1. osa: Kvertsetiini 3-O- -D-glükuroniidi põletikuvastane, antioksüdantne, niisutav ja melanogeneesivastane toime inimese keratinotsüütides ja melanoomirakkudes NF-κB ja AP{6}} aktiveerimise kaudu
Mar 21, 2022
Lisateabe saamiseks võtke ühendusttina.xiang@wecistanche.com
Abstraktne: kvertsetiin3-O- -D-glükuroniidil (Q-3-G), kvertsetiini glükuroniidi konjugaat, on teatatudpõletikuvastaneomadused lipopolüsahhariididega stimuleeritud makrofaagides, samuti vähivastased ja antioksüdantsed omadused. Erinevalt kvertsetiinist, millel on laialdaselt kirjeldatud laia valikut farmakoloogilisi toimeid, sealhulgas nahka kaitsvat toimet, jäi Q-3-G farmakoloogiline kasu ja mehhanismid nahas välja selgitamata. See uuring keskendus Q-3-UVB-indutseeritud või H2O2-indutseeritud oksüdatiivse stressi vastu nahka kaitsvate omaduste, sealhulgas põletikuvastaste ja antioksüdantsete omaduste iseloomustamisele, hüdratatsiooniefektidele jaantimelanogeneesinimese keratinotsüüte (HaCaT) ja melanoomi (B16F10) rakke kasutades. Q-3-G vähendas põletikueelse geeni ja tsütokiini, näiteks tsüklooksügenaasi-2 (COX-2) ja tuumori nekroosifaktori (TNF) ekspressiooni HO-s või UVB- kiiritatud HaCaT rakud. Samuti näitasime, et O-3-Geksponaatidel on antioksüdantne toime, kasutades vabade radikaalide püüdmise teste, voolutsütomeetriat ja tuumafaktori erütroidi 2--ga seotud faktori 2 (Nrf2) suurenenud ekspressiooni. Q-3-G vähendas melaniini tootmist melanotsüüte stimuleeriva hormooni (-MSH) poolt indutseeritud B16F10 rakkudes. Q-3-G hüdratatsiooniefekte ja mehhanisme uuriti, hinnates niisutava faktoriga seotud geene, nagu transglutaminaas-1(TGM-1), filaggriin(FLG) ja hüaluroonhappe süntaas (HAS)-1. Lisaks suurendas Q-3-G c-Jun, Jun N-terminaalse kinaasi (JNK), mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) kinaasi 4 (MKK4) ja TAK1 fosforüülimist, mis osalevad MAPK-des/AP. -1 rada ning IkB , IkB kinaasi (IKK)- , Akt ja Src fosforüülimine, mis osalevad NF-kB rajas. Kokkuvõttes oleme näidanud, et Q-3-G avaldab NF-kB ja AP-1 kaudu inimese keratinotsüütides ja melanoomirakkudes põletikuvastaseid, antioksüdantseid, niisutavaid ja melanogeneesivastaseid omadusi.
Märksõnad: kvertsetiin 3-O- -D-glükuroniid; UV-kaitse; niisutav; antimelanogenees; AP-1; NF-kB
1. Sissejuhatus
Nahk, keha suurim organ, pakub barjääri, mis mängib olulist rolli keha kaitsmisel väliskeskkonna ja kahjulike tegurite, nagu ultraviolettkiirgus, nakkuslikud mikroobid ja kahjulikud kemikaalid, eest. See barjäär reguleerib ka keha elektrolüütide tasakaalu ja temperatuuri ning hoiab ära niiskuskadu [1,2]. Inimese nahk koosneb kolmest kihist: epidermis, pärisnahk koos lisanditega ja nahaalune kude [3]. Epidermise kiht mängib kehatemperatuuri säilitamisel olulist rolli.
Keratinotsüüdid, naha epidermises rikkalik komponent, suhtlevad teistega tihedalt desmosoomide ja tihedate ühenduste kaudu, mis võimaldavad tõhusat füüsikalis-keemilist barjääri[4]. Kuigi nahk toimib kaitsva barjäärina, mõjutab ultraviolettkiirgus (UV) märkimisväärselt enamikku rakke, sealhulgas keratinotsüütides, naha väliskihti. UV-kiirgus võib põhjustada naha vananemist, nahakahjustusi, kortse ja hüperpigmentatsiooni, mida peetakse üheks kõige tsensoorsemaks riskiteguriks [5]. UV-valgus koosneb kolmest lainepikkuse vahemikust: UVA (320-400 nm), UVB (280-320 nm) ja UVC (200-280 nm). Lisaks vesinikperoksiidile (H2O2), mis teadaolevalt soodustab oksüdatiivset stressi, võib UVB põhjustada reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tootmist ROS-i tekitavate ensüümide aktiveerimise kaudu [6]. On kirjeldatud, et ROS-i kontrollimatu akumuleerumine rakkudes, sealhulgas keratinotsüütides, põhjustab lipiidide, valkude, nukleiinhapete ja teiste intratsellulaarsete molekulide oksüdatiivseid modifikatsioone, mis põhjustavad seejärel erinevat tüüpi nahakahjustusi ja vananemisega seotud protsesse, nagu rakusurm, oksüdatiivne stress, ja põletik [7,8]. Lisaks mõjutab oksüdatiivne stressivastus teadaolevalt erinevate rakukomponentide kahjustusi [9]. Kahjustatud naharakud võivad samuti põhjustada põletikulisi reaktsioone, mille tulemuseks on krooniliselt kahjustatud nahk [10]. Üks UVB- või H2O2-vahendatud nahakahjustuste tüüp bioloogiliste protsesside kaudu on põletikuliste geenide, nagu tsüklooksügenaas-2 (COX-2) ja põletikueelsete tsütokiinide ekspressioon [11]. Seetõttu on UVB- või H2O2-vahendatud nahakahjustustega seotud haiguste ennetamiseks ja tõkestamiseks hädavajalik välja töötada ohutumad, tugevamad ja tõhusamad nahka kaitsvad toimed.
Naha niisutamisel on oluline roll ka selle normaalse funktsiooni säilitamisel. Eelkõige on sarvkihil (SC) kaitsev toime veekao vastu [12]. Sarvkihi veesisaldus osaleb naha ketenduses ja õiges küpsemises, samas kui ebapiisav vesi SC-s soodustab sarvrakkude kuhjumist ja talitlushäireid [12,13]. Keratinotsüütide diferentseerumise lõppfaasis kaovad selle plasmamembraan ja rakulised organellid ning seejärel indutseerib kaltsiumi sissevool transglutaminaasi (TGM) ristsidumiseks teiste valkudega. TGM-1 puudulikkus või kadu põhjustab rakuümbrise puuduliku ristsidumise. Lamell-ihtüoos on näide haigusest, mis on põhjustatud TGM-1 kadumisest. Veelgi enam, filagriin (FLG), moodustunud keratiini maatriks, mängib rolli SC moodustumisel, kuna see toimib karkassina, mis seob korniseeritud ümbrisvalke ja lipiide[14], katalüüsides g-glutamüüllüsiini ristsidumise reaktsioone, ATGM-e ja membraani. -seotud ensüümid, mis annavad SC-dele terviklikkuse [15]. Lisaks on hüaluroonhape (HA) loodusliku niiskusfaktori (NMF) tüüp, mis on seotud niiskuse säilitamisega nahas ja millel on selge naha vananemise profiil, see on ravimi kohaletoimetaja ja rakuvälise maatriksi oluline komponent. [16,17]. HA mängib rolli naha niiskuse suurendamisel, reguleerides hüaluroonhappe süntaasi (HAS) geene; peale selle võib retinoehape (A-vitamiin) tõhusalt reguleerida HA-d epidermises [17]. TGM-1, FLG ja HAS-12,3 on NMF-i tootmisega seotud geenid [18]. Lisaks osalevad transkriptsioonifaktorite, nagu aktivaatorvalk-1(AP-1) ja tuumafaktor (NF)-kB aktiveerimine põletikueelsete ainete tootmises, mis optimeerivad naha barjääri ja naha hüdratatsiooni. AP-1 ja NF-kB radade kaudu[19]. AP-1 raja ülesvoolu signaaliülekande ensüümid hõlmavad mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaase (MAPK-d), nagu c-Jun N-terminaalne kinaas (JNK), rakuväline signaaliga reguleeritud kinaas (ERK) ja p38, samas kui Src, Akt, IkB -kinaas (IKKo/ ) ja KBO (IkBa) kuuluvad NF-KB rajasse [20. Nahk toodab melaniini ka epidermise kihis, eriti melanotsüütides, mis on peamine melaniini allikas, mis aitavad kaasa nahavärvi ja melanogeneesi määramisele [21]. UVB-kiirgus ja melanotsüüte stimuleeriv hormoon (o-MSH) võivad stimuleerida melaniini sekretsiooni, käivitades seeläbi melanogeneesi [22. Melanogeneesi ajal aktiveerib -MSH proteiinkinaasi A (PKA), valgu mikroftalmiaga seotud transkriptsioonifaktorit (MITF) ja cAMP vastuseelemente siduvat (CREB) [23]. Melaniini üheks funktsiooniks peetakse UV-kiirguse nahakahjustuste vältimist, sealhulgas päikesevalguse käes. Vananemisest, melanotsüüte stimuleerivast hormoonist ja UV-kiirgusest tingitud melaniini liigne tootmine või melaniinisisalduse puudumine soodustab aga tedretähne, melasmi, seniilseid lentigine ja muid hüper-/hüpopigmentatsioonihäireid, millel võib olla negatiivne mõju välimusele ja nahale. tervis [24]. Seega soovitakse ka melanogeneesi kontrolli all hoida nii inimkeha tervislikku kui ka kosmeetilist välimust.
kvertsetiinon domineeriv flavonooli tüüpi flavonoid, mida leidub köögiviljades, puuviljades, jookides ja ravimtaimedes [25]. Sellest tulenevalt on kvertsetiinil põhjalikult uuritud farmakoloogilisi eeliseid, sealhulgas põletikuvastaseid, ateroskleroosivastaseid,antioksüdant, vähivastased ja nahka kaitsvad omadused ning on seotud melanogeneesiga [24,26-29]. Siiski on mitmed tundlikke ja usaldusväärseid meetodeid kasutanud tööd näidanud, et kvertsetiini ei ole plasmas tuvastatud [30-33] ja seda ei leidu peaaegu ajus [34,35]. Kvertsetiin, mis esineb tavaliselt glükosiidvormina, imendub hästi, hüdrolüüsitakse ja metaboliseerub peensooles, käärsooles, maksas ja neerudes konjugeeritud metaboliitideks [30,36-38]. Tsirkuleerivas veres tuvastatakse ainult konjugeeritud metaboliidid, nagu glükuroniid või sulfaat (vastavalt metüleeritud või metüleerimata), mitte kvertsetiinaglükoon või selle glükosiidid. 3/-metüül-kvertsetiin-3-glükuroniid, kvertsetiin-3-glükuroniid ja kvertsetiin-3'-sulfaat on tuvastatud peamiste plasmametaboliitidena pärast 1,5 tundi pärast praetud sibula tarbimist[30, 32]. Need kvertsetiini metaboliidid moodustuvad peensooles ja maksas biotransformatsiooniensüümide, sealhulgas UDP-glükuronüültransferaaside toimel II faasi metabolismi tulemusena [29,39,40]. Samuti teatati, et kvertsetiini konjugeeritud metaboliidid akumuleeruvad inimese plasmas kontsentratsioonivahemikus 10-' kuni 10- kraadi M pärast sibula perioodilist allaneelamist koos toiduga ühe nädala jooksul[41]. Kvertsetiini metaboliitide poolväärtusaeg on üsna pikk, umbes 11–28 tundi [29]. Kuna neid ühendeid on täheldatud konjugeeritud kvertsetiini metaboliitide peamiste vormidena, oleksid flavonoolide bioloogilisele aktiivsusele keskenduvad uuringud nende konjugeeritud metaboliitide abil hädavajalikud, mis ajendas meid uurima ühe konjugeeritud kvertsetiini metaboliidi bioloogilist aktiivsust. Üks levinumaid glükuroniidi metaboliite, mida leidub peamiselt plasmas ja kudedes, sealhulgas maksas, neerudes ja ajus, on kvertsetiin 3-O- -D-glükuroniid (Q-3-G) (joonis 1) [31,35,40,42,43], mis võivad erinevates mudelites tekitada sarnaseid, tugevamaid või nõrgemaid aktiivsusi võrreldes lähteühenditega. Q-3-G transporditakse sihtkudedesse plasma kaudu, et avaldada oma bioloogilist aktiivsust [39]. O-3-G on pärast kvertsetiini suukaudset manustamist osutunud ka tõhusaks metaboliidiks roti plasmas [43]. Teistes uuringutes leiti, et Q-3-G-d sisaldav metaboliit kogunes aordis pärast kvertsetiinirikka toidu manustamist ja see on identifitseeritud aktiivse toimeainena, mis on inimveres tuvastatud vahemikus 0.{48} } μM【44】. Lisaks võib Q-3-G-d leida veinis [45] ja ravimtaimedes, nagu Hypericum hirsutum, Nelumbo nucifera, Oenothera biennis ja rohelised oad [46-49].Q-3-G on kirjeldatud kui põletikuvastast komponenti LPS-stimuleeritud tingimustes ja sellel on vereplasmas antioksüdantsed omadused [50-52]. Võrreldes kvertsetiini pika kasutusajaloo ja laiaulatusliku uurimisega, tuleb Q{57}}G uuringut siiski uurida. Seetõttu valiti Q-3-G kvertsetiini metaboliitide esindajaks kvertsetiini aktiivseks in vivo mängijaks. Lisaks ei ole veel täielikult välja selgitatud Q-3-G rolli nahka kaitsvatel mõjudel. Selles uuringus, kasutades erinevaid in vitro hinnanguid, uurisime Q-3-G nahka kaitsvat toimet UVBor H2O2-indutseeritud oksüdatiivse stressi ja põletiku vastu, naha hüdratatsiooni HaCaT-s (inimese keratinotsüütide rakuliin). ja melanogeneesivastast toimet B16F10 (hiire melanoomi rakuliin) rakkudes.
2. Tulemus
2.1. Q-3-G põletikuvastane ja antioksüdantne toime UVB- või H2O2-stimuleeritud HaCaT-rakkudele
Nahakude võib UV-kiirguse mõjul kahjustada saada. UV-kiirgus aktiveerib mitmeid kahjulikke tegureid, sealhulgas oksüdatiivset stressi, apoptootilist rakusurma, põletikku ja naha vananemist. Q-3-G UV-kiirguse eest kaitsva toime määramiseks hindasime algselt, kas Q-3-G mõjutab inimese keratinotsüütide rakkude elujõulisust. Kasutades 3-(4-5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüül-243 tetrasooliumbromiidi (MTT) analüüsi, uurisime tsütotoksilisi toimeid O-3-G HaCa rakkudes. Nagu on näidatud joonisel 2a, ei mõjutanud Q-3-G kontsentratsioonil 2.5-20 uM oluliselt rakkude elujõulisust, mis näitas, et O-3-G ei näidanud tsütotoksilisust kuni 20 μM ja ei kahjustanud keratinotsüüte, naharakkude pindmist kihti. Järgmisena hindasime Q-3-G nahka kaitsvat toimet UVB-kiirgusele avatud HaCaT-rakkudes. Pärast UVB kiiritamist kiirusega 30 mJ/cm² kaitses Q-3-G kontsentratsioonist sõltuval viisil märkimisväärselt HaCaTrakke UVB-indutseeritud rakusurma eest (joonis 2b). Kooskõlas MTT testiga, kasutades HaCaT-rakkude morfoloogia jäädvustamiseks mikroskoobiga ühendatud kaamerat, kaitses Q-3-G rakusurma eest UVB-kiirgusega kiiritatud HaCaT-rakkudest kuni kontsentratsioonini 10 μM (joonis 2c). . HaCaT rakkude arv igas seisundis oli töötlemata rühmas 482, UVB 30 mJ/cm-rühmas 91, UVB 30 mJ/cm² pluss 5 μM O-3-G rühmas 276 ja UVB 30 rühmas 320 mJ/cm² pluss 10 μM Q-3-G-rühm (joonis 2d). Need tulemused kinnitasid, et Q-3-G pärsib UVB-indutseeritud HaCaT kahjustusi ja päästab nahka kaitsva toime UVB-kiirguse eest.
![i-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 μM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 μM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 μM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s or incubated with H2O2 (500 μM) with or without Q-3-G (5–10 μM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 μM) was reacted with 2,2-diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s with or without Q-3-G (5– 10 μM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted.](/Content/uploads/2022842169/2022032111072748381b7599e14e8e8a252699414e284f.png "i-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 μM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 μM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 μM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s or incubated with H2O2 (500 μM) with or without Q-3-G (5–10 μM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 μM) was reacted with 2,2-diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s with or without Q-3-G (5– 10 μM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted.")
Põletiku tekkimine ja ägenemine kehas aktiveerivad aeg-ajalt makrofaage ja vabastavad mõned tsütokiinid. Põletik on oksüdatiivse stressi tunnus. Uurisime Q-3-G põletikuvastast toimet UVB- või HO2-indutseeritud põletikule. On hästi teada, et UVB võib soodustada DNA kahjustusi ja põletikku naharakkudes 【10】. Kiiritasime HaCaT rakke UVB-ga 30 mJ/cm² ja inkubeerisime HaCaT rakke H2O2-ga (500 uM). Põletikulise ensüümi COX-2 ja põletikueelse tsütokiini TNF- mRNA ekspressiooni kontrollimiseks kasutasime reaalajas PCR-analüüsi. Nagu näitavad tulemused joonisel 2e,f, inhibeeris 10 μM O-3-G kontsentratsioon oluliselt COX-2 ja TNF- mRNA ekspressiooni. Järelikult pärssis Q-3-G HaCaT-rakkudes pärast UVB-kiirguse või H2O2-ga kokkupuudet indutseeritud põletikulisi reaktsioone.
Kasutasime 2,2'-asinobis-(3-etüülbensotiasoliin-6-sulfoonhape) (ABTS) ja 2,2-difenüül-lpikrüülhüdrasüül(DPPH) radikaali püüdmise teste – laialt kasutatavaid mudelsüsteeme uurida looduslike ühendite in vitro eemaldamisaktiivsust – hinnata Q-3-G antioksüdantset omadust erinevatel kontsentratsioonidel. HaCaT rakke töödeldi Q-3-G-ga kontsentratsioonist sõltuval viisil alates 25-40 μM DPPH juuresolekul ja tulemus näitas märkimisväärset eemaldamisaktiivsust enam kui 2,5 uM juures (joonis 2g). . ABTS-analüüs näitas märkimisväärselt ka Q-3-G mõju vabade radikaalide püüdmisele kontsentratsioonist sõltuval viisil IC50 väärtusega 1,75 µM (joonis 2h). Positiivse kontrollina näitas askorbiinhape (AA) suurimat antioksüdantset toimet nii DPPH kui ka ABTS testides. Tuumafaktori erütroidi 2-seotud faktor 2 (Nrf2), üks antioksüdantide vastuseelemendist (ARE) sõltuvatest geenidest, reguleerib kaitsvaid oksüdoreduktaase ja selle nukleofiilseid substraate, soodustades seeläbi antioksüdantsete ensüümide toimet kahjustuste eemaldamiseks ja parandamiseks. süsteemid [53]. Järgmisena uurisime Nrf2 ekspressioonitaset UVB-kiirgusega HaCaT rakkudes. Tugevdades ülaltoodud leide, suurendas O-3-G oluliselt Nrf2 ekspressioonitaset UVB kiiritamisel võrreldes kontrollrühmaga kontsentratsioonist sõltuval viisil, kuni 10 uM (joonis 2i), mis viitas sellele, et Q-3- G-l on nii keemiliselt kui ka bioloogiliselt antioksüdantne toime, millel on vabu radikaale püüdev omadus, ning suurendab vastavalt Nrf{37}}sõltuva ARE signaalide kaitsvat toimet. Lisaks teostasime UV-tingimustes ka ROS-i voolutsütomeetria, kasutades diklorodihüdrofluorestseiindiatsetaati (DCFDA). On laialdaselt teada, et antioksüdant pärsib rakulisi stressoreid, inhibeerides ROS-i tootmist [54]. Tulemused näitasid, et töötlemine Q-3-G-ga kontsentratsioonidel 5 ja 10 μM vähendas UVB-indutseeritud ROS-i taset (joonis 2j). Kokkuvõttes näitasid need andmed, et Q-3- avaldab nahka kaitsvaid omadusi, nagu põletikuvastane ja antioksüdantne toime H2O või UVB-indutseeritud oksüdatiivse stressi ja põletiku vastu HaCaT-rakkudes.
![A level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s or incubated with H2O2 (500 µM) with or without Q-3-G (5–10 µM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 µM) was reacted with 2,2- diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s with or without Q-3-G (5–10 µM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) and Q-3-G (0-10 µM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2 , DPPH, or ABTS)](/Content/uploads/2022842169/202203211108455bff4d0223ef483dbe3172e2d3349d71.png "A level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s or incubated with H2O2 (500 µM) with or without Q-3-G (5–10 µM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 µM) was reacted with 2,2- diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s with or without Q-3-G (5–10 µM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) and Q-3-G (0-10 µM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2 , DPPH, or ABTS)")
2.2. Antitimelanogeneesi toime B16F10-s ja niisutav toime Q-3-G HaCaT-rakkudes
O-3-G mõju uurimiseks melanogeneesile töödeldi melanoomirakke -MSH-ga 48 tundi, et sekreteerida melaniini B16F10 rakkudes. MTT analüüse kasutades kinnitasime esmalt, et Q-3-G ei avaldanud B16F10 rakkudes tsütotoksilisust kontsentratsioonidel kuni 20 μM 48 tunni jooksul (joonis 3a). See tulemus näitas järgmistel hindamistel, et O-3-G mõju B16F10-s ei olnud tingitud rakusurmast. Järgmisena hindasime B16F10 koos Q-3-Gand -MSH-ga 48 tundi, et määrata Q-3-G mõju melanogeneesile. Nagu on näidatud joonisel 3b, inhibeeris Q-3-G märkimisväärselt melaniini sekretsiooni. Positiivne kontrollarbutiin vähendas oluliselt ka melaniini sekretsiooni.
Naha niiskusega seotud molekul on hüaluroonhape (HA). Nagu eelnevalt mainitud, on epidermises ja pärisnahas jaotunud HA NMF, mis suurendab naha hüdratatsiooni [55]. HAS-1 transkriptsioonitaseme uurimiseks 12 tunni pärast kasutasime pöördtranskriptsiooni PCR (RT-PCR) analüüsi Q-3-G kontsentratsiooniga kuni 30 uM. HAS soodustab keskmise suurusega HA akumuleerumist keratinotsüütides [12]. Nagu on näidatud joonisel 3c, suurendas HAS-1 ekspressiooni Q-3-G-ga töötlemine kuni 10 μM. Lisaks niisutavale faktorile uurisime ka FLG ja TGM{{ ekspressiooni. 13}}. Positiivse kontrollrühmana kasutasime retinooli. FLG ja TGM-1 transkriptsioonitasemed tõusid märgatavalt pärast Q-3-G-ga töötlemist kontsentratsioonidel kuni 10 μM (joonis 3d). Need leiud viitavad sellele, et Q-3-G-l on HaCaT-rakkudes nahka niisutav toime. Lisaks, kasutades SB203580 (p38 inhibiitor), SP600125 (JNK inhibiitor), UO126 (ERK inhibiitor) ja Bay11-7082 (NF-kB inhibiitor), uurisime MAPK ja NF-kB signaaliradade osalust niisutamises. Q-3-G-ga töödeldud HaCaT-rakkude tegur. O-3-G-indutseeritud geeniekspressiooni põhjal vähenesid nii TGM-1 kui ka FLG tasemed, kui ravi JNK inhibiitoriga SP600125 (joonis 3e), mis viitab sellele, et ekspressiooni suurendamiseks on vaja JNK-d. TGM-1 ja FLG O-3-G nahka niisutava toime osas. Lisaks vähendas FLG ekspressiooni ka Bay11-7082, IKK ja IkB inhibiitor, mis viitab sellele, et Q-3-G farmatseutiline mehhanism võib samuti kuuluda NF-kB signaalirajale.
2.3. Q-3-G niisutamisega seotud signaalirajad AP-1 ja NF-kB aktiveerimise kaudu
Varasemate mRNA tulemuste põhjal oletasime, et AP-1 ja NF-kB signaalide osalus Q-3-G hüdratatsiooniefektis võib esineda ka valgu tasemetes. Western blot analüüsi abil uurisime AP-1 ja NF-kB ülesvoolu molekulide fosforüülimist. Esiteks, AP-1 rajal suurenes c-Jun fosforüülimine pärast HaCaT rakkude inkubeerimist Q-3-G-ga 24 tundi (joonis 4a). P-INK tase tõusis ka pärast töötlemist Q-3-G-ga kontsentratsioonidel 2,5, 5 ja 10 μM. JNK koguvorm jäi muutumatuks (joonis 4b). Lisaks uurisime MKK4 ja TAK-1 fosforüülimist, mis on JNK ülesvoolu regulaatorid. Nagu on näidatud joonisel 3c, reguleeriti pärast HaCaT-rakkude töötlemist O-3-G-ga üles ka p-MKK4 ja p-TAK1 valgu tase.
Lisaks NF-kB signaalimisele suurendas Q-3-G NF-kB alaühiku p50 ja p65 fosforüülimist (joonis 4c). Lisaks hindasime IKK ja IkBa aktiveerimist, mida samuti suurendas Q-3-G kuni 10 uM võrreldes kontrollrühmaga (joonis 4d). Lõpuks määrasime kindlaks NF-KB signaalirajas osalevate ülesvoolu molekulide aktiveerimise. Src ja Akt (Ser473) fosforüülimist võimendas ravi O-3-G-ga (joonis 4e). Üldiselt näitavad need andmed, et Q-3-G nahakaitseefekt on suunatud TAK1 ja Src aktiveerimisele, suurendades valgu taset, reguleerides seeläbi vastavalt AP-1 ja NF-kB aktiivsust.
2.4. Q-3-G mõju AP-1 ja NF-kB transkriptsioonilisele aktiveerimisele
Uurisime Q-3-G raku tsütotoksilisust inimese embrüonaalse neeru rakuliini HEK293T rakkudes MTT testiga (joonis 4f). HEK293T-rakkude elujõulisust ei mõjutanud oluliselt pärast töötlemist Q-3-G（2.5-20 μM）-ga võrreldes töötlemata rakkudega.
Kasutasime lutsiferaasi testi, et teha kindlaks, kas Q-3-G võib moduleerida NF-kB ja AP-1 promootori teste. Kinnitasime, et O-3-G suurendas kontsentratsioonist sõltuval viisil AP-1-vahendatud lutsiferaasi aktiivsust (joonis 4g) ja NF-kB-vahendatud lutsiferaasi aktiivsust (joonis 4h). Need tulemused kinnitavad, et AP-1 aktiveerimine ja NF-KB aktiveerimine on Q-3-G olulised farmakoloogilised sihtmärgid.
Lisateabe saamiseks klõpsake linki:https://www.xjcistanche.com/news/part-2-põletikuvastane-antioxidant-moistu-55118278.html
