiilide proteaasid, mida soodustavad nakkuskohta värvatud neutrofiilid [11]. Epiteeli trüpsinogeeni, uriini trüpsiini ja/või neutrofiilide proteaaside panus HD5 töötlemisesse kuseteedes infektsiooni ajal tuleb veel kindlaks määrata. Veelgi enam, urineerimiskeskkonna muutuste mõju HD5 funktsioonile (osmolaarsuse, pH ja katioonsete kontsentratsioonide muutused) tuleb samuti kindlaks teha.

Kokkuvõtteks võib öelda, et see on esimene uuring HD5 ekspressiooni ja produktsiooni tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks kuseteedes. Meie tulemused näitavad, et HD5 on epiteelist tuletatud AMP, mis võib mängida olulist rolli inimese uroepitheliumi kaasasündinud immuunsuses, takistades sissetungivate patogeenide ümberpaigutamist vereringesse. HD5 tootmist reguleerivate tegurite väljaselgitamine võib anda uudse ülevaate UTI-de patogeneesist patsientidel, kellel on UTI-de risk, ja krooniliste infektsioonidega patsientidel.

meetodid

Uuringu heakskiit

Kõigilt selles uuringus osalenud patsientidelt saadi teadlik kirjalik nõusolek. Alla 18-aastaste uuritavate puhul saadi vanema/eestkostja kirjalik nõusolek. Üleriigiline lastehaigla (NCH) institutsionaalne ülevaatusnõukogu kiitis selle uuringu heaks koos nõusolekuprotsessi ja dokumentidega (IRB07-00383).

Inimese kudede ja uriini proovid

Nakatumata distaalne kusejuha ja põie kude (n= 4) saadi lastelt, kellele tehti ureetra reimplantatsioon muudel põhjustel kui korduv infektsioon. Mittenakatunudneerudproovid (n=6) saadi patsientidelt, kellele tehti neerukasvajate tõttu nefrektoomia. Koeproovid ei sisaldanud makroskoopilisi haiguse või põletiku tunnuseid.Neerkroonilise püelonefriidiga patsientide kude hankis Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38]. Kaks sõltumatut patoloogi kinnitasid püelonefriidi histopatoloogilist diagnoosi. Koeproovid külmutati või säilitati neutraalsete formaliiniga fikseeritud parafiiniga manustatud osadena. Nakatumata neerukoe lõigud lõigati enne säilitamist ajukooreks, medullaks või neeruvaagnaks (n=4).

Nakatumata ja nakatunud uriiniproovid saadi NCH erakorralise meditsiini osakonda või nefroloogiakliinikusse pöördunud lastelt. UTI diagnoos tehti Ameerika Pediaatriaakadeemia juhiste kohaselt positiivse uriinikultuuri tulemusel [39]. Kõikides nakatunud uriiniproovides oli E.coli 0,106 CFU/mL. Uriini pH väärtused jäid vahemikku 5,5–8,5 (keskmine uriin 6,9). Uriini ioonilist koostist ei mõõdetud. Uriiniproove tsentrifuugiti uriinisetete eemaldamiseks ja lisati proteaasi inhibiitorite kokteil (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Ribonukleiinhappe eraldamine ja pöördtranskriptsioon

Kogu RNA eraldati külmutatud koest, kasutades PromegaTotal RNA isolatsioonisüsteemi (Promega, Madison, WI, USA). ForcDNA süntees, 4–8 mg kogu RNA-st pöördtranskribeeriti Superscript III pöördtranskriptaasiga, kasutades oligo-(dT)12–18 praimerit vastavalt tarnija protokollile (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

Geenispetsiifiliste plasmiidide kloonimine standardkõverate jaoks

DEFA5 ja GAPDH kodeeriv cDNA klooniti vastavalt tootja juhistele 4-Topo plasmiidvektorisse (Invitrogen). Plasmiidid sekveneeriti, et kinnitada, et see on õige

konstruktsioonid saadi. Geenispetsiifiliste plasmiidide seerialahjendused kvantifitseeriti (spektrofotomeetrilise neeldumise abil 260 °C juures ja etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelelektroforeesiga) ja neid kasutati reaalajas PCR-is, et luua iga reaktsiooni jaoks standardkõverad.

Kvantitatiivne reaalajas PCR

Kvantitatiivne reaalajas PCR viidi läbi, kasutades inimese üheahelalist cDNA-dneerud, kusejuha ja põie kude spetsiifiliste oligonukleotiidpraimerite paaridega, kasutades 7500 Real-Time PCR süsteemi (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Kavandati PCR eksoniühendust hõlmavad praimerid ja järjestused kinnitati DNAstarH Laser Gene SeqBuilder (DEFA5 forward praimer) abil. : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA-39 ja DEFA5 pöördpraimer 59-GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA-39).

Lühidalt, cDNA, mis vastab 10 ng RNA-le, toimis atemplaadina 25 ml reaktsioonis, mis sisaldas 20 mM iga praimerit ja 16 Light-Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green segu. PCR tingimused olid järgmised: esialgne denatureerimine temperatuuril 95 uC 10 minutit, millele järgnes 40 tsüklit, kusjuures iga tsükkel koosnes denatureerimisest 94 uC juures 30 sekundi jooksul, anniilimisest 64 uC juures 30 sekundi jooksul ja pikendamisest 72 uC juures 30 sekundit. Tsüklitevahelist fluorestsentsi emissiooni jälgiti lainepikkusel 530 nm ja analüüsiti tarkvara 7500Software V2.0.3 (Applied Biosystems) abil. Iga reaktsioonikomplekti kaasati geenispetsiifilised plasmiidistandardid. Positiivse kontrollina lisati iga reaktsioonikomplekti terminaalne niudesoole RNA ja tulemusi võrreldi varem avaldatud standarditega [27].

Kavandatava produkti PCR-amplifikatsiooni kinnitamiseks analüüsiti esinduslikku proovi elektroforeesiga 1,5% agaroosgeelil. Tooted visualiseeriti etiidiumbromiidi värvimisega ja võrreldi DNA suuruse standarditega, et kinnitada eeldatavat toote suurust (pole näidatud). Lisaks määrati iga reaktsiooni lõpus iga PCR reaktsiooni sulamistemperatuuri profiili kõver.

HD5 antikehad

HD5 propeptiid (AA20-94) ja osaliselt töödeldud vormid (AA36-94 ja 56–94) tuvastati kaubanduslikult saadava hiire monoklonaalse (8C8) HD5-vastase antikeha (Abcam) abil. HD5 propeptiid ja küps peptiid (AA63-94) tuvastati eelnevalt kirjeldatud küüliku polüklonaalse antiseerumi abil[13,40].

Immunoblot

Sama lõigudneerudKvantitatiivseks reaalajas PCR-analüüsiks kasutatud proovid (3–6 mg märgkaal) pulbristati uhmri ja nuiaga vedelas lämmastikus ning lahustati proteaasi inhibiitoritega RIPA puhvris. Uriinivalgud ekstraheeriti uriiniproovidest, kasutades ProteospinTM Urine Protein Concentration Micro Kit (Norgen Biotek Corporation, Thorold, ON, Kanada). Neerude ja uriini valkude kontsentratsioonid kvantifitseeriti modifitseeritud Bradfordi testiga ja kinnitati anOD280 nm lugemisega. Võrdsed kontsentratsioonid neerukudet või uriini valku kanti 18-protsendilistele naatriumdodetsüülsulfaadi gradientgeelidele ja viidi läbi elektroforeesi. Võrdse valgukoormuse tagamiseks viidi läbi hõbedane peits.

Pärast elektroforeetilist eraldamist kanti valgud nitrotselluloosmembraanile. Pärast fikseerimist 0,05% glutaaraldehüüdiga TBS-is blokeeriti membraanid 5% rasvavabas piimas 30 kuni 60 minutit ja inkubeeriti küüliku polüklonaalse HD5 antiseerumi lahjenduses 1:1,000 üleöö. . Pärast pesemist kanti sekundaarset antikeha, küüliku mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud küülikuvastast IgG-d, lahjendati 1:10, 000 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), 1 tunniks toatemperatuuril. Immunoblotid alatesneerudkudesid sondeeriti ka GAPDH-vastase antikehaga (Sigma Aldrich) kaks tundi toatemperatuuril ja inkubeeriti seejärel ülalkirjeldatud sekundaarse antikehaga. Valgud visualiseeriti ECL tuvastamissüsteemi ja kemoluminestsentsfilmi abil vastavalt tootja juhistele (BioExpress, Kaysville, UT, USA).

HD5 kvantifitseeriti, võrreldes saadud ribade intensiivsust rekombinantse standardse proHD5 valgu seerialahjendusega (Peptides International, Louisville, KY, USA).NeerHD5 kontsentratsioonid standarditi märja koe massi järgi. UrinaryHD 5 kontsentratsioonid jagati uriini kreatiniiniga, et määrata kindlaks standardiseeritud uriini HD5--kreatiniini suhe (mg/mg), et võtta arvesse uriini lahjendamist. Uriini kreatiniini kontsentratsioonid määrati, kasutades Oxford Biomedical Researchi kreatiniini mikroplaadi analüüsi (Rochester Hills, Michigan, USA).

Immunohistokeemia

Pärast deparafiniseerimist, rehüdratsiooni ja antigeeni otsimist viidi läbi biotiiniplokk ja seerumivaba valgublokeering (Superblock, ScyTek Laboratories, Logan, UT, USA). Slaide inkubeeriti üleöö temperatuuril 4 uC hiire monoklonaalse HD5(8C8) antikehaga (1:2{{10}}0; Abcam) või küüliku polüklonaalse antiseerumiga (1:500), millele järgnes polüvalentse võltsitud biotinüülitud antikeha. Streptavidiin/HRP (ScyTek Laboratories). Sektsioonid töötati välja, kasutades 0,1% diaminobensidiintetrakloriidi 0,02% vesinikperoksiidiga ja värviti hematoksüliiniga. Negatiivsete kontrollide sektsioone inkubeeriti HD5 antikeha asemel mitteimmuunse seerumiga.

Immunofluorestsents

HD5 ekspressiooni lokaliseerimiseks viidi läbi topeltmärgistatud immunofluorestsentsneerud. Kogumiskanal märgistati peamiste rakkude jaoks topeltmärgistatud kitse polüklonaalse inimese akvaporiini -2 vastase antikehaga (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) [41]. Henle silmus märgistati topelt hiire polüklonaalse inimese uromoduliinivastase antikehaga (Sigma-Aldrich) ja proksimaalne tuubul kahekordselt märgistati kitse polüklonaalse inimese akvaporiiniga -1 (Santa Cruz) [41,42]. Sekundaarsete antikehadena toimisid eesli polüklonaalne anti-kitse (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA), rodamiinkitse anti-hiire (JacksonImmunoResearch Laboratories) ja FITC eesli polüklonaalne küülikuvastane antikeha (Santa Cruz).

Kõik sektsioonid valmistati ette ülalkirjeldatud viisil. Neid inkubeeriti hiire HD5 (1:200) (Abcam), AQP-2 (1:500), uromoduliini (1:500), AQP-1 (1:400) vastaste antiseerumite seguga. temperatuuril 90 minutit. Sekundaarset antikeha kanti peale 90 minutiks toatemperatuuril ja lõigud paigaldati DAPI-ga paigalduskeskkonda kasutades. Negatiivse kontrollina kasutati mitteimmuunset seerumit. Slaide uuriti aLeica DM4000B mikroskoobiga ja pildistati digitaalselt, kasutades Spot RT kaamerat/tarkvara (Diagnostic Instruments, SterlingHeights, MI, USA).

ELISA

Link Biotin Antibody Labeling Kit, Novus Biologicals) hiire monoklonaalne antikeha 2 tundi toatemperatuuril, lisati 30 minutiks streptavidiini-mädarõika peroksidaas (Biolegend, San Diego CA, USA). Pärast 15-minutilist TMB substraadi lahusega inkubeerimist (Kem-En-Tec Diagnostics) lõpetati reaktsioon STOP lahusega (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) ja loeti lainepikkusel 450 nm. ELISA testi HD5 kontsentratsioonid jagati uriini kreatiniiniga, et määrata kindlaks standardiseeritud uriini HD5--kreatiniini suhe (mg/mg), et võtta arvesse uriini lahjendamist, nagu eespool kirjeldatud.

Viited

1. Weichhart T, Haidinger M, Horl WH, Saemann MD (2008) Kuseteede infektsiooni ajal toimivate molekulaarsete kaitsemehhanismide praegused kontseptsioonid. Euroopa kliiniliste uuringute ajakiri 38 Suppl 2: 29–38.

2. Zasloff M (2007) Antimikroobsed peptiidid, kaasasündinud immuunsus ja tavaliselt steriilsed kuseteede. J Am Soc Nephrol 18: 2810–2816.

3. Lehrer RI, Lichtenstein AK, Ganz T (1993) Defensiinid: imetajate rakkude antimikroobsed ja tsütotoksilised peptiidid. Annu Rev. Immunol. 11: 105–128.

4. Valore EV, Ganz T (1992) Defensiinide translatsioonijärgne töötlemine inimese ebaküpsetes müeloidrakkudes. Blood 79: 1538–1544.

5. Liu L, Zhao C, Heng HH, Ganz T (1997) Inimese beeta-defensiini-1 ja alfa-defensiine kodeerivad külgnevad geenid: kahel erineva disulfiidtopoloogiaga peptiidiperekonnal on ühine esivanem. Genomics 43: 316-320.

6. Valore EV, Park CH, Quayle AJ, Wiles KR, McCray PB, Jr. jt. (1998) Inimese beeta-defensiin-1: urogenitaalkudede antimikroobne peptiid. J Clin Invest 101: 1633–1642.

7. Schroeder BO, Wu Z, Nuding S, Groscurth S, Marcinowski M jt. (2011) Disulfiidsidemete vähendamine paljastab inimese beeta-defensiini 1 tugeva antimikroobse toime. Nature 469: 419–423.

8. Lehmann J, Retz M, Harder J, Krams M, Kellner U jt. (2002) Inimese beeta-defensiinide 1 ja 2 ekspressioon neerudes kroonilise bakteriaalse infektsiooniga. BMC Infect Dis 2: 20.

9. Bevins CL (2006) Paneth raku defensiinid: kaasasündinud immuunsuse peamised efektormolekulid. Biochemical Society tehingud 34: 263–266.

10. Quayle AJ, Porter EM, Nussbaum AA, Wang YM, Brabec C jt. (1998) Inimese defensiini-5 geeniekspressioon, immunolokaliseerumine ja sekretsioon naise naise reproduktiivtraktis. Am J Pathol 152: 1247–1258.

11. Porter E, Yang H, Yavagal S, Preza GC, Murillo O jt. (2005) Neisseria gonorrhoeae ja Chlamydia trachomatise uretriidi erinevad defensiini profiilid näitavad uudseid epiteelirakkude ja neutrofiilide koostoimeid. Infect Immun 73: 4823–4833.

12. Com E, Bourgeon F, Evrard B, Ganz T, Colleu D jt. (2003) Antimikroobsete defensiinide ekspressioon rottide, hiirte ja inimeste isaste reproduktiivsüsteemis. Paljunemisbioloogia 68: 95–104.

13. Porter EM, poolakad MA, Lee JS, Naitoh J, Bevins CL jt. (1998) Inimese soolestiku defensiinide eraldamine niude neopõie uriinist. FEBS Letters 434: 272–276.

14. Townes CL, Ali A, Robson W, Pickard R, Hall J (2011) Bakteriuuria taluvus pärast uriini kõrvalekaldumist on seotud antimikroobse peptiidi aktiivsusega. Uroloogia 77: 509 e501–508.

15. Wang AP, Su YP, Wang S (2010) Rekombinantse inimese alfa-defensiini 5 antibakteriaalne aktiivsus ja mehhanism kliiniliste antibiootikumiresistentsete tüvede vastu. Afr J Microbiol Res. 4: 626–633.

16. Gropp R, Frye M, Wagner TO, Bargon J (1999) Epiteeli defensiinid kahjustavad adenoviiruse infektsiooni: mõju adenoviiruse poolt vahendatud geeniteraapiale. Inimese geeniteraapia 10: 957–964.

17. Smith JG, Nemerow GR (2008) Inimese alfa-defensiinide poolt adenoviiruse neutraliseerimise mehhanism. Rakuperemees ja mikroob 3: 11–19.

18. Dugan AS, Maginnis MS, Jordan JA, Gasparovic ML, Manley K jt. (2008) Inimese alfa-defensiinid pärsivad BK-viiruse nakatumist, agregeerides virioone ja blokeerides peremeesrakkudega seondumise. The Journal of Biological Chemistry 283: 31125–31132.

19. Zhang D, Liu ZH, Liao QP, Ma JM, Sun YF jt. (2009) Alumiste suguelundite infektsioonide kohaliku immuunsuse uuring. Zhonghua fu chan ke za zhi 44: 13–15.

20. Quayle AJ (2002) Kaasasündinud ja varane immuunvastus patogeeni väljakutsele naiste suguelundites ja epiteelirakkude pöördeline roll. Journal of Reproductive Immunology, 57: 61–79.