Cistanche Deserticola fenüületanoidglükosiidid: neuroprotektiivse toime mehhanism

Maiquan Li et al

Abstraktne:Tuumafaktori erütroidi 2-seotud faktor 2 (Nrf2) on peamine transkriptsioonifaktor oksüdatiivse stressi ja neurodegeneratiivsete häirete vastu.Fenüületanoidglükosiidid(PhG-d; salidrosiid,akteosiid, isoakteosiid jaehhinakosiid) omavad antioksüdante janeuroprotektiivnebioaktiivsused. See uuring viidi läbi, et uuridaneuroprotektiivnetoime ja molekulaarne mehhanismPhGs. PhGseeltöötlus pärssis oluliselt H2O2-indutseeritud tsütotoksilisust PC12 rakkudes, käivitades Nrf2 tuuma translokatsiooni ja muutes heemi oksügenaas 1 (HO-1), NAD(P)H kinoonoksidoreduktaasi 1 (NQO1) allareguleeritud valgu ekspressiooni. ), glutamaat-tsüsteiini ligaasi katalüütiline subühik (GCLC) ja glutamaat-tsüsteiini ligaasi modifitseeriv subühik (GCLM). Nrf2 siRNA või HO-1 inhibiitor tsink protoporfüriin (ZnPP) vähendasneuroprotektiivnemõju. PhG-d näitasid potentsiaalset interaktsiooni Nrf2 sidumissaidiga Kelchi-sarnases ECH-assotsiatsioonivalgus 1 (Keap1). See tulemus võib toetada hüpoteesi, et PhG-d on Nrf2 aktivaatorid. Näitasime potentsiaalset seondumist PhG-de ja Keapl-aktiveeritud Nrf2 / ARE raja vahel ning et rohkem glükosiide sisaldavatel PhG-del oli tõhustatud toime.

Märksõnad:Keap1; Nrf2;Neuroprotektiivne; PC12 rakud;PhGs(NQO1), muu hulgas [5-7]. See protsess on võtmeetapp rakkude kaitsmisel oksüdatiivse stressi eest ja sellest on kujunemas paljulubav neuroprotektsiooni terapeutiline sihtmärk [8]. Gaia teatas, et Nrf2 leevendab LRRK2- ja a-sünukleiini poolt indutseeritud neurodegeneratsiooni, soodustades tugevalt neuronaalsete valkude homöostaasi rakust autonoomsel ja ajast sõltuval viisil [9].

fenüületanoidglükosiidid (PhGs) iseloomustavad kaneelhappe- ja hüdroksüülfenüületüülrühmad, mis on seotud ap-glükopüranoosiga vastavalt estri- ja glükosiidsidemete kaudu. Need molekulid kuuluvad vees lahustuvate looduslike saaduste rühma, mis on taimeriigis laialt levinud [10]. In vitro ja in vivo uuringud on näidanud, et neil ühenditel on antioksüdant [11],neuroprotektiivne[12], antibakteriaalne,

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cistanche'il on neuroprotektiivsed omadused, lisateabe saamiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Oksüdatiivne stress, mis on antioksüdantide homöostaasi tasakaalustamatus, kutsub esile lipiidide peroksüdatsiooni, valgu ja DNA vigastusi, rakkude vananemist ja rakusurma. See protsess aitab tõenäoliselt kaasa mitmetele neurodegeneratiivsetele häiretele, nagu Alzheimeri tõbi (AD), Parkinsoni tõbi (PD) ja isheemia/reperfusioon [1]. Vesinikperoksiid (H2O2), mis on üks peamisi reaktiivseid hapniku liike (ROS), põhjustab teadaolevalt lipiidide peroksüdatsiooni ja DNA kahjustusi [2]. Lisaks on H2O2 endogeenne hüdroksüülvabade radikaalide allikas, mis aitab kaasa rakulise oksüdatiivse stressi taustatasemele [3,4]. Seetõttu võivad oksüdatiivse stressist põhjustatud apoptoosi ennetamise terapeutilised strateegiad omada potentsiaali neurodegeneratiivsete haiguste ravis.

Tuumafaktori erütroidi 2-seotud faktor 2 (Nrf2) on transkriptsioonifaktor, mis on tugevalt seotud oksüdatiivse stressiga. Nrf2 aktiveerimine indutseerib paljude antioksüdantide ja detoksifitseerimisgeenide, sealhulgas heemi oksügenaasi -1 (HO-1), NAD(P)H kinoonoksidoreduktaasi 1, transkriptsiooni

põletikuvastane [13] ja immunomoduleeriv [14] bioaktiivsus. Osmanthusfragrans on levinud koostisosa mitmes Aasia toidus ja seda on pikka aega tarbitud. Varem näitasime, et O. fragransi lilleekstraktid suurendasid ruumilist õppimist ja mälu, inhibeerisid oksüdatiivseid kahjustusi ja avaldasid neuroprotektiivset toimet d-galaktoosi poolt indutseeritud vananemisel ICR hiiremudelis [15]. Salidrosiid, akteosiid ja isoakteosiid on peamised PhG-de vastused O. fragransi lilleekstraktide antioksüdantsele toimele [16].

PhG-de neuroprotektiivse toime uuringud on andnud soovitavaid tulemusi. Salidrosiid vähendas oluliselt MPP plussis eksponeeritud PC12 rakkude apoptoosi [17,18]. Akteosiid leevendas ka MPP pluss-indutseeritud apoptoosi ja oksüdatiivset stressi PC12 rakkudes [19] ning A p25-35--indutseeritud SH-SY5Y rakukahjustust [20].ehhinakosiiduuriti tuumori nekroosifaktor-a (TNFa) poolt indutseeritud apoptoosi SH-SY5Y rakkudes [21], MPTP-indutseeritud dopamiinergilise toksilisuse kohta hiirtel [22], glutamaadiga vigastatud roti kortikaalsete rakkude primaarsetes kultuurides [23] ja {{ 9}}OHDA-indutseeritud kahjustused PC12 rakkudes [24]. Tulemused näitasid, et PhG-del oli tsütoprotektiivne toime ja need on potentsiaalsed ained neurodegeneratiivsete haiguste raviks. Uuringud on näidanud, et PhG-de antioksüdantsed omadused on nende ühendite paljude muude bioaktiivsuste aluseks [25]. Kuid vähesed uuringud on uurinud PhG-de molekulaarset mehhanismi oksüdatiivse toksilisuse vastu.

Meie uuringus valisime neli tüüpilist PhG-d järgmiselt: salidrosiid (fenüületanoidisahhariidid), akteosiid (fenüületanoiddisahhariidid), isoakteosiid (fenüületanoidisahhariidid) jaehhinakosiid(fenüületanoid-trisahhariidid). Kasutasime neuronaalse surma mudelit, kasutades diferentseeritud PC12 rakke [26], et uurida PhG-de kaitsvat toimet ja molekulaarset mehhanismi H2O2-indutseeritud PC12 rakumudelil. Näitasime, et PhG-d aktiveerisid Nrf2 / ARE raja, seondudes Kelchi-sarnase ECH-ga seotud valguga 1 (Keap1). See protsess reguleeris antioksüdantseid ensüüme ja suurendas PC12 rakkude resistentsust oksüdatiivse stressi suhtes.

2. Tulemused

2.1. PhG-de allasurutud H2O2-indutseeritud tsütotoksilisus PC12 rakkudes

Testiti H2O2 ja PhG-de (0,1,1,5 ja 10 卩g/mL) tsütotoksilist toimet PC12 rakkudele. Tulemused näitasid, et H2O2 kutsus esile PC12 rakkude elujõulisuse kadumise kontsentratsioonist sõltuval ja ajast sõltuval viisil (joonis 1A). PC12 rakkude kokkupuude 200 H2O2-ga 2 tunni jooksul andis rakkude elujõulisuseks 57,4 protsenti. Rakkude eeltöötlemine PhG-dega 0,1, 1, 5 ja 10 -/mL ei mõjutanud rakkude elujõulisust (joonis 1B) ja kaitses PC12 rakke märkimisväärselt H2O2--indutseeritud kahjustuste eest, parandades rakkude elujõulisust. vastavalt 9.549-22.141 protsenti , 12.092-25.289 protsenti , 1.470-9.289 protsenti ja 3.411-11.441 protsenti (joonis 1C) . Kuid salidrosiid (0,1 μg/mL), isoakteosiid (0,1, 1, 5 ja 10 μg/mL),ehhinakosiid(0.1, 1 ja 5 ^g/mL) eeltöötlus ei näidanud olulist erinevust HzOz-indutseeritud rakukahjustuses. Rakkude eeltöötlemine PhG-dega parandas ka H2O2 indutseeritud morfoloogilisi omadusi (joonis 1D).

Joonis 1. PhG-d vähendasid H2O2-indutseeritud tsütotoksilisust PC12 rakkudes. Rakkude elujõulisus tuvastati MTT testiga. H2O2 (A) ja PhG-de (B) tsütotoksiline toime erinevatel kontsentratsioonidel PC12 rakkudele. (C) PhG-d nõrgendasid H2O2-indutseeritud rakkude elujõulisuse vähenemist. PC12 rakke inkubeeriti PhG-dega ({{10}},1 ja 10 wg/mL) 24 tundi ja seejärel inkubeeriti veel 200 pM H2O2-ga. 2 tundi pärast PhG-de eemaldamist. (D) Morfoloogiline vaatlus. Rakke jälgiti pärast töötlemist faasikontrastmikroskoobiga (x100), CK: normaalne rühm, H2O2: H2O2-ga töödeldud rühm, HL: salidrosiidi väikese annusega ravitud rühm, HH: salidrosiidi suure annusega ravitud rühm, ML: väikese akteosiidiga ravitud rühm, MH: suure annusega ravitud akteosiidiga ravitud rühm, IL: isoakteosiidi väikese annusega ravitud rühm, IH: isoakteosiidi suure annusega ravitud rühm, SL: ehhinakosiidi väikese annusega ravitud rühm, SH: ehhinakosiidi suure annusega ravitud rühm. ** p < 0,01="" võrreldes="" ravimata="" rühmaga;="" #="" p="">< 0,05,="" võrreldes="" h2o2-ga="" töödeldud="" rühmaga;="" ##="" p="">< 0,01,="" võrreldes="" h2o2-ga="" töödeldud="">

2.2. PhG-d pärssisid H2O2-indutseeritud ROS-i rakusisest akumulatsiooni, lipiidide peroksüdatsiooni (MDA) ja suurenenud superoksiidi dismutaasi (SOD) aktiivsust PC12 rakkudes

PC12 rakkude kokkupuude 200 pM H2O2-ga 2 tunni jooksul suurendas ROS taset, MDA sisaldust ja vähendas SOD aktiivsust (joonis 2). PhG-de eeltöötlus nõrgendas ROS-i, salidrosiidi ja akteosiidi taset ning isoakteosiidi ja ehhinakosiidi eeltöötluse kõrge annus vähendas oluliselt ROS-i taset (p <0,01). salidrosiidi="" eeltöötlus="" ei="" avaldanud="" mõju="" mda="" sisaldusele,="">akteosiideeltöötlus vähendas oluliselt MDA sisaldust (p < 0,05).="" isoakteosiidi="" ja="" ehhinakosiidi="" eeltöötlus="" vähendas="" oluliselt="" mda="" sisaldust="">

Joonis 2. PhG-d blokeerisid ROS ja MDA akumulatsiooni ning suurendasid SOD aktiivsust PC12 rakkudes. PC12 rakke inkubeeriti PhG-dega (0,1 ja 10 4g/mL) 24 tundi ja seejärel inkubeeriti veel 200 |^M H2O2-ga. 2 tundi pärast PhG-de eemaldamist. (A) PhG-d blokeerisid ROS-i ja MDA akumulatsiooni. (B) PhG-d blokeerisid MDA akumulatsiooni. (C) PhG-d suurendasid SOD aktiivsust. CK: normaalne rühm, mudel: H2O2-ga töödeldud rühm, Salidrosiid: salidrosiidiga töödeldud rühm, Akteosiid: akteosiidiga töödeldud rühm, Isoakteosiid: isoakteosiidiga töödeldud rühm, ehhinakosiid: ehhinakosiidiga töödeldud rühm. ** p < 0,01="" versus="" ravimata="" rühm;="" #="" p="">< 0,05,="" versus="" h2o2-ga="" töödeldud="" rühm,="" ##="" p="">< 0,01,="" versus="" h2o2-ga="" töödeldud="">

2.3. PhG-de ümberpööratud H2O2-indutseeritud apoptoos PC12 rakkudes

H2O2-ravi (200 |1M) 2 tunni jooksul suurendas märkimisväärselt apoptoosi PC12 rakkudes, kogu apoptootiline määr oli kuni 16,02 protsenti (joonis 3). Kuid eeltöötlus PhG-dega (0,1 ja 10 µg/ml) 24 tunni jooksul vähendas apoptoosi kiirust kontsentratsioonist sõltuval viisil (p <0,01).>akteosiid, isoakteosiid jaehhinakosiidvähendas märkimisväärselt raku apoptoosi protsenti 4.750-6.627 protsenti, 4.413-5.800 protsenti, 6.593-10.047 protsenti ja 1.530-7. vastavalt 510 protsenti.

Joonis 3. PhG-d muutsid PC12 rakkudes H2O2-indutseeritud apoptoosi. PC12 rakke inkubeeriti PhG-dega (0.1 ja 10 µg/mL) 24 tundi ja seejärel inkubeeriti 200 pM H2O2-ga veel 2 tundi pärast PhG-de eemaldamist. Seejärel mõõdeti apoptoosi voolutsütomeetria abil, kasutades PI / FITC fluorestsentssondi.

CK: normaalne rühm, mudel: H2O2-ga töödeldud rühm, salidrosiid: salidrosiidiga töödeldud rühm, akteosiid: akteosiidiga töödeldud rühm, isoakteosiid: isoakteosiidiga töödeldud rühm,ehhinakosiid: ehhinakosiidtöödeldud rühm. ** p < {{0}},01="" versus="" ravimata="" rühm;="" ##="" p="">< 0,01,="" võrreldes="" h2o2-ga="" töödeldud="">

2.4. PhG-d leevendasid H2O2-indutseeritud Nrf2-ARE radade düsregulatsiooni PC12 rakkudes

Nrf{{0}}ARE rada, mis on enamiku rakutüüpide üks peamisi antioksüdante, on oluline rakkude kasvu ja rakusurma reguleerimisel. Seetõttu uurisime spetsiifilisi antikehi kasutades immunofluorestsentsi ja Western blot analüüsi abil, kas Nrf2-ARE rada on seotud H2O2-indutseeritud apoptoosiga. Immunofluorestsentsanalüüs näitas, et PhG-d (0,1 ja 10 pg/ml) kutsusid esile Nrf2 tuuma translokatsiooni (joonis 4). Pärast ravi PhG-de, isoakteosiidi jaehhinakosiidtulemuseks raku normaalse morfoloogia osaline taastumine. Western blot analüüsi ja halli tiheduse analüüside tulemused näitasid, et PhG-d ({{0}}.1 ja 10 pg/mL) ei mõjutanud oluliselt Nrf2 ekspressiooni tsütoplasmas (joonis 5A, B) (p > {{20}},05), kuid nrf2 ekspressioon tuumas ülesreguleeritud (joonis 5C, D) (p < 0,01).="" seejärel="" uurisime="" nrf2="" rolli="" h2o2-indutseeritud="" apoptoosis,="" importides="" nrf2="" sirna.="" nrf2="" valgu="" ja="" mrna="" ekspressioon="" oli="" kõigis="" nrf2="" sirna-ga="" töödeldud="" rühmades="" oluliselt="" alla="" reguleeritud="" (joonis="" 5e-h).="" phg-d="" (0,1="" ja="" 10="" pg/ml)="" hoidsid="" ära="" h2o2--indutseeritud="" tsütotoksilisuse="" rühmades,="" kus="" ei="" olnud="" nrf2="" sirna-ga="" ravitud="" (p="">< 0,01),="" kuid="" sellise="" kaitse="" tühistas="" nrf2="" sirna.="" pärast="" nrf2="" sirna-ga="" töötlemist="" vähenes="" rakkude="" elujõulisus="" märkimisväärselt="" isegi="" phg-ravi="" korral="" (joonis="">

Joonis 5. PhG-de kaitsev toime Nrf2-le H2O2-töödeldud PC12 rakkudes. (A) Nrf2 valgu ekspressioon tsütoplasmas tuvastati immunoblotanalüüsiga, kasutades spetsiifilist antikeha. Laadimiskontrollina kasutati p-aktiini. (B) Nrf2 valgu kvantitatiivne densitomeetriline analüüs tsütoplasmas. (C) Nrf2 valgu ekspressioon tuumas tuvastati immunoblotanalüüsiga, kasutades spetsiifilist antikeha. Laadimiskontrollina kasutati histoone H3. (D) Nrf2 valgu kvantitatiivne densitomeetriline analüüs tuumas. (E, F) PC12 rakke eelinkubeeriti ilma (E) või (F) Nrf2 siRNA-ga 24 tundi, seejärel inkubeeriti koos PhG-dega või ilma (0.1 ja 10 昭/mL) 24 tundi ja inkubeeriti H2O2-ga veel 2 tundi pärast PhG-de eemaldamist. Nrf2 valgu koguekspressioon tuvastati immunoblotanalüüsiga, kasutades spetsiifilist antikeha, ja laadimiskontrollina kasutati p-aktiini. (G) Kogu Nrf2 valgu kvantitatiivne densitomeetriline analüüs. (H) Nrf2 mRNA kvantitatiivne analüüs. (I) PC12 rakke eelinkubeeriti siRNA-ga või ilma 24 tundi, seejärel inkubeeriti koos PhG-dega (0,1 ja 10 -/ml) või ilma nendeta 24 tundi ja pärast PhG-de eemaldamist inkubeeriti H2O2-ga veel 2 tundi. Pärast töötlemist määrati ellujäämisrakud MTT testiga. CK: normaalne rühm, mudel: H2O2-ga töödeldud rühm, kontroll Si: kontroll-siRNA-ga töödeldud rühm, SiRNA negatiivne: ilma siRNA-ga töödeldud rühm, SiRNA positiivne: SiRNA-ga töödeldud rühm, salidrosiid: salidrosiidiga töödeldud rühm, akteosiid: akteosiidiga töödeldud rühm, isoakteosiid: isoakteosiidiga töödeldud rühm Grupp,ehhinakosiid: ehhinakosiidiga töödeldud rühm. ** p < {{0}}.01="" versus="" ravimata="" rühm;="" #="" p="">< 0.05,="" versus="" h2o2-ga="" töödeldud="" rühm="" (ilma="" nrf2="" sirna-ga="" töödeldud),="" ##="" p="">< 0,01="" versus="" h2o2-ga="" töödeldud="" rühm="" (ilma="" nrf2="" sirna-ga="" töödeldud);="" &="" p="">< 0,05="" versus="" h2o2-ga="" töödeldud="" rühm="" (töödeldi="" nrf2="" sirna-ga)="" ja="" p="">< 0,01="" versus="" h2o2-ga="" töödeldud="" rühm="" (töödeldi="" nrf2="">

2.4. PhG-d muutsid H2O2-indutseeritud HO-1, NQO1, GCLC ja GCLM valgu ekspressiooni allareguleerimise

HO{{0}}, NQO1 ja glutamaattsüsteiini ligaas (GCL) on olulised raku antioksüdantsed ensüümid ning HO-1, NQO1 ja GCL katalüütilised või modifitseerivad alaühikud (GCLC või GCLM) on Nrf2-reguleeritud allavoolu geenid [27]. Pärast töötlemist täheldati HO-1, NQO1, GCLC ja GCLM valgu ekspressiooni. Leiti ilmne erinevus HO-1 ja NQO1 valgu ekspressiooni vahel koos H2O2-ga või ilma (joonis 6A–C) (p < 0.01).="" phg-d="" (0.1="" ja="" 10="" p^g/ml)="" muutsid="" h2o2-indutseeritud="" ho-1="" valguekspressiooni="" allareguleerimise="" (v.a="" salidrosiid="" väärtusel="" {{32}="" },1="" pg/ml),="" nqo1="" (välja="" arvatud="" akteosiid="" 0,1="" pg/ml)="" (p="">< 0,01).="" h2o2="" vähendas="" ka="" gclc="" ja="" gclm="" valgu="" ekspressiooni="" (p="">< 0,05)="" (joonis="" 6a,="" d,="" e).="" phg-d="" (0,1="" ja="" 10="" pg/ml)="" muutsid="" h2o2-indutseeritud="" gclc="" valguekspressiooni="" allareguleerimise="">ehhinakosiid{{0}},1 pg/mL) (p < 0.01)="" ja="" gclm="" (välja="" arvatud="" salidrosiid="" 0,1="" pg/ml)="" (="" p="">< 0.01).="" seejärel="" kasutati="" ho-1="" keemilisi="" inhibiitoreid,="" et="" täiendavalt="" hinnata="" antioksüdantsete="" ensüümide="" rolli="" phg-de="" kaitse="" reguleerimisel="" h2o2-indutseeritud="" tsütotoksilisuse="" eest.="" phg-d="" (0,1="" ja="" 10="" pg/ml)="" hoidsid="" ära="" h2o2-indutseeritud="" tsütotoksilisuse,="" kuid="" ho-1="" inhibiitor="" znpp="" (p="">< 0,01)="" muutis="" sellise="" kaitsva="" toime="" 20="" pm="" juures="" (joonis="" 6f,="" p="">< 0,01)="">

2.5. Keap1 ekspressiooni ja molekulaarse dokkimise analüüs

Füsioloogilistes tingimustes toimib Keap1 Nrf2 repressorvalguna, seondudes Nrf2 Neh2 domeeniga ja suunates Nrf2 Cul3-põhisele E3 ubikvitiini ligaasile ubikvitineerimiseks ja sellele järgnevaks lagunemiseks 26S proteasoomi poolt [28]. PhG-de Keap1 seondumisvõimet hinnati molekulaarse dokkimisanalüüsi abil, et uurida nende antioksüdantse toime mehhanismi.

3. Arutelu

Uurisime PhG-de neuroprotektsiooni H2O2 indutseeritud tsütotoksilisuse suhtes PC12 rakkudes. Tulemused näitavad, et PhG-de eeltöötlus pärssis oluliselt HzOz-indutseeritud tsütotoksilisust, nõrgendas rakusisest ROS-i taset, parandas rakusiseste antioksüdantsete ensüümide taset ja lõpuks muutis H2O2-indutseeritud tsütotoksilisuse PC12 rakkudes. Veelgi enam, PhG-d suurendasid Nrf2 transkriptsioonilist aktivatsiooni, muutsid HzOz-indutseeritud HO-1, NQO1, GCLC ja GCLM valgu ekspressiooni allareguleerimise. Lisaks näitasid PhG-d potentsiaalset interaktsiooni Keap1 valgu Nrf2 sidumissaidiga.

H2O2-indutseeritud PC12 rakukahjustuse korral suurendas lipiidide peroksüdatsioon, mis viitab lipiidide oksüdatiivsele lagunemisele, membraanide läbilaskvust, põhjustades rakukahjustusi [29]. MDA moodustumist kasutatakse laialdaselt lipiidide peroksüdatsiooni indeksina [30]. H2O2 suurendas ROS-i tootmist ja ammendas antioksüdantide kaitseensüüme, nagu SOD, katalaas ja GPx. See protsess põhjustab oksüdatiivset stressi [31], mis mängib võtmerolli enamiku neurodegeneratiivsete häirete põhjuslikkuses ja progresseerumises. Kooskõlas varasemate uuringutega täheldasime pärast H2O2-ravi suurenenud ROS-i taset, vähenenud intratsellulaarseid antioksüdantseid ensüüme ja PC12-rakkude suurenenud apoptoosi. PhG-de eeltöötlus nõrgendas oluliselt HzOz-indutseeritud rakusisese ROS-i suurenemist, parandas rakusiseseid antioksüdantseid ensüüme ja muutis lõpuks HzOz-indutseeritud tsütotoksilisuse PC12 rakkudes.

Kuang et al. [32] teatas sellestehhinakosiidnäitas mitokondriaalse apoptootilise raja kaudu olulist neuroprotektiivset toimet H2O2-indutseeritud tsütotoksilisusele PC12 rakkudes. Selles uuringus leidsime, et ehhinakosiid, salidrosiid, akteosiid ja isoakteosiid avaldasid neuroprotektiivset toimet, suurendades PC12 rakkude antioksüdantset aktiivsust, kuna need suurendasid Nrf2 transkriptsioonilist aktivatsiooni ja reguleerisid üles HO-1, NQO1 allavoolu valgu ekspressiooni. GCLC ja GCLM. Paljud uuringud on selgelt näidanud, et Nrf2 sihtgeenide, eriti HO-1 aktiveerimine astrotsüütides ja neuronites kaitseb tugevalt põletiku, oksüdatiivsete kahjustuste ja rakusurma eest. On teatatud, et HO-1 süsteem on kesknärvisüsteemis väga aktiivne ja selle modulatsioonil on ilmselt oluline roll neurodegeneratiivsete häirete patogeneesis [33]. Hiljutised uuringud selgitasid ka Nrf2 rolli PD [9] progresseerumisel ja riskil ning Keap1 kui tõhusat sihtmärki Nrf2 taasaktiveerimiseks AD-s [34]. Tulemused toetavad uusi tõendeid Nrf2 kui neurodegeneratiivsete haiguste terapeutilise sihtmärgi kohta.

Molekulaarne dokkimisanalüüs näitas, et PhG-d võivad seostuda Keap1-ga järgmiste sidumisvõimetega:ehhinakosiid>isoakteosiid > akteosiid > salidrosiid. Kooskõlas nende tulemustega viis PhG-de eeltöötlus Nrf2 tuuma translokatsioonini, mille tuumas oli järgmine Nrf2 ekspressioon:ehhinakosiid>isoakteosiid * akteosiid > salidrosiid. Eeldasime, et glükosiidide arv mõjutas PhG-de ja Keap1 võimalikku seondumisviisi ning seondumisrežiim põhjustas veelgi Nrf2 vabanemise Keap1-st. Selle protsessi tulemuseks oli Nrf2 ja allavoolu geenide aktiveerimine ning lõppkokkuvõttes kaitseb PC12 rakke H2O{6}}indutseeritud oksüdatiivse stressi eest.

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Keemilised ühendid ja reaktiivid

Salidrosiid (CAS nr 10338-51-9), akteosiid (CAS nr 61276-17-3), isoakteosiid (CAS nr 61303-13-7) jaehhinakosiid(CAS nr {{0}}) osteti ettevõttelt YYuanye Biotechnology Company (Shanghai, Hiina). PhG-d lahustati PBS-is, et saada 10 mg/ml põhilahus, mida säilitati -20 kraadi juures. H2O2 osteti firmalt Aladdin® (Shanghai, Hiina). RPMI-1640 sööde ja veise looteseerum osteti ettevõttest Hyclone (Logan, UT, USA) ning 0,5-protsendiline trüpsiini EDTA, penitsilliini ja streptomütsiini osteti ettevõttest Keyi (Hangzhou, Hiina). MDA, SOD diagnostikakomplektid, MTT ja DCFH-DA osteti ettevõttest Beyotime Biotechnology Institute (Nanjing, Jiangsu, Hiina). Anneksiin V-FITC/PI topeltvärvimise komplekt osteti ettevõttest Solarbio Life Sciences (Peking, Hiina). Antikehad Nrf2, Histoon H3, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM ja p-aktiini, hiire-mädarõika peroksiidi (HRP) IgG ja küülikuvastase HRP-IgG vastu osteti ettevõttelt Abcam (London, Ühendkuningriik). HO-1 ja ZnPP inhibiitorid osteti ettevõttelt Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). RNAiso Plus, PrimeScript™RT reaktiivikomplekt koos gDNA kustutuskummiga ja SYBR® Premix Ex Taq™ II osteti ettevõttest Takara (Shiga, Jaapan). Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent osteti firmast Thermo Fisher Scientific (Waltham, UK). Nrf2 siRNA järjestused olid järgmised: edasi, CCGAAUUACAGUGUCUUAA; ja tagurpidi, UUAAGACACUGUAAUUCGG. Vahepeal olid kontroll-siRNA järjestused järgmised: edasi, UUCUCCGAACGUGUCACGU; ja tagurpidi, ACGUGACACGUUCGGAGAA.

4.2. Rakukultuur

Hiire neerupealiste feokromotsütoomi liin (PC12 rakud) saadi SIBSi biokeemia ja rakubioloogia instituudist (CAS, Shanghai, Hiina). Rakke hoiti RPMI-1640-s (Hyclone), mis sisaldas 10 protsenti veise loote seerumit (Hyclone), 100 U/ml penitsilliini ja 0,1 mg/ml streptomütsiini 37 kraadi juures 5 protsendi CO2-ga. Söödet vahetati ülepäeviti.

4.3. Rakkude elujõulisuse test

PC12 rakud külvati 96-süvendiga plaatidele tihedusega 2 x 104 rakku süvendi kohta. Pärast kinnitamist eelinkubeeriti rakke 20 minutit koos inhibiitoriga või ilma, inkubeeriti koos PhG-dega või ilma 24 tundi ja seejärel inkubeeriti H202-ga veel 2 tundi pärast PhG-de eemaldamist. Pärast inkubeerimist töödeldi rakke 5 mg/ml MTT-ga 4 tundi 37 kraadi juures ja sööde eemaldati ettevaatlikult. Ellujäänud rakkudest moodustunud formatsaani kristallid lahustati sinise värvuse saamiseks 150 rL DMSO-s [35] ja neeldumist mõõdeti plaadilugejal lainepikkusel 570 nm. Kontrollides kasutati sama kontsentratsiooni söödet ainult DMSO-ga. Rakkude elujõulisus normaliseeriti kontrolli protsendina.

PhG-de kontsentratsioonid (0.1, 1,5 ja 10 Rg/ml) valiti sõltuvalt PhG-de tsütotoksilisuse analüüsist ja ehhinakosiidi teatatud tsütoprotektiivsest toimest [32]. Aruande kohaselt ei ilmnenud alla 10 Rg/ml tsütotoksilist toimet ja teatati, et ehhinakosiidil on HzOz-vigastatud rakumudelis tsütoprotektiivne toime.

4.4. Apoptoosi test

Apoptoos tuvastati anneksiin V-FITC/PI topeltvärvimiskomplektiga (Solarbio). PC12 rakud külvati 6-süvendiplaatidele tihedusega 2 x 105 rakku süvendi kohta. Pärast kinnitamist töödeldi rakke PhG-dega (0,1 ja 10 Rg/ml) 24 tundi ja inkubeeriti H202-ga veel 2 tundi pärast PhG-de eemaldamist. Pärast inkubeerimist pesti rakke külmas PBS-s, tsentrifuugiti kaks korda kiirusel 1500 p/min 10 minutit ja resuspendeeriti 500 rL sidumispuhvris. FITC-märgistatud anneksiin V (5 rL) ja propiidiumjodiid.

4.5. Intratsellulaarse ROS-i, MDA produktsiooni ja SOD mõõtmine

Rakusisene ROS-i tase määrati ROS-tundliku fluorestsentssondi, nimelt 2,7-diklorodihüdrofluorestseeruva diatsetaati (DCFH-DA) abil. PC12 rakud külvati 6-süvendiplaatidele tihedusega 2 x 105 rakku süvendi kohta. Pärast kinnitamist töödeldi rakke PhG-dega (0,1 ja 10 µg/ml) 24 tundi ja inkubeeriti H202-ga veel 2 tundi pärast PhG-de eemaldamist. Pärast inkubeerimist pesti rakke kolm korda PBS-ga ja seejärel inkubeeriti 10 µM DCFH-DA-ga. Pärast 20-minutilist inkubeerimist 37 kraadi juures pesti rakke PBS-ga ja koguti õrna tsentrifuugimisega. Intratsellulaarset ROS-i mõõdeti Gallios™ voolutsütomeetriga (Beckman Coulter, Brea, CA, USA).

MDA ja SOD mõõdeti testikomplektidega (Beyotime Biotechnology, Nanjing, Jiangsu, Hiina). Kõik protseduurid vastasid täielikult tootja juhistele. MDA ja SOD sisaldus normaliseeriti vastava üldvalgusisaldusega.

4.6. Nrf2 tuuma translokatsiooni immunofluorestsents

PC12 rakud külvati 6-kaevu klaasslaididesse tihedusega 2 x 105 süvendi kohta. Pärast kinnitamist töödeldi rakke PhG-dega (0,1 ja 10 卩g/ml) 24 tundi ja inkubeeriti H2O2-ga veel 2 tundi pärast PhG-de eemaldamist. Pärast inkubeerimist pesti rakke külmas PBS-s ja fikseeriti 4% paraformaldehüüdis 15 minutit toatemperatuuril, millele järgnes membraani läbilaskvus, kasutades 0,5% Triton X-100 PBS-is 5 minutit. Rakke inkubeeriti öö läbi temperatuuril 4 °C nrf2-vastase küüliku IgG-ga (Abcam) koos 5% FBS-iga. Seejärel kanti rakkudele 20 minutiks toatemperatuuril FITC-ga konjugeeritud sekundaarsed küülikuvastased antikehad. Viimases ettevalmistusetapis värviti tuumad 4z,6-diamidino-2-fenüülindooliga (DAPI). Objektiklaase loputati korraks PBS-ga, kuivatati õhu käes ja paigaldati fluorestsentsivastasesse ainesse pleekivas keskkonnas. Slaidid visualiseeriti laserkonfokaalse mikroskoobi all (LMS780, Zeiss, Saksamaa).

4.7. Valkude ekstraheerimine

PC12 rakud külvati 100 mm tassidesse 1 x 107 rakku tassi kohta. Pärast kinnitamist töödeldi rakke PhG-dega (0,1 ja 10 µg/ml) 24 tundi ja seejärel inkubeeriti veel 2 tundi H2O2-ga koos PhG-de eemaldamisega. Pärast inkubeerimist pesti rakke kaks korda külma PBS-ga ja kaabiti plaatidelt 1000 µl PBS-ga. Rakkude homogenaate tsentrifuugiti kiirusel 1500 p/min 10 minutit. Pärast töötlemist ekstraheeriti rakulised valgud, kasutades Beyotime RIPA rakulüüsipuhvrit 1 mM PMSF-iga vastavalt tootja juhistele. Lisaks eraldati tsütoplasmaatilised ja tuumavalgud, nagu on kirjeldatud Beyotime'i tuuma- ja tsütoplasmaatilise ekstraheerimise komplektis. Proovide valgukontsentratsioon tuvastati Beyotime BCA valguanalüüsi komplektiga ja kõiki proove säilitati Western blot analüüsi jaoks temperatuuril -80.

4.8. Western blot analüüs

Western blot analüüs viidi läbi standardsete meetoditega. Lühidalt, valguproovid (20 või 30 µg) eraldati SDS-PAGE abil ja kanti üle PVDF membraanidele. Membraanid blokeeriti 5% piima-TBST-s ja inkubeeriti üleöö 4 kraadi juures primaarses antikehas. Kasutatud antikehad olid Nrf2 (Abcam), Keap1 (Abcam), HO-1 (Abcam), NQO-1 (Abcam), GCLC (Abcam), GCLM (Abcam), Histone H3 (Abcam) ja p-aktiin (Abcam). Sekundaarse antikehana kasutati peroksidaasiga konjugeeritud hiirevastast IgG-d (Abcam) või küülikuvastast IgG-d (Abcam). Valguribad visualiseeriti ChemiScope seeria abil (Clinx Science Instruments, Shanghai, Hiina). Valguribade halli väärtus määrati ImageJ abil (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.9. Kvantitatiivne reaalajas PCR

Kogu RNA ekstraheeriti, kasutades RNAiso Plusi (Takara, Shiga, Jaapan), järgides tootja juhiseid. Kogu RNA proovid pöördtranskribeeriti PrimeScript™ RT reaktiivikomplektiga koos gDNA kustutuskummiga (Takara, Shiga, Jaapan) vastavalt tootja juhistele. Kvantitatiivne reaalajas PCR viidi läbi, kasutades SYBR® Premix Ex Taq™ II (Takara, Shiga, Jaapan) rakenduses Applied Biosystems ViiA™ 7 Real-Time PCR System. Sihtgeenide suhteline ekspressioon normaliseeriti p-aktiiniks ja analüüsiti 2-AACt meetodil. Nrf2 praimeri järjestused olid järgmised: edasi, ACAGTGCTCCTATGCGTGAA ja tagurpidi, TCTGGGCGGCGACTTTAT. p-aktiini praimerijärjestused olid järgmised: edasi, GCTGTCCCTGTATGCCTCT; ja tagurpidi, TTGATGTCACGCACGATTT.

4.10. siRNA transfektsioon

PC12 rakke kultiveeriti 6-kaevu klaasslaididel tihedusega 2 x 105 süvendi kohta (Western blot analüüsi jaoks) või 96-süvendi klaasslaididel tihedusega 2 x 104 süvendi kohta (raku jaoks elujõulisuse analüüs). Kontroll-siRNA ja Nrf2 siRNA transfekteeriti rakkudesse, kasutades Lipofectamine RNAiMAX-i (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) vastavalt tootja juhistele. Pärast 24-tunnist inkubeerimist töödeldi rakke PhG-de ja H2O2-ga või ilma nendeta näidatud aegadel ning seejärel kasutati Western blot analüüsis, qRT-PCR-is või rakkude elujõulisuse analüüsis, nagu ülalpool kirjeldatud.

4.11. Molekulaarse dokkimise analüüs

Molecular docking analysis was performed to investigate the possible binding mode of PhGs to Keap1. The 3D structure of ligands was obtained from NCBI. The crystallized structure of Keap1 (PDB Code: 4L7B) was prepared using correcting structure issues (such as break bond and miss loop) using SYBYL-X 2.0. In this software simulation, crash represents the inadequate penetration between the protein and the ligand. Polar represents the hydrogen bonding and electrostatic interactions between the protein and the ligand. G-score [36] represents the hydrogen bonding, complex (ligand-protein), and internal (ligand-ligand) energies between the protein and the ligand. PMF-score [37] represents the Helmholtz free energy between the protein and the ligand. D-score [38] represents the charge and van der Waals interactions between the protein and the ligand. Chem-score [39] represents the hydrogen bonding, metal-ligand interaction, lipophilic contact, and rotational entropy, along with an intercept term between the protein and the ligand. C score represents the consensus score between the protein and the ligand, comprehensively reflecting the G, PMF, D, and Chem-scores. Tota-score reflects the binding capacity of the ligand to the protein. The best modes were generated and evaluated using the Total-score (>6) and C-score (>4).

4.12. Statistiline analüüs

Andmeid analüüsiti ühesuunalise ANOVA abil koos LSD analüüsidega, kasutades SPSS-i. Kõik tulemused kinnitati kolme sõltumatu katsega. Andmed väljendati keskmistena 土 SD. Statistiliselt olulisi erinevusi arvestati p <>

Tänuavaldused: Seda uuringut toetasid Hiina riiklik teadus- ja arendustegevuse suurprogramm (nr 2017YFD0400200), Hiina Zhejiangi provintsi loodusteaduste sihtasutus (nr R15C200002) ja põllumajandustoodete kvaliteedi ohutuse riskihindamise eriprojekt (nr. GJFP2018015), Hiina põllumajandus- ja maaeluministeerium.

Autori kaastööd:Baiyi Lu ja Maiquan Li kavandasid uuringu. Maiquan Li tegi laboritööd, andmeanalüüsi ja kirjutas töö. Maiquan Li, Tao Xu, Fei Zhou, Mengmeng Wang, Huaxin Song, Xing Xiao ja Baiyi Lu muutsid käsikirja.

1 Intelligentse toidutehnoloogia ja seadmete riiklik tehnikalabor,

Põllumajandus- ja maaeluministeeriumi põllumajandustoodete koristusjärgse käsitsemise võtmelabor, põllumajandus- ja maaeluministeeriumi põllumajandustoodete toitumisalase hindamise võtmelabor, Zhejiangi põllumajandusliku toidu töötlemise võtmelabor, Fuli toiduteaduse instituut, biosüsteemide kolledž Tehnika- ja toiduaineteadus, Zhejiangi Ülikool, Hangzhou 310058, Hiina;

2 Guangzhou Hiina meditsiini ülikooli esimese kliinilise meditsiini kolledž,

Viited

1. Päike, AY; Chen, YM Oksüdatiivne stress ja neurodegeneratiivsed häired. J. Biomed. Sci. 1998, 5, 401-414.

2. Maheshwari, A.; Misro, MM; Aggarwal, A.; Sharma, RK; Nandan, D. H2O2 poolt indutseeritud munandite idurakkude apoptoosiga seotud rajad in vitro. FEBS J. 2009, 276, 870-881.

3. Halliwell, B. Reaktiivsed hapniku liigid ja kesknärvisüsteem. J. Neurochem. 1992, 59, 1609-1623.

4. Richardson, JS; Subbarao, KV; Ang, LC Raua poolt indutseeritud vabade radikaalide peroksüdatsiooni võimaliku rolli kohta neuraalses degeneratsioonis Alzheimeri tõve korral. Ann. NY Acad. Sci. 1992, 648, 326-327.

5. Zhang, DD Nrf{1}}Keap1 signaaliraja mehaanilised uuringud. Narkootikumide Metab. Rev. 2006, 38, 769-789.

6. Itoh, K.; Tong, KI; Yamamoto, M. Molekulaarne mehhanism, mis aktiveerib Nrf{1}}Keap1 raja elektrofiilidele adaptiivse reaktsiooni reguleerimisel. Vaba Radik. Biol. Med. 2004, 36, 1208-1213.

7. Kong, AN; Owuor, E.; Yu, R.; Hebbar, V.; Chen, C.; Hu, R.; Mandlekar, S. Ksenobiootiliste ensüümide esilekutsumine kaardikinaasi raja ja antioksüdandi või elektrofiilse vastuse elemendi (ARE/EpRE) abil. Narkootikumide Metab. Rev. 2001, 33, 255-271.

8. Buendia, I.; Michalska, P.; Navarro, E.; Gameiro, I.; Egea, J.; Leon, R. Nrf{1}}ARE rada: esilekerkiv sihtmärk oksüdatiivse stressi ja neuropõletike vastu neurodegeneratiivsete haiguste korral. Pharmacol. Seal. 2016, 157, 84-104. [CrossRef] [PubMed]

9. Skibinski, G.; Hwang, V; Ando, ​​DM; Daub, A.; Lee, AK; Ravisankar, A.; Modan, S.; Finucane, MM; Shabby, BA; Finkbeiner, S. Nrf2 leevendab LRRK2- ja a-sünukleiini poolt indutseeritud neurodegeneratsiooni, moduleerides proteostaasi. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2016, 114, 1165-1170.

10. Jimenez, C.; Riguera, R. Fenüületanoidglükosiidid taimedes: struktuur ja bioloogiline aktiivsus. Nat. Prod. Rep. 1994, 11, 591-606.

11. Georgijev, M.; Alipieva, K.; Orhan, I.; Abrašev, R.; Denev, P.; Angelova, M. Verbascum xanthophoeniceum Griseb antioksüdantide ja koliinesteraaside inhibeerivad tegevused. ja selle fenüületanoidglükosiidid. Food Chem. 2011, 128, 100-105.

12. Li, N.; Wang, J.; Ma, J.; Gu, Z.; Jiang, C.; Yu, L.; Fu, X. Cistanchesi herbateraapia neuroprotektiivne toime mõõduka Alzheimeri tõvega patsientidele. Tõenditepõhine täiendus. Altern. Med. 2015, 2015, 103985.

13. Liu, YL; Tema, WJ; Mo, L.; Shi, MF; Zhu, YY; Pan, S.; Li, XR; Xu, QM; Yang, SL Monochasma savatieri Franchi fenüületanoidglükosiidide antimikroobne, põletikuvastane toime ja toksikoloogia. endine Maxim. J. Ethnopharmacol. 2013, 149, 431-437.

14. Dong, Q.; Yao, J.; Fang, JN; Ding, K. Cistanche deserticola YC Ma kahe külma veega ekstraheeritava polüsahhariidi struktuurne iseloomustus ja immunoloogiline aktiivsus. Süsivesikud. Res. 2007, 342, 1343-1349.

15. Xiong, L.; Mao, S.; Lu, B.; Yang, J.; Zhou, F.; Hu, Y.; Jiang, Y.; Shen, C.; Zhao, Y. Osmanthusfragransi lilleekstrakt ja akteosiid kaitsevad d-galaktoosist põhjustatud vananemise eest ICR-hiiremudelis. J. Med. Toit 2016, 19, 54-61.

16. Jiang, Y.; Mao, S.; Huang, W.; Lu, B.; Cai, Z.; Zhou, F.; Li, M.; Lou, T.; Zhao, Y. Osmanthusfragrans Louri fenüületanoidglükosiidi profiilid ja antioksüdantsed omadused. Lilled UPLC/PDA/MS ja simuleeritud seedimise mudeli järgi. J. Agric. Food Chem. 2016, 64, 2459-2466.

17. Li, X.; Jah, X.; Li, X.; Päike, X.; Liang, Q.; Tao, L.; Kang, X.; Chen, J. Salidroside kaitseb MPP pluss-indutseeritud apoptoosi eest PC12 rakkudes, inhibeerides NO rada. Brain Res. 2011, 1382, 9-18.

18. Zhang, L.; Ding, W.; Sun, H.; Zhou, Q.; Huang, J.; Li, X.; Xie, Y.; Chen, J. Salidroside kaitseb PC12 rakke MPP pluss-indutseeritud apoptoosi eest, aktiveerides PI3K/Akt raja. Food Chem. Toksikool. 2012, 50, 2591-2597.

19. Sheng, GQ; Zhang, JR; Pu, XP; Ma, J.; Li, CL Verbaskosiidi kaitsev toime 1-metüül-4- fenüülpüridiiniumiioonide poolt põhjustatud neurotoksilisusele PC12 rakkudes. Eur. J. Pharmacol. 2002, 451, 119-124.

20. Wang, H.; Xu, Y.; Yan, J.; Zhao, X.; Päike, X.; Zhang, Y.; Guo, J.; Zhu, C. Akteosiid kaitseb inimese neuroblastoomi SH-SY5Y rakke beeta-amüloidist põhjustatud rakukahjustuse eest. Brain Res. 2009, 1283, 139-147.