Kuidas Cistanche polüsahhariid vähendab melanogeneesi ja vähendab oksüdatiivset stressi?

Lisateabe saamiseks võtke ühendust:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola polüsahhariid kutsub esile melanogeneesi melanotsüütides ja vähendab oksüdatiivset stressi

1 Dermatoloogia osakond, kolmas Xiangya haigla, Central South University, Changsha, Hiina

2 Uroloogia osakond, kolmas Xiangya haigla, Central South University, Changsha, Hiina

3 Meditsiini katsekeskus, kolmas Xiangya haigla, Kesk-Lõuna ülikool, Changsha, Hiina

Cistanchedeserticolasellel on palju efekte, lisateabe saamiseks klõpsake siin

Abstraktne: Pigmentatsioonihäirete peamise osana on naha depigmentatsioonihaigused, nagu vitiliigo ja akroomne naevus, väga levinud ja saavad praegu rohkem tähelepanu. Depigmentatsiooni patogenees hõlmab melanotsüütide düsfunktsiooni ja kadu, mis võivad olla põhjustatud pärilikkusest, autoimmuunsusest ja oksüdatiivsest stressist. Nende hulgas,oksüdatiivne stressmängib võtmerolli; aga vähesed kliinilised ravimeetodid suudavad oksüdatiivse stressiga toime tulla. Nagu teatatud,Cistanchedeserticola polüsahhariid(CDP) on tõhus antioksüdant; selle põhjal hindasime selle rolli melanotsüütides ja paljastasime veelgi mehhanismid. Selles uuringus leidsime, et CDP võib soodustada melanogeneesi inimese epidermaalsetes melanotsüütides (HEM) ja hiire melanoomi B16F10 rakkudes, samuti indutseeris see sebrakala pigmentatsiooni. Lisaks võib CDP aktiveerida mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) signaaliraja, seejärel reguleerida üles mikroftalmiaga seotud transkriptsioonifaktori (MITF) ja allavoolu geenide TYR, TRP1, TRP2 ja RAB27A ekspressiooni. Vastasel juhul avastasime, et CDP võib nõrgendada H2O2-indutseeritud tsütotoksilisust ja apoptoosi melanotsüütides. Täiendavad tõendid näitasid, et CDP võib tugevdada NRF2/HO-1 antioksüdantide rada ja eemaldada rakusisest ROS-i. Kokkuvõttes võib CDP soodustada melanogeneesi ja ennetada melanotsüüte oksüdatiivse stressikahjustuse eest, mis viitab sellele, et CDP aitab säilitada melanotsüütide normaalset seisundit. Seega võib CDP olla uudne ravim depigmentatsioonihaiguste raviks.

MÄRKSÕNAD:

Cistanche deserticola polüsahhariid, depigmentatsioonihaigus, melanotsüüdid, melanogenees, NRF2,oksüdatiivne stress

1. SISSEJUHATUS

Naha depigmentatsioonihaigusi, nagu vitiliigo ja akroomne naevus, iseloomustab laiguline või ulatuslik naha depigmentatsioon.1 Kuigi nahakahjustused põhjustavad harva raskeid kehavigastusi, mõjutavad need patsiendi välimust ja tekitavad tõsise psühholoogilise koormuse, isegi vaimse tervise häireid.2 depigmentatsiooni peamised patoloogilised muutused hõlmavad melanotsüütide düsfunktsiooni ja kadu, mis mõjutab suuresti melaniini sünteesi ja transporti, 3 mis viib melaniini ebapiisava akumuleerumiseni nahas.

Depigmentatsiooniga seotud mehhanismid on praegu teadmata, kuid uuringud on tuvastanud mõned seotud tegurid. Ühest küljest sõltub melanotsüütide funktsioon osaliselt mikroftalmiaga seotud transkriptsioonifaktorist (MITF), mis on hästi tuntud melanogeneesiga seotud geenide, sealhulgas türosinaas (TYR), türosinaasiga seotud valgu 1 (TRP1), türosinaasiga seotud geenide ekspressiooni soodustamise poolest. valk 2 (TRP2), ras-iga seotud valk Rab-27a (RAB27A) ja fastsini aktiini siduv valk 1 (FSCN1).4 Nendest geenidest mängib TYR võtmerolli melaniini sünteesis l-dopa oksüdeerimise kaudu dopakinoon.5 Teisest küljest näitavad uuringud mitme teguri kombinatsiooni, mis võivad põhjustada melanotsüütide kadu, sealhulgas pärilikkus, keskkond, autoimmuunsus ja oksüdatiivne stress.{17}} Nendest teguritest peetakse oksüdatiivset stressi kõige olulisemaks. .

Mehhanismidoksüdatiivne stressosaliselt on ilmnenud depigmentatsiooni põhjus; Reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) ülekoormus on üks võtmetegureid.10 ROS-i ülekoormus depigmentatsioonis hõlmab tasakaalustamatust pro- ja antioksüdantsüsteemide vahel.11 Üks selles tasakaalutuses osalevaid elemente on seotud tuumafaktoriga erütroidi 2- faktor 2/antioksüdantide vastuseelement (NRF2/ARE) antioksüdantide raja kahjustus.12 Rada koosneb NRF2-st ja antioksüdatiivsetest ensüümidest, nagu heemi oksügenaas-1 (HMOX-1, HO-1) , katalaas (CAT), glutatioonperoksidaas 1 (GPX1) ja NAD(P)H kinoondehüdrogenaas 1 (NQO1).13 Kui melanotsüüdid puutuvad kokku liigse ROS-iga, võib NRF2 translokeeruda tuuma ja seonduda konserveerunud ARE-ga ning seejärel soodustada antioksüdantsete ensüümide ekspressioon. Mõne depigmentatsioonihaiguse (nt vitiliigo) korral ei saa kahjustatud NRF2/ARE antioksüdantide rada aga tõhusalt eemaldada ROS-i.14 Depigmentatsiooniks tavaliselt kasutatavad kliinilised ravimeetodid hõlmavad paikseid või süsteemseid kortikosteroide, kaltsineuriini inhibiitoreid, kitsariba ultraviolett B (NBUVB; 311) , 308-nm eksimervalgus, autoloogne epidermise siirdamine ja traditsioonilise hiina meditsiini (TCM) ravi. Kortikosteroidid ja kaltsineuriini inhibiitorid võivad vähendada immuunsüsteemi ebanormaalset aktivatsiooni,15 samas kui esmavaliku ravina kasutatakse fototeraapiat; eelkõige stimuleerib NBUVB melanotsüütide proliferatsiooni ja T-rakkude hävitamist,16 samas kui 308-nm eksimervalgus kutsub esile T-rakkude apoptoosi.17 Lisaks on TCM-ravi mõju seotud melanogeneesi soodustamisega.18 Teatud määral on need meetodid on abiks depigmentatsiooni parandamisel, kuid haiguse progresseerumise kontrollimine on endiselt keeruline. On vaja välja töötada uusi ravimeetodeid, eriti oksüdatiivse stressi jaoks, mis varem oli tähelepanuta jäetud.

Cistanche deserticolaon tuntud kui "kõrbe ženšenn".19 Selle komponendid on kasulikud etanoolist põhjustatud maksakahjustuse ja soolepõletikulise hüperplaasia korral; seda saab kasutada ka väsimus-, põletiku- ja kasvajavastase reagendina.20-22 Hiljuti teatasid Guo jt, etCistanche deserticola polüsahhariid(CDP), üks selle põhikomponente, omas antioksüdantset ja hepatoprotektiivset toimet20; veel kaks uuringut tuvastasid selle rolli rakkude kaitsmisel vigastuste eest hapniku-glükoosi deprivatsiooni/reperfusiooni ja osteoporoosi tingimustes.23,24 Siiski ei ole CDP rolli depigmentatsioonihaiguste korral selgitatud. Siin püüdsime kinnitada, kas CDP coksüdatiivne stressvõib mõjutada melanogeneesi ja kaitsta melanotsüüte oksüdatiivse stressi eest.

2.|MATERJALID JA MEETODID

2.1|Kemikaalid ja antikehad

Cistanche deserticolapolüsahhariid(CDP) ja l-dopa osteti ettevõttelt Yuanye Biotec (puhtus 98 protsenti või suurem; Shanghai, Hiina). Vesinikperoksiid (H2O2), dimetüülsulfoksiid (DMSO), NaOH, Triton X-100, 4,5-dimetüültiasool-2-üül-2, 5-difenüültetrasooliumbromiid ( MTT) ja anneksiin V-FITC apoptoosi tuvastamise komplekt osteti ettevõttelt Sigma-Aldrich. 4 protsenti neutraalset paraformaldehüüdi osteti firmalt Biosharp (Hefei, Hiina); ja Immunofluorestsentsvärvimiskomplekt (Alexa Fluor 488) ja 2,{15}}diklorofluorestseiindiatsetaati (DCFH-DA) osteti ettevõttelt Beyotime Biotec (Shanghai, Hiina). Fontana-Massoni plekikomplekt ja nukleoplasmaatilise valgu ekstraheerimise komplekt osteti ettevõttest Sloarbio (Peking, Hiina). Inimese melanotsüütide kasvu lisand (HMGS), Dulbecco modifitseeritud Eagle sööde (DMEM) ja sööde 254 osteti firmalt Gibco. Veise loote seerum (FBS) osteti ettevõttest BI (Kibbutz Beit-Haemek, Iisrael). Primaarsed antikehad -aktiini, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK,

p38, p-p38, NRF2 ja HO-1 osteti ettevõttest Cell Signaling Technology, MITF-i esmane antikeha osteti ettevõttest St John's Laboratory, primaarne p-MITF-i antikeha osteti ettevõttelt Affinity Biosciences, esmane antikeha. GAPDH jaoks osteti ettevõttelt Bioworld ja primaarne antikeha TRP1 jaoks osteti ettevõttelt EMD Millipore.

2.2| Rakukultuur ja ravi

Hiire melanoomi B16F10 rakke kasvatati söötmes DMEM, millele oli lisatud 10 protsenti FBS-i ja 1 protsenti penitsilliini-streptomütsiini antibiootikumide segu. Inimese epidermaalsed melanotsüüdid (HEM) eraldati inimese eesnahast (vt meie eelmist uuringut25) ja kultiveeriti söötmes 254, millele oli lisatud HMGS, 5 protsenti FBS ja 1 protsenti penitsilliini-streptomütsiini antibiootikumide segu. Kõiki rakke kultiveeriti niiskes inkubaatoris 37 kraadi juures 5% CO2-ga. CDP lahustati DMSO-s ja lahjendati

söötmega enne kasutamist oli DMSO lõppkontsentratsioon madalam kui 0,1 protsenti. Enne kasutamist lahjendati H2O2 söötmega.

2,3|Sebrakala kasvatamine ja ravi

Sebrakala embrüod ja sööde osteti ettevõttelt EzeRinka Biotech. Katseprotokolli kiitis heaks Kesk-Lõuna ülikooli eetikakomitee. Sebrakala kasvatati 12-süvendiplaatidel 37-kraadise nurga all valgusest eemal ja töödeldi erineva kontsentratsiooniga CDP-ga. Sebrakala peades ja sabades leiduvate melaniinide jälgimiseks ja registreerimiseks kasutati iga päev pöördmikroskoopi. Pärast vaatlust muutsime söödet ja lisasime uuesti CDP. Melaniini tihedust sebrakala sabades mõõdeti pildiga J ja väärtused on esitatud integreeritud optiliste tihedustena (IOD).

2,4| Rakkude elujõulisus

Rakkude elujõulisust mõõdeti MTT testiga. CDP tsütotoksilisuse uurimiseks siirdati HEM-id ja B16F10 rakud 96-süvendiplaatidele tihedusega 2 × 1{{30}}3 rakku süvendi kohta ja kultiveeriti kuni rakud kinnitati plaatidele. Seejärel töödeldi rakke erineva kontsentratsiooniga (0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 ja 320 ug/ml) CDP-ga 24, 48 või 72 tundi. Enne mõõtmist lisati igasse süvendisse 20 μL MTT-d ja plaate inkubeeriti 37 kraadi juures 4 tundi. Pärast seda visasime supernatandi ära ja lisasime formasaani kristallide lahustamiseks igasse süvendisse 160 μL DMSO-d. Neeldumisväärtus 490 nm juures mõõdeti mitmemoodilise plaadilugejaga (PerkinElmer). CDP mõju uurimiseks H2O2--indutseeritud tsütotoksilisuse seisundis plaaditi HEM-id ja B16F10 rakud 96-süvendiga plaatidele tihedusega 4 × 103 rakku süvendi kohta. Rakke töödeldi erineva kontsentratsiooniga CDP-ga (0, 20, 40 või 80 ug/ml) 24 tundi, mille järel lisasime igasse süvendisse H2O2 (lõppkontsentratsioonid: 500 μm HEM-ide ja 1,0 mm B16F10 rakkude jaoks). ja inkubeeriti rakke veel 24 tundi. Me moodustasime CDP-ga töödeldud ja negatiivse kontrolli (NC) rühmad. Avastamise etapid olid samad, mis eelnevalt kirjeldatud.

2,5|Melaniinisisalduse NaOH analüüs

Rakke kultiveeriti {{0}} mm Petri tassidel ja töödeldi CDP-ga erinevatel kontsentratsioonidel (0, 20, 40 ja 80 ug/ml) 48 tundi, seejärel digereeriti trüpsiiniga ja koguti 1. 5-ml tuubid. Pesime rakke kaks korda topeltdestilleeritud veega, resuspendeerisime need 1 ml etanoolis ja keeristasime melaniini vabastamiseks. Seejärel tsentrifuugisime (200 g, 5 minutit) segu ja eemaldasime supernatandi, lisasime igasse katseklaasi 1 ml 10% DMSO-d (lahjendatud 1 mm NaOH lahusega) ja suspendeerisime sette. Inkubeerisime suspensiooni veevannis 80 kraadi juures 1 tund, et melaniini lahustuks. Lõpuks kanti 200 μL vedelikku 96-süvendiga plaadile ja kasutasime mitmerežiimilise plaadilugeja abil neeldumisväärtust 470 nm juures.

2,6|Türosinaasi aktiivsuse mõõtmine

Rakke kultiveeriti {{0}} mm Petri tassidel ja töödeldi enne mõõtmist CDP-ga, digereeriti trüpsiiniga ja koguti 15- ml tuubidesse ning pesti kaks korda fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS). ). Teisaldasime igast proovist 106 rakku uude katsutisse ja pärast tsentrifuugimist visasime supernatandi ära, seejärel lisasime rakusademele 1 ml 0,5% Triton X-100 ja säilitasime segu 0 kraadi juures 15 minutit. Seejärel lisasime substraadiks 1 ml l-dopat (1 mm, lahjendatud 0,1 M fosfaatpuhvriga) ja segasime lahuse, teisaldasime 200 μL segu 96-süvendiga plaadile. kohe ja mõõtis neeldumisväärtust (A0) lainepikkusel 475 nm, kasutades mitmerežiimilist plaadilugejat, korrates mõõtmist 10 minuti pärast (A10). Türosinaasi aktiivsus arvutati (A10-A0)/105 ja tulemused on väljendatud protsentides ( protsentides ) võrreldes negatiivse kontrolliga.

2,7| Fontana-Massoni melaniini värvimine

Rakke kultiveeriti 12-süvendiga plaatidel kuni 50-protsendilise tiheduse saavutamiseni. Pärast töötlemist fikseeriti rakud 30 minuti jooksul 4% neutraalse paraformaldehüüdiga ja pesti destilleeritud veega. Seejärel lisasime igasse süvendisse 500 µl Fontana ammoniaagi-hõbeda lahust ja hoidsime plaate 16 tundi pimedas, et melaniini värvida. Järgmisena pesime rakke destilleeritud veega viis korda (iga kord 1 minut) ja leotasime neid 5 minutit 500 µl hüposulfitiga; lõpuks eemaldasime hüposulfiti ja loputasime rakke uuesti destilleeritud veega 1 minuti jooksul. Seejärel kasutasime melaniinide vaatlemiseks ja registreerimiseks pöördmikroskoopi.

2,8|RNA ekstraheerimine ja kvantitatiivne pöördtranskriptsiooni-polümeraasi ahelreaktsioon

Rakke kultiveeriti 6-süvendiga plaatidel. Pärast töötlemist lõigati rakud trüpsiiniga ja koguti 15-mL tuubidesse. Pesime rakke kaks korda PBS-ga, lisasime seejärel 1 ml lüüsipuhvrit, segasime segu keerisega ja asetasime tuubid 5 minutiks jääle, et rakud täielikult lüüsida. RNA ekstraheeriti Total RNA komplekti (Omega Bio-Tek) abil ja pöördtranskribeeriti (RT), kasutades ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). Kvantitatiivne pöördtranskriptsiooni-polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) viidi läbi, kasutades KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO). RT segu reaktsioonimaht oli 20 μL, PCR segu reaktsioonimaht aga 20 μL (cDNA 1-8 μL, MIX 10 μL, praimer F 1 μL, praimer R 1 μL, lisage DEPC H2O kuni 20 μL ). Katsed viidi läbi vastavalt protokollidele. Praimerite järjestused on loetletud tabelis S1.

2,9|Valgu ekstraheerimine ja Western blotting / immunofluorestsents

Rakke kultiveeriti 100- mm Petri tassidel. Pärast töötlemist lõigati rakud trüpsiiniga ja koguti 15-mL tuubidesse. Pesime rakke kaks korda PBS-iga, seejärel lisati 500 μL RIPA lüüsipuhvrit (Thermo Fisher), millele oli lisatud 1 mm fenüülmetüülsulfonüülfluoriid (Thermo Fisher) ja 1:100 lahjendatud fosfataasi inhibiitori kokteil (Roche). Tuuma- ja tsütoplasma valk ekstraheeriti Nucleoplasmic Protein Extraction Kit abil vastavalt tootja protokollile. Panime torud 30 minutiks jääle ja keeristasime neid iga 5 minuti järel, et rakud täielikult lüüsida. Tsentrifuugisime rakke (200 g, 4 kraadi, 15 minutit), teisaldasime supernatandi uude katsutisse ja mõõtsime koguvalgu kontsentratsiooni, kasutades BCA valguanalüüsi komplekti (KeyGEN Biotec). Keetsime valke 5-kordse laadimispuhvriga (Beyotime Biotec, Hiina) 100 kraadi juures 10 minutit, seejärel säilitasime -80 kraadi juures. Western blot analüüsis kasutati polüakrüülamiidgeelelektroforeesi (PAGE) meetodit ning 20 ug valku igast rühmast eraldati ja kanti üle polüvinülideenfluoriidmembraanile. Pärast antigeeni blokeerimist inkubeerisime membraani 1:1000 lahjendatud primaarses antikehas 16 tundi 4 kraadi juures, seejärel pesti membraani PBST-ga ja inkubeerisime 1:10 000 lahjendatud fluorestseeruva sekundaarse antikehaga 1 tund 37 kraadi juures. . Fluorestsentsi intensiivsus tuvastati Odyssey CLx Imaging System (LI-COR) abil. Immunofluorestsents viidi läbi kasutades Immunofluorescence Staining Kit (Alexa Fluor

488) primaarse antikeha lahjendusega 1:100.

2.10|Rakkude apoptoosi mõõtmine

Rakke kultiveeriti {{0}}mm Petri tassidel ja töödeldi 24 tundi erineva kontsentratsiooniga (0, 20, 40 ja 80 ug/ml) CDP-ga ning lisati H2O2 ( lõppkontsentratsioonid: 500 μm HEM-ide jaoks, 1,0 mm B16F10 rakkude jaoks) igasse süvendisse ja inkubeeriti veel 24 tundi. Samuti moodustasime CDP-ga töödeldud ja NC rühmad. Pärast töötlemist seedisime rakud EDTA-vaba trüpsiiniga ja kogusime need tuubidesse, seejärel pesti rakke kaks korda PBS-iga ja resuspendeerisime need 100 µl PBS-is. Rakud värviti anneksiin V-FITC apoptoosi tuvastamise komplektiga vastavalt protokollile ja tuvastati voolutsütomeetria (FCM) abil. Apoptoosi määra analüüsimiseks kasutati FlowJo tarkvara.

2.11| Intratsellulaarne ROS mõõtmine

Rakke kultiveeriti {{0}}süvendiga plaatidel ja töödeldi 24 tundi erinevate kontsentratsioonidega (0, 20, 40 ja 80 ug/ml) CDP-ga, millele lisasime H2O2 (lõppkontsentratsioonid: 500). μm HEM-ide jaoks,

10 mm B16F10 rakkude jaoks) igasse süvendisse, inkubeeriti neid teise jaoks

24 tundi ja seadistage CDP-ga töödeldud ja NC rühmad. Pärast töötlemist pesti rakke kaks korda PBS-ga, et eemaldada kogu sööde ja FBS, seejärel lahjendati DCFH-DA sondi söötmega 1:1000-ni ja lisati see igasse süvendisse. Inkubeerisime rakke 37 kraadi juures 30 minutit ja pesti neid kolm korda seerumivaba söötmega. Kasutasime an

fluorestsentsi jälgimiseks ja registreerimiseks pööratud fluorestsentsmikroskoop, seejärel kasutati fluorestsentsi intensiivsuse mõõtmiseks ImageJ-d.

2.12|Statistika ja analüüs

Antud töö andmed on esitatud keskmise ± standardhälbena (SD) ning statistiline analüüs viidi läbi kasutades GraphPad Prism (versioon 7.0) või SPSS (versioon 22.0) ja Student's Mitme rühma võrdlemiseks kasutati t-testi või ühesuunalist dispersioonanalüüsi (ANOVA). WB valgu ribade halli väärtus standarditi GAPDH või -aktiiniga. Väärtusi P < 0,05="" peeti="" oluliseks.="" kõiki="" katseid="" korrati="" vähemalt="" kolm="">

3|TULEMUSED

3.1|CDP indutseeris melanogeneesi HEM-ides ja B16F10 rakkudes

Enne alustamist kasutasime MTT testi, et uurida CDP võimalikku tsütotoksilisust HEM-idele ja hiire melanoomi B16F10 rakkudele. Rakke töödeldi CDP-ga erinevatel kontsentratsioonidel 24, 48 või 72 tundi. HEM-i elujõulisuse testimine näitas, et kui kontsentratsioonid olid madalamad kui 320 ug/ml, ei mõjutanud CDP rakkude elujõulisust; elujõulisus vähenes aga oluliselt, kuna kontsentratsioon jõudis 24, 48 ja 72 tunni pärast 320 ug/ml (P < 0,05;="" joonis="" 1a).="" b16f10="" rakkude="" elujõulisus="" vähenes="" ka="" 48.="" ja="" 72.="" tunni="" pärast,="" kui="" cdp="" saavutas="" 320="" ug/ml="" (p="">< 0,01),="" kuid="" madalamatel="" kontsentratsioonidel="" muutust="" ei="" täheldatud="" (joonis="" 1b).="" seejärel="" uurisime="" eelnevalt="" cdp="" rolli="" melanogeneesis="" ja="" võrdlesime="" selle="" mõju="" -melanotsüüte="" stimuleeriva="" hormooni="" (-msh;="" kontsentratsioonid:="" 20,="" 100="" ja="" 400="" nm)="" ja="" dmso="" (0,1="" protsenti)="" mõjudega="" hem-ides.="" melaniini="" värvimise,="" türosinaasi="" aktiivsuse="" ja="" melaniinisisalduse="" analüüside="" tulemused="" näitasid,="" et="" cdp="" oli="" melanogeneesi="" soodustamiseks="" võrreldav="" -msh-ga,="" samas="" kui="" 0,="" 1-protsendiline="" dmso-ga="" töötlemine="" ei="" muutnud="" (joonis="">

Täiustasime oma uurimist vastavalt. HEM-e töödeldi CDP-ga erinevatel kontsentratsioonidel (20, 40 ja 80 ug/ml) 48 tundi; viidi läbi melaniini värvimise, melaniini sisalduse ja türosinaasi aktiivsuse testid ning kõik näitasid pärast CDP-ga töötlemist kontsentratsioonist sõltuval viisil olulist suurenemist, mis saavutas maksimumi 80 ug/ml rühmas (P < 0,05,="" joonis="" 2a-c)="" .="" seejärel="" mõõtsime="" melanogeneesiga="" seotud="" geenide="" (mitf,="" tyr,="" trp1,="" trp2,="" rab27a="" ja="" fscn1)="" mrna="" ja="" valgu="" taset.="" cdp="" suurendas="" oluliselt="" nende="" geenide="" mrna="" taset="" hem-ides="" (p="">< 0,05;="" joonis="" s2a).="" lisaks="" suurenesid="" mitf-i,="" tyr-i,="" trp1-="" ja="" rab27a-valkude="" tasemed,="" nagu="" ka="" fosforüülitud="" mitf-i="" ja="" kogu="" mitf-i="" suhe="" (p=""><0,05), samas="" kui="" trp2="" ja="" fscn1="" ei="" näidanud="" erinevust="" (joonis="" 2d,="" e).="" tulemused="" näitasid,="" et="" cdp="" võib="" soodustada="" melanogeneesi="" ja="" ülesreguleerida="" melanogeneesiga="" seotud="" geenide="" ekspressiooni="" inimese="">

Lisaks kontrollisime uuesti CDP mõju B16F10 rakkudega ja leidsime, et B16F10 rakkude melaniinisisaldus suurenes oluliselt (P < 0,01;="" joonis="" s2b).="" pealegi="" cdp="">

3.2|CDP soodustas sebrakala melanogeneesi

Uurida, kas CDP võiks edendadamelanogeneesin vivo kasutasime sebrakala embrüoid. Sebrakala embrüod jagati nelja rühma ja neid töödeldi pidevalt ainult söötmega (NC) või CDP-ga erinevatel kontsentratsioonidel (20, 40 ja 80 ug/ml); melaniini graanulite tihedust ja jaotumist jälgiti ja registreeriti iga päev. Sebrakala embrüote kasvades avastasime, et melaniini tihedus suurenes järk-järgult peades ja sabades. 3. päeval olid rühmadevahelised erinevused eristatavad ja erinevus kasvas jätkuvalt, kuni lõpetasime katse 6. päeval (joonis 3A). Me kasutasime kujutist J, et mõõta melaniini tihedust sebrakala sabades; melaniini tihedus CDP-ga töödeldud rühmades oli oluliselt kõrgem kui kontrollrühmas (P < 0,05;="" joonis="">

3,3|CDP aktiveeritud MAPK signaali rada HEM-ides ja B16F10 rakkudes

Et paljastada mehhanismid, mille abil CDP edendasmelanogenees, töödeldi HEM-e CDP-ga erinevatel kontsentratsioonidel (20, 40 ja

80 ug/ml) 48 tunni jooksul ja seejärel uuriti ERK, JNK ja p38 valkude fosforüülitud ja üldtasemeid MAPK signaalirajas. Western blot analüüsiga mõõdetuna tõusid p-ERK, p-JNK ja p-p38 tasemed pärast CDP-ravi (P < 0,05),="" samas="" kui="" nende="" kogutase="" ei="" muutunud="" (joonis="" 4a,="" b).="" katseid="" korrati="" b16f10="" rakkudega="" ning="" erk,="" jnk="" ja="" p38="" valkude="" fosforüülitud="" tasemed="" tõusid="" (p="">< 0,05),="" kuid="" mapk="" kogutase="" ei="" muutunud="" (joonis="" 4c,="" d),="" mis="" on="" kooskõlas="" tulemustega="" hem-ides.="">

3,4|CDP nõrgestatud H2O2-indutseeritud

tsütotoksilisus ja apoptoos HEM-ides ja B16F10 rakkudes

Simuleerimiseks kasutasime H2O2oksüdatiivne stresskeskkonda ja uuris täiendavalt CDP rolli melanotsüütides alloksüdatiivne stress. HEM-ides kasutatud H2O2 lõppkontsentratsioon oli 500 μm, samas kui B16F10 rakkudes oli see 1,0 mm. Et uurida CDP mõju H2O2-indutseeritud tsütotoksilisusele, eeltöötlesime HEM-e ja B16F10 rakke CDP-ga erinevatel kontsentratsioonidel (20, 40 ja 80 ug/ml) 24 tundi, seejärel lisasime H2O2 ja jätkasime nende töötlemist. 24 tundi enne vaatluse ja MTT analüüsi läbiviimist.

H2O2 põhjustas HEM-ides nähtavat membraani muljumist ja rakkude kokkutõmbumist, CDP-ga eeltöödeldud rühmades olukord leevenes. Ravi ainult CDP-ga ei avaldanud mõju (joonis 5A). MTT test näitas sarnast tulemust, kuna H2O2-ravi vähendas HEM-i elujõulisust, samas kui CDP leevendas seda kahjulikku mõju märkimisväärselt

3,5|CDP eemaldatud H2O2-indutseeritud intratsellulaarne ROS HEM-ides ja B16F10 rakkudes

Et uurida CDP mehhanisme H2O2-indutseeritud tsütotoksilisuse ja apoptoosi vähendamiseks, tuvastasime täiendavalt rakusisese ROS-i HEM-ides ja B16F10 rakkudes, kasutades DCFH-DA fluorestsentsi.

4|ARUTELU JA JÄRELDUSED

Selles uuringus uurisime CDP rolli HEM-ides ja B16F10 rakkudes. Esmakordselt leidsime, et CDP võib edendadamelanogeneesmelanotsüütides ja soodustavad sebrakala pigmentatsiooni. Järgnev katse näitas, et MAPK signaalirada aktiveeriti CDP-ravi ajal. Uurisime täiendavalt selle rollioksüdatiivne stressja leidis, et CDP võib nõrgendada H2O2--indutseeritud tsütotoksilisust ja apoptoosi melanotsüütides; vahepeal võib CDP aktiveerida NRF2/HO-1 antioksüdantide raja ja eemaldada rakusisest ROS-i.oksüdatiivne stresstingimused.

Mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaas on oluline rada, mis osaleb MITF-i reguleerimises, mis on peamine transkriptsioonifaktor, mis soodustabmelanogenees26,27 Meie uuringus suurenes ERK, JNK ja p38 aktivatsioon melanotsüütides oluliselt pärast CDP-ravi; vahepeal MITF/p-MITF ja MITF-i juhitud TYR, TRP1, TRP2 ja RAB27A avaldised

reguleeriti vastavalt üles. Seega soovitame, et CDP saaks

edendadamelanogeneesMAPK raja aktiveerimise kaudu, kuid kuidas CDP MAPK-sid aktiveerib, jääb teadmata. Hiljutiste uuringute kohaselt ekspresseerub teemaksulaadne retseptor 4 (TLR4) kõrgelt melanotsüütides ja osaleb melanogeneesis.28,29 TLR4 on oluline transmembraanne valk, mis suudab spetsiifiliselt siduda lipopolüsahhariidi (LPS)30; uuringud teatasid, et LPS võib indutseerida melanogeneesi.29 Huvitaval kombel on mitmeidpolüsahhariididTeadaolevalt on ekstraheeritud taimedest või seentest aktiveeritud TLR-id ja allavoolu signaalirajad, nagu MAPK ja tuumafaktor kappa beeta (NF-κB).31,32 Seetõttu kahtlustame, et TLR-id võivad CDP-d ära tunda ja siduda ning seejärel aktiveerib allavoolu MAPK signaali. ling rada ja soodustabmelanogenees. Lisaks on teada, et nukleotiide siduvad oligomerisatsioonidomeenilaadsed retseptorid (NLR-id) tunnevad ära rakusisesed ligandid ja juhivad MAPK ja NF-KB signaaliradade aktiveerimist.33,34 Nagu teatatud, võivad Ganoderma lucidum'ist ja Astragalusest ekstraheeritud polüsahhariidid siseneda rakkudesse. ja mõjutada NLR-e.35,36 Seega on võimalik, et CDP võib siseneda melanotsüütidesse ja reguleerida MAPK signaalirada NLR-ide kaudu. Selle hüpoteesi kontrollimiseks on aga vaja täiendavaid uuringuid.

Mõned praegused uuringud on teatanud ravimtaimede kasutamisestpolüsahhariididmelanogeneesis, et pärssida melaniini tootmist.37,38 Kuid selles uuringus soodustas CDP melanogeneesi

melanotsüüdid ja see toime kinnitati veelgi pärast võrdlust -MSH-ga. CDP on ka omamoodipolüsahhariidürtidest ekstraheeritud, kahtlustame, et CDP vastupidine toime võib olla seotud struktuuriliste erinevustega CDP ja teistepolüsahhariidid. Polüsahhariidid moodustuvad monosahhariidide polümerisatsioonil, kuid nende monosahhariidide tüüp, monosahhariidi koostis, glükosiidside, külgahela struktuur ja molekulmass on erinevad39,40; Arvatakse, et need tegurid määravad nende bioloogilised funktsioonid.41 Olemasolevad uuringud on välja pakkunud CDP struktuuri ja oletanud, et CDP struktuur mõjutab hiljem selle funktsiooni.42 Seega on CDP täielikuks mõistmiseks ja meie hüpoteesi kinnitamiseks vaja rohkem tõendeid.

Melanogenees on oluline resistentsuse kaitsemehhanism

ultraviolettkiirguse kahjustused ja keha homöostaasi säilitamine43; samal

Aja jooksul puutuvad melanotsüüdid kergesti kokku ebasoodsa keskkonnaga, näiteks ROS-i ülekoormusega.11 On teada, et ROS osaleb edendamises.melanogenees, on üks mehhanismidest MAPK-de aktiveerimine.44 Kuid uuringud näitasid ka, et see efekt esineb ainult teatud ROS-i taseme piires, samas kui ROS-i ülekoormus kahjustab melanogeneesi märkimisväärselt.45 ROS-i, MAPK-i ja melanogeneesi vaheline seos on erinevates tingimustes erinev, seega pro- ja antioksüdantide süsteemide tasakaal on ilmselgelt oluline. Depigmentatsioonihaiguste (nt vitiliigo) puhul kahjustab tasakaalustamata antioksüdantide süsteem ja kontrollimatu ROS-i ülekoormus melanotsüüte ja vähendab rakkude elujõulisust.11,46 Selles uuringus kasutasime rakkude ROS-i ülekoormuse simuleerimiseks erinevaid H2O2 kontsentratsioone ja HEM-id näitasid kehvemat taluvust rakkude suhtes. H2O2 kui B16F10 rakud. Kui melanotsüüte raviti H2O2-ga, halvenes nende elujõulisus ja apoptoosi määr, kuid

CDP eeltöötlus võib suundumust osaliselt muuta. Samal ajal hakati ROS-i raiskama. Nagu teatatud, on NRF2/ARE antioksüdatsiooniraja aktiveerimine peamine meetod ROS-i eemaldamiseks naharakkudes.14 Meie katsetes oli NRF2 ja HO-1 valgu tase melanotsüütides ülesreguleeritud pärast H2O2-ravi ilma CDPta; see tähendab, et H2O2-indutseeritudoksüdatiivne stressvõib aktiveerida NRF2/HO-1 raja, kuid sellest ei piisa redoks-tasakaalu säilitamiseks ja raku kaitsmiseks vigastuste eest. Kuid CDP eeltöötlus tugevdas NRF2/HO-1 antioksüdatsiooni rada ja taastas tasakaalu. Seega soovitame CDP kaitsta melanotsüüte oksüdatiivse stressi kahjustuse eest, aktiveerides NRF2/HO-1 antioksüdatsiooniraja ja eemaldades ROS-i.

Leidsime, et ainult CDP-ravi ei mõjuta ROS-i ega NRF2/HO-1 melanotsüütides. See tulemus viitab sellele, et CDP võib oksüdatiivse stressi korral mõjutada redoks-tasakaalu, kuid mitte normaalsetes tingimustes. Veelgi enam, NRF2/HO-1 antioksüdatsioonirada reguleerivad väidetavalt PI3K, NF-κB ja MAPK signaalirajad.47,48 Meie uuringus suutis CDP aktiveerida MAPK signaaliraja. Võimalik, et CDP saab aktiveerida NRF2/HO-1 raja ülesreguleerivate MAPK-de kaudu. Nagu Slominski teatas, on melanotsüüdid regulatiivses võrgustikus osalevad stressiandurid ja nende funktsioonid võivad keskkonnale reageerides kiiresti muutuda.49 Arvame, et CDP rolli mõjutab melanotsüütide staatus, see võib soodustada melanogeneesi ilma antioksüdanti mõjutamata. süsteemi normaalsetes tingimustes, kuid taastage redoks-tasakaalu alloksüdatiivne stresstingimused. Seetõttu saab CDP melanotsüütide funktsiooni ja ellujäämist säilitada kahel erineval viisil. CDP aitab melanotsüütidel säilitada homöostaasi, mis on samuti oluline melanogeneesi funktsioon.50,51

Kokkuvõtteks võib CDP edendadamelanogeneesmelanotsüütidest

MAPK signaaliraja aktiveerimise kaudu. CDP võib parandada melanotsüütide ellujäämist NRF2/HO-1 antioksüdantide raja aktiveerimise ja rakusisese ROS-i eemaldamise kaudu oksüdatiivse stressi tingimustes. Meie leiud on tähendusrikkad, kuna need näitavad, et CDP võib mõlemat edendadamelanogeneesja kaitsta melanotsüüteoksüdatiivne stressvigastus, mis võib olla vastutav melanotsüütide düsfunktsiooni ja kadumise eest. Selle uuringu tulemused näitavad, et CDP võib olla uudne ravim depigmentatsioonihaiguste ravis.

TUNNUSTUS

Seda tööd toetasid Hiina riiklik loodusteaduste fond (nr 81703101), Kesk-Lõuna ülikooli kolmanda Xiangya haigla uued Xiangya talendiprojektid (nr JY201623 ja nr 20170301), Hunani provintsi loodusteaduste sihtasutus (nr. nr 2018JJ3788 ja nr 2018JJ3793) ning Hunani tervisekomisjoni projekt (nr C2019173). Dr Yibo Hu viis läbi uuringu põhiosa ja kirjutas käsikirja; Professor Jing Chen ja Qinghai Zeng kavandasid uuringu ja juhendasid käsikirja kirjutamist; Professor Jinhua Huang, Lihua Huang ja Hong Xiang pakkusid tehnilist tuge ja analüüsisid andmeid; Osa katsetest aitasid kaasa dr Yixiao Li, Ling Jiang, Yujie Ouyang, Yumeng Li, Lun Yang ja Xiaojiao Zhao.

HUVIDE KONFLIKT

Autorid kinnitavad, et huvide konflikti ei ole.

ANDMETE KÄTTESAADAVUSE AVALDUS

Selle uuringu tulemusi toetavad andmed on mõistliku taotluse korral kättesaadavad vastavalt autorilt.

VIITED

1. Bleuel R, Eberlein B. Vitiligo terapeutiline juhtimine. J Dtsch Dermatol Ges. 2018;16:1309-1313.

2. Taieb A, Meurant JM. Kas peaksime vitiligo ravis eelistama psühholoogilisi sekkumisi? J Eur Acad Dermatol Venereol. 2018;32:2053-2054.

3. Picardo M, Dell'Anna ML, Ezzedine K jt. Vitiligo. Nat Rev Dis krundid. 2015;1:15011.

4. Slominski A, Tobin DJ, Shibahara S, Wortsman J. Melaniini pigmentatsioon imetajate nahas ja selle hormonaalne regulatsioon. Physiol Rev. 2004;84:1155-1228.

5. Slominski A, Zmijewski MA, Pawelek J. L-türosiin ja L-dihüdroksüfenüülalaniin kui hormoonitaolised melanotsüütide funktsioonide regulaatorid. Pigment Cell Melanoma Res. 2012;25:14-27.

6. Spritz RA. Üldise vitiligo ja autoimmuunse kilpnäärmehaiguse aluseks olevad ühised geneetilised suhted. Kilpnääre. 2010;20:745-754.

7. Lin X, Tang LY, Fu WW, Kang KF. Lapsepõlve vitiligo Hiinas: kliinilised profiilid ja immunoloogilised leiud 620 juhul. Olen J Clin Dermatol. 2011;12:277-281.

8. Boehncke WH, Brembilla NC. Autoreaktiivsed T-lümfotsüüdid põletikuliste nahahaiguste korral. Front Immunol. 2019; 10:1198.

9. Iannella G, Greco A, Didona D jt. Vitiligo: patogenees, kliinilised variandid ja ravimeetodid. Autoimmun Rev. 2016;15:335-343.

10. Forrester SJ, Kikuchi DS, Hernandes MS jt. Reaktiivsed hapniku liigid metaboolses ja põletikulises signaaliülekandes. Circ Res. 2018;122:877-902.

11. Denat L, Kadekaro AL, Marrot L jt. Melanotsüüdid kui oksüdatiivse stressi õhutajad ja ohvrid. J Invest Dermatol. 2014;134:1512-1518.

12. Qiu L, Song Z, Setaluri V. Oksüdatiivne stress ja vitiligo: Nrf{1}}ARE

signalisatsiooniühendus. J Invest Dermatol. 2014;134:2074-2076.

13. Hayes JD, Dinkova-Kostova AT. Nrf2 reguleeriv võrk pakub liidest redoks- ja vaheainevahetuse vahel. Trends Biochem Sci. 2014;39:199-218.

14. Marrot L, Jones C, Perez P, Meunier JR. Nrf2 tähtsus

rada (foto)-oksüdatiivse stressi vastuses inimese epidermise melanotsüütides ja keratinotsüütides. Pigment Cell Melanoma Res. 2008;21:79-88.

15. van Geel N, Speeckaert R, Mollet I jt. In vivo vitiligo induktsiooni ja ravi mudel: topeltpime randomiseeritud kliiniline uuring. Pigment Cell Melanoma Res. 2012;25:57-65.

16. Nicolaidou E, Antoniou C, Stratigos A, Katsambas AD. Kitsasribaline ultraviolett-B fototeraapia ja 308-nm eksimerlaser vitiligo ravis: ülevaade. J Am Acad Dermatol. 2009;60:470-477.

17. Novak Z, Bonis B, Baltas E jt. Ksenoonkloriidi ultraviolett-B laser

on psoriaasi ravis ja T-rakkude apoptoosi esilekutsumisel efektiivsem kui kitsariba ultraviolett-B. J Photochem Photobiol B Biol. 2002;67:32-38.

18. Xu P, Su S, Tan C jt. Eclipse herba, Polygoni multiflora radix preparator ja Rehmanniae radix preparator vesiekstraktide mõju melanogeneesile ja inimese melanotsüütide migratsioonile. J Etnopharmacol. 2017;195:89-95.

19. Wang T, Zhang X, Xie W.Cistanche deserticolaYC Ma, "Desertginseng": ülevaade. Am J Chin Med. 2012;40:1123-1141.

20. Guo Y, Cao L, Zhao Q jt. Esialgsed iseloomustused, antioksüdantne ja hepatoprotektiivne toimepolüsahhariidalatesCistanche deserticola. Int J Biol Macromol. 2016;93:678-685.

21. Cai RL, Yang MH, Shi Y jt. Fenüületanoidirikka ekstrakti väsimusvastane toimeCistanche deserticola. Phytother Res. 2010;24:313-315.

22. Zhang H, Xiang Z, Duan X jt. Oligosahhariidide kasvajavastane ja põletikuvastane toime alatesCistanche deserticolaväljavõte seljaaju vigastusest. Int J Biol Macromol. 2019;124:360-367.

23. Liu Y, Wang H, Yang M jt.Cistanche deserticola polüsahhariididkaitsta PC12 rakke OGD/RP-indutseeritud vigastuste eest. Biomed Pharmacother. 2018;99:671-680.

24. Laul D, Cao Z, Liu Z jt.Cistanche deserticola polüsahhariidnõrgendab osteoklastogeneesi ja luu resorptsiooni, pärssides RANKL-i signaaliülekannet ja reaktiivsete hapnikuliikide tootmist. J Cell Physiol. 2018;233:9674-9684.

25. Fu C, Chen J, Lu J et al. TUG1 alareguleerimine soodustab melanogeneesi ja UVB-indutseeritud melanogeneesi. Exp Dermatol. 2019;28:730-733.

26. Johannessen CM, Johnson LA, Piccioni F, et al. Melanotsüütide liini programm annab resistentsuse MAP kinaasi raja inhibeerimise suhtes. Loodus. 2013;504:138-142.

27. Vachtenheim J, Borovansky J. Pigmendi moodustumise transkriptsioonifüsioloogia melanotsüütides: MITF-i keskne roll. Exp Dermatol. 2010;19:617-627.

28. Yu N, Zhang S, Zuo F jt. Kultiveeritud inimese melanotsüüdid ekspresseerivad funktsionaalseid teemaksutaolisi retseptoreid 2–4, 7 ja 9. J Dermatol Sci. 2009;56:113-120.

29. Ahn JH, Park TJ, Jin SH, Kang HY. Inimese melanotsüüdid ekspresseerivad funktsionaalset Toll-sarnast retseptorit 4. Exp Dermatol. 2008;17:412-417.

30. Reed SG, Carter D, Casper C jt. GLA perekonna adjuvantide tegevuse korrelatsioonid. Semin Immunol. 2018;39:22-29.

31. Guo MZ, Meng M, Feng CC jt. Novellpolüsahhariidsaadud Craterellus cornucopioides suurendab immunomoduleerivat aktiivsust immunosupressiivsete hiirte mudelites TLR4-NF-kappaB raja reguleerimise kaudu. Toidu funktsioon. 2019;10(8):4792-4801.

32. Wei W, Xiao HT, Bao WR jt. TLR-4 võib vahendada Astragaluse signaaliteidpolüsahhariidRAP indutseeris RAW264.7 rakkude tsütokiini ekspressiooni. J Etnopharmacol. 2016;179:243-252.

33. Chen H, Yang D, Han F jt. Bakteriaalne T6SS efektor EvpP hoiab ära NLRP3 põletikulise aktivatsiooni, inhibeerides Ca(2 pluss)-sõltuvat MAPK-Jnk rada. Peremeesraku mikroob. 2017;21:47-58.

34. Levy M, Shapiro H, Thaiss CA, Elinav E. NLRP6: mitmetahuline in-Nate immuunsensor. Trends Immunol. 2017;38:248-260.

35. Chen YS, Chen QZ, Wang ZJ, Hua C. Ganoderma lucidum'i põletikuvastane ja hepatoprotektiivne toimepolüsahhariididsüsiniktetrakloriidist põhjustatud maksakahjustuse vastu Kunmingi hiirtel. Farmakoloogia. 2019;103:143-150.

36. Tian Z, Liu Y, Yang B jt. Astragaluspolüsahhariidnõrgendab hiire koliiti NLRP3 põletiku inhibeerimise kaudu. Planta Med. 2017;83:70-77.

37. Jiang L, Huang J, Lu J jt. Ganoderma lucidumpolüsahhariidvähendab melanogeneesi, pärssides keratinotsüütide ja fibroblastide parakriinset toimet IL-6/STAT3/FGF2 raja kaudu. J Cell Physiol. 2019;234:22799-22808.

38. Cai ZN, Li W, Mehmood S jt. MõjupolüsahhariidMorchella esculenta FMP{0}} melanogeneesi kohta B16F10 rakkudes ja sebrakalades. Toidu funktsioon. 2018;9:5007-5015.

39. Zhang C, Li Z, Zhang CY jt. Molekulaarsed omadused ja bioaktiivsuspolüsahhariididlutsernist (Medicago sativa L.). Toitained. 2019;11:1181.

40. Coconi Linares N, Di Falco M, Benoit-Gelber I jt. Mikrokomponentide olemasolu laiendab oluliselt Aspergillus nigeri molekulaarset vastust guarkummile. Uus biotehnoloogia. 2019;51:57-66.

41. Ma H, Zhang K, Jiang Q jt. Taime iseloomustuspolüsahhariididDendrobium officinale'st mitme kromatograafilise ja massispektromeetrilise tehnika abil. J Chromatogr A. 2018;1547:29-36.

42. Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. Kahe külma veega ekstraheeritava konstruktsiooni iseloomustus ja immunoloogiline aktiivsuspolüsahhariididalatesCistanche deserticolaYC Ma. Carbohydr Res. 2007;342:1343-1349.

43. Slominski AT, Zmijewski MA, Plonka PM, et al. Kuidas UV-kiirgus naha kaudu aju ja endokriinsüsteemi puudutab ja miks. Endokrinoloogia. 2018;159:1992-2007.

44. Schalke S. Uued andmed hüperpigmentatsioonihäirete kohta. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2017;31 (lisa 5):18-21.

45. Klaasimees SJ. Vitiligo, reaktiivsed hapnikuliigid ja T-rakud. Clin Sci. 2011;120:99-120.

46. ​​Ristow M. Tõe lahti harutamine antioksüdantide kohta: mitohormees selgitab ROS-i poolt põhjustatud kasu tervisele. Nat Med. 2014;20:709-711.

47. Balogun E, Hoque M, Gong P jt. Kurkumiin aktiveerib heemoksügenaasi-1 geeni, reguleerides Nrf2 ja antioksüdantidele reageerivat elementi. Biochem J. 2003;371:887-895.

48. Paine A, Eiz-Vesper B, Blasczyk R, Immenschuh S. Signaalid

heemoksügenaas-1 ja selle põletikuvastane terapeutiline potentsiaal.

Biochem Pharmacol. 2010;80:1895-1903.

49. Slominski A, Paus R, Schadendorf D. Melanotsüüdid kui "sensoorsed" ja reguleerivad rakud epidermises. J Theor Biol. 1993;164:103-120.

50. Slominski RM, Zmijewski MA, Slominski AT. Melaniini pigmendi roll melanoomi korral. Exp Dermatol. 2015;24:258-259.

51. Slominski A, Kim TK, Brozyna AA jt. Melanogeneesi roll melanoomi käitumise reguleerimisel: melanogenees põhjustab HIF-1alfa ekspressiooni ja HIF-sõltuvate kaasnevate radade stimuleerimist. Arch Biochem Biophys. 2014;563:79-93.