HLA-G-d ekspresseerivad laialdaselt nuumrakud maksas, kopsudes ja neerudes asuvates organfibroosi piirkondades
Feb 21, 2022
Abstraktne:Varem näitasime, et HLA-G-d ekspresseerivad nuumrakud on seotud C-hepatiidi viiruse poolt indutseeritud piirkondadegamaksfibroos. Siin püüdsime kindlaks teha, kas HLA-G ekspressioon nuumrakkudes on spetsiifiline viiruse etioloogiale,maksvõi üldisele fifibroosi protsessile. Loendasime HLA-G pluss rakud ja nuumrakud punkti (i) immunohistokeemia abilmaksblokeerib 41 alkohoolse tsirroosi juhtu, (ii) 10 idiopaatilise kopsufibroosi (IPF) ja (iii) 10 juhtumit renalfibroos. HLA-G pluss rakkude olemus täpsustati mitmekordse immunofluorestsentsi abil, kasutades tarkvara. Rohkem kui pooled kõigist HLA-G pluss rakkudest olid nuumrakud alkohoolse tsirroosi ja IPF fifibrootilistes piirkondades. Aastalneerud,fifibroosi allutatud HLA-G pluss rakud olid tõepoolest nuumrakud, kuid neid ei saanud loendada. Lisaks on teatud juhtudelmaksja kopsudes, täheldasime mitmeid rakusõlmesid, mis olid sekundaarsed või tertsiaarsed folliikulid, milles HLA-G ekspresseeriti tugevalt B-lümfotsüütide poolt. Kokkuvõtteks võib HLA-G pluss nuumrakke täheldada kõigi uuritud elundite fifibrootilistes piirkondades. Varasemad uuringud viitavad HLA-G pluss nuumrakkude kaitsvale rollile põletiku ja fibroosi vastu. Täheldatud folliikulid B-lümfotsüütidega, mis ekspresseerivad HLA-G-d, võivad samuti tugevdada nende antifibrootilist rolli.
Märksõnad:fibroos; HLA-G; nuumrakud; folliikuleid; B-lümfotsüüdid; antifibrootiline; Neer; Maks
SissejuhatusKroonilisi haigusi, mis põhjustavad elundifibroosi, seostatakse märkimisväärse suremuse ja haigestumusega, mis moodustab arenenud riikides kuni 45 protsenti surmajuhtumitest [1]. Fifibrootiliste haiguste levimus kasvab pidevalt ja on oluline rahvatervise probleem. Fibrootilised haigused võivad mõjutada kõiki elundeid, näiteksmaks, neerud, kopsud ja süda. Patoloogilist fibroosi iseloomustab ekstratsellulaarse maatriksi (ECM) komponentide, näiteks kollageeni, liialdatud ladestumine. Selline ECM-i kuhjumine hävitab elundi normaalse arhitektuuri ja põhjustab organi talitlushäireid ja rikkeid koos iga organi spetsiifiliste funktsioonide muutumisega, st.maks, detoksifitseerimise funktsioon, kopsude jaoks, gaasivahetuse funktsioon janeerud,fifiltratsiooni funktsioon. Lisaks võib fibroos soodustada vähi teket. Transplantatsioon fifibrootilise organi asendamiseks on sageli parim ravivõimalus. Fibroosi protsess tekib vastusena vigastusele või koekahjustusele pärast püsivat või liiga tugevat põletikulist reaktsiooni. Fibroos, mis on algselt pöörduv, võib areneda pöördumatuks olekuks [2]. Themaksvõivad vigastada viirused (B-, C-, D-, E-hepatiit), seente toksiinid, parasiidid, autoantikehad, kõrge rasvasisaldusega dieet ja liigne alkoholitarbimine, mis on sagedane etioloogia.maksfifibroos [3] ja teatud riikides isegi peamine põhjus. Kui solvangud korratakse,makstekib krooniline fifibroosiga hepatiit, millele järgneb kaugelearenenud fibroos või tsirroos, mis on hepatotsellulaarse kartsinoomi (HCC) eelsoodumus.
Kopsudes on idiopaatiline kopsufibroos (IPF) kõige levinum haiguste rühmast, mis hõlmab ülitundlikkust tekitavat fibroosi ja reumatoidset kopsu. See tundmatu päritoluga krooniline progresseeruv fibroosne interstitsiaalne kopsuhaigus on haruldane ja mõjutab kogu maailmas kolme miljonit inimest. IPF-i seostatakse aga varajase surmaga. Tõepoolest, IPF põhjustab kaugelearenenud hingamispuudulikkust ja on ka sõltumatu kopsuvähi riskitegur [4]. Kaugelearenenud haigusega noorte patsientide puhul tuleks kaaluda kopsusiirdamist.
NeerudFifibroos on paljude progresseeruvate haiguste viimane ühine radaneeruhaigused.Krooniliste haiguste esinemineneeruhaigus, mis viib lõppstaadiumisseneeruhaigus, on märkimisväärselt suurenenud, mõjutades 10 protsenti maailma elanikkonnast ja kõrge suremusega [5]. Lisaks patsientidele, kellel on kroonilineneeruhaiguson suurenenud risk haigestudaneerudvähk (kuni 10 korda võrreldes üldpopulatsiooniga), sagedaste kahepoolsete ja/või multifokaalsete kahjustustega [6].
Sõltumata sellest, millisest elundist fibroos areneb, on oluline mõista selle tekkega seotud mehhanisme, et töötada välja selle ennetamiseks mõeldud ravi. Eelkõige põhjustab krooniline põletikmaksvõineeru-fifibroosi kontrolli all hoidmine võib võimaldada piirata selle progresseerumist ning elundipuudulikkuse või vähi teket. Tsütokiinid ja kemokiinid mängivad keskset rolli nii immuunvastuse orientatsioonis kui ka põletiku säilimises [7,8]. Lisaks nendele immuunmolekulidele on uuritud ka teisi valke, nagu HLA-G, Ib klassi HLA molekul, mis on hästi tuntud oma immunomoduleerivate omaduste poolest [9]. Varem näitasime, et HLA-G-d ekspresseerivad nuumrakud, mis on seotud C-hepatiidi viiruse poolt indutseeritud piirkonnaga.maksfibroos [10,11]. Käesolevas uuringus uurisime, kas HLA-G ekspressioon nuumrakkudes on spetsiifiline viiruse etioloogiale,maksvõi fifibroosi protsess, olenemata elundist. Iseloomustasime HLA-G ekspressiooni nuumrakkudes ja immuunrakkudes 41 alkoholist põhjustatud tsirroosiga, 10 IPF-iga ja 10 patsiendi kohortide parafiinplokkidel.neeru-fibroos. HLA-G-d ekspresseerivate rakkude täpne identifitseerimine viidi läbi, kasutades neljakordset immunofluorestsentsi parafiini sektsioonidel ja tarkvara, mis analüüsib flfluorestsentsi eraldi ja liidab selle kolmel juhul.maksalkoholist põhjustatud fibroos ja kaks IPF-i.
Tulemused
HLA-G pluss rakkude kvantitatiivne ekspressioon ja olemus alkoholist põhjustatud fibroosi korralEsialgne immunohistokeemia uuring viidi läbi alkoholist põhjustatud fibroosi proovide seeriaga (n=41), mis võimaldas HALO tarkvara abil poolautomaatse loendamise teel loendada HLA-G pluss ja CD117 pluss rakke kogu objektiklaasil. Tulemused on kokku võetud tabelis 1.
HLA-G pluss ja CD117 pluss rakud loendati 41 alkohoolse tsirroosi juhtumi seeriaslaidide kogu pinnalt, kasutades HALO tarkvara koos sobiva algoritmiga, järgides immunohistokeemiat 4H84-ga, mis tunneb ära HLA-G, ja anti-CD117/c-komplektiga. HLA-G pluss ja CD117 pluss rakkude jaoks on näidatud keskmine, standardhälve ja vahemik: 555 ± 699 HLA-G plus /(41–2686) ja 200 ± 271 CD 117 pluss rakku (12–1113).
HLA-G pluss rakkude morfoloogilised tunnused alkoholist põhjustatud tsirroosi topograafilises osas vastavad nuumrakkudele (joonis 1A). Teatud juhtudel viidi läbi CD117 ja inimese nuumrakkude topeltmärgistamine ja see näitas, et maksa CD117 pluss rakud on fifibrootilise piirkonna nuumrakud (joonis 1A). HLA-G pluss rakkude täpseks tuvastamiseks uuriti kolme tüüpilist alkoholist põhjustatud tsirroosi juhtumit neljakordse immunofluorestsentsi ja Sirius Red värvimisega, kasutades HALO tarkvara. Fibroosi keskmine pindala vastas 19,4 protsendilemakspabertaskurätik. HLA-G rakkude pluss identifitseerimine näitas, et 51 protsenti olid nuumrakud (tabel 2; joonis 1A, 1B1), mis on määratletud inimese nuumraku trüptaasi pluss CD1177 fenotüübi või inimese nuumraku trüptaasi pluss CD117 kaasvärvimisega. HLA-G-d ekspresseerivad nuumrakud paiknesid fifibrootilistes piirkondades (joonis 1B1). Vastupidi, 49 protsenti HLA-G pluss rakkudest ei olnud nuumrakud ega CD117 plussrakud (tabel 3) ja üldiselt tundusid olevat rühmitatud sõlmedena (joonis 1B2). Seega viidi nende rakkude tuvastamiseks erinevates tsoonides läbi muu märgistus (tabel 4). Erinevat tüüpi HLA-G pluss rakkude jagunemine erines sõltuvalt piirkonnastmaksuuritud kude (tabelid 3 ja 4). Üldiselt näis, et 63 protsenti HLA-G pluss rakkudest fifibrootilises piirkonnas olid nuumrakud, võrreldes ainult 3 protsendiga sõlmedes. Lisaks ekspresseeris 68 protsenti HLA-G pluss rakkudest sõlmedes CD20, B-lümfotsüütide markerit (joonis 1C1) ja 3 protsenti CD3 (joonis 1C2). HLA-G pluss CD117 nuumrakkude trüptaas HLA-G pluss CD117 HLA-G pluss CD117 nuumrakkude trüptaas pluss ja HLA-G pluss CD117 pluss nuumrakkude trüptaas pluss rakud loendati kolmel tüüpilisel juhulmaksfifibroosi, kasutades sobiva algoritmiga HALO tarkvara. Rakud loendati alkohoolse tsirroosi proovi kahes erinevas piirkonnas, st fifibrootilises piirkonnas ja rakusõlmes, tüüpilisel juhulmaksfifibroosi, kasutades sobiva algoritmiga HALO tarkvara. Ükski HLA-G pluss rakk ei ekspresseeri koos CD31, endoteelirakkude markerit ega CD1a, dendriitrakkude markerit.
Joonis 1. HLA-G rakkude olemus tüüpilisel juhulmaksfibroos. (A) Esimeses lõigus näitavad kaks vasakpoolset fotot HLA-G ja CD117 ekspressiooni tüüpilisel juhulmaksfifibroosi 41-st immunohistokeemiat kasutades, kusjuures 4H84 tunneb ära HLA-G ja CD117 antikeha c-kit rakud. Objektiklaasid värviti Mayeri hematoksüliiniga. Fibroosipiirkonnad on ümbritsetud punase joonega. Ringides olevad alad vastavad topograafiliselt HLA-G ja CD117 värvitud slaididele. Ristkülik näitab selle ala tugevat suurendust, mis näitab, et kaks HLA-G rakku sobivad kahe CD117 rakuga. Lisaks on nende morfoloogia ühilduv nuumrakuga. Topeltfluorestsentsiga fotol (CD117/nuumraku trüptaas), millel on kolm fotot paremal, mis vastavad lihtsale fluorestsentsile (DAPI värvib tuumad siniseks, CD117 roheliseks, nuumrakkude trüptaas punaseks) näitab enamikku kaasmärgistatud rakke kollasena. CD117 rakud on suures osas nuumrakud. (B) Neljakordne immunofluorestsents tüüpilisel juhulmaksfifibroos (kolmest), kasutades DAPI-d sinise tuumaga, HLA-G-d (4H84 antikehaga) rohelise pseudovärviga, CD117 tsüaani pseudovärviga, nuumrakkude trüptaasi punase pseudovärviga ja liitpilti või liitmist. Paremal on kujutatud Sirius Red värvimist. 1 ja 2 vastavad kahele erinevale alalemaks,vastavalt fibroosi ulatus ja rakusõlm. Enamik HLA-G rakke ekspresseerivad fifibroosi korral CD117 ja nuumrakkude trüptaasi (1). Seevastu suurem osa HLA-G rakkudest ei ekspresseeri koos nuumrakke, välja arvatud teatud HLA-G rakud rakusõlme (2) perifeerias, fibroosi lähedal või fibroosi korral. (C) Neljakordne immunofluorestsents sõlmerakkudelmaksfifibroos näidatud B2-s DAPI-ga, HLA-G rohelise pseudovärviga, CD20 fuksiaroosaga või CD3 tsüaani pseudovärviga vastavalt punktides 1 ja 2. Sirius Redi värvuse sobivus on paremal. Ruut näitab piiratud topograafilist ala, mis sisaldab HLA-G positiivseid rakke ja vastavaid rakke selles tsoonis. Liitkujutis näitab HLA-G ja CD20 roosat kaasmärgistust. Rohelise pseudovärviga HLA-G ja tsüaani pseudovärviga CD3 vahel ei täheldatud kaasvärvimist.
HLA-G pluss, CD3 pluss (T-lümfotsüüdid), CD20 pluss (B-lümfotsüüdid) ja nuumrakkude trüptaasi pluss (nuumrakud) rakkude absoluutarv määrati HALO tarkvara abil sobiva algoritmiga ühel tüüpilisel juhul ja seda väljendatakse mm2 kohta.
HLA-G pluss rakkude analüüs IPF-isEsimeses uuringus, mis viidi läbi immunohistokeemia abil IPF (n=10) seeriaga, nagu eelnevalt kirjeldatud, hindasime HLA-G pluss rakkude arvuks 135 ± 62/mm2 ja CD117 pluss rakkude arvuks 227 ± 134/mm2 (tabel 5). HLA-G pluss rakud ei vastanud kopsufifibroosi CD117 pluss rakkudele (joonis 2A). Neljakordse immunofluorestsentsi ja Sirius Rediga värvimise HALO analüüs näitas, et HLA-G rakkude olemus on erinev sõltuvalt kopsu histoloogilisest piirkonnast (tabel 6). Tõepoolest, 63 protsenti HLA-G pluss rakkudest fifibrootilistes piirkondades olid nuumrakud (B1, C1), samas kui need moodustasid ainult 7 protsenti HLA-G pluss rakkudest sõlmedes (B2, C2). Enamik HLA-G pluss rakkudest sõlmedes ekspresseerisid koos CD20 (joonis 2B).
Joonis 2. HLA-G rakkude olemus IPF tüüpilisel juhul. (A) Esimeses lõigus on vasakpoolsel fotol kümnest IPF-st ühe tüüpilise juhtumi puhul Sirius Red värvus, keskmisel fotol on Mayeri hematoksüliini vastuvärv, kasutades immunohistokeemiat. Ringides olevad alad vastavad topograafiliselt HLA-G ja CD117 värvitud slaididel, kus 4H84 tunneb ära HLA-G ja CD117 antikehad, mis tunnevad ära c-kit rakud. Ristkülikud näitavad nende alade tugevat suurendust, mis näitab, et HLA-G rakud ei ühti CD117 rakkudega. (B) Neljakordne immunofluorestsents tüüpilisel juhulmaksfifibroos kahest, kasutades DAPI-d sinise tuumaga, HLA-G-d (4H84 antikehaga) rohelise pseudovärviga, CD117 tsüaani pseudovärviga, nuumrakkude trüptaasi punase pseudovärviga ja liitpilti või liitmist. Paremal on kujutatud Sirius Red; 1 ja 2 vastavad kahele erinevale kopsupiirkonnale, vastavalt fibroosi ulatusele ja rakusõlmele. (C) Viiekordne immunofluorestsents DAPI-ga, HLA-G rohelise pseudovärviga, trüptaas punase pseudovärviga, CD3 tsüaani pseudovärviga, CD20 fuksiaroosa pseudovärviga, samal IPF-i juhtumil, mis on näidatud punktis (B) . (C1) vastab (B1) alale. In (C1) vastab enamik HLA-G rakkudest nuumrakkudele fifibroosi piirkonnas, samas kui väga haruldased nuumrakud on HLA-G sõlmes, mis on näidatud (C2). Suurem osa sõlme rakkudest on CD20. HALO analüüs näitas, et enamik HLA-G pluss rakkudest on B-lümfotsüüdid.
HLA-G pluss ja CD117 pluss rakud loendati 10 juhtumi puhul, kasutades HALO tarkvara koos sobiva algoritmiga, järgides immunohistokeemiat. Näidatud on keskmine, standardhälve ja vahemik.
HLA-G pluss rakkude analüüs neerufibroosi korralUurides seeriat 10 juhtumistneeru-fifibroosi korral leidsime immunokeemia abil 133 ± 102 HLA-G pluss rakku/mm2 ja 426 ± 207 CD117 pluss rakku/mm2 (tabel 7). HLA-G pluss ja CD117 pluss rakkude vahel ei olnud vastet (joonis 3A).
Joonis 3. HLA-G rakkude olemus tüüpilisel juhulneeru-fibroos. (A) Esimeses lõigus on vasakpoolsel fotol Sirius Red värvus, keskmisel fotol on Mayeri hematoksüliini vastuvärv, kasutades immunohistokeemiat. Ringides olevad alad vastavad topograafiliselt HLA-G ja CD117 värvitud objektiklaasidele, kusjuures 4H84 tunneb ära HLA-G ja CD117 c-kit rakud. Punased nooled on positiivsed rakud. Ristkülikud näitavad nende alade tugevat suurendust, mis näitab, et HLA-G rakud ei ühti CD117 rakkudega. (B) Neljakordne immunofluorestsents tüüpilisel juhulmaksfibroos, kasutades DAPI-d sinise tuumaga, HLA-G-d (4H84 antikehaga) rohelise pseudovärviga, CD117 tsüaani pseudovärviga, nuumrakkude trüptaasi punase pseudovärviga ja liitpilti või liitmist. Paremal on Sirius Red esindatud. Ühinemisel kollaseks värvunud rakud vastavad HLA-G pluss nuumrakkudele. (C) Tsüaaniga värvitud alad vastavad paljudele tuubulitele, mis ekspresseerivad ainult CD117. Ühinemisel kollaseks värvunud rakud vastavad HLA-G pluss nuumrakkudele.
HLA-G pluss ja CD117 pluss rakud loendati 10 juhtumi puhulneeru-fifibroosi, kasutades HALO tarkvara koos sobiva algoritmiga, järgides immunohistokeemiat. HLA-G pluss ja CD117 pluss rakkude jaoks on näidatud keskmine, standardhälve ja vahemik. Sirius Rediga ühendatud HALO tarkvaraga neljakordne märgistamine ja morfoloogiaanalüüs näitasid märgistuse olulist heterogeensustneerudmitte ainult anatoomilise piirkonna järgi, vaid ka samas anatoomilises sektsioonis (joonis 3B, C). Seega ei olnud HLA-G pluss rakkude protsendi loendamine ja arvutamine selles elundis asjakohane. Tõepoolest, mikroskoopiline uurimine näitas tuubulite ümbermõõdu tugevat värvimist CD117-ga, mis ei kaasnenud nuumrakkude omaga (joonis 3C). HLA-G pluss rakud on nuumrakud ja asuvad põletikulises interstitsiumis (joonis 3B, C).
AruteluHLA-G valkude ekspressiooni demonstreeriti esmakordselt tsütotrofoblastides loote-ema liidesel [12]. Põhitingimustes on selle ekspressioon suures osas piiratud spetsiifiliste kudedega, nagu sarvkest [13], harknääre [14] ja kõhunäärme saarekesed [15]. Kuid teatud tüüpi rakud, nagu bronhide epiteelirakud [16], mesenhümaalsed rakud [17], monotsüütilise päritolu rakud [18–20] ning erütroid- ja endoteeli prekursorid [21], on võimelised seda ka omapärastes tingimustes ekspresseerima. . Varem näitasime, et nuumrakud võivad ekspresseerida HLA-G-d põhiolekus, suurendades ekspressiooni teatud tsütokiinirikastes keskkondades, eriti fifibrootilistes keskkondades.maksa kude.Uurisime, kas HLA-G-d saavad ekspresseerida nuumrakud, mis on seotudmaksmuust etioloogiast tulenev fibroos või mõne teise organi fibroos, uurides 41 alkoholist põhjustatud haigusjuhtumakstsirroos, 10 IPF ja 10neeru-fibroos.
Infektsioonid, toksilised ja metaboolsed vigastused ning idiopaatilised põletikulised haigused võivad soodustada fifibroosi teket, kuna krooniline vigastus kutsub esile parenhüümirakkude apoptoosi, mis vabastavad profifibrogeenseid ja põletikulisi tsütokiine nagu TGF-. Kollageeni tootvad rakud eristuvad vastusena vigastusele residentidest mesenhümaalsetest rakkudest. Epiteeli üleminek mesenhümaalseks on rakkude transdiferentseerumise nähtus, mida täheldatakse kolangiotsüütide puhulmaks, pneumotsüüdid kopsus ja tubulaarsed epiteelirakudneerud[22]. Apoptootilised rakud kutsuvad esile TGF- kontsentratsiooni tõusu kõigis elundites. Siiski võib eri organites eristada fifibrogeneesi spetsiifilisi tunnuseid. Aastalmaks,apoptoos puudutab hepatotsüüte, samas kui see mõjutab epiteelirakke kopsudes janeerud[22]. Seega elavad fibroblastid sisseneerudja kopsud aktiveeruvad müofibroblastiks, mis ekspresseerib a-SMA-d, kollageeni1, samas kuimaksmüofibroblastid säilitavad oma närvispetsiifilised markerid [23].
Aastalmaks,maksa tähtrakud moodustavad rohkem kui 80 protsenti kõigist kollageeni tootvatest rakkudest. Kopsudes on pneumotsüütide kahjustus seotud endoteelirakkude apoptoosiga. Põletiku roll IPF-is on vastuoluline. Tüüpiline IPF ei näita põletikuliste rakkude sissevoolu, kuid mõned autorid viitavad põletiku rollile kopsufifibroblastide diferentseerumisel ECM-i tootvateks müofifibroblastideks [24]. IPF-iga on seotud korduvad tundmatu etioloogiaga alveolaarsed epiteeli kahjustused ja alveolaarne epiteeli apoptoos [25]. Aastalneerudjamaks,müelomonotsüütilised rakud värvatakse luuüdist ja moodustavad vastavalt 14–15 protsenti ja 8–12 protsenti müofibroblastidest. Kopsudes ei täheldata fifibroosi pöörduvust erinevaltmaksjaneerudvigastuste puudumisel ja kui tagasipöördumise punkti ei ole saavutatud. Tõepoolest, põletikulised protsessid on IPF-is piiratud, eriti haiguse varases faasis, samas kui tundmatu etioloogiaga korduvad alveolaarsed epiteeli kahjustused ja alveolaarne epiteeli apoptoos võivad soodustada kopsufibroblastide või müofibroblastide proliferatsiooni ja aktivatsiooni [25].
Nagumaksfibroos, haavade ebaõnnestunud paranemisprotsessneerudkude pärast kroonilist, kestvat vigastust põhjustab põletikueelsete tsütokiinide, aga ka TGF- tootmist ja sekretsiooni, mis mängib fifibrootilises protsessis võtmerolli. Näiteks sissemaksFifibroosi, TGF-, mida väljendatakse väikese kogusena vaikses HSC-s, toodavad seda tüüpi rakud kiiresti pärastmaksakahjustus.Lisaks HSC-le on teisi TGF-allikaid kirjeldatud kui trombotsüüte, makrofaage, hepatotsüüte ja ka nuumrakke [26]. TGF- 1 säilitatakse maatriksis varjatud kujul ja pärast aktiveerimist soodustab see üleminekut fifibroblastilt müofifibroblastile, mis on fifibroosiprotsessi jaoks põhiline. Lisaks pärsib see ECM-i lagunemist, surudes alla metalloproteaase ja soodustades looduslikku inhibiitorit TIMP. Seega kutsub see esile ECM-i tootmise SMAD3-sõltuvate või SMAD-iga mitteseotud mehhanismide kaudu [27]. Tõepoolest, nuumrakkude ja TGF- vahel on vastastikune interaktsioon. TGF- on nuumrakkude tugev atraktant; tõepoolest, TGF- vahendatud patoloogilised protsessid on sageli seotud nuumrakkude akumulatsiooniga [28]. Lisaks on nuumrakud üks peamisi IL{10}} allikaid, mis põhjustavad TGF- -sõltuvat fibroosi [29]. Samuti on teatatud, et TGF- soodustab või pärsib nuumrakkude funktsioone. Tõepoolest, TGF- inhibeerib kõrge afiinsusega IgE retseptori Fc1RI ekspressiooni, mis aktiveerib nuumrakke [30]. Teisest küljest pärsib see nuumrakkude proliferatsiooni, degranulatsiooni ja mitmete efektormolekulide, näiteks histamiini ja TNF-i tootmist [31]. Arvestades MC suurenemist fifibroosi korral, võib TGF-i mõju MC funktsioonidele olla oluline põletikuliste reaktsioonide reguleerimisel, mis säilitavad fifibroosi protsessi.
Nagu C-hepatiidi viirusest põhjustatudmaksfifibroosi korral leidsime, et pooled alkoholist põhjustatud tsirroosi HLA-G pluss rakkudest on nuumrakud (tabel 2) ja ainult 34 protsenti nuumrakkudest ekspresseerisid HLA-G-d, kusjuures standardhälve näitab suurt individuaalset varieeruvust (tabel 1). . Lisaks täheldasime selget jaotumist vastavalt piirkonnalemaks,milles 63–92 protsenti fifibrootiliste piirkondade HLA-G plussrakkudest olid nuumrakud, samas kui ainult 3–23 protsenti olid rakusõlmede nuumrakud (tabel 3). Samamoodi täheldatakse teistsugust mustrit nuumrakkude puhul, kuna 92 protsenti fifibrootiliste piirkondade nuumrakkudest ekspresseerisid HLA-G-d, samas kui ainult 23 protsenti ekspresseerisid HLA-G-d rakusõlmedes (andmeid pole näidatud). Seega ei ole HLA-G ekspressioon piiratud viiruse etioloogiagamakstsirroos. Tõepoolest, saime kopsude puhul sarnase tulemuse. IPF-is olid 63 protsenti fifibrootiliste piirkondade HLA-G pluss rakkudest nuumrakud, samas kui ainult 7 protsenti sõlmedes leiduvatest rakkudest olid nuumrakud (tabel 6). Juhtumidneeru-Fifibroos olid erilised. Tubulite suure arvu tõttu ei olnud võimalik fifibrootilistes piirkondades rakke õigesti loendada, kuna nuumrakud olid tuubulitesse infifiltreerunud. Sai läbi viia ainult kvalitatiivse mikroskoopilise vaatluse, mis näitas, et mitmed HLA-G pluss rakud on nuumrakud, ilma et oleks võimalik tuubuleid fifibrootilistest piirkondadest eristada (joonis 3). Seega näib, et fifibrootilise haiguse nuumrakud ekspresseerivad HLA-G-d rakupinna ja tsütoplasmasiseste molekulide kaudu, olenemata elundist. Oleme varem näidanud, et kultuuris olevad inimese nuumrakud suutsid konditsioneeritud söötmes algolekus toota lahustuvaid HLA-G vorme ja et sekretsioon suurenes pärast stimuleerimist tsütokiinidega, sealhulgas IL-10 [10].
Suurem protsent nuumrakkudest (üle poole), mis ekspresseerivad HLA-G-dmaksja kopsud võivad olla seletatavad fifibroosi põletikuliste komponentidega. Tõepoolest, kaasasündinud immuunrakkudena suureneb nuumrakkude arv põletikuliste seisundite korral ja nad võivad vabastada ka põletikueelseid vahendajaid [32]. Nuumrakkude arv on suurenenud fifibrootiliste haiguste korral. Tõepoolest, nuumrakkude tihedus on IPF-iga patsientide kopsudes suurem kui teiste kopsupatoloogiate [33] ja normaalse kopsuga patsientide kopsudes. Samamoodi ka inimeneneeruhaigusednendega kaasneb nuumrakkude arvu suurenemineneeru-ajukoores, eriti fifibroosi piirkonnas [34], kuna tervetel inimestel täheldatakse nuumrakke harvaneerud.
Varasemates väljaannetes on väidetud, et nuumrakud puuduvad normaalses inimese maksas, kopsudes ja kopsudes või leidub neid harva.neerud[35]. Nuumrakkude alaste teadmiste areng on näidanud, et nuumrakke kui kaasasündinud immuunrakke võib täheldada kõigis kudedes, kuid neid leidub rohkem keskkonnale avatud kohtades. Lisaks on neil suur retseptorite repertuaar, mis võimaldab neil reageerida stiimulitele ja suhelda teiste rakkudega [36].Neerudnuumrakud sarnanevad funktsionaalselt kopsurakkudega. Nuumrakkude rolli kohta fifibroosis on teatatud vastuolulistest andmetest. Mitmed autorid on väitnud, et nuumrakud on seotud fifibroosiga, kuna neil on osa ägedas ja kroonilises põletikus, mis selle käivitab. Lisaks on nuumrakud võimelised sekreteerima histamiini, hepariini ja IL{0}}, mis soodustavad fifibroblastide proliferatsiooni. Kuid teised [37, 38], sealhulgas meie [39], on näidanud, et nuumrakud mängivad antifibrootilist rolli: näiteks loommudelites, nagu nuumrakkude puudulikkusega Ws / Ws hiired ja rotid. Okazaki jt. näitas, et indutseeritud fibroos oli nuumrakkude puudulikkusega rottidel raskem kui metsikut tüüpi rottidel [38].
Lisaks on näidatud, et nuumrakud on sarnaselt makrofaagidega vähi korral polariseerunud [40]. Põletikuvastased nuumrakud ekspresseerivad tsütokiine, nagu IL-10, ja nende arv on pöördvõrdeliselt seotud põletiku raskusastmega, samas kui põletikueelsed nuumrakud vastavad põletikueelsele keskkonnale. On tõenäoline, et põletikuvastased nuumrakud ekspresseerivad HLA-G-d eelkõige seetõttu, et (i) mitmes mudelis on näidatud seost IL-10 taseme ja HLA-G ekspressiooni ning (ii) HLA-G vahel. on põletikuvastase toimega. HLA-G-d ekspresseerivad nuumrakud võivad esineda haiguse varases staadiumis, põletikufaasis, et tõrjuda põletikku, mis on esimene reaktsioon kahjustusele. Kirjanduses on teatatud, et Il-10, vähendades põletikulist reaktsiooni, võib pärssida müofifibroblastide proliferatsiooni ja kollageeni sünteesi [41]. Tõepoolest, IL{13}} võib alkohoolikute puhul mängida kaitsvat rollimaksahaigus[42]. Seevastu IPF-iga patsientidel leiti seerumi IL-10 kõrgem tase kui normaalsetel isikutel ja kõrgeim IL-10 tase bronhoalveolaarses loputuses ilmnes IPF-iga patsientidel võrreldes sarkoidoosi või ülitundlikkuse pneumoniidiga. [43]. Seda võiks seletada vähem olulise põletikulise komponendiga. sisseneeru-fibroos, näidati hiiremudelis, et IL-10 puudumine süvendasneerudpõletik ja fibroos [44]. Inimestel parandab ravi TGF-antagonistiga seotud lokaalse IL-10 immunoteraapiaga kroonilistneeruhaigus [45].
Teine oluline tulemus on HLA-G pluss rakkude jälgimine rakusõlmedes, harvadel alkohoolse tsirroosi juhtudel fifibrootiliste piirkondade lähedal. Neid rakke iseloomustab morfoloogiliselt väikeste kuni keskmise suurusega kergesti äratuntavate rakkude klaster, mis viitab lümfoidse agregaadile. Nende morfoloogilised omadused viitavad folliikulitele, mis on peamiselt B-lümfotsüütidest moodustunud struktuurid. Neljakordne immunofluorestsents sõlmedes kinnitas seda hüpoteesi, kuna 68 protsenti HLA-G pluss rakkudest ekspresseeris koos CD20, mis on B-lümfotsüütide spetsiifiline marker (tabel 3). Sarnaseid struktuure täheldati ka IPF-is, sarnase tulemusega, mis näitas, et 76 protsenti sõlmede HLA-G pluss rakkudest on B-lümfotsüüdid (tabel 6). Fibroosi korral on teatatud lümfoidse neogeneesi tekkest. Seega võivad rakulised agregaadid teatud patoloogiliste seisundite, näiteks püsiva põletiku korral areneda kõrgelt organiseeritud struktuuriks, mis sarnaneb sekundaarse lümfoidkoega, st tertsiaarseteks lümfoidorganiteks või ektoopilisteks lümfoidseteks folliikuliteks [46]. Sellised lümfoidsed folliikulid sisaldavad T-rakkude rikkaid piirkondi ja eristatavaid B-raku folliikuleid koos idukeskustega [47]. Mehhanismi, mille abil infifiltreeruvad B-rakud korraldavad ektoopilise folliikuli ja idukeskuse, kontrollivad lümfotoksiin- 1 2 ja lümfoidsed kemokiinid, nagu CC-kemokiini ligand 19 (CCL19), CCL21, CXC-kemokiini ligand 12 (CXCL12) ja CXCL13, mis reguleerivad lümfotsüütide suunamist. Lisaks lümfofotoksiinile ja kemokiinidele on folliikulite moodustumise esilekutsumiseks ja säilitamiseks vajalik ka antigeenne stimulatsioon. Selliseid folliikuleid meie C-hepatiidi viiruse indutseeritud kohordis ei täheldatudmaksfifibroosi ja neid leiti ainult ühel kolmest alkoholist põhjustatud juhtumistmaksfifibroos, mis viitab haiguse kindlale staadiumile. Tõepoolest, ektoopiliste lümfoidorganite funktsioon ja nende seos põletiku ja fibroosiga pole veel selge. Mitmed uuringud on näidanud B-rakkude uudset ja üllatavat rolli fifibroblastide reguleerimisel fifibroosi korral, kus nende profifibrootiline toime on analoogne TGF-i omaga ja seda võimendab ka B-raku aktiveeriv faktor (BAFF) [48].
HLA-G rakulise allika olulisus fifibroosi korral ei ole mitte ainult kirjeldav, vaid ka funktsionaalne. HLA-G-l on spetsiifiliste retseptorite, nagu ILT2 ja ILT4, kaudu inhibeeriv toime igat tüüpi lümfotsüütide [49] ja dendriitrakkude [20, 50] talitlusele. HLA-G olemasolu nendel immuunrakkudel on lisaks põletiku markerile ka märgiks sobivast immuunreaktsioonist, vähendades ka põletikku. Tõepoolest, HLA-G mängib teadaolevalt kaitsvat rolli liialdatud põletikuliste reaktsioonide eest, nagu on varem näidatud septilise šoki puhul [51]. Lisaks uurisime eelnevalt nuumrakkude ja maksa tähtrakkude vahelist vastastikust koostoimet ning näitasime, et see viib nuumrakkude ligitõmbamiseni ja HLA-G produktsiooni kaudu HSC rakkude kollageenitootmise olulise vähenemiseni [39]. Lisaks võib HLA-G ekspressioon B-rakkude poolt ektoopilistes folliikulites samuti aidata neutraliseerida B-lümfotsüütide profifibrootilist toimet müofifibroblastidele, inhibeerides B-rakke autokriinse mehhanismi kaudu.
Patsiendid ja meetodid
Patsiendid41-liikmeline kohortmaksuuriti alkoholist põhjustatud tsirroosiga siirdatud patsiente. Patsiente teavitati protokollist ja saadi vastulause puudumine (haigla eetikakomitee, teade nr 16.47). Kümme parafiinploki näidistneeru-fifibroosi ja 10 IPF (haigla eetikakomitee, teade nr 16.123), täielikult ja pöördumatult anonüümseks muudetud, uuriti Helsingi deklaratsiooni põhimõtete kohaselt. Kolme kohordi kliinilised ja bioloogilised omadused on vastavalt kokku võetud tabelites 8–10.
Metoodika
Immunohistokeemia ja immunofluorestsentsKuded saadi eksplantaadistmaksjaneeru-või kopsu biopsia. Valmistati parafiiniga manustatud seerialõigud (paksused 4 µm) ja viidi läbi standardne histoloogiline värvimine, st HES-värvimine ja kollageeni märgistamine Sirius Rediga. Paralleelselt viidi immunohistokeemia ja immunofluorestsents läbi sama ploki parafiiniga manustatud sektsioonide jadalõikudel pärast deparaffineerimist ja antigeeni otsimise protokolli. Primaarsed antikehad (mAb) olid järgmised: monoklonaalne hiire anti-inimese HLA-G (Exbio, 4H84 2 µg/mL või 1:100, Vestec, Tšehhi Vabariik), polüklonaalne küüliku anti-inimese CD117/c-komplekt , mis tunneb ära müeloid- ja nuumrakud (Dako, 1:200, Koppenhaagen, Taani), hiire monoklonaalse inimese (hum) nuumrakkude trüptaasi (kloon AA1, Dako, 1:1000), mis on spetsiifiline nuumrakkudele, monoklonaalne inimesevastane CD3 (Thermo Scientififics, SP7, 1:500, Waltham, MA, USA), spetsiifiline T-lümfotsüütide jaoks ja monoklonaalne inimese vastane CD20 (Dako, M0755, 1:600), spetsiifiline B-lümfotsüütide jaoks.
Lühidalt, immunohistokeemia jaoks mõeldud slaidid inkubeeriti primaarse antikehaga Discovery Ultra (Roche, Meylan, Prantsusmaa) automatiseeritud süsteemis. Seondunud primaarne antikeha tuvastati, kasutades biotinüülitud kitse hiire- või küülikuvastast IgG-vastast sekundaarset antikeha (Vector, ABCYS, les Ulis, Prantsusmaa, 1:700) ja diaminobensidiini (DAB MAP-tuvastuskomplekt, Roche). , Meylan, Prantsusmaa), millele järgnes Mayeri hematoksüliini värvus. HLA-G pluss rakkude olemuse täpseks määramiseks kolmekordsed (DAPI, CD117, nuumrakkude trüptaas), neljakordsed (DAPI, HLA-G, CD117, nuumrakkude trüptaas) ja viiekordsed (DAPI, HLA-G, CD3, Seejärel viidi läbi CD20, nuumrakkude trüptaasi) immunofluorestsentsvärvimine kolme tüüpilise alkoholist põhjustatud tsirroosi ja kahe IPF tüüpilise juhtumiga. Ilmutamine viidi läbi Discovery FAM, rodamiini, DCC ja Cy5 komplektide abil (Ventana Medical Systems, Illkirch, Prantsusmaa). Pärast värvimist digiteeriti sektsiooni kogu pinna kujutis 20 × või 40 × suurendusega, kasutades konfokaalset skannerit (Panoramic Scanner, 3DHistech, Budapest, Ungari). Immunohistokeemiat ja multipleksset immunofluorestsentsvärvimist analüüsiti HALO digitaalanalüüsi tarkvara (V3.0.311) abil. Tarkvara koolitati tuvastama fifibroosi (Sirius Red), kasutades piirkonna kvantifitseerimise (V2.1.3) moodulit, samas kui Fish-IF moodulit (v1.2.2) koolitati värvainetega märgistatud proovide jaoks. Igast proovist valiti analüüsimiseks terved lõigud vastava algoritmiga. Andmed ekstraheeriti analüüsimiseks tabelarvutustarkvarasse.
JäreldusSee töö, mis on seotud meie varasemate andmekatsetega nuumrakkude kaitsevastase rolli kohta HLA-G ekspressiooni kaudu [39], viitab sellele, et nuumrakud mängivad fifibrootilistes olukordades HLA-G ekspressiooni kaudu fibroosivastast ja kaitsvat rolli. Seda rolli tugevdavad B-lümfotsüüdid, mis ekspresseerivad HLA-G-d ektoopilistes folliikulites. Üldiselt viitavad need leiud HLA-G kaitsvale rollile, mida ekspresseerivad nuumrakud fifibrootilistes organites.
