Fisetiin nõrgendab lipopolüsahhariidide põhjustatud põletikulisi reaktsioone makrofaagides

Lisateabe saamiseks võtke ühendusttina.xiang@wecistanche.com

Mitmed uuringud on teatanud polüfenoolide tõhususest ja ohutusest inimeste tervisele; nende tõhususe kontrollimine on siiski ebapiisav. Selle uuringu eesmärk oli uurida, kas fisetiin, üks puu- ja köögiviljades esinevatest flavonoididest, võib pärssida lipopolüsahhariidi-(LPS-) indutseerimist.põletikulinevastused makrofaagides. LPS suurendas põletikueelse mRNA (MCP 1, IL-1ß ja iNOS) arvukust, kuid fisetiin surus neid alla. LPS-i, oksüdatiivse stressifaktori, lämmastikoksiidi suurenemist nõrgendas fisetiin. Lisaks vähenes mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (ERK ja JNK) LPS-ga tugevdatud fosforüülimine. Lõpuks nõrgendas fisetiin uPA, uP AR, MMP-2 ja MMP-9 ekspressiooni või aktiivsust, mida tuntakse makrofaagide värbamise või infiltratsiooni seotud teguritena. Kokkuvõtteks,fisetinon paljulubav terapeutiline aine makrofaagidega seotud põletikuliste haiguste, nagu sepsis ja ateroskleroos.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin.

1. Sissejuhatus

Looduslike komponentide terapeutiline kasutamine on pälvinud rohkem tähelepanu viimase kahe aastakümne jooksul. Nende suure tõhususe ja madala toksilisuse tõttu on 40 protsenti FDA poolt heaks kiidetud raviainetest looduslikud komponendid või nende derivaadid [1]. Teiste ravimitega seotud toksilisust on edukalt ära hoitud erinevate looduslike toodetega [2]. Seega on väga oluline ja oluline uurida taimse päritoluga looduslikke ühendeid edasi.

Polüfenoolidon taimede sekundaarsed metaboliidid ja neid leidub laialdaselt taimset päritolu toitudes ja jookides, puuviljades, köögiviljades, vürtsides, tees ja veinis. Kuigi neid ei peeta olulisteks mikrotoitaineteks, näitavad mitmesugused kirjandused nende kasulikku mõju inimeste tervisele, eriti dieedi puhul, mis on seotud suure puu- ja köögiviljade tarbimisega [3-5]. Aastakümnete jooksul on polüfenoolide farmakoloogiliste mõjude uurimiseks läbi viidud arvukalt uuringuid, mis viitavad tervisele kasulikule mõjule. Kasvavad tõendid on näidanud, et mõned polüfenoolid omavadpõletikuvastaneomadused

[6-8]. Lisaks on hiljutised uuringud näidanud, et mitut tüüpi polüfenoolid võivad pärssida põletikuga seotud regulatoorseid ensüüme või transkriptsioonifaktoreid [9].

Dieet mõjutab põletiku erinevaid staadiume ja avaldab olulist mõju mitmetele põletikulistele haigustele[10,11]. Põletik mängib võtmerolli selliste haiguste nagu diabeet, astma, südame-veresoonkonna haiguste ja vähi tekkes [12]. Seetõttu võib põletiku kontrolli all hoidmine neid haigusi ära hoida. Kuna makrofaagid on peamised põletiku vahendajad, on neil kudede homöostaasis ja põletikus mitmesugused funktsioonid. Seega on nende funktsioone tõhusalt moduleerivatel ainetel suur kliiniline väärtus, kuna makrofaagide ebanormaalne aktiveerimine võib põhjustada kahjulikke immuunvastuseid. Praegune uurimissuund näitab selgelt, et looduslikud tooted on uute ravimite üks olulisemaid allikaid [13].

Üks polüfenool, isetiini (3,3',4',7-tetrahüdroksüflavon), sisaldub rikkalikult maasikas, õunas, tomatis, sibulas, apelsinis, virsikus, viinamarjas, kiivis, hurmas, tees ja veinis [14] . Seni on fisetiinist teatatud tugevast põletikuvastasest [15-17],

antioksüdant [18], kasvajavastane[19,20, antiangiogeenne [21], diabeedivastane [22], neuroprotektiivne [23] ja kardioprotektiivne toime [24] nii rakukultuuris kui ka inimhaigustega seotud loommudelites. Kuigi fisetiinil on palju füsioloogilisi toimeid, ei ole selle mõju makrofaagidele palju teatatud.

Käesolevas uuringus uurisime fisetiini kasulikku mõju makrofaagide põletikulisele vastusele, mis on aktiveeritudlipopolüsahhariid(LPS).

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Peritoneaalsete makrofaagide isoleerimine.

BALB/c hiired saadi Tokyo ülikooli meditsiiniteaduste instituudist ja neid hoiti Okayama ülikooli loomaressursside keskuses. Kõik loomkatsed viidi läbi NIH juhiste (laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhend) järgimiseks. Katseprotokolli kiitsid heaks Okayama ülikooli meditsiini-, hambaravi- ja farmaatsiateaduste kooli (OKU{0}}) loomkatsete eetikakontrolli komiteed. Kõiki hiiri hoiti barjääris ja neile toideti tavalist laboratoorset dieeti. Isased ja emased BALB/c hiired, vanuses 16 ± 4 nädalat, tuimastati isofluraaniga ja eutaniseeriti emakakaela dislokatsiooni teel. Makrofaagid koguti peritoneaalse loputamise teel, kasutades soolalahust (5 ml). Kõhukelme loputuslahust tsentrifuugiti kiirusel 1500 p/min 5 minutit. Sete suspendeeriti väheses koguses DMEM-is (SIGMA, kat. nr D6046). Punased verelibled lüüsiti ammooniumkloriidi lahuse abil. Makrofaagide arv arvutati hemotsütomeetriga, seejärel resuspendeeriti DMEM-is, mis sisaldas kuumusega inaktiveeritud FBS-i (10% vv), penitsilliini (10 U/mL) ja streptomütsiini (10 mg/ml), ning plaaditi 6-süvendisse. plaadid (Corning Incorporated, kat. nr 3516) [25,26].

2.2. Rakukultuuri tingimused.

Pärast üleöö seerumi nälgimist inkubeeriti makrofaage valitud fisetiini kontsentratsioonidega (10, 30 ja 100 µM); SIGMA, kass. nr F4043) või vehiikulit 3 tundi ja inkubeeriti LPS-i (10 ng/mL; SIGMA, kat. nr L4391) juuresolekul või puudumisel sobiva aja jooksul. Seejärel koguti sööde ja rakud. Söödet kasutati lämmastikoksiidi (NO) testis ja želatiini sümograafias. Rakulüsaate kasutati kvantitatiivse polümeraasi ahelreaktsiooni (qPCR) ja Western blot analüüsi jaoks.

2.3. Reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon.

mRNA-d ekstraheeriti makrofaagidest, kasutades RNeasy Mini Kits (QIAGEN, kat. nr 74104). Pöördtranskriptsioon viidi läbi, kasutades iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, kat. nr 1708891). qPCR viidi läbi ABI Step One reaalajas PCR süsteemiga (Applied Biosystems, QuantStudio 3), kasutades Fast SYBR Green Real-time PCRMixture'i (Applied Biosystems, kat. nr 4385612)[27). Praimerid monotsüütide kemotaktilise valgu 1 (MCP-1) (Takara Bio Inc, kat. nr MA066003), interleukiin 1 beeta (IL-1) (Takara Bio Inc., kat. nr MA025939) jaoks, indutseeritav lämmastikoksiidi süntaas (iNOS) (Takara Bio Inc, kat. nr MA083369), maatriksi metalloproteinaas-(MMP-)2 (Takara Bio Inc., kat. nr MA127110), MMP-9(Takara Bio Inc. ., kataloogi nr MA031311), ja18S ribosomaalne RNA(18S) (Takara Bio Inc., kat. nr MA050364) olid kaubanduslikult saadaval. Iga proov normaliseeriti 18S mRNA ekspressiooni väärtustele (AACT meetod) [27].

2.4. Lämmastikoksiidi analüüs.

Üksikud rakukultuuri supernatandid koguti ja tsentrifuugiti 10 minutit kiirusel 14, 000rpm 4 kraadi juures. Seejärel kasutati supernatanti lämmastikoksiidi (NO) testis. NO test viidi läbi nii, nagu on kirjeldatud kaubanduslikult saadavates komplektides (BioAssay Systems, kat. nr D2NO-100). BioAssay Systems'i QuantiChrom lämmastikoksiidi analüüsikomplekt on kolorimeetriline test NO tootmise määramiseks pärast nitraadi redutseerimist nitritiks, kasutades täiustatud Griessi meetodit.

2.5. Western Blotting.

Täisrakuvalgud ekstraheeriti makrofaagidest, kasutades lüüsipuhvrit (Cell Signaling, kat. nr 9803). Iga proov kanti 10% SDS-PAGE-sse ja kanti üle polüvinülideenfluoriidmembraanile, immunoblotitud primaarsete antikehadega (rakuvälise signaaliga reguleeritud kinaasi (p-ERK) fosforüülimine; Cell Signaling, kat. nr 9101, rakkude fosforüülimine c-Jun N-terminaalne kinaas (p-JINK); Cell Signaling, kat. nr 9251, urokinaasi plasminogeeni aktivaator (uPA); Abcam, kat.nr.

ab20789, urokinaasi plasminogeeni aktivaator ja retseptor (uPAR); R&D, kataloogi nr AF534 ja -aktiin; Sigma kass. nr A5441)[28]. Seejärel inkubeeriti membraane sobivate sekundaarsete antikehadega ja immuunkompleksid visualiseeriti kemoluminestsentsil (Merck Millipore, kat. nr WBLUF0100, kat. nr. WBLUC0100) ja kvantifitseeriti, kasutades General Electric Imager (GE Healthcare, LAS4000 mini)[29].

2.6. Želatiini sümograafia.

Rakukultuuri supernatandid eraldati mitteredutseerivates tingimustes SDS-PAGE-ga (10 massiprotsenti), mis polümeriseeriti želatiini (0,1 massiprotsenti) juuresolekul, et hinnata MMP aktiivsust. {4}}. Geele pesti Triton X-100-ga (2,5 mahuprotsenti) 60 minutit ja destilleeritud veega kaks korda 15 minutit. Seejärel inkubeeriti geele üle öö temperatuuril 37 kraadi Cin 50 mM Tris puhvriga, mis sisaldas kaltsiumkloriidi (5 mM) pH 8,0. Pärast inkubeerimist värviti geelid Coomassie Brilliant Blue R-250-ga (Bio-Rad, kat. nr. {18}}) 30 minutit toatemperatuuril, millele järgnes värvi eemaldamine Coomassie Brilliant Blue R-250 värvieemalduslahusega (Bio-Rad, kat. nr.{22}}), kuni ilmusid selged ribad. Geeli kujutised kvantifitseeriti, kasutades General Electric Imager (GE Healthcare, LAS 4000 mini); värvimata, poolläbipaistvad lagundatud piirkonnad esindasid MMP aktiivsuse piirkondi [30].

2.7. Statistika.

Kõik statistilised analüüsid viidi läbi kasutades Sigma Plot v14.{1}}(Systat Software Inc, California, USA). Andmed on esitatud keskmisena ± keskmise standardviga. Statistilist olulisust mitme rühma vahel hinnati ühe- või kahesuunalise dispersioonanalüüsiga, millele järgnes Holm-Sidaki post hoc test või Student-Newman-Keulsi post hoc test. pväärtus<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Tulemused

3.1. Fisetiini nõrgestatud põletikulised vahendajad makrofaagides, mida stimuleeritakse LPS-iga.

Kuna aktiveeritud makrofaagid toodavad põletikueelseid tsütokiine ja põletikulisi vahendajaid, nagu NO[8], uurisime fisetiini mõju LPS-iga stimuleeritud makrofaagide põletikumediaatoritele. Esiteks, et uurida, kas fisetiinil on transkriptsioonitasemel põletikuvastane toime, määrasime põletikuliste geenide, nagu MCP-1, IL-1 ja iNOS, mRNA A ekspressioonitasemed (joonis 1(a). ). Nagu oodatud, pärssis fisetiin nende põletikuliste geenide ekspressioone annusest sõltuval viisil. Järgmiseks, et kinnitada, kas fisetiin pärsib makrofaagides põletikulist vastust, hindasime selle võimet pärssida NO tootmist LPS-iga töödeldud makrofaagides (joonis 1 (b)). Nagu oodatud, vähendas fisetiin NO tootmist annusest sõltuval viisil.

3.2. Fisetiini vähendatud mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaas LPS-iga stimuleeritud makrofaagides.

Kuna teatati, et fisetiin inhibeerib mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) radasid erinevates rakutüüpides [31, 32], uurisime fisetiini mõju MAPK-dele makrofaagides. Esiteks täheldati LPS-i poolt indutseeritud MAPK-de aktiveerimist makrofaagides (joonis 2 (a)). LPS-i p-ERK suurenemine saavutas haripunkti 15 minutit pärast stimulatsiooni, samas kui p-JNK suurenemine LPS-i poolt saavutas maksimumi 30 minutiga. Seega stimuleeriti järgmistes katsetes makrofaage LPS-iga 30 minutit. Kaastöötlemine fisetiiniga vähendas oluliselt LPS-i poolt indutseeritud p-ERK ja p-JNK võimendust (joonised 2(b) ja 2(c)).

3.3. Fisetiin vähendas uPA ja uPAR LPS-ga stimuleeritud makrofaagides.

Makrofaagide aktiveerimine on tihedalt seotud rakkude invasiivsusega. Lisaks aitavad uPA ja uPAR makrofaagides kaasa rakkude infiltratsioonile. Seega uuriti fisetiini mõju uPA ja uPAR ekspressioonile. LPS indutseeris uPA (joonis 3 (a)) ja uPAR (joonis 3 (b)) valgu rohkuse. Fisetiini kaastöötlemine vähendas uPA (joonis 3 (a)) ja uPAR suurenemist LPS-i poolt (joonis 3 (b)).

3.4. Fisetiini vähendatud MMP-2 ja MMP-9 LPS-ga stimuleeritud makrofaagides.

Lisaks uurisime fise-tina mõju MMP-dele selgitamiseks MMP-2 ja MMP-9 väljendeid, uPA/uPAR-i allavoolu vahendajaid. Seoses mRNA tasemega suurendas LPS oluliselt MMP-2 ja MMP-9 mRNA ekspressiooni võrreldes vehiikuliga töötlemisega (joonis 4(a)). Fisetiin vähendas nende LPS-i poolt indutseeritud MMP-2 või MMP9 geeniekspressioonide tugevnemist annusest sõltuval viisil (joonis 4(a)). Lisaks hinnati MMP{10}} valgu aktiivsust sümograafia abil (joonis 4(b)). MMP-9(92kDa) valgu aktiivsust suurendas LPS-i stimuleerimine, mida vähendas fisetiin (joonis 4(b)).

4. Arutelu

Leidsime fisetiini olulise toime põletiku vastu makrofaagides. Käesolev uuring näitas, et fisetiin nõrgendas LPS-i poolt makrofaagides indutseeritud põletikuliste komponentide, nagu MCP-1, IL-1, iNOS ja NO, esilekutsumist. Lisaks pärssis fisetiin MAPK aktivatsiooni ja nõrgendas LPS-i poolt indutseeritud uPA ja uPAR ekspressiooni suurenemist. Lisaks nõrgendas fisetiin MMP-2 ja MMP-9 mRNA arvukuse suurenemist ja MMP-9 aktiivsust.

Gramnegatiivsest infektsioonist põhjustatud sepsise korral peetakse LPS-i tavaliselt sepsise põhjustajaks. Paljudes uuringutes on LPS-i kasutatud nii sepsise kui ka põletiku mudelina. Lisaks kutsub krooniline põletik esile varajast vähki põletikuliste rakkude aktiveerimise ja põletikueelse vahendaja (nt iNOS) ja transkriptsioonifaktorite (nt tuuma transkriptsioonifaktori kappa B (NF-xB)) ebaõige tootmise kaudu [33]. Lisaks on teatatud ka sellest, et oksüdatiivset stressi vähendab iNOS-i ekspressiooni nõrgenemine [34]. Meie uuring näitas, et fisetiin võib olla efektiivne sepsise ja septilise šoki ennetamisel ja ravimisel, kuna see pärsib põletikueelsete geenide mRNA arvukust ja NO tootmist. Selles uuringus pärssis fisetiin NO tootmist, vähendades põletikueelse geeni (iNOS) mRNA ekspressiooni; seetõttu oli tõenäoline, et fisetiin nõrgendas oksüdatiivset stressi. Järelikult toetasid need tulemused fisetiini põletikuvastast, kasvajavastast ja antioksüdantset toimet.

Mitmed uuringud on teatanud, et LPS indutseeris MAPK-de, sealhulgas ERK ja JNK [35] fosforüülimist. Lisaks on teatatud, et fisetiin pärsib inimese emakakaela rakkude migratsiooni ja invasiooni, vähendades uPA ekspressiooni MAPK pärssimise kaudu[36]. -faagide puhul on saadaval vähe aruandeid fisetiini mõju kohta uPA ja uPAR ekspressioonile ja aktiivsusele. Meie uuring näitas esimest korda, et fisetiin pärssis LPS-i poolt indutseeritud uPA ja uPAR ekspressiooni, pärssides MAPK signaaliülekannet makrofaagides, nagu varem vähirakkudes teatatud.

MMP-d on proteaaside perekond, mille ekspressioon on seotud teatud protsessidega, nagu areng, füsioloogia ja patoloogia. Tavaliselt on MMP{0}} tunnustatud erinevate põletikuliste haiguste, nagu ateroskleroos, artriit ja süsteemne erütematoosluupus [37], marker. Lisaks oli MMP-9 tihedalt seotud rakkude migratsiooniga [38,39]. Mitmed uuringud on eriti teatanud, et MMP-2 ja MMP-9 osalevad aterogeneesis ja mängivad olulist rolli aterosklerootiliste naastude stabiliseerimisel 40-42]. Selles osas näitavad meie tulemused, et inhibiitorid MMP{8}} võib pakkuda paljutõotavat terapeutilist lähenemisviisi haavatavate naastude stabiliseerimiseks. Veelgi enam, hiljutised uuringud on näidanud, et MMP -9 liigne aktiveerimine pärsib naha haavade paranemist [43]. Seetõttu tehti ettepanek, et fisetiinil on potentsiaali ka terapeutilise lähenemisviisina naha paranemiseks. Molekulaarsete mehhanismide üksikasjade selgitamiseks on vaja tulevasi uuringuid.

Hiljutine farmaatsiatööstuse suundumus on avastada strateegiaid loodusliku taime enda arendamiseks uue ravimina. Tõepoolest, kaks hiljutist loomkatset on näidanud, et fisetiiniravi parandas LPS-i põhjustatud ägedat kopsupõletikku ja kollageenist põhjustatud artriiti |32,44. Veel üks ex vivo uuring näitas samuti, et fisetiin suutis nõrgendada LPS-i indutseeritud tsütokiinide vabanemist kroonilise obstruktiivse kopsuhaiguse või II tüüpi diabeediga patsientide leukotsüütidest[45]. Põletikuliste ja autoimmuunhaiguste leevendamiseks on välja töötatud palju immunosupressiivseid ravimeid[46-50]; sellegipoolest on enamikul ühenditel märkimisväärsed kõrvalmõjud. Kuna polüfenoole leidub tavaliselt puu- ja köögiviljades, võivad need olla ohutumad immunosupressiivsed ained [51, 52]. Puu- ja köögiviljad sisaldavad laias valikus fütokemikaale, sealhulgas seskviterpeenlaktoone, terpenoide, polüsahhariide ja fenoolseid ühendeid. Meie tulemused, mis näitavad fisetiini põletikuvastast, kasvajavastast ja antioksüdantset toimet, näitavad kindlalt, et seda saab välja töötada uue ravimina. Kuigi fisetiin on paljutõotav immunoteraapia kandidaat, tuleb fisetiini sisaldavate looduslike toodete potentsiaali teatud haiguse raviainena kliinilises keskkonnas täiendavalt kontrollida.

5. Kokkuvõtted

Käesolev uuring näitas, et fisetiin vähendas suurenemistpõletikulinegeenid (MCP-1, IL-1b ja iNOS), NO tootmist ning MAPK, uPA, uPAR ja MMP fosforüülimist, mida indutseerib LPS makrofaagides. Need tulemused näitasid, et fisetiin võib olla terapeutiline aine mitmete makrofaagidega seotud haiguste korral.