Seerumi amüloid-P ladestumine on membraanitaolise glomerulopaatia tundlik ja spetsiifiline tunnus koos maskeeritud IgG kappa ladestustega

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Christopher P. Larsen1, Shree G. Sharma1, Tiffany N. Caza1, Daniel J. Kenan1, Aaron J. Storey2, Ricky D. Edmondson2, Christian Herzog2 ja John M. Arthur2

MÄRKSÕNAD:glomerulonefriit; maskeeritud hoiused; massispektromeetria; membraanitaoline glomerulopaatia; subepiteliaalsed ladestused

Cistanche võib parandada neerufunktsiooni

Membraanitaoline glomerulopaatia maskeeritud IgG kappa ladestustega (MGMID) on hiljuti kirjeldatud unikaalse histopatoloogiaga glomerulonefriidi muster. Mustrit iseloomustab subepiteliaalne ja/või mesangiaalneimmuunneladestused, mis on "maskeeritud", immunoglobuliiniga värvimiseks rutiinse immunofluorestsentsiga, kuid värvivad tugevalt IgG ja kappa kerge ahela pärast proteaasiga lõhustamist. Sellise glomerulonefriidi mustriga patsiendid on enamasti noored naised, kellel esineb proteinuuria ja ebamäärane anamneesis autoimmuunhaigus, näiteks madala tiitriga tuumavastased antikehad. Siin võrreldi üheksa MGMID-i neerubiopsia laserpüüdmise mikrodissekteeritud glomerulite massispektromeetria profiili kaheksa biopsiaga, mis näitasid muid membraanse glomerulopaatia mustreid. Valk, mis MGMID-s kõige olulisemalt suurenes, oli seerumi amüloid P. Immunovärvimine näitas, et seerumi amüloid P oli kolokaliseerunud IgG-ga MGMID glomerulites, kuid mitte PLA2R-ga seotud membraanse glomerulopaatiaga. Seerumi amüloid P oli positiivne kõigi 32 MGMID biopsia glomerulites, kuid negatiivne muud tüüpi membraansete glomerulopaatiate, näiteks PLA2R ja THSD7A-ga seotud biopsiate puhul. 173 biopsia hulgas, mis ei vastanud MGMID või amüloidoosi kriteeriumidele, oli neli biopsiat glomerulaarse seerumi amüloid P värvumisega. Kõigil neljal positiivse seerumi amüloid-P värvimisega biopsial oli glomerulopaatia membraanne muster IgG kappa ladestustega, mis erines MGMID-st ainult "maskimise" puudumise tõttu. Seega tuvastab seerumi amüloidi positiivne värvumine glomerulaarsetes ladestustes ainulaadse glomerulonefriidi vormi, millel on tõenäoliselt ühine haiguse patofüsioloogiline mehhanism.

Maskeeritud IgG kappa ladestustega membraanitaoline glomerulopaatia (MGMID) on 2014. aastal kirjeldatud glomerulonefriidi histopatoloogiline muster, mis oli esimene kirjeldus, mida nimetatakse maskeeritud glomerulaarde ladestumiseks.1 Selle haiguse iseloomulik histopatoloogia hõlmab mesangiaalset ja subepiteliaalset ladestumist. IgG kappa piiranguga hoiused. Kummalisel kombel on komplemendi komponendi 3 (C3) värvumine sageli ilmne külmutatud koe rutiinse immunofluorestsentsi abil, kuid Ig värvimine sageli maskeerib, mis tähendab, et see näitab rutiinse immunofluorestsentsi abil valenegatiivset värvimist, kuid positiivset värvimist, kui seda korratakse parafiiniga kaetud koel pärast proteaasiga seedimist. Seega, kui patoloogil ei ole selle üksuse suhtes kõrge kahtluse indeks, võidakse see valesti diagnoosida kui C3 glomerulopaatiat. Muud üksused, mille kohta on kirjeldatud seda maskeerivat nähtust glomerulaarsetes ladestustes, on membranoproliferatiivne glomerulonefriit koos maskeeritud monotüüpsete Ig ladestustega ja krüoglobulineemiline glomerulonefriit.2,3

Biopsia käigus tuvastatud MGMID-ga patsiendid on enamasti noored naised<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologic study results such as antinuclear antibodies, although few carry a diagnosis of any well-defined autoimmune disease such as lupus.4 Mean proteinuria in a recent case series of 41 patients was 3.5 g/24 h, and mean serum creatinine was found to be 1.4 mg/dl.4 The deposits of all reported cases that could be tested for IgG subclass were of the IgG1 kappa subclass. Despite this monotypic staining on biopsy, the vast majority of patients tested (>95 protsenti) olid monoklonaalsete Ig-de suhtes negatiivsed seerumivalgu elektroforeesiga ja ühtegi juhtumit, mis oleks seotud hematoloogilise pahaloomulise kasvajaga, ei ole täheldatud.

Eeldati, et MGMID-i patsientide ühised kliinilised patoloogilised leiud võivad viidata ühisele molekulaarsele patofüsioloogilisele mehhanismile, mis põhjustab nende haigust. Selle üksuse esmakordsel aruandlusel oli meie kavatsus määratleda kohort edasiseks analüüsiks.1 Kirjeldame siin valguseerumi amüloid-p komponendi (SAP) olemasolu, mida leidub ainulaadselt MGMID glomerulite ladestustel. SAP-i immunovärvimine glomerulaarsetes ladestustes on tundlik ja spetsiifiline meetod MGMID-i diagnoosimiseks, mis annab ka patogeense ülevaate.

Joonis 1|Seerumi amüloid P-komponent (SAP) on märkimisväärselt rikastatud maskeeritud IgG kappa ladestustega membraanitaolise glomerulopaatiaga patsientide mikrodissekteeritud glomerulites. Statistilise analüüsi jaoks kasutati MaxQuanti (Max Plancki Biokeemia Instituut, Planegg, Saksamaa) normaliseeritud intensiivsusel põhinevaid absoluutseid kvantifitseerimisväärtusi. Katkendjooned kujutavad heuristlikke piire voltimise muutuse ja P-väärtuse jaoks. (a) Vulkaanidiagramm, mis võrdleb kolme fosfolipaasi A2 retseptori (PLA2R) positiivset membraanijuhtumit teistega, tuvastab 2 valku, mis on paremas ülanurgas selged kõrvalekalded. (b) Vulkaanidiagramm, milles võrreldakse kahte trombospondiini 1. tüüpi domeeni sisaldavat 7A (THSD7A) positiivset membraanijuhtumit teistega, tuvastab 2 valku, mis on selged kõrvalekalded, kusjuures THSD7A näitab suurimat voltide muutust. ( c ) Vulkaanidiagramm, mis võrdleb membraanitaolise glomerulopaatia proove maskeeritud IgG kappa ladestustega kõigi muud tüüpi membraansete juhtudega, tuvastab 6 valku, mis on paremas ülanurgas selged kõrvalekalded. C6, komplemendi komponent 6; C7, komplemendi komponent 7; CFHR1, komplemendi faktori H-ga seotud valk 1; HP1BP3, heterokromatiini valku 1 siduv valk 3; HPRT1, hüpoksantiinfosforibosüültransferaas 1; IGHG3, Ig raske konstantne gamma 3.

TULEMUSED

Laserpüüdmisega mikrodissekteeritud glomerulite massispektromeetria

9 MGMID juhtumi laserpüüdmisega mikrodissekteeritud glomerulite massispektromeetria analüüsi võrreldi 8 membraanse glomerulopaatia (MG) juhtumiga, sealhulgas 3 fosfolipaas A2 retseptori (PLA2R) positiivse MG juhtumiga, 2 trombospondiini 1. tüüpi domeeniga (sisaldab 7A domeeni) THSD7A) – positiivne MG ja 3 MG luupuse juhtumit. Selles analüüsis tuvastati kokku 1695 valku. Viidi läbi põhimõtete tõestusanalüüs, et testida, kas MG haiguse patogeneesis osalevaid valke saab massispektromeetria abil tuvastada. Iga teadaoleva membraanitüübi puhul võrreldi valkude erinevust ülejäänud rühmadega, kasutades normaliseeritud intensiivsusel põhinevaid absoluutse kvantifitseerimise (iBAQ) väärtusi. Statistiline analüüs viidi läbi Welchi t-testi abil ja tulemused visualiseeriti vulkaani graafikul. PLA2R oli PLA2R-ga seotud MG juhtudel märkimisväärselt rikkalikum ja näitas tugevaimat voltide muutust (joonis 1a). THSD7A näitas THSD7A-ga seotud MG tugevaimaid voldimuutusi, ehkki suurema P-väärtusega selle rühma väikese valimi suuruse tõttu (n ¼ 2; joonis 1b). Üldiselt näitas see põhimõtet tõendav analüüs, et laserpüüdmisega mikrodissekteeritud glomerulite massispektromeetria abil saab tuvastada valke, mis on olulised membraanse glomerulopaatia haiguse patogeneesis.

Järgmisena püüdsime selle lähenemisviisi abil tuvastada MGMID patogeneesis potentsiaalselt seotud valgud. Kokku 6 valku oli MGMID proovides teiste rühmadega võrreldes oluliselt rohkem (tabel 1). Suurima kordamismuutusega valk oli SAP (joonis 1c). Ülejäänud valgud koosnesid IgG Kappast, 3 komplementvalgust ja heterokromatiini valku 1 siduvast valgust 3 (HP1BP3). SAP-i peeti parimaks kandidaadiks, kuna see tuvastati kõigis MGMID proovides ja see näitas suurimat erinevust arvukuses võrreldes mitte-MGMID proovidega. Kõik Ig-id, mis on massispektromeetria abil identifitseeritud laserpüüdmisega mikrodissekteeritud glomerulites IgG kappa ladestustega membraanitaolise glomerulopaatia juhtudest, on näidatud täiendavas tabelis S1. Spektriloendused kõigi valkude proovide võtmisel, mis näitasid MGMID proovides $1 log2 suurenenud arvukust ja P-väärtust #0.1, on näidatud täiendavas tabelis S2.

Cistanchesaab parandadaneerudfunktsiooni

SAP-värvimine membraanitaolise glomerulopaatia korral

SAP-valgu vastane polüklonaalne küüliku antikeha (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) näitas tugevat positiivset värvumist piki MGMID-ga juhtude glomerulaarset alusmembraani, mis konfokaalse analüüsi abil kolokaliseeriti IgG-ga. SAP ei näidanud kolokaliseerumist IgG-ga PLA2R-ga seotud MG glomerulites (joonis 2). HP1BP3-vastast polüklonaalset küüliku antikeha testiti neljas biopsias MGMID-ga ja see näitas kõigi nelja juhtumi puhul negatiivset värvumist glomerulaarsetes ladestustes.

SAP-värvimine viidi läbi kokku 211-lneerudbiopsiadglomerulonefriidiga (tabel 2). Kokku 36 immuuntüüpi ladestustega juhtumit olid SAP-i suhtes positiivsed. Kõik positiivselt värvunud juhtumid jagasid teatud histopatoloogilisi tunnuseid, sealhulgas mesangiaalseid ja subepiteliaalseid ladestusi koos IgG kappa piiranguga ning valgusmikroskoopiaga ei esinenud endokapillaarseid ega membraaniproliferatiivseid muutusi. SAP oli kõigil juhtudel negatiivne, maskeeritud ladestustega, mis ei olnud MGMID, sealhulgas 3 krüoglobulineemilise glomerulonefriidi juhtu ja 3 maskeeritud membranoproliferatiivse glomerulonefriidi juhtu. Samuti oli see negatiivne kõigil 19 monoklonaalsete Ig ladestustega (PGNMID) proliferatiivse glomerulonefriidi korral, sealhulgas IgG1 kappa (4 juhtu), IgG2 lambda (1 juhtu), IgG 3 kappa (8 juhtu) ja IgG3 lambda (6 juhtumit) puhul. ). Kõik 30 polüklonaalse membraanse glomerulopaatia juhtumit (PLA2R, THSD7A, luupus ja segmentaalne) olid SAP-i suhtes negatiivsed. Uuriti ka täiendavaid glomerulonefriidi vorme, mis olid negatiivsed. Infektsiooniga seotud glomerulonefriidi hulgas oli 7 positiivset IgG värvimist ja 6 korral subepiteliaalset küüru ladestumist. Nagu oodatud, näitasid kõik 6 amüloidoosi juhtumit amüloidiladestustes positiivset värvumist. Kuid määrdunud ladestumise muster oli teravas kontrastis MGMID-i juhtudel esineva granulaarse värvimisega. Erinevate neeruhaiguste SAP-värvi glomerulite tüüpilised mikrofotod on näidatud lisajoonisel S1.

Kõik 32 varem MGMID-na identifitseeritud juhtumit olid SAP-i suhtes positiivsed. Lisaks ilmnes SAP-i suhtes positiivne värvumine glomerulites 4-l 25-st membraanse glomerulopaatia juhtumist koos monotüüpse IgG ladestumisega, mis rutiinselt ei maskeerunud.

immunofluorestsents, sealhulgas 4 juhtu 13-st IgG1 kappaga, 0 2 juhtumist IgG1 lambdaga, 0 5 juhtumist IgG2 kappaga, 0 4 juhtumist IgG3 kappaga ja {{ 12}} 1 juhtumist IgG4 kappaga. Üldiselt oli 32 SAP-positiivsest glomerulopaatiast 36-st (89 protsenti) maskeeritud ja sobis MGMID kategooriasse, samas kui ülejäänud 4 36-st (11 protsenti) olid paljastatud ja diagnoositud MG-na, millel oli IgG1 kappa ladestused. Patsientide, kellel oli monotüüpne membraanne glomerulopaatia, kes ei varjanud, kuid olid SAP-i suhtes positiivsed, keskmine vanus oli 33 aastat ning naiste ja meeste suhe oli 4:0. Monotüüpse membraanse glomerulopaatiaga juhtude puhul, mis ei varjanud, kuid olid SAP suhtes negatiivsed, oli keskmine vanus 59,3 aastat ja naiste ja meeste suhe oli 15:4.

Tabel 1|Valgud suurenesid märkimisväärselt patsientide glomerulitesmembraanitaoline glomerulopaatiamaskeeritud IgG kappa ladestustega, nagu on näidatud massispektromeetria abil

Seerumi reaktiivsus SAP-ile

22 MGMID-ga, 12 PLA2R-positiivse membraanse glomerulopaatiaga patsiendi ja 6 normaalse kontrolli seerumeid testiti IgG reaktiivsuse suhtes SAP suhtes ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsiga (ELISA). Kuigi igas rühmas esines patsientide vahel mõningast varieeruvust, ei olnud rühmade vahel olulist erinevust IgG reaktiivsuses SAP suhtes (täiendav joonis S2).

Joonis 2|IgG ja seerumi amüloid P-komponendi (SAP) kolokaliseerimine. ( a–c ) Immunofluorestsentskatsed, mis viidi läbi neerubiopsia prooviga patsiendilt, kellel on diagnoositud membraanitaoline glomerulopaatia koos maskeeritud IgG kappa ladestustega, näitavad (a) SAP ja (b) IgG granulaarset glomerulaarset alusmembraani värvimist. ( c ) SAP ja IgG tugev kolokalisatsioon glomerulaarsetes alusmembraani ladestustes. (d–f) Immunofluorestsentskatsed, mis viidi läbi 3 fosfolipaasi A2-retseptor-positiivse membraanse glomerulopaatiaga patsiendi neeru biopsia prooviga, näitavad (d) negatiivset glomerulaarmembraani värvimist SAP-i jaoks ja (e) positiivset granulaarset glomerulaarmembraani värvimist IgG jaoks. (f) Sellel 3 fosfolipaasi A2 retseptoriga seotud membraanse glomerulopaatiaga patsiendil puudub kolokalisatsioon. Selle pildi vaatamise optimeerimiseks vaadake selle artikli veebiversiooni tabelis 2|Seerumi amüloid-p-komponendi (SAP) värvimise tulemused neerubiopsiates

AA, amüloid A; AL, amüloidi kerge ahel; C3, komplemendi komponent 3; GBM, glomerulaarne basaalmembraan; MG, membraanne glomerulopaatia; MGMID, membraanitaoline glomerulopaatia maskeeritud IgG kappa ladestustega; MPGN, membraaniproliferatiivne; glomerulonefriit; PGMNID, proliferatiivne glomerulonefriit koos monoklonaalsete IgG kappa ladestustega; PLA2R, fosfolipaasi A2 retseptor; THSD7A, trombospondiini tüüpi 1 domeeni sisaldav 7A.

ARUTELU

MGMID on hiljuti kirjeldatud ja ainulaadne glomerulopaatia muster, mida iseloomustavad subepiteliaalsed ja mesangiaalsed ladestused, mis värvivad parafiini IF-ga IgG kappa (joonis 3). Sellise glomerulopaatiaga patsiendid on tavaliselt noored naised (vanus<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">

SAP on pentraksiini perekonda kuuluv 25-kDa pentameerne valk, mida kodeerib APCS geen ja mida leidub rohkesti seerumis ja glomerulaarse basaalmembraani komponendina.5 Kuigi SAP-i täpne funktsioon on ebaselge, on see teada. interakteeruda plasmas paljude erinevate valkudega, sealhulgas komplemendi komponendid, apolipoproteiinid ning koagulatsiooni ja proteolüüsi regulaatorid.6 See moodustab stabiilse kaltsiumist sõltuva interaktsiooni oma ligandidega, sealhulgas valkude, lipoproteiinide ja DNA-ga, kaitstes neid lagunemise eest. SAP toimib lahustuva mustrituvastusmolekulina, mis osaleb kaasasündinud immuunvastuses, tuvastades mitmesuguseid patogeenide ja kahjustustega seotud molekulaarseid mustreid, sealhulgas mikroobseid komponente ja apoptootilist rakujäätmeid.7 SAP interaktsioon patogeeni või kahjustusega seotud molekulidega. mustrid soodustavad komplemendi vahendatud apoptootiliste rakujäätmete kliirensit, seondudes otsese komplemendi komponendiga 1q (C1q) ja aktiveerides klassikalise komplemendi raja. Vaatamata komplemendi aktiveerimisele annab SAP teadaolevalt immunoregulatsiooni, vähendades neutrofiilsustpõletikkudedes tänu vähenenud endoteeli adhesioonile8, vähenenud elastaasi funktsioonile9 ja vähenenud kudedele omastamisele.10 SAP on ka teadaolevalt peamine DNA ja kromatiini siduv valk plasmas.11

Haiguse korral on SAP kõige paremini tuntud amüloidoosi ladestuste osana. Kuigi seda on vähem uuritud, on ka tõendeid selle kohta, et see võib mängida rolli autoimmuunhaiguste inimeste ja loomade mudelites. SAP-i antikehad on tuvastatud patsientidel, kellel onautoimmuunnehaigusedja vähenenud SAP ekspressioon soodustabautoimmuunsushiiremudelites. SAP-vastased antikehad tuvastatakse 44 protsendil süsteemse erütematoosluupusega patsientidest, kusjuures antikehade tiitrid korreleeruvad haiguse aktiivsusega.12 Leiti, et SAP-i puudulikkus põhjustab spontaanse autoimmuunsuse väljakujunemist autoimmuunsusele kalduvatel C57BL/6 hiirtel ja mitte-autoimmuunsetel hiirtel. altid 129/Sv hiired, kui neid ristati C57BL/6 hiirtega (129/Sv x C57BL/6 F2)13, kuid mitte ainult 129/Sv tüvega, mis viitab sellele, et autoimmuunsuse esilekutsumiseks võib olla vajalik geneetiline vastuvõtlikkus SAP-i puudulikkusele. hiirtel ilmnevad tuumavastaste antikehade, üheahelalise DNA, kaheahelalise DNA vastaste antikehade ja reumatoidfaktorite tootmine. Nad arendavad proliferatiivsetimmuunnekompleksvahendatud glomerulonefriit, sagedamini naistel.13 Luupusnefriidi hiiremudelis, kus glomerulonefriit on indutseeritud aktiveeritud enese-DNA süstimisega seerumis, vähendas SAP geeniteraapia plasmiidvektoriga kaheahelalise DNA vastaste antikehade tootmist. , immuunkompleksi ladestumist ja neerupõletikku ning hoidis ära luupusnefriidi teket.15

Joonis 3|Neeru biopsia leiud membraanitaolises glomerulopaatias koos maskeeritud IgG kappa ladestustega. Siin on näidatud joonisel 2 näidatud biopsia mikropildid. (a) Jonesi meteenamiini hõbedase peitsi abil (algne suurendus × 400) on piki glomerulaarseid alusmembraane segmentaalsed naelu. (b) Elektronmikroskoopia tuvastab glomerulaarses alusmembraanis olevad subepiteliaalsed ladestused (algne suurendus × 12, 000). (c) Glomeruli värvus IgG suhtes negatiivne rutiinse immunofluorestsentsi abil värskel koel (otsene immunofluorestsents; algne suurendus × 400). (d) Samast juhtumist pärit glomerulid värvusid pärast proteaasiga lõhustamist parafiiniga manustatud koele positiivseks (otsene immunofluorestsents; algne suurendus × 400). (e) Glomeruli värvuvad kappa ja (f) mitte lambda suhtes proteaasiga seeditud parafiiniga manustatud koes (otsene immunofluorestsents; algne suurendus × 400). Selle pildi vaatamise optimeerimiseks vaadake selle artikli veebiversiooni aadressil www.neerud-international.org.

Hoolimata biopsias täheldatud kerge ahela piirangust, ei ole praegu tõendeid selle üksuse seostamise kohta lümfoproliferatiivsete häirete või ringlevate monoklonaalsete Ig-dega.4 Seega ei tohiks MGMID-i pidada käesoleval juhul neerude tähtsusega monoklonaalse gammopaatia spektriks kuuluvaks. aega. SAP autoantikehade roll on samuti ebakindel. Erinevalt teistest membraanse glomerulopaatia vormidest, mille puhul on spetsiifiliselt immuunladestustes esinev valk, nagu PLA2R-ga seotud haigus, ei näi MGMID-d olevat juhitud SAP-i vastu suunatud autoantikehadest, kuna meil ei õnnestunud MGMID-ga patsientidel tuvastada seerumi antikehade reaktiivsust SAP-i vastu. . Alternatiivne selgitus on see, et IgG kappa esineb pigem nende kahe valgu vahelise normaalse interaktsiooni kui autoimmuunse antigeeni ja antikeha interaktsiooni tulemusena, kuna teadaolevalt on Ig kappa ahel seerumi SAP normaalse interaktsiooni osa. kuigi see on kasulik selle üksuse kudede diagnostikaks, ei toimi SAP-antikehade testimine seerumis praegu mitteinvasiivse diagnostikana ja selle haiguse põhjustaja jääb saladuseks.

MGMID kliinilised tulemused on väga erinevad, ulatudes spontaansest remissioonist kuni progresseerumiseni lõppstaadiuminineerudhaigusretsidiiviga siirdamisel. Retrospektiivne analüüs ei ole näidanud seost kasutatud ravi ja kliinilise tulemuse vahel.4 SAP-i seotuse avastamine selle haigusega võib mõjutada ravi. Otseselt SAP-le suunatud ravi on osutunud amüloidoosi ravis varakult lubavaks.17,18 Lisaks näitavad massispektromeetria tulemused, et komplemendi kaskaadile suunatud ravi võib olla kasulik selle glomerulonefriidi vormi ravimisel, arvestades, et enamik valke, mis on suurenenud. MGMID-s on glomerulid seotud komplemendiga. Selle haiguse aktiivsuse biomarkerite ja ravimeetodite tuvastamiseks on vaja täiendavaid uuringuid.

Rutiinse immunofluorestsentsi MGMID-biopsiate immuunladestuste varjamise põhjus jääb saladuseks. SAP olemasolu hoiustes tõstatab selle nähtuse kohta uusi võimalikke seletusi MGMID puhul. Näiteks on teada, et SAP-valgu interaktsioonid sõltuvad tugevalt Ca2-st,6 ning paljudes transpordisöötmetes ja puhvrites, mida kasutatakse neerubiopsia koe töötlemisel immunofluorestsentsi jaoks, puudub Ca2. See Ca2þ in vitro puudumine võib põhjustada immuunladestuste katkemist, nii et need ei ole enam külmutatud koel immunofluorestsentsi abil tuvastamiseks saadaval. Immuunkompleksi ladestused jääksid aga formaliiniga fikseeritud koes tuvastamiseks kättesaadavaks, kuna formaliinist põhjustatud kovalentsed keemilised sidemed koes valkude vahel.

Kirjeldame siin esimest korda SAP-i ainulaadset esinemist MGMID-i glomerulaarsetes ladestustes. Lisaks näitame seda värvimistneerudbiopsiadSAP puhul tuvastab rutiinse immunofluorestsentsi abil juhtumid, mille kliinilised tunnused on sarnased MGMID-iga, ilma maskeerimata. Arvestades neid tulemusi, usume, et SAP-i positiivne värvumine glomerulaarsetes ladestustes tuvastab ainulaadse glomerulonefriidi vormi, millel on ühine haiguse patofüsioloogiline mehhanism. Kuni MGMID hiljutise kirjelduseni diagnoositi neid juhtumeid erinevatesse kategooriatesse, alates C3 glomerulopaatiast kuni infektsiooniga seotud glomerulonefriidi ja atüüpilise membraanse glomerulopaatiani.1 Diagnostiliste kriteeriumide kiire areng ja meie arusaam sellest glomerulonefriidi vormist rõhutavad massi jõudu. spektromeetria, et anda patofüsioloogiline ülevaade immuunvahendatud glomerulonefriidist.

MEETODID

Neeru biopsia töötlemise tehnikad

Kasutati standardseid neerubiopsia töötlemise tehnikaid, sealhulgas valgus-, immunofluorestsents- ja elektronmikroskoopiat.19,20 Kõik valgusmikroskoopia proovid värviti hematoksüliini ja eosiini, Jonesi meteenamiini hõbeda, Massoni trikroomi ja perioodilise happe-Schiffi reagendiga. Kõik otsese immunofluorestsentslõigud lõigati 4 mm kaugusel ja reageeriti flfluorestseiiniga märgistatud polüklonaalsete küüliku anti-inimese antikehadega IgG, IgA, IgM, C3, C1q, fibrinogeeni ning k- ja l-kergete ahelate vastu (Dako, Carpenteria, CA) 1 tund ja loputa; katteklaas kanti, kasutades vesipõhist kinnitusvahendit. Valitud juhtumid värviti flfluorestseiiniga märgistatud polüklonaalsete hiire anti-inimese antikehade suhtes IgG1, IgG2, IgG3 ja IgG4 vastu (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Parafiini immunofluorestsents viidi läbi pärast proteaasiga lõhustamist, nagu eelnevalt kirjeldatud.2,3 Massispektromeetria analüüsiks valiti kokku 9 MGMID biopsiat ja 8 võrdluskontrollbiopsiat teist tüüpi membraanse glomerulopaatiaga. Uuringuprotokolli kiitis heaks Solutions Institutional Review Board ja see vastas Helsingi deklaratsiooni põhimõtetele.

Cistanche saabtoniseerivadneerud

Laserpüüdmisega mikrodissekteeritud glomerulite massispektromeetria

Neeru biopsiakude formaliiniga fikseeritud parafiiniga manustatud koest lõigati 10 mm paksuselt Leica PET-membraani raami alusklaasidele (Leica, Wetzlar, Saksamaa). Seejärel värviti need slaidid hematoksüliiniga. Glomerulid mikrodissekteeriti mikrotsentrifuugituubidesse, kasutades Leica DM60{{20}}0B mikroskoopi. Mikrodissekteeritud glomeruleid lüüsiti 2-protsendilises naatriumdodetsüülsulfaadis ja 0,1 M ditiotreitoolis 99 kraadi juures 1 tund ja töödeldi filtri abil proovi ettevalmistamisega (FASP).21 Selitatud lüsaat kanti üle Vivacon 500 kontsentraatoritesse (MWCO 30 kDa; Sartorius 30 kDa; , Göttingen, Saksamaa). Naatriumdodetsüülsulfaat eemaldati korduvate pesudega 8 M uureaga 0,1 M tris(hüdroksümetüül)aminometaanis/Cl-s, pH 8,5; proovid alküüliti seejärel 0,05 M jodoatsetamiidiga. Jodoatseetamiid eemaldati 3 pesemisega 8 M uurea/0,1 M tris(hüdroksümetüül)aminometaan/Cl lahusega, pH 8,5, millele järgnes 3 pesemist 0,05 M ammooniumvesinikkarbonaadiga. Valke lagundati trüpsiiniga (sekveneerimisaste, Promega, Madison, WI) massisuhtes 40:1 37 kraadi juures 16 tundi. Peptiidid koguti tsentrifuugimise teel ja sooladest eemaldati C18-Stage tips (Thermo Scientific, Waltham, MA).

Seeditud peptiide analüüsiti NanoLC-tandem-massispektromeetria abil, kasutades massispektromeetrit Thermo Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific). Peptiidid laaditi pöördfaasi püüduri kolonni (Integra-frit, New Objective, Woburn, MA), mis sisaldas 2,5 mm Waters XSelect (Waters Corp., Milford, MA) laetud pinnaga hübriidvaiku, mis oli ühendatud 150 mm X 0.075 mm analüütiline kolonn, mis sisaldab sama pöördfaasivaiku, mida kasutatakse lõksus. Seejärel kasutati nanoAcquity üliefektiivset vedelikkromatograafiasüsteemi (Waters Corp.), et tekitada 60-minutiline gradient vahemikus 98:2 kuni 60:40 puhvri A:B suhe (puhver A ¼ 0,1 protsenti sipelghapet 0,5 protsenti atsetonitriili; puhver B ¼ 0,1 protsenti sipelghapet, 99,9 protsenti atsetonitriili).

Peptiidid elueeriti kolonnist integreeritud pihustusotsakuga (Picofrit, New Objective) ja ioniseeriti elektropihustusega (20 kV), millele järgnes tandem-massispektromeetria analüüs, kasutades suurema energiaga kokkupõrkest põhjustatud dissotsiatsiooni (HCD). Peptiidi prekursorite uuringuskaneeringud viidi läbi eraldusvõimega 240K (sagedusel 400 m/z) ioonide arvu sihtmärgiga 5 × 105. Tandem-massispektromeetria viidi läbi isoleerimisega 1, 6 Th juures kvadrupooliga, HCD fragmenteerimisega normaliseeritud kokkupõrkeenergiaga 30 ja kiire skaneerimise massispektromeetria analüüsiga ioonilõksus. Saadud tandem-massispektromeetria andmeid otsiti kõige uuemast Uniproti inimeste andmebaasist, mis sisaldas nii Swiss Prot kui ka TREMBLE kirjeid, kasutades

MaxQuant (Max Plancki Biokeemia Instituut, Planegg, Saksamaa). Andmete visualiseerimiseks kasutati Scaffold v4.6 (Proteome Software, Portland, OR). Peptiidi ja spektri vastete puhul määrati valede avastamise määraks 1 protsent. Kvantifitseerimiseks kasutati MaxQuant'i normaliseeritud iBAQ väärtusi. Iga proovi iBAQ jaotused kohandati mediaaniga, et kontrollida koormuse erinevusi. Nulliga võrdsed iBAQ väärtused eemaldati andmekogumist. Statistilise hüpoteesi testimiseks viidi iga valgu jaoks läbi Welchi t-proovi 2-proov, kasutades kahe rühma normaliseeritud iBAQ väärtusi. Kui valk tuvastati ainult ühes rühmas, viidi läbi Welchi t-testi 1-proov, kasutades nullhüpoteesina väikseimat tuvastatud iBAQ väärtust.

SAP värvimine

Formaliiniga fikseeritud parafiiniga manustatud lõigud, mis olid lõigatud 3 mm, deparaffineeriti ja antigeeni otsimine viidi läbi 99 kraadi juures. Sektsioonid reageerisid küüliku polüklonaalse SAP-vastase polüklonaalse antikehaga (1:400; ThermoFisher, Waltham, MA), millele järgnes rodamiinpunase X-konjugeeritud kitse küülikuvastane sekundaarne antikeha, mis adsorbeeriti tahkes faasis, et tagada minimaalne ristreaktsioon inimesega. IgG (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Iga juhtum viidi läbi positiivsete ja negatiivsete kontrollidega. Värvi hinnati standardse immunofluorestsentsmikroskoopia abil. See hinnati positiivseks, kui glomerulites oli graanulite kapillaarsilmus värvunud, ja negatiivseks, kui kapillaarsilmust ei olnud

värvimine glomerulites. IgG ja SAP kolokalisatsiooni glomerulaarsetes alusmembraanides uuriti konfokaalse mikroskoobiga, kasutades Zeiss LSM 880 konfokaalset laserskaneerivat mikroskoopi (Zeiss Microscopy, Jena, Saksamaa). Selle analüüsi jaoks pandi polüklonaalne (flfluorestseiini isotiotsüanaadiga konjugeeritud) küüliku anti-inimese IgG (1:40; Agilent, Santa Clara, CA) reageerima kuumusega eraldatud koega pärast ülalkirjeldatud SAP värvimist. Antikeha spetsiifilisuse tagamiseks viidi läbi negatiivsed kontrollid, jättes välja primaarsed antikehad. Neljal MGMID juhtumil testiti HP1BP3 olemasolu (1:100; Thermo Fisher, Waltham, MA) immunoperoksüdaasiga värvimisega.

SAP-vastaste seerumi antikehade testimine

SAP valk (R & D Systems, Minneapolis, MN; {{0}}SAB-050) lahjendati karbonaat-vesinikkarbonaatpuhvris (pH 9,6) kontsentratsioonini 3 ng/ml ja kaeti {{ 6}} süvend Immulon H2 plaat (Thermo Scientific) üleöö temperatuuril 4 kraadi . Plaate pesti 3 korda, kasutades 200 ml pesupuhvrit (1 × fosfaatpuhverdatud soolalahus ja 0,05 protsenti Tweeni) ja blokeeriti 2 tundi blokeeriva puhvriga (1 × fosfaatpuhverdatud soolalahus, 0,05 protsenti). Tween, 1% kalaželatiin). Seejärel pesti plaate 3 korda 200 ml pesupuhvriga. Igasse süvendisse lisati 20 mikroliitrit lahjendatud seerumit (1:100 pesupuhvris) ja inkubeeriti 2 tundi toatemperatuuril. Plaate pesti korda 7 200 ml pesupuhvriga, millele järgnes tuvastusantikeha, anti-Human IgG-HRP (Jackson ImmunoResearchLaboratories; 309-035-003) lisamine. Plaate pesti x 7 200 ml pesupuhvriga. Järgmisena segati 3,3',5,5'-tetrametüülbensidiini peroksidaasi substraat ja peroksidaasi substraat Sol B vahekorras 1:1 ning plaadile lisati 100 ml. Reaktsioon peatati 100 ml 2M H2SO4 lisamisega, jäeti 20 minutiks pingile seisma, enne kui määrati 450 nm juures. Kontrollimiseks, et tagada SAP-valgu seondumine plaadiga, kasutasime küüliku anti-SAP-i (Invitrogen, Carlsbad, CA; PA1-28361) seerialahjenduses, millele järgnes küülikuvastane IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories). ; 111-035-144). Kontroll näitas head korrelatsiooni antikeha lahjenduse ja neeldumise vahel, keskmise R-ruudu väärtusega 0,95.

Cistanche parandamise eestneerudfunktsiooni

AVALIKUSTAMINE

Kõik autorid ei deklareerinud konkureerivaid huve.

TÄIENDAV

MATERJALI lisafail (PDF)

Joonis S1. Tüüpilised kujutised glomerulaarse SAP-i värvimisest mitmesugustest neeruhaigustest.

Joonis S2. Anti-SAP seroreaktiivsuse uuringud ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsiga.

Tabel S1. Kõik Ig-id identifitseeriti massispektromeetria abil laserpüüdmisega mikrodissekteeritud glomerulites membraanitaolise glomerulopaatia juhtudest koos IgG kappa ladestustega.

Tabel S2. Spektriloendused kõigi valkude proovide võtmisel näitasid MGMID proovide arvukuse suurenemist 1 $ log2 ja P-väärtust # 0.1.

VIITED

1. Larsen CP, Ambruzs JM, Bonsib SM jt. Membraanitaoline glomerulopaatia maskeeritud IgG kappa ladestustega.NeerInt. 2014;86: 154–161.

2. Messias NC, Walker PD, Larsen CP. Parafiini immunofluorestsents neerupatoloogia laboris: rohkem kui päästetehnika. Mod Pathol. 2015;28:854–860.

3. Larsen CP, Messias NC, Walker PD jt. Membranoproliferatiivne glomerulonefriit maskeeritud monotüüpsete immunoglobuliinide ladestustega. Kidney Int. 2015;88:867–873.

4. Larsen CP, Boils CL, Cossey LN jt. Maskeeritud IgG kappa ladestustega membraanitaolise glomerulopaatia kliinilised patoloogilised tunnused. Kidney Int Rep. 2016;1:299–305.

5. Emsley J, White HE, O'Hara BP, et al. Inimese pentameerse seerumi amüloid P komponendi struktuur. Loodus. 1994;367:338–345.

6. Poulsen ET, Pedersen KW, Marzeda AM jt. Seerumi amüloid P komponendi (SAP) interaktsioon inimese plasmas, mis sisaldab füsioloogilist kaltsiumi taset. Biokeemia. 2017;56:896–902.

7. Agrawal A, Singh PP, Bottazzi B jt. Mustri tuvastamine pentraksiinide abil. Adv Exp Med Biol. 2009;653:98–116.

8. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M jt. Pentraksiinid PTX3 ja SAP kaasasündinud immuunsuses, põletiku reguleerimises ja kudede ümberkujundamises. J Hepatol. 2016;64:1416–1427.

9. Li JJ, McAdam KP. Inimese amüloid P komponent: elastaasi inhibiitor. Scand J Immunol. 1984;20:219–226.

10. Cox N, Pilling D, Gomer RH. Seerumi amüloid P: kaasasündinud immuunvastuse süsteemne regulaator. J Leukoc Biol. 2014;96:739–743.

11. Kravitz MS, Pitashny M, Shoenfeld Y. Kaitsemolekulid – C-reaktiivne valk (CRP), seerumi amüloid P (SAP), pentraksiin3 (PTX3), mannoosi siduv lektiin (MBL) ja apolipoproteiin A1 (Apo A1), ja nende autoantikehad: levimus ja kliiniline tähtsus autoimmuunsuses. J Clin Immunol. 2005;25:582–591.

12. Zandman-Goddard G, Blank M, Langevitz P jt. Seerumi amüloidi komponendi P-vastased antikehad süsteemse erütematoosluupusega patsientidel korreleeruvad haiguse aktiivsusega. Ann Rheum Dis. 2005;64:1698–1702.

13. Bickerstaff MC, Botto M, Hutchinson WL jt. Seerumi amüloid-P komponent kontrollib kromatiini lagunemist ja hoiab ära antinukleaarse autoimmuunsuse. Nat Med. 1999;5:694–697.

14. Gillmore JD, Hutchinson WL, Herbert J jt. Autoimmuunsus ja glomerulonefriit hiirtel, kellel on seerumi amüloidi P-komponendi geeni sihipärane deletsioon: SAP-i puudulikkus või tüvede kombinatsioon? Immunoloogia. 2004; 112:255–264.

15. Zhang W, Wu J, Qiao B jt. Luupusnefriidi leevendamine seerumi amüloid-P komponendi geeniteraapiaga koos erinevate mehhanismidega varieerus haiguse erinevatest etappidest. PloS One. 2011;6:e22659.

16. Beck LH, Bonegio RG, Lambeau G jt. M-tüüpi fosfolipaasi A2 retseptor sihtantigeenina idiopaatilise membraanse nefropaatia korral. N Engl J Med. 2009;361:11–21.

17. Richards DB, Cookson LM, Berges AC jt. Amüloidi terapeutiline kliirens seerumi amüloid P komponendi vastaste antikehade poolt. N Engl J Med. 2015;373:1106–1114.

18. Richards DB, Cookson LM, Barton SV jt. Süsteemse amüloidoosiga patsientidel tuleb seerumi amüloid P komponendi vastaste antikehade korduvad annused puhastada amüloidi ladestumist. Sci Transl Med. 2018;10.

19. Walker PD, Cavallo T, Bonsib SM. Praktilised juhised neeru biopsia jaoks. Mod Pathol. 2004;17:1555–1563.

20. Walker PD. Neeru biopsia. Arch Pathol Lab Med. 2009;133:181–188.

21. Wisniewski JR, Zougman A, Nagaraj N jt. Universaalne proovi ettevalmistamise meetod proteoomi analüüsiks. Nat meetodid. 2009; 6: 359–362.