Wen-Lan Li, Jing-Xin Ding, Jing Bai, Yang Hu, Hui Song, Xiang-Ming Sun, Yu-Bin Ji

Lisateabe saamiseks võtke ühendust:Joanna.jia@wecistanche.com

Abstraktne

LC-tehnoloogia on tunnustatud meetod, mida kasutatakse kogu maailmas traditsiooniliste hiina ravimite (TCM) kvaliteedi hindamiseks. TCM-i kvaliteet mõjutab otseselt selle tõhusust. Seetõttu on TCM-i efektiivsuse põhjalikuks paljastamiseks vaja kõigepealt mõista selle tõhususe materiaalset alust ja seejärel kontrollida toimeainete kvaliteeti. Spektri-mõju seose meetodi rakendamine on farmakoloogilise materiaalse baasi määramisel ülioluline. Selle töö eesmärk oli uurida aluseks olevaid seoseid keemiliste profiilide ja östrogeense aktiivsuse vahel.Cistanche, et paljastada aktiivsed ühendid. Keemilised profiilidCistancheregistreeriti HPLC/Q-TOF-MS/MS abil ning östrogeenne aktiivsus määrati emaka kasvutesti ja MTT testiga. Seejärel kahe muutujaga analüüsi, põhikomponentide analüüsi ja halli korrelatsioonianalüüsi meetodi tulemuste kombineerimisel tuvastati viisteist toimeainet. Need on 8-epilogaanhape, salidrosiid, syringaliid A 3'- -l-ramnopüranosiid, tsistanosiid A, ehhinakosiid, tsistanosiid F, tsistanosiid B, tsistanosiid C, osmantusiid B, akteosiid, isoakteosiid, tubulosiid B, 2 '-atsetüüllakteosiid ja kaks tundmatut ühendit. See uuring loob aluse in vivo uuringuteleCistancheja selle kliinilise rakenduse arendamiseks.

Cistanchetubulosa

Märksõnad:Cistanchedeserticola; LC/Q-TOF-MS; östrogeenne aktiivsus; põhikomponentide analüüs (PCA); Emaka kasvu test.

Lühendid

TCM: traditsiooniline hiina meditsiin

HPLC/Q-TOF-MS: kõrgjõudlusega vedelikkromatograafia/kvadrupoolne lennuaja massispektromeetria

BA: kahemõõtmeline analüüs

PCA: põhikomponentide analüüs

GCAM: halli korrelatsioonianalüüsi meetod

MTT: trüpsiin, 3-(4, 5-dimetüültiasool-2-üül)-2, 5-difenüültetrasoolumbromiid

DMSO: dimetüülsulfoksiid

RPMI1640 Roswell Parki mälestusinstituut 1640

1. Sissejuhatus

Viimasel ajal on TCM muutunud Aasia ja lääneriikides üha populaarsemaks tänu oma stabiilsele ravitoimele ja madalale toksilisusele kliinikus. Selle tulemusena on vaja välja töötada uudsed TCM-i tüübid ja mõista nende kliinilisel kasutamisel kasutatavaid tõhusaid koostisi [1-6].

Esiteks uuritakse spektri-efekti suhet, et teha kindlaks kromatograafilise sõrmejälje ja farmakodünaamika efektiivsuse vaheline seos. Seejärel kasutage suhet TCM-is tõhusate komponentide otsimiseks ja kontrollistandardite sõnastamiseks, et kajastada nende sisemist kvaliteeti. Spektri-efekti seost on rakendatud paljudes TCM-i uurimisvaldkondades, nagu üksik- ja liit-TCM-i materiaalne alus, komponentide ühilduvus, töötlemismehhanism, farmakoloogilise toime prognoos ja tehnoloogia optimeerimine [7-12]. Spektri-mõju seost kasutatakse uute ideede ja meetodite esitamiseks toimeainete uurimiseks, valemite optimeerimiseks, valmistamisprotsesside parandamiseks, sihtkoostisosade jälgimiseks ja eraldamiseks ning uute TCM-ravimite väljatöötamiseks [13-17].

Cistancheon laialdaselt kasutatud seksuaalfunktsiooni häirete, kõhukinnisuse, prostatiidi ja neerupuudulikkuse raviks. Sellel on lai bioaktiivsuse spekter, sealhulgas östrogeenne, vananemisvastane, antioksüdatiivne ja immuunne toime [18-19]. Üldiselt peeti fenüületanoidglükosiide (nagu tsistanosiid A, tubulosiid A), lignaane ja iridoidglükosiide Cistanche'i ja selle toodete kvaliteedikontrollis farmakoloogilisteks koostisosadeks ja keemilisteks markeriteks [20-21]. Cistanche'i keemilised spektrid erinevatest piirkondadest registreeriti kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) [22-23] abil. Selles uuringus valime nende östrogeense aktiivsuse hindamiseks emaka kasvutesti ja MCF7 rakkude proliferatsiooni testi. Östrogeense aktiivsuse korreleerimiseks üksikute komponentidega kasutati põhikomponentide analüüsi, kahemõõtmelist analüüsi ja halli korrelatsioonianalüüsi meetodeid. Selle uuringu eesmärk oli tuvastada Cistanche bioaktiivsed ühendid, mis vastutavad in vivo östrogeense toime eest. Uuring paneb aluse Cistanche süvauuringutele.

Kõik katseprotseduurid vaatas läbi ja kiitis heaks Harbini Kaubandusülikooli loomaeetikakomitee.

Cistanchedeserticola (cd-20120227-005) osteti ravimiturult ja selle tuvastas prof Zhang Delian (Harbini kaubandusülikool). Dietüülstilbestrool osteti ettevõttelt HEFEI JIULIAN PHARMACEUTICAL CO., LTD. RPMI1640 ja RPMI1640 ilma fenoolpunaseta osteti firmalt HyClone Company (USA). MTT ja DMSO osteti kõik ettevõttelt Sigma-Aldrich Co. LLC (St Louis, USA). Inimese rinnavähi MCF7 rakuliini andis bio- ja keskkonnateaduste uurimiskeskus (Harbini kaubandusülikool). Kasutati järgmisi standardeid: akteosiid (111530- 200505), ehhinakosiid (111670-200503) ja salidrosiid (110736-200628) saadi riiklikust farmaatsia- ja bioloogiliste toodete kontrolli instituudist (Peking). , Hiina). Atsetonitriil, metanool ja sipelghape olid MS-klassiga, vesi aga ülipuhas. Teised reaktiivid olid analüütiliselt puhtad ja kaubanduslikult saadaval.

2 Katseprotseduur

2.1 Materjalid

Analüütilise keemia katseteks ja andmetöötluseks kasutati Agilent 1290 HPLC süsteemi, Agilent 6530 seeria kvadrupooli lennuaja LC/MS (Q-TOF) süsteemi ja Chemical HPLC{5}}D tööjaamu. Proovide ja standardite valmistamiseks kasutati Milli-Q ülipuhast vett. Täiendavad instrumendid olid elektrooniline analüütiline kaal AR1140 (Ohaus International Ltd), 680 mikroplaadilugeja (Bio-Rad Corporation) ja 64R suure kiirusega tsentrifuug (Beckman Coulter Allegra).

Ebaküpsed emased Kunmingi hiired (umbes 21 päeva sünnist võõrutatud), kaaluga (12 ± 2) g, osteti Changchuni riiklikust bioloogilise tööstuse baasi laboratoorsest loomakeskusest (Changchun, Hiina). Hiiri hoiti reguleeritud temperatuuriga ruumis (22 ± 2 kraadi), kus oli piiramatu juurdepääs toidule ja veele. Loomkatsed alustati pärast viiepäevast aklimatiseerumist. Enne testlahuste manustamist hoiti hiiri öö läbi tühja kõhuga. See uuring viidi läbi rangelt kooskõlas riiklike tervishoiuinstituutide laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendis esitatud soovitustega.

2.2 Proovilahuse valmistamine

Cistancheproovid koguti kümnest erinevast elupaigast, nimelt Neimeng, Xinjiang, Ningxia, Guizhou, Chaidamu, Xizang, Alashan, Qinghai, Sichuan ja Hubei provints.

Lahus (1.0 g/mL)Cistancheproov valmistati destilleeritud vees suukaudseks manustamiseks. Dietüülstilboöstooli kontsentratsioon oli 20 ug/ml ja seda kasutati positiivse kontrolllahusena. Cistanche'i proovi lahus (1{5}} g/mL) valmistati 50 protsendilises atsetonitriilis. Akteosiid, ehhinakosiid ja salidrosiid (igaüks 2,0 mg) lahustati 10 ml 50% atsetonitriili lahuses. Nii proov kui ka standardlahused filtreeriti enne analüüsi 045-μm filtriga.

2.3 LC-MS tingimused

Proovide analüüsimiseks kasutati Waters Symmetry Shield RP18 (3,9 mm × 15{5}} mm, 5 μm; Waters Corporation, Milford, MA, USA). Liikuv faas koosnes atsetonitriilist (A) ja 0,2% (maht/maht) sipelghappe vesilahusest (B) ning pumbati voolukiirusel 0,5 ml/min. Iga proovi süstimismaht oli 10 μL. Gradiendi elueerimise programm oli järgmine: liikuv faas A käivitati 5 protsendi juures ja tõusis lineaarselt 23 protsendini 35 minuti pärast. Seejärel suurendati lahust A 25 protsendini (35 kuni 65 minutit). Seejärel vähendati liikuvat faasi A 5 protsendini jooksu viimaseks 5 minutiks (65 kuni 70 minutit). Kolonni temperatuuri hoiti 30 kraadi juures. Kromatogramme jälgiti lainepikkusel 254 nm. Pihustamisgaasi rõhk oli 30 psi ja kapillaarpinge oli 3,5 kV. Kuiva gaasi voolukiiruseks määrati 8 l/min temperatuuril 30 kraadi. Massispektrid registreeriti skaneerimisvahemikus 100- 3,000 Da ja need olid negatiivsete ioonide skaneerimisrežiimis.

2.4 Sõrmejälgede hindamine

10 erinevast partiist kogutud proovide LC-sõrmejäljed määrati ja sobitati automaatselt, kasutades TCM-i kromatograafilise sõrmejälje sarnasuse hindamissüsteemi (versioon 2012; Hiina farmakopöa komitee, Peking, Hiina). Lisaks koostati võrdluskromatogrammi kaart mediaanmeetodi abil. Lisaks kasutati kümnest erinevast elupaigast võetud proovide kvaliteedi hindamiseks klasteranalüüsi.

2.5 Põhikomponentide analüüs (PCA)

PCA on mitme muutujaga statistiline meetod. See võib andmete kogumisel säilitada piisavalt teavet. Käesolevas uuringus skriiniti LC-kromatogrammide iseloomulikke piike täiendavalt PCA-ga ja nende eesmärk oli identifitseerida aktiivsed ühendid spektri-efekti seose põhjal.

2.6 Emaka kasvu test

Hiired jagati 12 rühma (1 0 rühma kohta). Cistanche'ist valmistatud proovilahused koguti kümnest erinevast elupaigast ja neid manustati kaks korda päevas (hommikul ja õhtul) sondiga annuses 30 g/kg kehakaalu kohta nelja päeva jooksul. Tühi ja positiivne kontrollrühmad sisaldasid võrdses koguses destilleeritud vett ja dietüülstilboöstrooli lahust ning neid manustati kaks korda päevas nelja päeva jooksul. Viiendal päeval võeti anesteseeritud hiirtelt ravimit sisaldavad vereproovid. Proove tsentrifuugiti (5, 000 p/min, 10 min) ja supernatandid (ravimit sisaldavad seerumiproovid) eraldati. Ravimit sisaldavad seerumiproovid inaktiveeriti kuumutamisel 56 kraadi juures veevannis 30 minutit ja filtreeriti enne MTT testi läbi 022-μm filtri. Samal ajal lõigati hiirte emakas kohe välja ja kaaluti emaka kaaluindeksite arvutamiseks. Loomkatseid alustati pärast viiepäevast aklimatiseerumist. Hiired on enne testlahuste manustamist paastunud üleöö ja neil on vaba juurdepääs veele. Käesolev uuring viidi läbi rangelt kooskõlas riiklike tervishoiuinstituutide laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendi soovitustega. Kõik katseprotseduurid vaatas läbi ja kiitis heaks Harbini Kaubandusülikooli loomaeetikakomitee. Kõik potentsiaalselt stressi tekitavad protseduurid viidi läbi naatriumpentobarbitaali anesteesia all.

2,7 MTT analüüs

MCF7 rakke kasvatati koos RPMI 1640-ga ilma fenoolpunaseta (sisaldab 5 protsenti CDT-FBS-i) neli päeva. Rakud külvati 96-süvendiplaatidele tihedusega 2,000 rakku süvendi kohta. Saadi kleepuv kultuur ja pärast 72-tunnist kultiveerimist kultiveeriti rakke koos RPMI 1640 söötmes, mis sisaldas Cistanche'iga töödeldud hiirte seerumiproove. Katsed viidi läbi kuues korduses. Seejärel lisati igasse süvendisse 20 µl MTT lahust (5 mg/ml PBS-is) ja rakke inkubeeriti 4 tundi. Pärast söötme eemaldamist lisati formazaanprodukti saamiseks 150 ui DMSO-d ja plaate loksutati pimedas, et need täielikult lahustuksid. Neeldumist mõõdeti 570 nm juures, kasutades Microplate Readerit. Proliferatsioonikiirus arvutati ravimit sisaldava seerumirühma keskmise neeldumisväärtuse jagamisel tühja kontrollrühma keskmise neeldumisväärtusega (rakud, mida kultiveeriti koos RPMI 1640-s ilma seerumita).

2.8 Statistiline analüüs

Paarisproovi t-testi (kahe sabaga) kasutati statistiliselt oluliste erinevuste tuvastamiseks tühikatse ja katserühmade väärtuste vahel. Erinevusi peeti olulisteks 95-protsendilise usaldustaseme juures (p <>

PCA-d kasutati kümne erineva elupaiga proovide kromatogrammides iseloomulike piikide alade hindamiseks. Piikide pindalade ja nende östrogeense aktiivsuse korrelatsiooni hindamiseks kasutati kahemõõtmelist analüüsi ja Grey korrelatsioonianalüüsi. Korrelatsiooni arvutati SPSS-i statistikatarkvara statistika (SPSS for Windows 21.0, SPSS Inc., USA) abil. Erinevusi peeti olulisteks 95-protsendilise usaldusnivoo korral (kahesuunaline).

Eetiline heakskiit: läbiviidud uuringud ei ole seotud inimeste ega loomade kasutamisega.

3. Tulemused ja arutelu

3.1 Klasteranalüüs ja sarnasuse hindamine

Iseloomulike piikide retentsiooniaja ja piigi pindala suhteline standardhälve oli {{0}},58 ja 0,34 protsenti täpsuse korral, 0,52 ja {{8} },31 protsenti reprodutseeritavuse ja {{10}},19 ja 0,13 protsenti stabiilsuse eest. Need leiud näitasid, et meie LC-meetod sõrmejälgede määramiseks oli mõistlik ja usaldusväärne. Kümne proovi kromatogrammide sarnasused olid suuremad kui 0,9. Kõigi proovide ühised piigid ei saanud täielikult esindada Cistanche iseloomulikke koostisosi, kuna piik võis kaduda. Seetõttu kohandati proovi sobivusarv 26-lt 20-le, et saada täpsem kromatogrammi kaart. Kokku saadi 26 piiki ja nende pindalade summa oli suurem kui 0, 8 võrreldes proovi üldise piigi pindalaga. Seetõttu jõudsime järeldusele, et need kromatograafilised piigid võivad tõhusalt kajastada Cistanche peamisi keemilisi koostisosi. Klasteranalüüsi tulemused on näidatud joonisel 1. Kokku jaotati kümme erinevat elupaika kolme kategooriasse järgmiselt: (A) 2, Guizhou; 3, Qinghai; 4, Chaidamu; 10, Neimeng; 7, Xinjiang ja 6, Sichuan. (B) 1, Xizang; 8, Ningxia ja 5, Alashan. (C) 9, Hubei. Klasteranalüüsi trend näitas, et ravimtaimede kasvukohad on künnise põhjas olles sarnased. Kuid künnise tõusuga on elupaikade kliima ja kasvutingimused lähedased. See näitab, et klastrianalüüs ei suuda mitte ainult hästi eristada erinevaid elupaiku, vaid kajastada ka nendevahelisi afiinsusi.

3.2 Keemiliste koostisosade identifitseerimine

Based on the synergy between components, TCM exerted pharmacological effects. Certain studies have been conducted to identify the chemical compositions of C. deserticola [24-26]. The correlation of inherent constituents with their activities indicated that they could be identified based on the combination of LC with the corresponding indices of pharmacological activity. Q-TOF-MS is suitable for multi-constituent identification of TCM since it can provide the exact molecular mass because of its high resolution. A total of 26 compounds were identified by analyzing the primary and secondary MS data. PCA was used to assess whether these compounds concerning their oestrogenic activity. A contribution of the activity is indicated by an eigenvalue higher than 1 (> 1) and a cumulative contribution rate of variables higher than 0.8 (>0.8). Mida suurem on Eigeni koormuse absoluutväärtus, seda suurem on ühendite mõju östrogeensetele indeksitele.

Cistanche kromatogramme ja standardproove võrreldi üksikute komponentide tuvastamiseks samades LC-MS tingimustes. Nagu on näidatud tabelis 1, tuvastati retentsiooniaja ja MS andmete [24-26] põhjal kokku 26 koostisosa. Toimeaineid manustatakse suukaudselt segudena, mitte monomeeridena, kuna traditsiooniline hiina meditsiin on segu kujul, et täita terapeutilist rolli. Üks ühend pärast individuaalset eraldamist ei mänginud rolli. Meie eesmärk on paljastada ühendeid, millel on Cistanche [23-30] teadaolevates komponentides östrogeenne toime ja mis seetõttu ei valinud nende identiteedi kinnitamiseks NMR-i ega muid tehnilisi vahendeid. Piik 1 näitas domineerivat deprotoneeritud iooni m/z suhtega 373 (C16H22O10), mis oli identne geniposidhappe elemendilise koostisega. Seda toetas glükoosiosa kadu, mis andis fragmendi iooni m/z suhtega 211. Piik 2 näitas domineerivat deprotoneeritud iooni m/z suhtega 461 (C20H30O12), mis oli identne elemendi koostisega. dekofeoüüllakteosiidist ja seda toetas ramnosüüli fragmendi kadu, moodustades fragmentatsiooni m/z suhtega 315. Piik 4 näitas domineerivat deprotoneeritud iooni m/z suhtega 375 (C16H24O10), mis oli identne 8-epilogaanhappe elementaarne koostis. Glükoosiosa kadu, mis moodustas killustumise m/z suhtega 213, toetas järeldust veelgi. Piik 6 näitas domineerivat deprotoneeritud iooni m/z suhtega 607 (C29H36O14), mis oli identne syringalide A3'- - l-ramnopüranosiidi elementaarse koostisega.

Veelgi toetas järeldust kohvfragmendi kadu, mis moodustas fragmendi iooni m/z suhtega 445. Piik 8 viitas domineerivale deprotoneeritud ioonile m/z suhtega 799 (C36H48O20), mis oli identne tsistanosiidi A elementaarse koostisega. Caff-osa kadumisel tekkis fragmendi ioon m/z suhtega 637, toetas järeldust veelgi. Piik 11 näitas domineerivat deprotoneeritud iooni m/z suhtega 487 (C21H28O13), mis oli identne tsistanosiidi F elementaarse koostisega. Seda toetas ramnosüüli fragmendi kadu, mis andis fragmendi iooni m/z väärtusega. suhe oli 341 ja teise caff-osa kadumine moodustas fragmendi iooni m/z suhtega 179, toetas järeldust veelgi. Piik 12 näitas domineerivat deprotoneeritud iooni m/z suhtega 813 (C37H50O20), mis oli identne tsistanosiidi B elementaarse koostisega. Glükoosiosa kadumisel tekkis fragmendi ioon m/z suhtega 651, toetas järeldust veelgi. Piik 13 viitas domineerivale deprotoneeritud ioonile m/z suhtega 827 (C37H48O21), mis oli identne tubulosiidi A elementaarse koostisega. Ramnosüüli fragmendi kadumisel moodustus fragmentatsioon m/z suhtega 681. toetas järeldust. Piik 14 näitas domineerivat deprotoneeritud iooni m/z suhtega 637 (C30H38O15), mis oli identne tsistanosiidi C elementaarse koostisega. Ramnosüüli fragmendi kadumisel tekkis fragmendi ioon m/z suhtega 491, toetas järeldust veelgi.

Piik 15 näitas domineerivat deprotoneeritud iooni m/z suhtega 591 (C29H36O13), mis oli identne osmantusiid B elementaarse koostisega. Ramnosüüli fragmendi kadumisel tekkis fragmendi ioon m/z suhtega 445, toetas järeldust veelgi. Piik 16 näitas domineerivat deprotoneeritud iooni m/z suhtega 623 (C29H36O15), mis oli identne akteosiidi elementaarse koostisega. Järeldust toetas veelgi kohvfragmendi kadu, mis moodustas fragmendi iooni m/z suhtega 461. Piik 18 näitas domineerivat deprotoneeritud iooni m/z suhtega 623 (C29H36O15), mis oli identne isoakteosiidi elementaarse koostisega. Caff-osa kadu, esipiik 15, näitas domineerivat deprotoneeritud iooni m/z suhtega 591 (C29H36O13), mis oli identne osmantusiidi B elementaarse koostisega. Ramnosüüli fragmendi kadumisel tekkis fragmendi ioon m/z suhe 445, toetas järeldust veelgi. Piik 16 näitas domineerivat deprotoneeritud iooni m/z suhtega 623 (C29H36O15), mis oli identne akteosiidi elementaarse koostisega. Järeldust toetas veelgi kohvfragmendi kadu, mis moodustas fragmendi iooni m/z suhtega 461. Piik 17 näitas domineerivat deprotoneeritud iooni m/z suhtega 623 (C29H36O15), mis oli identne cis-akteosiidi elementaarse koostisega. Kaffi fragmendi kadu, mis moodustas fragmendi jodi ja fragmendi iooni m/z suhtega 461, toetas järeldust veelgi. Piik 21 näitas domineerivat deprotoneeritud iooni m/z suhtega 653 (C30H38O16), mis oli identne kampneosiidi Ⅰ elementaarse koostisega.

Caff fragmendi kadu moodustas fragmendi iooni m/z suhtega 491 ja teise ramnosüüli fragmendi kadumisel moodustus fragmendi ioon m/z suhtega 345, mis toetab järeldust veelgi. Piik 22 näitas domineerivat deprotoneeritud iooni m/z suhtega 665 (C31H38O16), mis oli identne tubulosiidi B elementaarse koostisega. CH3 CO fragmendi kadumisel tekkis fragmendi ioon m/z suhtega 623, ja teise caff-osa kadumine moodustas fragmendi iooni m/z suhtega 461, mis toetab järeldust veelgi. Piik 23 näitas domineerivat deprotoneeritud iooni m/z suhtega 639 (C29H36O16), mis oli identne kampneosiidi elementaarse koostisega. Järeldust toetas veelgi ramnosüüli fragmendi kadu, mis moodustas fragmendi iooni m/z suhtega 493. Piik 24 viitas domineerivale deprotoneeritud ioonile m/z suhtega 665 (C31H38O16), mis oli identne 2'-atsetüüllakteosiidi elementaarse koostisega. Ac fragmendi kadu, moodustas fragmendi iooni m/z suhtega 623, ja teise caff fragmendi kadumisel moodustus fragmendi ioon m/z suhtega 461, mis toetab järeldust veelgi. Piik 25 näitas domineerivat deprotoneeritud iooni m/z suhtega 445 (C20H30O11), mis oli identne tsistanosiidi G elementaarse koostisega. Ramnosüüli fragmendi kadumisel tekkis fragmendi ioon m/z suhtega 299, toetas järeldust veelgi. Ühendite struktuurid on toodud joonisel 2.

3.3 PCA

As shown in Table 2, the eigenvalues of the first eight principal components were higher than 1(> 1), and the cumulative contribution rate of the first six principal components was 93.417%. Therefore, the first six principal components were evaluated further. Table 2 indicates their eigenvalues and factor loadings. The first principal component exhibited a higher load based on the eigenvalues of the eight peaks (>0.9). Need piigid olid järgmised: 9, 12, 14 ja 15. Järelikult valiti östrogeense aktiivsuse tüüpilisteks muutujateks ehhinakosiid, tsistanosiid B, osmantusiid B ja akteosiid, mis vastasid kokku 4 piigile (joonis 3).

.

3.4 Östrogeense aktiivsuse määramine

Arvutati emaka märgkaalu ja iga hiire kehamassi suhe (joonis 4). Loomadel, kes puutusid Cistanche'iga kokku üheksast elupaigast, ilmnes märkimisväärne östrogeenne toime, kuna nende emakakaal suurenes võrreldes tühja kontrollrühma hiirtega. Joonisel 4 on lisaks näidatud Cistanche'iga töödeldud hiirte seerumiga töödeldud MCF7 rakkude proliferatsioonikiirus. Rakud, mida töödeldi hiirte seerumitega, kellele manustati Cistanche'i kümnest elupaigast, näitasid oluliselt suuremat kasvu võrreldes rakkudega, mida ei ravitud.

3.5 Kahe muutujaga analüüs

Käesolevas uuringus täheldasime, et ebaküpsete emaste Kunmingi hiirte emakakaal suurenes ja MCF7 inimese rinnavähirakkude proliferatsioon soodustati. Need leiud kinnitasid Cistanche östrogeenset aktiivsust. Joonisel 5 on näidatud nende koostisosade emaka indeksid ja MCF7 rakkude proliferatsiooni määrad. Suhteliste piikide pindalade arvutamiseks kasutati Pearsoni korrelatsioonikoefitsienti, mis vastas proovide östrogeensele aktiivsusele. Korrelatsioonikordajaid, mis olid kõrgemad kui 0,3, peeti oluliseks (p < 0.05),="" samas="" kui="" korrelatsioonikordajaid,="" mis="" olid="" kõrgemad="" kui="" 0,5,="" peeti="" väga="" oluliseks="" (p).="">< 0,01).="" tulemuste="" põhjal="" näidati,="" et="" cistanche="" omab="" östrogeenset="">

Emaka kaalu suurenemisega korreleerus kokku üheksa ühendit (p < {0}},05),="" samas="" kui="" kümme="" ühendit="" korreleerus="" oluliselt="" mcf7="" rakkude="" proliferatsiooniga="" (p="">< 0,05).="" ühendid,="" mis="" korreleerusid="" olulisel="" määral="" emaka="" massi="" ja="" rakkude="" proliferatsiooniga,="" olid="" 8-epilogaanhape,="" salidrosiid,="" syringaliid="" a3'-="" -="" l-ramnopüranosiid,="" tsistanosiid="" a,="" tsistanosiid="" b,="" tsistanosiid="" c,="" osmantusiid="" b,="" akteosiid,="" isoakteosiid,="" tubulosiid="" b,="" 2'-atsetüüllakteosiid="" ja="" kaks="" tundmatut="" ühendit="" (joonis="" 5).="" need="" kolmteist="" ühendit="" avaldasid="" östrogeenset="">

3.6 Halli korrelatsioonianalüüsi meetod

Joonisel 6 on näidatud 26 ühendi iseloomulike piikide suhteline korrelatsioon emakaindeksitega ja joonisel 7 on näidatud 26 ühendi iseloomulike piikide suhteline korrelatsioon nende rakkude proliferatsioonikiirustega. Kokku näitasid kolm ühendit suurimat korrelatsiooni emaka indeksiga, nimelt 8-epilogaanhape, tsistanosiid F ja akteosiid (joonis 6, kahanevas järjekorras); arvestades, et kuus ühendit, millel oli suurim korrelatsioon MCF7 rakkude proliferatsiooniga, olid ehhinakosiid, tsistanosiid F, tsistanosiid B, osmantusiid B, isoakteosiid ja tubulosiid B (joonis 7, kahanevas järjekorras). Ehhinakosiidi, osmantusiidi B, akteosiidi ja isoakteosiidi suhtelised korrelatsioonid olid kõrgemad kui 0,5.

3.7 LC-MS tingimuste optimeerimine

Parema kromatogrammi kaardi saamiseks võrreldi metanooli ja atsetonitriili. Lõpuks oli sipelghappe vesilahuse (0,2 protsenti, maht/maht) ja atsetonitriili kombinatsioon eraldamiseks parim liikuv faas. 200-400nm täislainepikkusega skaneerimise vahemikus valiti optimaalseks 254 nm. Lisaks täiustati ka MS parameetreid. Negatiivsete ioonide skaneerimise režiim valiti, kuna see parandas enamiku Cistanche koostisainete reaktsiooniväärtusi.

4. Järeldus

Cistanche östrogeensete aktiivsete koostisosade tuvastamiseks kasutati LC-Q-TOF-MS tehnoloogiat. Käesolev uuring näitas, et 8-epilogaanhape, salidrosiid, syringaliidA3'- -l-ramnopüranosiid, tsistanosiid A, ehhinakosiid, tsistanosiid F, tsistanosiid B, tsistanosiid C, osmantusiid B, akteosiid, isoakteosiid, tubulosiid B, 2'-atsetüüllakteosiid ja kaks tundmatut ühendit olid Cistanche peamised aktiivsed koostisosad. Need leiud nõuavad aga täiendavaid uuringuid, et uurida koostisainete in vivo mõjusid ja toimemehhanismi.

Tänuavaldused:

Seda projekti toetasid Hiina riiklik loodusteaduste sihtasutus (nr 81073015), Heilongjiangi provintsi loodusteaduslik sihtasutus (ZD2017014) ja Heilongjiangi provintsi kolledži noorte innovatiivsete talentide koolituskava (UNPYSCT{2}}) . Autorid kinnitavad, et käesoleva töö avaldamisega seoses puudub huvide konflikt.

Viited

[1] Wang Z., Xia Q., Liu X., Liu W., Huang W., Mei X., Luo J., Shan M., Lin R., Zou D., Ma Z., fütokeemia, farmakoloogia , Forsythia suspensa (Thunb.) kvaliteedikontroll ja edasised uuringud Vahl: A Review, J. Ethnopharmacol., 2018, 210, 318- 339.

[2] Shu Y., Liu Z., Zhao S., Song Z., He D., Wang M., Zeng H., Lu C., Lu A., Liu Y., Integrated and global pseudotargeted metabolomics strategy used tsitrusviljade TCM-ide kvaliteedikontrolli markerite skriinimiseks, Anal. Bioanal. Chem., 2017, 409(20), 4849-4865.

[3] Yang B., Wang Y., Shan L., Zou J., Wu Y., Yang F., Zhang Y., Li Y., Zhang Y., A Novel and Practical Chromatographic "Fingerprint-ROC-SVM Traditsioonilise hiina meditsiini süstide kvaliteedianalüüsi strateegia: KuDieZi süsti kasutamine juhtumiuuringuna, molekulid., 2017, 22

(7). PII: E1237.[4] Zhuo L., Peng J., Zhao Y., Li D., Xie X., Tong L., Yu Z., QiShenYiQi tilkuvate pillide bioaktiivsete kvaliteedikontrolli markerite sõelumine ülikõrge jõudlusega vedelikkromatograafia sõrmejälgede vahelise seose alusel ja vaskulaarne kaitsev toime, J. Sep. Sci., 2017, 40(20), 4076-4084.

[5] Liu N., Li J., Li BG, Mitmemõõtmelise statistilise analüüsi ja mõtlemise rakendamine Hiina meditsiini kvaliteedikontrollis, Zhongguo. Zhong. Yao. Za. Zhi., 2014, 39

(21), 4268-4271.

[6] Wang DD, Liang J., Yang WZ, Hou JJ, Yang M., Da J., Wang Y., Jiang BH, Liu X., Wu WY, Guo DA, HPLC/qTOF-MS orienteeritud iseloomulike komponentide andmed komplekt ja kemomeetriline analüüs komplekssete TCM-preparaatide terviklikuks kvaliteedikontrolliks: Niuhuang Shangqingi pill näitena, J. Pharm. Biomed. Anal., 2014, 89, 130-141. [7] Hernaez R., Thrift AP, kõrge negatiivne ennustusväärtus, madal levimus ja spektriefekt: ettevaatus tõlgendamisel, Clin. Gastroenterool. Hepatol., 2017, 15(9), 1355-1358.

[8] Liang J., Chen Y., Ren G., Dong W., Shi M., Xiong L., Li J., Dong J., Li F., Yuan J., Screening Hepatottoxic Components in Euodia rutaecarpa by UHPLC-QTOF/MS Spektri-toksilisuse seose põhjal, Molecules., 2017, 22(8). PII: E1264.

[9] Li W., Sun X., Liu B., Zhang L., Fan Z., Ji Y., Evodia rutaecarpa hepatotoksilise komponendi sõelumine ja tuvastamine spektri-efekti seose ja UPLC-Q-TOFMS alusel, Biomed . Chromatogr., 2016, 30(12), 1975-1983.

[10] Chopard G., Puyraveau M., Binetruy M., Meyer A., ​​Vandel P., Magnin E., Berger E., Galmiche J., Mauny F., Spectrum Effect and Spectrum Bias in the Screening Test Performance for Amnestiline kerge kognitiivne kahjustus: millised on kliinilised tagajärjed?, J. Alzheimers. Dis., 2015, 48(2), 385-393.

[11] Xu GL, Xie M., Yang XY, Song Y., Yan C., Yang Y., Zhang X., Liu ZZ, Tian YX, Wang Y., Jiang R., Liu WR, Wang XH, ta GM, Spektri-efekti seosed kui süstemaatiline lähenemine traditsioonilise hiina meditsiini uurimistööle: praegune seis ja tulevikuperspektiivid, Molecules., 2014, 19(11), 17897-17925.

[12] Zheng Q., Zhao Y., Wang J., Liu T., Zhang B., Gong M., Li J., Liu H., Han B., Zhang Y., Song X., Li Y. , Xiao X., Spektri-efekti seosed UPLC sõrmejälgede ja Aconitum carmichaelii Debeaux (Fuzi) sekundaarsete juurte bioaktiivsuse ja selle kolme töödeldud toote mitokondriaalsel kasvul koos kanoonilise korrelatsioonianalüüsiga, J. Ethnopharmacol., 2014, 153 (3) , 615-623.

[13] Shi Z., Liu Z., Liu C., Wu M., Su H., Ma X., Zang Y., Wang J., Zhao Y., Xiao X., Spectrum-Effect Relationships Between Chemical Fingerprints ja Lonicerae Japonicae Flos ja Lonicerae Flos baasi antibakteriaalne toime UPLC ja mikrokalorimeetria kohta, esikülg. Pharmacol., 2016, 7, 12.

[14] Usher-Smith JA, Sharp SJ, Griffin SJ, Spektriefekt riskide prognoosimise, sõeluuringu ja diagnoosimise testides, BMJ, 2016, 353, i3139.

[15] Chen Y., Yu H., Wu H., Pan Y., Wang K., Liu L., Jin Y., Zhang C., Uute hemostaatiliste ühendite jälgimine Flos Sophorae kogu flavonoidide kuumutamise produktidest spektri järgi -efekti seosed ja kolonnkromatograafia, J. Sep. Sci., 2015, 38(10), 1691-1699.

[16] Liu X., Wang XL, Wu L., Li H., Qin KM, Cai H., Pei K., Liu T., Cai BC, Da-Huang-Fu spektri-efekti seoste uurimine. Zi-Tang rottidel UHPLC-ESI-Q-TOF-MS meetodil, J. Ethnopharmacol., 2014, 154(3), 606-612.

[17] Xie RF, Zhou X., Shi ZN, Li YM, Li ZC, Rhizoma Rhei, cortex Magnoliae Officinalis'e, Fructus Aurantii Immaturus'e ja nende valemi spektriefekti seose uuring, J. Chromatogr. Sci., 2013, 51(6), 524-532. [18] Li F., Yang X., Yang Y., Guo C., Zhang C., Yang Z., Li P., Antiosteoporotic activity of Echinacoside in ovariectomized rott, Phytomedicine., 2013, 20(6), { {9}}.

[19] Xiong WT, Gu L., Wang C., Sun HX, Liu X., Cistanche tubulosa anti-hüperglükeemilised ja hüpolipideemilised toimed II tüüpi diabeediga DB/DB hiirtel, J. Ethnopharmacol., 2013, 150(3) , 935- 945.

[20] Morikawa T., Ninomiya K., Imamura M., Akaki J., Fujikura S., Pan Y., Yuan D., Yoshikawa M., Jia X., Li Z., Muraoka O., atsüülitud fenüületanoidglükosiidid , ehhinakosiid ja Cistanche tubulosa akteosiid, parandavad hiirte glükoositaluvust, J. Nat. Med., 2014, 68(3), 561-566.

[21] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, põletikuvastase toimega fenüületanoidglükosiidid Tarimi kõrbes kultiveeritud Cistanche deserticola vartest, Fitoterapia., 2013, 89, {{4 }}.

[22] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Cistanches Herba kvantitatiivne analüüs, kasutades kõrgjõudlusega vedelikkromatograafiat koos dioodimassiivi tuvastamise ja suure eraldusvõimega massispektromeetria kombineerituna kemomeetriliste meetoditega, J. Sep. Sci., 2013, 36(12), 1945-1952.

[23] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Cistanches deserticola YC Ma fenüületanoidglükosiidide struktuurne iseloomustus ja identifitseerimine. UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochem. Anal., 2012, 23(6), 668-676.

[24] Xiang Y., Jing Z., Haixia W., Ruitao Y., Huaixiu W., Zenggen L., Lijuan M., Yiping W., Yanduo T., Lagotis brevituba Maximist eraldatud fenüülpropanoidide proliferatsioonivastane aktiivsus, Phytother . Res., 2017, 31(10), 1509-1520.

[25] Yan Y., Song Q., Chen X., Li J., Li P., Wang Y., Liu T., Song Y., Tu P., Laia polaarsuse ja sisuvahemikuga komponentide samaaegne määramine Cistanche tubulosa, kasutades seeriaviisiliselt sidestatud pöördfaasi-hüdrofiilse interaktsiooni kromatograafia-tandem-massispektromeetriat, J. Chromatogr. A., 2017, 1501, 39-50.

[26] Zou P., Song Y., Lei W., Li J., Tu P., Jiang Y., 1H NMR-põhise metaboloomika rakendamine erinevate osade eristamiseks ja Cistanche deserticola uue töötlemise töövoo väljatöötamine, Acta. Pharm. Patt. B., 2017, 7(6), 647-656.

[27] Pan YN, värske Cistanche tubulosa koostisainete ja bioaktiivsuse uuringud, Ph.D. doktoritöö, Shenyangi farmaatsiaülikool, Shenyang, Hiina, 2011.

[28] Cui Q., ​​Pan Y., Xu X., Zhang W., Wu X., Qu S., Liu X. Inimese või roti soolebakterite või sooleensüümi in vitro toodetud akteosiidi metaboolne profiil kasutati UPLC-d Q-TOF–MS, Fitoteraapia., 2016, 109, 67-74.

[29] Cui Q., ​​Pan Y., Bai X., Zhang W., Chen L., Liu X., Cistanche tubulosa ehhinakosiidi ja akteosiidi metaboliitide süstemaatiline iseloomustus roti plasmas, sapis, uriinis ja väljaheites UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr., 2016(9), 1406-1415.

[30] Cui Q., ​​Pan Y., Yan X., Qu B., Liu X., Xiao W., metaboolne viis uurida seotud takistusi, mis põhjustavad isoakteosiidi halba biosaadavust suukaudsel manustamisel rottidel, kes kasutavad ülikõrge jõudlusega vedelikkromatograafiat/ kvadrupoolne lennuaja tandemmassispektromeetria, Rapid. Commun. Massispekter, 2017(4), 371-380.