Ekstratsellulaarne atsidoos piirab ühe süsiniku ainevahetust ja säilitab T-rakkude tüve

Happeliste metaboolsete jääkproduktide akumuleerumine kasvaja mikrokeskkonnas pärsib kasvajat paisuvate lümfotsüütide (TIL) efektorfunktsioone. Siiski jääb ebaselgeks, kuidas happeline keskkond mõjutab T-rakkude metabolismi ja diferentseerumist. Siin näitame, et pikaajaline kokkupuude happega programmeerib ümber T-rakkude rakusisese metabolismi ja mitokondriaalse sobivuse ning säilitab T-rakkude tüve. Mehhaaniliselt kahjustab kõrgenenud rakuväline atsidoos metioniini omastamist ja metabolismi SLC7A5 alareguleerimise kaudu, muutes seega H3K27me3 ladestumist peamiste T-rakkude tüvigeenide promootoritel. Need muutused soodustavad "tüvelaadse mälu" seisundi säilitamist ja parandavad hiirtel pikaajalist in vivo püsivust ja kasvajavastast efektiivsust. Meie leiud ei näita mitte ainult ekstratsellulaarse atsidoosi ootamatut võimet säilitada T-rakkude tüvilaadseid omadusi, vaid edendavad ka meie arusaama sellest, kuidas metioniini metabolism mõjutab T-rakkude tüve.

cistanche taime suurendav immuunsüsteem

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Kasvaja-antigeenispetsiifiliste T-rakkude ülekandmine on suur edasiminek vähiravi valdkonnas, kuna see on viinud teatud pahaloomuliste kasvajate täieliku taandumiseni. Selle terapeutiline efektiivsus sõltub suuresti ülekantud T-rakkude püsivusest ja diferentseerumisest1, 2. Vähem diferentseeritud mälu T-rakud on T-rakkude adoptiivse ülekande (ACT) eelistatud populatsioon tänu nende tüvirakkudele sarnastele iseuuenemis- ja multipotentsusomadustele3, 4. Tõepoolest, on näidatud, et tüvilaadsete mälu-T-rakkude kasutamine ACT jaoks annab parema kasvajavastase vastuse5. Võrreldes lõplikult diferentseerunud efektor-T-rakkudega, on tüvisarnastel T-rakkudel erinevad tunnused6. Nii inimese kui ka hiire tüvisarnaseid T-rakke iseloomustab nende antigeeniga kogenud ja hominguga seotud molekulide ekspressioon, sealhulgas CD62L ja CCR7 kõrge tase (viide 7). Meie arusaam transkriptsiooniprofiilidest, epigeneetilistest modifikatsioonidest ja metaboolsetest radadest, mis reguleerivad tüvisarnaseid T-rakke, on viimastel aastatel 8–10 dramaatiliselt edenenud. On teatatud, et mitmed transkriptsioonifaktorid, nagu TCF1, KLF2 ja LEF1, mängivad olulist rolli T-raku tüve juhtimisel või säilitamisel9. Nimelt on TCF1 peamine transkriptsioonifaktor, mis soodustab pikaealiste mälu T-rakkude teket11. Krooniliste infektsioonide ajal säilitab väike osa TCF1+ tüvi-tüüpi T-rakkudest T-rakkude vastuseid sekundaarse infektsiooni vastu1,12. Epigeneetilised muutused pakuvad T-rakkudele vahendit nii mälurakkude omaduste omandamise aluseks olevate transkriptsiooniliste muutuste algatamiseks kui ka nende transkriptsiooniliste ekspressioonimustrite säilitamiseks13. Mitmed uuringud on näidanud, et histooni H3 trimetüülimine K4-s (H3K4me3), aktiveerimisega seotud modifikatsioon, saavutatakse mäluga seotud geeni lookustes, sealhulgas TCF7, KLF2, LEF1, CCR7 ja SELL, naiivse CD diferentseerumise käigus.{47 }} T-rakud mälu T-rakkudeks, samas kui H3 trimetüülimine K27 juures (H3K27me3), mis on repressiivne modifikatsioon, kaob nendes lookustes13–15. Seevastu efektoriga seotud geenid (GZMB, PRF1, IFNG ja TBX21) näitavad nendes lookustes efektor-T-rakkudes 13, 16 vähenenud repressiivseid ja suurenenud aktiveerivaid epigeneetilisi modifikatsioone. Lõpuks näitavad kogunevad tõendid, et metaboolsed ahelad dikteerivad T-rakkude saatuse otsuseid ja kujundavad nende epigeneetilisi ja funktsionaalseid olekuid17. Lühiealised efektor-T-rakud on väga glükolüütilised ja sõltuvad ühe süsiniku metabolismist18, 19, samas kui tüvilaadsetel mälu-T-rakkudel on erinevad metaboolsed profiilid, mida iseloomustab suurenenud rasvhapete oksüdatsioon (FAO) ja mitokondriaalne vaba hingamisvõime (SRC), kardinal. pikaajalise püsimisega seotud omadused20–22. Seetõttu on metaboolne ümberprogrammeerimine oluline tüve tõhusaks omandamiseks ja T-rakkude pikaajaliseks ellujäämiseks.

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

Immunosupressiivne kasvaja mikrokeskkond (TME), mida iseloomustab madal pH, hüpoksia, glükoosipuudus ja piimhappe rikastamine, on peamine barjäär, mis takistab T-rakkude nõuetekohast laienemist, diferentseerumist ja funktsionaalsust23, 24. Tõepoolest, TME põhjustatud metaboolne stress kahjustab mitokondriaalset võimekust ja sobivust, käivitades intratumoraalse T-rakkude metaboolse puudulikkuse ja düsfunktsiooni 25–28. Huvitaval kombel on enamik kasvajasse infiltreeruvaid lümfotsüüte (TIL-id) düsfunktsionaalsed, kuid väikesel osal on tüvelaadsed mälu- või prekursoromadused 7, 29. See tüvetaoline TIL-i alamhulk säilitab proliferatiivse potentsiaali ja püsivuse ning on seotud soodsa vastusega immuunkontrollpunkti blokaadile (ICB) ja TIL-ACT-le vähihaigetel11,30. Varasemad uuringud on näidanud, et kõrgenenud ekstratsellulaarne atsidoos (↑[H+ ]) pärssis T-rakkude tsütolüütilist aktiivsust nii in vitro kui ka in vivo31–33. Lisaks on happelisel TME-l märkimisväärne mõju kasvajasse infiltreeruvate müeloidrakkude, nagu dendriitrakkude (DC) ja kasvajaga seotud makrofaagide (TAM) aktiivsusele ja diferentseerumisele 34–36. ↑ [H+ ] mõju T-rakkude tüvele ja metaboolsele sobivusele on aga suuresti teadmata. Siin teatame, et pikaajaline in vitro ↑[H+ ] kokkupuude hõlbustab inimese ja hiire tüvilaadsete CD8+ T-rakkude diferentseerumist terminaalsete efektor-CD8+ T-rakkude arvelt. Leidsime, et pikaajaline ↑ [H+ ]-ravi muudab T-rakkude metabolismi ja säilitab mitokondriaalse hingamisvõime. Lisaks kahjustab püsiv ↑ [H+ ] kokkupuude metioniini omastamist ja ainevahetust, mille tulemuseks on hiljem mäluga seotud geenide H3K27me3 ladestumise vähenemine, hõlbustades seeläbi "tüvelaadse mälu" seisundi säilitamist. Lõpuks näitab ↑[H+]-tingimustes kultiveeritud T-rakkude adoptiivne ülekanne tugevat kasvajavastast toimet in vivo, kooskõlas nende vähem kurnatud fenotüübiga. Seega näitab meie uuring ekstratsellulaarse atsidoosi ootamatut rolli T-rakkude tüve säilitamisel raku metabolismi ja epigeneetiliste mustrite ümberkujundamise kaudu.

Tulemused

↑[H+ ] kokkupuude soodustab CD8+ T-rakkude tüve teket

Et teha kindlaks, kas rakuväline ↑[H+ ] mõjutab tüvilaadsete T-rakkude diferentseerumist, teostasime peamiste tüvisarnaste fenotüüpide voolutsütomeetrilise analüüsi inimese T-rakkudel, mida kultiveeriti 12 päeva mõlemas kontrollsöötmes, ↑[H+] söötmes, mis sisaldas 10 mM piimhapet. (matkides laktaadi kontsentratsiooni patofüsioloogilistes olukordades23, 35) või happelist keskkonda (~pH 6,6, vesinikkloriidhappega) (joonis 1a). ↑ konditsioneeritud T-rakkudes täheldati suuremat osa tüvilaadseid CD8+ T-rakke, sealhulgas varajane mälu (CD45RO−CD27+ ) ja keskmälu (CD45RO+ CD27+ ). [H+ ] versus kontrollkeskkond (laiendatud andmed joonis 1a). Lisaks avastasime, et ↑[H+] söötmes kultiveeritud T-rakkudes oli suurem tüvisarnaste rakkude (CCR7+ CD62L+) protsent (joonis 1b). Tähelepanuväärne on see, et nii inimese kui ka hiire CD8+ T-rakkudes, mis olid kokku puutunud ↑[H+ ]-ga (joonis 1c ja tsentraalse mälu diferentseerumise võtmetegur) märkasime valgu tasemel märgatavalt suurenenud TCF1 ekspressiooni. Laiendatud andmed Joon. 1b). Lisaks oli [H+]-kontsentratsioonist sõltuv mõju CCR7 ja TCF1 ekspressioonile (laiendatud andmed, joonis 1c). Vastavalt ↑[H+] konditsioneeritud T-rakkude tüvilaadsele fenotüübile vähenes nendes rakkudes oluliselt intratsellulaarse interferooni (IFN-) ja tuumori nekroosifaktori (TNF-) tootmine (joonis 1d).

T-rakkude diferentseerumise seisundi paremaks uurimiseks viisime läbi RNA sekveneerimise (RNA-seq) analüüsi ja leidsime, et pikaajaline in vitro ↑[H+] kokkupuude andis tulemuseks selge transkriptsiooniprofiili (laiendatud andmed, joonis 1d). Kokkupuude ↑[H+]-ga põhjustas efektormolekule, nagu PRF1, GZMB ja IFNG ning kaasinhibeerivat retseptorit BTLA kodeerivate geenide ekspressiooni märkimisväärselt vähenenud (joonis 1e, f ja laiendatud andmed, joonis 1e). Seevastu ↑[H+]-kultuuritud T-rakud näitasid kõrgemat BACH2, CCR7, LEF1 ja TCF7 ekspressiooni, mis on korrelatsioonis T-rakkude tüvega (joonis 1e, f ja laiendatud andmed, joonis 1e). Geenikomplekti rikastamise analüüs (GSEA) näitas, et ↑[H+] kokkupuutest põhjustatud transkriptsioonimuster oli sarnane mälu T-rakkude omaga (joonis 1g ja laiendatud andmed, joonis 1f). Lisaks kinnitas kvantitatiivne polümeraasi ahelreaktsiooni (qPCR) analüüs BACH2, KLF2, LEF1 ja TCF7 suurenenud mRNA ekspressiooni pärast ↑[H+] töötlemist (joonis 1h). Need tähelepanekud toetavad ühiselt tõsiasja, et ↑[H+]-ravi kujundab oluliselt T-rakkude transkriptsiooniprofiile, et luua tüvi. Märkimist väärib see, et leidsime, et ↑[H+]-ravi pärssis T-rakkude proliferatsiooni ja kallutas rakutsükli jaotust G1-faasi suunas ja S-faasist eemale (täiendav joonis 1a–c). Järgmisena uurisime T-rakkude aktiveerimist ↑[H+]-ga töötlemisel TCR-i stimuleerimise ajal ja leidsime, et ↑[H+] kokkupuude ei mõjuta oluliselt T-rakkude aktivatsioonimarkerite ekspressiooni ega raku suurust (täiendav joonis 2a, b). Lisaks kinnitasime veel, et ↑[H+] kokkupuude pärast T-rakkude aktiveerimist võib siiski esile kutsuda T-rakkude tüvilaadse oleku (täiendav joonis 2c–f). Need leiud välistavad võimaluse, et ↑[H+]-ga kokku puutunud T-rakud on lihtsalt stimulatsioonile vastupidavad, mitte aga tüvilaadse oleku omaksvõtmisele.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Varasemad aruanded on näidanud, et happeline miljöö pärsib ägedalt T-rakkude tsütolüütilist aktiivsust nii in vitro kui ka in vivo 23, 31. Samuti leidsime, et lühiajaline ↑ [H+ ] kokkupuude kahjustas tsütokiinide tootmist, kuid avaldas vähe mõju tüvilaadsele fenotüübile T-rakkudes (laiendatud andmed joonised 1g–i ja täiendav joonis 3a–c). Lisaks on tsütokiinide tootmist ↑[H+] kokkupuutel pärssiv toime mööduv ja pöörduv, kuna ↑[H+] eemaldamine taastab kiiresti T-rakkude tsütokiinide tootmise (laiendatud andmed joonis 1h). Seega on T-rakkude efektorfunktsiooni pärssimine happelise miljöö poolt väga kiire, samas kui T-rakkude tüve ümberprogrammeerimine nõuab pikaajalist ↑[H+] kokkupuudet. Kuna laktaat esineb lahuses kas dissotsieerumata kujul (piimhape) või ioonsoolana (naatriumlaktaat), püüdsime järgmisena kindlaks teha, kas naatriumlaktaat avaldab samasugust mõju T-rakkude tüvele, ja leidsime, et naatriumlaktaat soodustas ka tüve tunnuseid, kuigi selle efektiivsus oli palju madalam kui piimhappega töötlemisel (10 mM) (laiendatud andmed joonised 1j, k ja täiendav joonis 4a–f). Need leiud viitavad nii ↑[H+ ] tähtsusele kui ka selle erinevusele laktaadioonidega töötlemisest CD8+ T-rakkude tüvilaadse fenotüübi esilekutsumisel.

Joonis 1|↑[H+ ] kokkupuude hõlbustab tüvilaadsete CD8+ T-rakkude diferentseerumist. a Inimese T-rakkude aktiveerimise skeem näidatud tingimustes: pH 7,4 (–↑[H+ ], kontroll), pH 6,6 (+↑[H+ ], vesinikkloriidhape) või 10 mM piimhape (+↑[H+ ]). PBMC-d, perifeerse vere mononukleaarsed rakud. b, tüüpilised CCR7 ja CD62L ekspressiooniprofiilid inimese CD8+ T-rakkudes erinevates tingimustes 12. päeval. n=3 sõltumatud proovid. c, tüüpilised histogrammid ja TCF1 ekspressiooni kvantifitseerimine inimese CD8+ T-rakkudes erinevates tingimustes 12. päeval. n=3 sõltumatud proovid. MFI, keskmine fluorestsentsi intensiivsus. d, inimese T-rakke paljundati nagu a 12 päeva ja stimuleeriti 4,5 tundi brefeldiin A-d (BFA) sisaldava forbool12-müristaat13-atsetaadiga (PMA). IFN- ja TNF-i intratsellulaarne ekspressiooniprofiil on kujutatud T-rakkude puhul pH 7,4 (vasakul), 10 mM piimhappe (keskel) või pH 6,6 (paremal) tingimustes. n=3 sõltumatut näidist. e,f, inimese T-rakkude RNA-seq analüüs, mida paisutati kontrollrühmas (pH 7,4) või piimhappes (10 mM). Valitud geenide soojuskaart (e) ja kõigi geenide vulkaanidiagramm, milles märgistati mälu, efektori ja ammendatud T-rakkudega seotud geenid (f). Vulkaani graafikul tähistab x-telg piimhappega töödeldud rakkude log2-transformeeritud kordade muutuse (FC) väärtusi võrreldes kontrollrühmaga 12. päeval ja y-telg tähistab korrigeeritud P väärtusi. n=4 sõltumatut näidist. g, GSEA graafik, mis võrdleb kontrolli piimhappega konditsioneeritud T-rakkudega efektori ja mälu rikastamise osas. NES, normaliseeritud rikastamise skoor. h, T-rakkude tüvega seotud transkriptsioonifaktorite (BACH2, KLF2, LEF1, TCF7) kvantitatiivne mRNA ekspressioon T-rakkudes näidatud tingimustel. n=3 sõltumatut näidist. Andmed on esitatud keskmisena ± sem. Statistilised analüüsid määrati paaritu kahepoolse Studenti t-testiga (b–d,h). Nominaalsed P väärtused ja valede avastamise määrad (FDR-id) arvutati GSEA tarkvara vaikemeetodiga (g).

Kõrgenenud [H+ ] vallandab metaboolse ümberprogrammeerimise

Lisaks erinevatele transkriptsiooniprogrammidele omandavad tüvirakud T-rakud eelistatavalt ka ainulaadsed metaboolsed atribuudid, sealhulgas kõrgenenud FAO ja piiratud glükolüütiline metabolism 17, 20, 37. Pikaajaliste in vitro ↑[H+ ]-ga eksponeeritud T-rakkude metaboolsete omaduste uurimiseks viisime läbi geeniontoloogia (GO) rikastamisanalüüsi ja leidsime olulisi erinevusi metaboolsete radadega seotud geenide ekspressioonis, nagu väikemolekulaarne metabolism ja glükolüüs (joonis 2a). Tõepoolest, pikaajalisel ↑[H+]-konditsioneeritud T-rakkudel ilmnes vähenenud glükolüüs ja aminohapete metabolism, erinevalt suurenenud pika ahelaga rasvhapete metabolismist (laiendatud andmed joonised 2a, b). Erinevalt pikaajalisest ↑[H+] kokkupuutest inhibeeris lühiajaline ↑[H+]-ravi ainult glükolüüsi, kuid sellel ei olnud olulist mõju FAO-le (täiendav joonis 5a). Kvantitatiivne PCR analüüs kinnitas veel, et glükolüüsi geenid SLC2A1, SLC2A3 ja LDHA olid ↑[H+]-ga eksponeeritud T-rakkudes oluliselt vähenenud (laiendatud andmed joonis 2c). Vastupidi, ↑[H+] konditsioneerimine soodustas karnitiini palmitoüültransferaasi 1 (kodeeritud CPT1A) ekspressiooni. See on kiirust piirav ensüüm, mis osaleb FAO-s (laiendatud andmed joonis 2c). ↑[H+] poolt indutseeritud metaboolsete muutuste edasiseks selgitamiseks teostasime erapooletu metaboolse analüüsi ja leidsime 285 erinevat vaheühendit T-rakkudes, mida kultiveeriti ↑[H+]-ga võrreldes kontrollidega (laiendatud andmed, joonis 2d). Täpsemalt, kokkupuude ↑[H+ ]-ga vähendas oluliselt glükolüütiliste vaheühendite ja teatud asendamatute aminohapete hulka, selle asemel et suurendada karnitiini, rasvhapete aktiveeritud vormi, mis kandub oksüdatsiooniks mitokondritesse (laiendatud andmed joonised 2e–g). Metaboolse voo analüüs [13C6]glükoosi või [13C16]palmitaadiga näitas, et ↑[H+ ] kokkupuude takistas drastiliselt [13C6]glükoosi liitumist TCA vaheühendite ja piimhappega, soodustades samal ajal [13C16]palmitaadi inkorporeerimist atsetüül-CoA-sse ja tsitraadisse, toetades notitsiooni. et ekstratsellulaarne atsidoos pärsib glükolüüsi ja suurendab FAO-d T-rakkudes (joonis 2b-e). Nendel ↑[H+] konditsioneeritud T-rakkudel oli toitainete omastamise osas piiranguid, mida tõendab [13C6]glükoosi vähenenud tarbimine ja lipiidianaloogide (BODIPY FL C16) imendumine, mis võib olla tingitud suurenenud elektrokeemilisest gradiendist. (Laiendatud andmed joonis 2h, i).

Piiratud toitainete omastamine ja rakulise ainevahetuse lüliti võivad põhjustada T-rakkude signaalivõrkude muutusi. Piimhappega töödeldud T-rakkude GO rikastamise analüüs näitas, et enamik mõjutatud geene on peamiselt seotud PI3K-AKT, mTOR ja TCR signaaliülekandega (laiendatud andmed joonis 3a). mTOR-i signaalimine mängib keskset rolli immuunsignaalide ja metaboolsete näpunäidete integreerimisel T-rakkude õigeks aktiveerimiseks ning mTOR-i signaaliülekande pärssimine kallutab rakke efektori diferentseerumise asemel mälu-CD8+ T-rakkude moodustumise suunas38–40. Meie GSEA analüüs näitas, et nii AKT-mTOR kui ka NF-KB signaaliülekande aktiivsus ↑[H+ ]-konditsioneeritud T-rakkudes vähenes võrreldes kontroll-T-rakkude omaga (joonis 2f ja laiendatud andmed, joonis 3b). Seda kinnitas veel S6 (Ser235 ja Ser236), 4EBP1 (Thr37 ja Thr46), AKT (Ser473 juures) ja NF-KB (Ser536 juures) fosforüülimise vähenemine ↑[H+]-konditsioneeritud T-rakkudes (joonis fig. 2g,h ja laiendatud andmed, joonis 3c). Teadaolevalt on mTOR mitmesuguste bioloogiliste protsesside, sealhulgas raku suuruse, energia tootmise ja valkude sünteesi oluline regulaator41. Tõepoolest, leidsime, et ↑[H+]-konditsioneeritud T-rakkude rakkude suurus oli kontroll-T-rakkude omaga võrreldes väiksem (laiendatud andmed, joonis 3d). Järgmisena hindasime bioenergiast sõltuvat valgusünteesi ↑[H+]-konditsioneeritud T-rakkudes, kasutades SCENITH-i, äsja väljatöötatud meetodit, mis kasutab valkude sünteesi tasemete näiduna puromütsiini lisamist42. Ootuspäraselt pärssis ↑[H+ ] kokkupuude energiamahukat valgusünteesi (joonis 2i), mis viitab sellele, et energia metabolism CD8+ T-rakkudes oli muutunud. Need tulemused on kooskõlas varasemate leidudega, et mTOR aktiivsuse pärssimine rapamütsiini poolt suurendas tüvega seotud transkriptsioonifaktorite ekspressiooni (laiendatud andmed, joonised 3e, f). Tulemusi kokku võttes järeldame, et pikaajaline ↑ [H+ ] kokkupuude korraldab metaboolse lüliti ja pärsib mTOR aktiivsust, hõlbustades seeläbi T-rakkude tüve omandamist ja säilitamist.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

↑[H+]-vahendatud metioniini metabolismi piiramine säilitab epigeneetilise tüve

Kogunevad tõendid viitavad sellele, et ühe süsiniku metabolism dikteerib T-rakkude saatuse otsuseid ja kujundab nende funktsionaalseid olekuid 43, 44. Meie RNA-seq analüüs näitas, et ühe süsiniku metaboolse protsessi ja metioniinitsükli allkirjade rikastumine on T-rakkudes, mis puutusid kokku pikaajalise, mitte lühiajalise ↑[H+ ]-ga, halvasti (joonis 3a, laiendatud andmed, joonis 4a, ja täiendav joonis 5b). Vastavalt sellele pärssis ↑[H+ ] kokkupuude metioniinitsükliga (MTR, AHCY ja BHMT) seotud ensüüme kodeerivate geenide ekspressiooni ning folaadi metabolismi (SHMT1 ja SHMT2) (laiendatud andmed joonis 4b). Täiendav metaboolne analüüs näitas, et piimhappes kultiveeritud T-rakkudes vähenes oluliselt metioniinitsüklis osalevate rakusiseste metaboliitide, sealhulgas metioniini, S-adenosüülmetioniini (SAM) ja S-adenosüülhomotsüsteiini (SAH) hulk, kuid tõusis seriini ja homotsüsteiini tase (Extended). Andmed Joon. 4c). [13C5]metioniini jälgimine kinnitas veelgi, et metioniini, 13C-märgistatud rakusisese SAM-i (m+5), SAH-i (m+4) ja 5'-metüültioadenosiini (MTA, m) omastamine ja intratsellulaarne arvukus +1) vähenesid märkimisväärselt ↑[H+ ]-ga eksponeeritud T-rakkudes (joonis 3b–d ja laiendatud andmed, joonis 4d). Tähelepanuväärne on, et eksogeense metioniini lisamine taastas [13C5]metioniini omastamise ja intratsellulaarse arvukuse, samuti asjakohaste vaheühendite ↑[H+]-ga eksponeeritud T-rakkudes (joonis 3c, d ja laiendatud andmed, joonis 4d), mis viitab sellele, et eksogeenne metioniin täiendamine võib taastada metioniini omastamise ja ↑[H+]-ga eksponeeritud T-rakkude metabolismi. Järgmisena uurisime, kas metioniini piiramine võib juhtida T-rakkude tüve. Leidsime, et metioniini puudus tõepoolest soodustas TCF1+ CD{8+ T-rakkude populatsiooni esilekutsumist, kuid ei mõjutanud CD62L ja CD44 ekspressiooni (laiendatud andmed joonised 4e, f). Metioniini metabolismi rolli edasiseks uurimiseks ↑[H+]-indutseeritud T-raku tüve puhul kultiveerisime T-rakke ↑[H+] söötmega, millele oli lisatud metioniini, SAM-i või SAH-i. Ekstratsellulaarse atsidoosi poolt indutseeritud T-rakkude tüve fenotüüp oli tõepoolest osaliselt keelatud metioniini või SAM-i lisamisega, kuid mitte SAH-ga (joonis 3e ja laiendatud andmed, joonised 4g-i). Intratsellulaarne metioniin muundatakse SAM-iks, oluliseks metüülrühma doonoriks DNA ja histooni metüülimisreaktsioonides (laiendatud andmed, joonis 5a). Seega iseloomustasime histooni metüülimise mustreid ja leidsime, et kõrgenenud [H+ ] vähendas oluliselt H3K27me3 kogutaset T-rakkudes, kuid sellel ei olnud olulist mõju teiste histooni metüülimise markerite ekspressioonile (joonis 3f ja laiendatud andmed, joonis 5b). Ootuspäraselt taastas metioniini lisamine T-rakkudele ↑[H+] kokkupuutel H3K27me3 ekspressiooni üldtaseme (joonis 3f). Pikaajalist ↑[H+]-ravi läbinud T-rakkudes täheldatud H3K27me3 taseme spetsiifiline vähenemine ajendas meid oletama, et ↑[H+] kokkupuude reguleerib selektiivselt H3K27me3 ladestumise suhtes spetsiifilist metüültransferaasi. Tõepoolest, me täheldasime EZH2, H3K27me3 võtmemetüültransferaasi ekspressiooni märkimisväärselt vähenenud nii mRNA kui ka valgu tasemel ↑[H+]-eksponeeritud T-rakkudes (laiendatud andmed joonised 5c, d). Lisaks suurendas EZH2 aktiivsuse pärssimine väga spetsiifilise inhibiitori GSK126 poolt TCF1 ekspressiooni ja ka CCR7+ CD62L+ CD8+ T-rakkude protsenti (laiendatud andmed joonised 5e, f) , mis oli kooskõlas eelmise aruandega, et EZH2 võib reguleerida mälu-T-rakkude potentsiaali selektiivsete epigeneetiliste modifikatsioonide kaudu45. Genoomiüleste muutuste tuvastamiseks ↑[H+ ]-indutseeritud T-raku tüve epigeneetilistes mustrites viisime läbi CUT&Tag-seq testi ja leidsime minimaalsed muutused H3K4me3 ja H3K27me3 ladestumise proportsionaalsuses erinevates töödeldud rühmades piki promootorit, geenikeha ja geenidevahelised piirkonnad (laiendatud andmed joonis 5g). Täpsemalt näitas epigenoomne profileerimine repressiivse histooni markeri H3K27me3 taseme langust mäluga seotud geeni lookustes (nt TCF7, CCR7, ID3, LEF1 ja KLF2) pikaajaliselt ↑[H+]-ga töödeldud T-rakkudes (joonis 3g). . Oluline on see, et metioniini lisamine ↑[H+ ] kokkupuute all taastas osaliselt H3K27me3 taseme ülaltoodud lookustes ja ka nende geeniekspressiooni, mis viitab metioniini olulisele rollile nende mäluga seotud geenide epigeneetilises modulatsioonis (joonis 3g ja Laiendatud andmed joonis 5h). Kooskõlas eelmise uuringuga14 omandasid efektorgeenid nagu PRF1, GZMB, IFNG, TBX21 ja NR4A2 soodsalt aktiveeriva histooni metüülimise mustri (H3K4me3hi ja H3K27me3lo) (joonis 3g). Tähelepanuväärne on, et H3K4me3 hõivatus nende efektorgeenide promootorpiirkondades oli ↑[H+] kokkupuute all kultiveeritud T-rakkudes halvenenud ja need taastati metioniini lisamisega (joonis 3g). Üldiselt näitavad need leiud, et ↑[H+]-vahendatud metioniinitsükli katkemine soodustab T-rakkude tüve epigeneetilist säilimist.

Mitmed metioniini transporterid (SLC), sealhulgas SLC7A5, SLC38A1, SLC38A2 ja SLC43A2, võivad vahendada metioniini transporti46. Uurimaks, kuidas ↑[H+] kokkupuude metioniini omastamist ja ainevahetust T-rakkudes vähendab, analüüsisime erinevate SLC-de ekspressioonimustreid ja leidsime, et ↑[H+] vähendas dramaatiliselt SLC7A5 ja SLC38A2 ekspressiooni, kuid mõjutas vähe SLC38A1 ekspressiooni (laiendatud). Andmed joonis 6a,b). Lisaks vähendas ↑[H+ ] kokkupuude MYC ekspressiooni ja aktiivsust (laiendatud andmed joonised 6c, d), mis on väidetavalt reguleerinud metioniini transporterite nagu SLC7A5 ekspressiooni (viide 47). Lisaks näitasime MYC suurt hõivatust SLC7A5 promootoril ja vähemal määral SLC38A2 promootoril (laiendatud andmed joonis 6e). Oluline on see, et pikaajaliselt ↑[H+]-ga töödeldud T-rakkudes täheldati oluliselt vähenenud MYC seondumist nende lookustega (laiendatud andmed, joonis 6e). Kooskõlas nende tähelepanekutega taastas MYC üleekspressioon märkimisväärselt SLC7A5 ja SLC38A2 ekspressiooni ↑[H+]-eksponeeritud T-rakkudes (laiendatud andmed, joonis 6f). Need tulemused toetavad MYC olulist rolli metioniini transporterite ekspressiooni vähenemisel ↑[H+] kokkupuutel. Huvitaval kombel avastasime, et metioniini lisamine võib taastada ka MYC ja SLC7A5 ekspressiooni ↑[H+]-eksponeeritud T-rakkudes (laiendatud andmed joonis 6g), mis viitab sellele, et metioniini lisamine võib taastada T-rakkude metioniini omastamise võime. metioniini transporteri SLC7A5 ekspressiooni ülesreguleerimine MYC-sõltuval viisil. Eelmine uuring on näidanud, et SLC7A5 on aktiveeritud T-rakkudes kõige rikkalikum metioniini transporter47. See koos meie varasemate leidudega viitab sellele, et SLC7A5 võib mängida olulist rolli ↑ [H+ ]-indutseeritud metioniini piirangus ja tüvetaolise oleku säilitamises. Tõepoolest, me avastasime, et SLC7A5 üleekspressioon kahjustas osaliselt ↑[H+ ]-indutseeritud tüvelaadset fenotüüpi (laiendatud andmed, joonis 6h, i), toetades veelgi metioniini transporteri SLC7A5 kaasamist ↑[H+]-indutseeritud T-raku mälus. -sarnane fenotüüp. Analüüsides erinevaid kasvajasse infiltreeruvaid CD8+ T-rakkude alampopulatsioone, leidsime nii MYC kui ka SLC7A5 vähenenud ekspressiooni mälusarnastes CD8+ TIL-ides (laiendatud andmed joonised 7a, b), mis on kooskõlas meie in vitro leidudega. Seega viitavad need leiud sellele, et MYC – SLC7A5 – metioniini telg võib potentsiaalselt aidata kaasa TIL-ide mälutaolise staatuse säilitamisele.

Joonis 2|↑[H+ ] kokkupuude käivitab metaboolse ümberprogrammeerimise ja pärsib mTOR signaali. a, GO analüüs, kasutades RNA-seq andmeid, mis näitab tüüpilisi erinevalt ekspresseeritud metaboolseid geene kontroll- ja piimhappega konditsioneeritud inimese T-rakkudes (kohandatud P väärtus < 4,23 × 10–2). b, [13C6]glükoosi või [13C16]palmitaadi märgistusmustrite skeem. c, näidatud m+3 laktaadi protsent kogu laktaadist või m+3 püruvaadi protsent kogu püruvaadist T-rakkudes. n=3 sõltumatut näidist. d, [13C6]glükoosist saadud TCA vaheühendite, nagu tsitraat (m+2), malaat (m+2) ja suktsinaat (m+2) isotopomeeri protsent. n=3 sõltumatut näidist. e, näidatud m+2 atsetüül-CoA protsent atsetüül-CoA üldsisaldusest või m+2 tsitraadi isotoobi protsent kogu tsitraadist T-rakkudes [13C16] palmitaadist. n=4 sõltumatut näidist. f, GSEA koos mTORC1 signaaliülekandega seotud geenikomplekti statistilise analüüsiga kontrollrühmas versus piimhappega konditsioneeritud (vasakul) või pH 6.{33}}konditsioneeritud (paremal) inimese T-rakkudega. g,h, Ser235 ja Ser236 (g) juures fosforüülitud S6 ja Thr37 ja Thr46 (h) juures fosforüülitud S6 voolutsütomeetriline analüüs ja kvantifitseerimine inimese CD8+ T-rakkudes näidatud tingimustel. n=3 sõltumatut näidist. I, voolutsütomeetriline analüüs ja energiamahuka valgusünteesi kvantifitseerimine kontrollides või piimhappe või pH 6.{47}}konditsioneeritud inimese T-rakkudes. n=3 sõltumatut näidist. Andmed on esitatud keskmisena ± sem. Statistilised analüüsid määrati ühepoolse Fisheri täpse testiga Benjamini–Hochbergi mitme võrdluse testiga (a) või paaritu kahepoolse Studenti t-testiga (c–e,g–i). Nominaalsed P väärtused ja FDR-id arvutati GSEA tarkvara vaikemeetodiga (f).

Joonis 3|Suurenenud [H+] muudab T-rakkude metioniini metabolismi, et säilitada epigeneetiline tüvi. GSEA graafik geenikomplektist, mis on seotud ühe süsiniku metabolismi ning tsüsteiini ja metioniini metabolismiga kontrollis versus piimhappega konditsioneeritud inimese T-rakud. b, [13C5]metioniini märgistusmustrite skeem. c, [13C5]metioniinist tuletatud rakusisese SAM-i (m+5), SAH-i (m+4) ja MTA-de (m+1) ​​protsent nende vastavatest kogumitest T-rakud, mida kasvatati kontrolltingimustes või 10 mM piimhappe või 10 mM piimhappega, millele on lisatud metioniini (10 mM + Met). n=3 sõltumatut näidist. d, [12C5]metioniini ja [13C5]metioniini suhteline arvukus T-rakkudes. e, TCF1 tüüpiline histogramm ja kvantifitseerimine inimese CD8+ T-rakkudes, mida on kultiveeritud erinevates tingimustes. n=3 sõltumatut näidist. f, metioniini lisamise mõju histooni metüülimisele inimese T-rakkudes. H3K4me3, histoon H3 trimetüülitud K4 juures; H3K79me2, H3 dimetüülitud K79 juures; H3K27me3, H3 trimetüülitud K27 juures; H3K9me2, H3 dimetüleeritud K9 juures. n=3 sõltumatut näidist. g, tüüpiliste geeni lookuste genoomi rajavaade, millel on H3K27me3 (punane, joone kohal) või H3K4me3 (sinine, joone all) piigid. CUT&Tag-seq andmed pärinevad kahest sõltumatust proovist. Andmed on esitatud keskmiste ± sem P-väärtustena ja FDR-id arvutati GSEA tarkvara vaikemeetodiga (a). Statistilised analüüsid viidi läbi kahesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil koos Tukey mitme võrdluse testiga (c–f).

Kokkupuude ↑[H+ ]-ga säilitab mitokondrite sobivuse 

Arvestades vähenenud energiamahukat valgusünteesi ↑[H+] konditsioneeritud T-rakkudes, oletasime, et pikaajaline kokkupuude ↑[H+]-ga võib põhjustada olulisi muutusi raku energeetilises metabolismis. Nii kontroll- kui ka ↑[H+]-konditsioneeritud T-rakke analüüsiti SCENITH42 abil, et arvutada glükoosist sõltuvus, mitokondriaalne sõltuvus, glükolüütiline võime ning FAO ja aminohapete oksüdatsioonivõime (joonis 4a ja laiendatud andmed, joonis 8a). Vastavalt meie metaboolika ja isotoopide jälgimise tulemustele täheldasime ↑[H+ ]-ga eksponeeritud T-rakkudes mitokondriaalse metabolismi suurenemist, samas kui glükolüüsi kiirused vähenesid (joonis 4b, c ja laiendatud andmed, joonis 8b), mis viitab rakusisese ümberprogrammeerimisele. energeetiline metabolism ↑[H+]-konditsioneeritud T-rakkudes. Merihobu analüüs näitas veel, et ↑[H+ ]-konditsioneeritud T-rakkudel oli kõrgem hapnikutarbimise kiirus (OCR), samuti SRC, mis on pikaealise mälu CD{20}} T-rakkude22 põhiomadus ja madalam rakuväline hapestumise määr ( ECAR) (joonis 4d–h ja laiendatud andmed joonised 8c–f). Kuna suurenenud mitokondriaalne mass/fusioon ja vähenenud mitokondriaalse membraani potentsiaal (Δψm) on olulised T-rakkude tüve säilitamiseks48–50, uurisime täiendavalt ↑[H+]-konditsioneeritud T-rakkude mitokondrite kogust ja kvaliteeti ning leidsime, et ↑[H+ ] ravi suurendas mitokondriaalset massi nii inimese kui ka hiire T-rakkudes (joonis 4i, j ja laiendatud andmed, joonis 8g, h), mis säilitavad ka madalama Δψm (joonis 4k ja laiendatud andmed, joonis 8i). Ultrastruktuuri analüüs elektronmikroskoopiaga (EM) näitas, et ↑[H+ ]-ga eksponeeritud T-rakkudel olid suured, tihedalt pakitud mitokondrid, mis olid tsütoplasmas hajutatud ja neil oli palju kitsaid ja kitsaid kriise võrreldes kontroll-T-rakkudega, mis on kooskõlas avaldatud tulemustega. mitokondrite morfoloogiale mälu T-rakkudes (joonis 4l,m). Kooskõlas selle leiuga täheldasime ka mitme mitokondriaalse sulandumise kriitilise regulaatori suurenenud geeniekspressiooni ↑[H+]-konditsioneeritud T-rakkudes (laiendatud andmed joonis 8j), millel on oletatavasti oluline roll mälu T-rakkude genereerimisel50. Kokkuvõttes näitavad need leiud, et ↑[H+] kokkupuude suurendab mitokondriaalset massi/fusiooni ja sobivust, et soodustada tüvilaadsete T-rakkude moodustumist.

cistanche taime suurendav immuunsüsteem

↑[H+ ] kokkupuude suurendab CD8+ T-rakkude kasvajavastast toimet 

Tüvilaadsed T-rakud soodustavad adoptiivses immunoteraapias siirdamist, laienemist ja kasvajavastast efektiivsust51. Uurimaks, kas pikaajalisel in vitro ↑[H+ ]-säilitatud CD8+ T-rakkudel on ülekandmisel suurenenud paisumine või püsivus, CD45.1+ OT-I T-rakud, mida paisutati kontroll- või ↑[ H+ ]-konditsioneeritud sööde kanti üle CD45.{13}}C57BL/6N hiired, kellel ei olnud implanteeritud kasvajat (joonis 5a). Kuigi ↑[H+] konditsioneerimisel tuvastati veidi suurenenud apoptootiliste rakkude arv (laiendatud andmed joonis 9a), oli ↑[H+] seisundis paisunud T-rakkudega üle kantud hiirte perifeerses veres oluliselt suurem T-rakkude protsent. võrreldes kontrollsöötmes (kontroll-T-rakud) paisutatutega (joonis 5b). Samamoodi tuvastati oluliselt kõrgemad T-rakkude sagedused põrnas ja lümfisõlmedes (LN-id) (laiendatud andmed joonised 9b, c). Lisaks avastasime B16-OVA kasvajaga hiirtel, kelle ↑[H+ ]-paisutatud rakud olid adoptiivselt üle kantud, oluliselt suurenenud T-rakkude akumuleerumine kasvajates, põrnas ja dreneerivates lümfisõlmedes, võrreldes hiirte omaga. saanud kontrollrakke, mis viitab sellele, et ↑[H+ ]-s säilitatud CD8+ T-rakkudel on parem püsivus (joonis 5c–e ja laiendatud andmed, joonis 9d). Kooskõlas nende leidudega suurenes mälu T-rakkude protsent märkimisväärselt nende hiirte põrnas ja LN-des, kes said ↑[H+]-konditsioneeritud T-rakke (joonis 5f ja laiendatud andmed, joonis 9e). Märkimisväärne on see, et ↑[H+]-paisutatud OT-I T-rakkudel oli kasvaja kasv oluliselt hilinenud võrreldes kontroll-T-rakkudega (joonis 5g). Järgmisena uurisime ↑[H+ ]-paisutatud CD19 kimäärse antigeeni retseptoriga modifitseeritud (CAR) T-rakkude terapeutilist efektiivsust in vivo kasvajamudeliga, milles CD19-K562 kasvajarakud süstiti subkutaanselt kasvaja külgedele. NCG hiired (joonis 5h). Leidsime, et ↑[H+ ] kokkupuude soodustas ka CAR-T rakkude tüve, kuid ei mõjutanud apoptoosi (laiendatud andmed joonis 9f), mida tõendab CCR7+ CD62L+ tüvilaadse CAR-T märkimisväärselt suurenenud protsent. rakke, aga ka TCF1 ülesreguleeritud ekspressiooni (laiendatud andmed joonised 9g, h). Lisaks oli pärast ↑[H+] konditsioneeritud T-rakkude infusiooni suurem CAR-T-rakkude akumuleerumine NCG-hiirte kasvajakohtades ja põrnades (joonis 5i). Ootuspäraselt ilmnes NCG hiirtel, kellele siirdati ↑[H+ ]-s paisutatud CAR-T-rakke, suurem implanteeritud CD19+ kasvaja kliirens võrreldes nendega, kes said paisutatud CAR-T-rakke. kontrollsöötmes (joonis 5j). Kokkuvõttes näitasid need andmed, et ↑[H+]-ravi soodustab T-rakkude in vivo püsivust ja kasvajavastast toimet.

Kokkupuude ↑[H+ ]-ga piirab T-rakkude kurnatust

Püsiva ↑[H+ ]-ga kokkupuute mõju edasiseks uurimiseks T-rakkude ammendumisele in vitro mõõtsime LAG-3 ja TIM-3 ekspressiooni ↑[H+ ]-praimitud inimese T-rakkudes, mis läbisid mitu tsüklit. edasist stimuleerimist anti-CD3 antikehadega ja konditsioneeriti kontrollsöötmes (joonis 6a). Leidsime, et nii LAG-3 kui ka TIM-3 ekspressioon vähenes ↑[H+ ]-ga eksponeeritud T-rakkudes (joonis 6b ja laiendatud andmed, joonis 10a), mis näitab, et ravi ↑[H+ ]-ga on vähenenud. T-rakkude kurnatus. Lisaks avastasime, et metioniini kõrge kontsentratsioon põhjustab inhibeerivate markerite, nagu PD-1, LAG-3 ja TIM-3, ekspressiooni suurenemist, samas kui ravi madala kontsentratsiooniga metioniini kontsentratsioon vähendas veidi nende markerite ekspressiooni (täiendav joonis 6a–c). Nimelt oli pikaajalisel in vitro ↑[H+ ]-ga kokkupuutel TIM-3+ LAG-3+ OT-I T-rakkudesse ja CD19-CAR T-rakkudesse infiltreeruvate kasvajate sagedus suuresti. vähenenud pärast adoptiivset ülekandmist (joonis 6c-e ja laiendatud andmed joonis fig 10b), mis on kooskõlas nende väiksema kurnatusega in vitro ja paranenud kasvaja kontrollivõimega in vivo. Lisaks näitasime, et pikaajalised ↑[H+]-konditsioneeritud T-rakud näitasid oluliselt vähenenud TOX-i ekspressiooni nii in vitro kui ka in vivo (joonis 6f, g ja laiendatud andmed, joonis 10c, d). Nagu eelnevalt kirjeldatud, võib ammendunud T-rakud üldiselt jagada eellasrakkudest ammendatud või lõplikult ammendatud alamhulgaks, mis on määratud TCF1 ja TIM-3 ekspressiooniga52,53. Sellisena mõõtsime TCF1 ja TIM-3 ekspressioonimustrit CD45.1+ TIL-ides ja märkasime, et TCF1−TIM-3+ lõplikult ammendunud T-rakkude sagedus oli suuresti vähenenud. oluliselt suurenenud TCF1+ TIM-3 – eellas-T-rakkude protsent ↑[H+ ] konditsioneerimise all (joonis 6h). Lisaks näitasime suurenenud LY108+ TIM-3 – eellasrakkude T-rakkude populatsiooni (laiendatud andmed, joonis 10e) ning IFN- + TNF- + T suurenenud sagedust. rakud (laiendatud andmed joonis 10f), mis toetab veelgi tõsiasja, et pikaajalised in vitro ↑[H+]-paisutatud adoptiivselt ülekantud T-rakud piiravad kurnatust ja säilitavad tüve.

Arutelu

Kasvaja-spetsiifiline ACT on paljutõotav lähenemisviis refraktaarsete kasvajatega isikute raviks, kuid terapeutilist toimet piirab suuresti TME-s esinev T-rakkude düsfunktsioon. Hiljuti on pööratud märkimisväärset tähelepanu T-rakkude eelkonditsioneerimisele koos mööduva glükoosinälgimise, glutamiinipiirangu või kõrgenenud rakuvälise kaaliumisisaldusega (↑ [K+ ]) in vitro kultiveerimise ajal, et säilitada T-rakkude tüvi ja parandada ravitulemusi54–56. Selles uuringus näitasime, et CD8+ T-rakkude kultiveerimine kõrge [H+ ] taseme juures praimimise ajal soodustas üllatavalt T-rakkude tüvirakkude omandamist ja suurendas vastupanuvõimet T-rakkude kurnatuse suhtes, parandades oluliselt T-rakkude kasvajavastast toimet. adoptiivselt ülekantud T-rakud.

Piimhappe liigset kogunemist TME-s on pikka aega peetud kasvaja immuunsüsteemi põgenemise võtmeteguriks. Näiteks on näidatud, et piimhape ja happeline TME pärsivad CD{{0}} T-rakkude tsütolüütilist aktiivsust ja tsütokiinide tootmist31–33,57. Kooskõlas nende leidudega leidsime ka, et lühiajaline kokkupuude ↑[H+]-ga in vitro oli piisav efektortsütokiinide tootmise sügavaks inhibeerimiseks, kuid see ei mõjutanud TCF1 ekspressiooni ega tüvega seotud metaboolseid omadusi. Kuid pikaajaline ↑[H+]-ravi soodustas ootamatult TCF1 ekspressiooni ja säilitas tüvilaadsete T-rakkude fenotüübi metaboolse ümberprogrammeerimise ja epigeneetilise ümberkujundamise kaudu. T-rakkude kokkupuude ↑[H+]-ga pärast nende täielikku aktiveerimist võib samuti esile kutsuda tüvetaolise fenotüübi, välistades seega võimaluse, et madala pH-ga kokku puutunud T-rakud on lihtsalt muutunud stimulatsioonile vastupidavaks, selle asemel, et omandada tüvilaadne olek. Füsioloogiline piimhappe kontsentratsioon tervete inimeste veres on umbes 1,5–3,0 mM, kuid TME-s võib see tõusta 10–40 mM35,58. Kasutades püsivat anti-CD3/CD28 stimulatsiooni mudelit, Feng et al. on hiljuti teatanud, et naatriumlaktaadi kõrge kontsentratsioon suurendab H3K27ac taset TCF7 supervõimendi lookuses histooni deatsetülaasi aktiivsuse pärssimise kaudu, mis suurendab TCF1 ekspressiooni ja soodustab CD8+ T-rakkude tüve59. Seevastu avastasime, et pikaajaline kokkupuude suhteliselt madala kontsentratsiooniga piimhappega (10 mM), kuid mitte naatriumlaktaadiga, võib metioniini metabolismi piiramise ja H3K27me3 reguleerimise kaudu kergesti vallandada T-rakkude tüvilaadse signatuuri. ladestumine tüvega seotud geeni lookustes, mis toetab selgelt selget epigeneetilist regulatsiooni naatriumlaktaadi ja piimhappe poolt. Kuid madala happesusega (pH 6,9) ravil ei ole püsiva anti-CD3/CD28 stimulatsiooni korral olulist mõju TCF1 ekspressioonile, mis viitab sellele, et CD8+ T-rakkude tüvilaadsed signatuurid on indutseeritud ↑[H+] poolt. kokkupuudet võib TCR-i stimulatsioon tühistada. TCR-i aktiveerimine võib suurendada metioniini omastamist ja ümber programmeerida metioniini metabolismi, et aidata T-rakkude aktiveerimisel 19, 60. Spekuleerisime, et TCR-i stimuleerimine võib tugevdada metioniini omastamist ↑[H+]-ga töödeldud T-rakkudes, millel oli metioniini metabolism piiratud, häirides seetõttu ↑[H+]-indutseeritud epigeneetilist tüve. Lisaks võivad T-rakud kasutada laktaadiioone rakuvälise süsinikuallikana, et hõlbustada tüve omandamist püsiva TCR-i stimulatsiooni juuresolekul või puudumisel. Metaboolne aktiivsus on tihedalt seotud T-rakkude diferentseerumisega ja teatud metaboolsed sekkumised võivad oluliselt soodustada pikaajalist mälu-T-rakkude moodustumist21, 37, 61, 62. Sellest lähtuvalt toetavad meie metaboolsed ja isotoopide jälgimise analüüsid arvamust, et pikaajaline ↑ [H+ ] kokkupuude põhjustab silmatorkavat metaboolset ümberprogrammeerimist, nagu glükoosi omastamise vähenemine ning glükolüüsi ja TCA tsükli metabolismi vähenemine. Mitmed uuringud on näidanud, et CD8+ T-mälurakud kasutavad oma energiavajaduste rahuldamiseks FAO-d, kuigi see on tõenäoliselt kohandus mäluliini diferentseerumiseks ja Cpt1 üleekspressioon soodustab T-rakkude pikaealisust21, 22, 63, 64. Kuid oma T-raku-spetsiifilise Cpt1a geneetilise deletsiooni mudelis on Raud et al. näitas hiljuti, et LC-FAO on T-rakkude aktiveerimiseks ja CD8+ T-mälurakkude moodustamiseks suures osas asendamatu65. Sellise lahknevuse selgitamine on endiselt väljakutse. Meie uuringu kontekstis oletame, et ekstratsellulaarse atsidoosi poolt põhjustatud rasvhapete metabolismi ümberprogrammeerimine on tõenäoliselt seotud mälu T-rakkude tekkega, kuigi selle hüpoteesi aluseks olev täpne mehhanism nõuab täiendavat uurimist. Lisaks leidsime, et ↑[H+] kokkupuude inhibeeris mTOR aktiivsust, mida võib indutseerida glükolüütiline inhibeerimine. Eelkõige võib mTOR-i signaaliülekande pärssimine kaasa aidata metaboolsele üleminekule glükolüüsilt mitokondriaalsele hingamisele. Tõepoolest, need ↑[H+]-laiendatud T-rakud näitasid paranenud mitokondriaalset sobivust, mida tõendab märgatavalt suurenenud SRC ja mitokondriaalne mass ning vähenenud Δψm. Neid mitokondriaalseid signatuure, mis on rikastatud tüvisarnaste T-rakkudega ja mis on seotud pikaealisuse ja parema kasvajavastase toimega in vivo, moduleerivad tihedalt mitokondriaalne sulandumine ja lõhustumise dünaamika 22, 48, 50. Mitokondriaalse sisemembraani liitvalk OPA1 mängib mälu-T-rakkude genereerimisel asendamatut rolli50. Vastavalt sellele avastasime, et rakuväline atsidoos soodustas ka OPA1 ekspressiooni T-rakkudes, mille tulemuseks oli lõpuks morfoloogia tasakaal T-rakkude sulandumise suunas. On näidatud, et paljud raku metaboliidid aitavad otseselt kaasa epigeneetilistele modifikatsioonidele. Näiteks võib ühe süsiniku metabolism genereerida histooni metüülimiseks universaalse metüüldoonori SAM-i66.

Joonis 4|Mitokondriaalne sobivus säilib T-rakkudes, mis on kokku puutunud ↑[H+]. inimese T-rakkude SCENITH-analüüs kontroll- või piimhappega konditsioneeritud T-rakkudes. Kuvatakse tüüpiline tõlke tase (anti-Puro) (n=3 sõltumatut näidist). Katkendjoon tähistab pärast töötlemist 2-desoksü-d-glükoos + oligomütsiin (2-DG+O) saadud taustataset. b, c, glükolüütilise võimekuse (b) ja mitokondriaalse sõltuvuse (c) kvantitatiivne analüüs a piires. n=3 sõltumatut näidist. Kontroll- ja piimhappega konditsioneeritud T-rakkude d–f, OCR (d) mõõdeti reaalajas põhitingimustes vastusena näidatud inhibiitoritele. FCCP, karbonüültsüaniid-p-trifluorometoksüfenüülhüdrasoon; ROT/AA, rotenoon ja antimütsiin A. Basaalse OCR (e), maksimaalse hingamise (e) ja SRC (f) tüüpiline statistiline analüüs. n=9 testid; Analüüsiti 3 sõltumatut proovi ja iga proovi mõõdeti 3 korda. g,h, kontroll- või piimhappega konditsioneeritud T-rakkude ECAR (g), mõõdetuna vastusena näidatud inhibiitoritele. Basaal-ECAR-i ja pingestatud ECAR-i (h) esinduslik statistiline analüüs. n=9 testi; Tuvastati 3 sõltumatut proovi ja iga proovi mõõdeti 3 korda. i, COXIV ja TIM23 immunoblotanalüüs inimese T-rakkudes näidatud tingimustel. Laadimiskontrollina kasutati aktiini. j,k, tüüpilised histogrammid või kontuurigraafikud ja mitokondriaalse massi (MTG) (j) ja mitokondriaalse membraanipotentsiaali (TMRM) (k) statistiline analüüs vastavalt kontroll- või piimhappe- või pH-ga 6.{30} }konditsioneeritud inimese T-rakud. n=3 sõltumatut näidist. l,m, 12 päeva jooksul kontrolltingimustes, piimhappes või pH 6,6 tingimustes kultiveeritud T-rakkude tüüpiline mitokondriaalne morfoloogia, analüüsitud EM-ga (skaala riba, 1 μM) (l). Üksikute mitokondrite pindala T-rakkudes (m), n=45 rakku. Andmed on esitatud keskmisena ± sem. Statistilised analüüsid viidi läbi paaristamata kahepoolse Studenti t-testi abil.

Joonis 5|↑[H+]-paisutatud T-rakkudel on suurenenud kasvajavastane toime. a,b, kontroll- või piimhappega paisutatud CD8+ T-rakke analüüsiti püsivuse suhtes pärast adoptiivset ülekandmist (n=6 hiirt). Värskelt isoleeritud hiire CD45.{9}} OT-I T-rakud aktiveeriti hiire IL-2 ja plaadiga seotud hiire CD3- ja hiire CD28-vastaste antikehadega 2 päeva ning hoiti seejärel söötmes koos hiire IL-2 kuni adoptiivse ülekandeni (CD3&CD28+IL-2). Loomkatse (a) skeem, samuti tüüpilised FACS-graafikud ja CD45.{23}} ja CD45.2+ T-rakud veres on näidatud punktis b. c–g, CD45.{27}} OT-I T-rakke paljundati kontroll- või piimhappesöötmes 7 päeva ja kanti üle B16-OVA-kasvajat kandvatele hiirtele ning hinnati infiltratsiooni suhet. (n=5 hiirt). Loomkatse skeem, milles kasutati B16-OVA kasvajat kandvaid hiiri (c), samuti esindavad FACS-i graafikud (vasakul) ja ülekantud CD45 arvu (paremal) statistika.1+ OT- I T-rakud kasvajas (d). sc, subkutaanne süst. Statistika CD45 protsendi kohta.1+ T-rakud (e) ja tüüpilised andmed (vasakul) ning statistika CD62L+ CD44+ CD45.1+ T-rakkude protsendi kohta (f) ) on näidatud põrnas. Kasvaja kasvukõver (g) (n=5 hiirt, 14. päev). h–j, CD19-CAR T-rakke paljundati kontroll- või piimhappesöötmes 12 päeva ja kanti üle CD19-kasvajat kandvatesse K562 üleekspresseerivatesse NCG hiirtesse ning infiltratsiooni suhe kasvajas ja põrnas oli hinnatud (n=6 hiirt). Näidatud on loomkatse skeem (h), ülekantud T-rakkude tüüpiline protsent kasvajas ja põrnas (i) ja kasvaja kasvukõverad (j) (n=6 hiirt, 10. päev). Andmed on esitatud keskmisena ± sem. Statistilised analüüsid viidi läbi paaristamata kahepoolse Studenti t-testi abil.

Joonis 6|↑[H+] kokkupuude piirab T-rakkude kurnatust. Inimese T-rakkude kroonilise stimuleerimise skeem in vitro. b, tüüpilised FACS-i graafikud LAG-3 ja TIM-3 jaoks krooniliselt stimuleeritud inimese T-rakkudes, mida kultiveeriti kontroll- või piimhappetingimustes. n=3 sõltumatut näidist. c, LAG-3 ja TIM-3 ekspressioon CD45-s.1+ TIL-id B16-OVA kasvajaga C57BL/6N hiirtelt (n=5 hiirt ). d, LAG-3, TIM-3 ja PD-1 ekspressiooni kvantifitseerimine CD45-s.1+ TIL-id B16-OVA-kasvajat kandvast C57BL/ 6N hiirt (n=5 hiirt). e, LAG-3 ja TIM-3 ekspressioon kasvajaga infiltreeruvates CD19-CAR T-rakkudes CD19-K562 kasvajaga NCG hiirtelt, määratud voolutsütomeetriaga (n=6 hiirt). f, TOX ekspressioon CD45-s.{34}} TIL-id B16-OVA kasvajaga C57BL/6N hiirtelt (n=5 hiirt). g, TOXi histogrammid ja statistiline analüüs kasvajaga infiltreeruvates CD19-CAR T-rakkudes CD19-K562 kasvajaga NCG hiirtelt (n=6 hiirt). h, vasakpoolne tüüpiline voolutsütomeetria diagramm TIM-3 ja TCF1 jaoks CD45-s.1+ B16-OVA kasvajat kandvate C57BL/6N hiirte TIL-id (n=5 hiirt) . Õige, TCF1+ TIM-3– või TCF1–TIM-3+ populatsioonide protsent. Andmed on esitatud keskmisena ± sem. Statistilised analüüsid viidi läbi paaristamata kahepoolse Studenti t-testi abil.

On teatatud, et metaboliidid, nagu S-2-hüdroksüglutaraat ja -hüdroksübutüraat, toimivad mälu-T-rakkude diferentseerumise epigeneetiliste regulaatoritena67,68. Meie tulemused näitasid, et püsiv ↑[H+]-ravi piirab metioniini omastamist ja metioniini metabolismi, vähendades rakusisese metioniini, SAM-i ja SAH-i, pärssides metioniini transporterite ekspressiooni. Need tulemused võivad osaliselt selgitada, miks T-rakud ei ole võimelised kasvajarakke konkureerima metioniini omastamisel TME69-s. Mehhaaniliselt näitasime, et ↑[H+] kokkupuude vähendas dramaatiliselt MYC ekspressiooni ja selle seondumist SLC7A5 promootoriga, mille tulemuseks on SLC7A5 ekspressiooni vähenemine ja metioniini metabolismi halvenemine T-rakkudes. Huvitaval kombel võib metioniini lisamine taastada MYC ja SLC7A5 ekspressiooni, samuti metioniinitsükli voo ↑[H+]-eksponeeritud T-rakkudes, mis viitab sellele, et metioniini omastamisvõime taastamine oli tõenäoliselt tingitud metioniini transporteri ülesreguleerimisest. SLC7A5 MYC-st sõltuval viisil. On teatatud, et mTOR aktiivsus reguleerib MYC translatsiooni70. Sellest lähtuvalt spekuleerisime, et ↑[H+]-indutseeritud MYC alareguleerimine on tõenäoliselt tingitud translatsioonilisest repressioonist mTOR-i progresseeruva inhibeerimise ja metioniini omastamise halvenemise kaudu. Sellise repressiooni võib ümber pöörata eksogeense metioniini lisamisega, kuigi täpne mehhanism vajab täiendavat uurimist. Arvatakse, et metioniinitsüklist tuletatud SAM vahendab efektor-T-rakkude diferentseerumise ajal histooni metüülimist ja epigeneetilist ümberkujundamist8, 71. Kooskõlas intratsellulaarse SAM-i vähenemisega ↑[H+]-paisutatud T-rakkudes leidsime, et H3K27me3 koguarv ja selle hõivatus T-raku tüve lookuste promootoris olid mõlemad oluliselt vähenenud. H3K27me3 ja H3K4me3 on selektiivselt modifitseeritud viisil, mis korreleerub T-rakkude14 efektor- või tüviprogrammi kesksete geenide ekspressiooniga. Tõepoolest, H3K4me3 rikastus efektorgeeni promootorites ↑[H+]-laiendatud T-rakkudes. Seega põhjustab metioniini omastamise ja metabolismi halvenemisest ↑[H+] seisundis tingitud metüüldoonori SAM-i vähenenud tasemed epigeneetilisi muutusi, mis lõppkokkuvõttes soodustavad T-rakkude diferentseerumist mälu olekusse. Huvitaval kombel ei päästa metioniini lisamine ↑[H+ ]-ekspositsioonile mitte ainult MYC ja SLC7A5 ekspressiooni ↑[H+ ]-ga eksponeeritud T-rakkudes, vaid taastab ka H3K27me3 ekspressiooni üldtaseme, toetades MYC-SLC7A5 olulist rolli. –metioniini metabolismi telg ↑[H+]-indutseeritud epigeneetilise tüve reguleerimisel. Tõepoolest, leidsime, et SLC7A5 üleekspressioon kahjustas osaliselt ↑[H+]-indutseeritud tüvetaolist fenotüüpi, toetades veelgi metioniini transporteri SLC7A5 kriitilist rolli T-raku mälutaolise fenotüübi omandamisel ↑[H+] kokkupuutel.

Ajalooliselt arvatakse, et enamik TIL-e on ammendunud pideva TCR-iga kokkupuute tõttu kasvajates, kuid paradoksaalselt säilitab T-rakkude klonotüüpide väike alamhulk transkriptsioonifaktorit TCF1 ekspresseerivates TIL-ides tüvirakkudele sarnased omadused. Meie tulemused näitasid, et ↑[H+ ] kokkupuude kompenseerib T-rakkude efektori funktsiooni ja säilitab T-rakkude tüve MYC-SLC7A5-metioniini metabolismi telje kaudu, mis annab võimaliku seletuse praegusele paradoksile, miks väike osa TIL-idest sisaldab endiselt tüvi. nagu mälu või eelkäija omadused. Tegelikult on teatatud sarnastest leidudest, mille kohaselt TME kaaliumiioonidel on kahekordne roll, mis mõjutab nii T-rakkude efektori funktsiooni kui ka tüve 56, 72, toetades veelgi TME immunosupressiivsete tegurite (nt krooniline TCR-i stimulatsioon, hüpoksia ja madal toime) keerulisi mõjusid. glükoos) T-rakkude funktsioonile ja diferentseerumisele. Lisaks on kasvajate happelised piirkonnad väga dünaamilised ja nii ruumiliselt kui ka ajaliselt reguleeritud ning ekstratsellulaarse atsidoosiga kohandatud T-rakkude sobivus jääb tõenäoliselt varju, kui nad puutuvad kokku teiste karmide TME teguritega, mis võivad mõjutada intratumoraalse T-rakkude efektori funktsiooni ja diferentseerumist. Lisaks täheldasime MYC kõrgemat ekspressiooni lõplikult ammendunud T-rakkudes (LY108−TIM-3+) kui eellasrakkudest tühjenenud T-rakkudes (LY108+ TIM-3- ), mis on kooskõlas varasemate aruannetega, et MYClo T-rakud omandavad eelistatavalt mälu saatuse73. Kooskõlas SLC7A5 ekspressiooni ja metioniini omastamisega ↑[H+ ]-ga eksponeeritud T-rakkudes vähenes SLC7A5 ekspressioon oluliselt ka kasvajate LY108+ TIM-3-eellastest ammendatud T-rakkude populatsioonis, mis viitab sellele, et MYC – SLC7A5 – metioniini reguleeriv telg võib toimida ka in vivo . Nüüd on ilmne, et vähem diferentseerunud tüvilaadsetel mälu-T-rakkudel on nende pikaajalise püsivuse ja düsfunktsiooni tekkele vastupidavuse tõttu parem kasvajavastane terapeutiline toime51, 74. Oleme siin esitanud veenvaid tõendeid selle kohta, et pikaajalised ↑[H+ ]-konditsioneeritud CD8+ T-rakud näitasid in vivo paremat püsivust ja paremat kasvajavastast võimet koos vähenenud lõplikult ammendunud T-rakkude populatsiooniga (TCF1−TIM{ {39}} ) ja suurenenud tüvilaadsete eellaste alamhulk (TCF1+ TIM-3– ) kasvajate sees. Kokkuvõtteks võib öelda, et meie käesolev uuring annab ülevaate ↑ [H+ ] kokkupuute mitmemõõtmelisest mõjust T-rakkude efektorfunktsiooni pärssimisele ja selle kokkulangevale mõjule T-rakkude tüvele.

meetodid

Hiired ja rakuliinid

Kõik loomkatsed viidi läbi Suzhou Süsteemimeditsiini Instituudi (ISM-IACUC-0151-R) institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitee (IACUC) heakskiidul ja loomi hoiti spetsiaalsetes patogeenivabades hiirte rajatistes. Hiiri peeti standardtingimustes, valguse/pimeduse tsüklitega 12-h/12-h, ​​kontrollitud temperatuur 22–24 kraadi ja õhuniiskus 60%, piiranguteta toidu ja veega. kättesaadavust ja neid kontrolliti iga päev. Kõik kasvajakoormused ei ületanud Suzhou Süsteemimeditsiini Instituudi institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitee poolt heaks kiidetud luba. CD45.{9}} Emased OT-I TCR transgeensed hiired C57BL/6N taustal majutati koos. CD45.{14}} Emased C57BL/6N hiired vanuses 6–8 nädalat osteti Vital Riverist saajatena. Emased NCG (NOD / ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22 / Gpt) hiired vanuses 6–8 nädalat osteti ettevõttelt GemPharmatech. Ühe sõltumatu in vivo katse jaoks sobitati CD45.{28}} ja CD45.2+ hiirtel (6–12 nädalat) sugu. American Type Culture Collection'i (ATCC) HEK-293T-rakke hoiti DMEM söötmes, millele oli lisatud 10% veiseloote seerumit (FBS) ja 1% penitsilliini-streptomütsiini. ATCC-st pärit hiire melanoomi rakuliin B16 transdutseeriti OVA ekspressiooniks ja hoiti DMEM söötmes, millele oli lisatud 10% FBS ja 1% penitsilliini-streptomütsiin. ATCC K562 rakud transdutseeriti inimese CD19 ekspresseerimiseks ja kultiveeriti RPMI 1640 söötmes, millele oli lisatud 10% FBS-i, 1% penitsilliini-streptomütsiini, 1% GlutaMAXi, 0,1 M HEPES-i, 1% asendamatuid aminohappeid, 1 mM naatriumpüruvaati ja 500. μM -merkaptoetanool. Kõik ülaltoodud reaktiivid osteti firmalt Gibco.

Primaarse T-rakkude eraldamine, aktiveerimine ja retroviiruse transduktsioon

Hiire CD{0}} T-lümfotsüüdid eraldati 6–12-nädalaste isaste või emaste OT-I hiirte põrnadest, kasutades CD8 naiivset T-rakkude isolatsioonikomplekti (BioLegend) ja kultiveeriti RPMI-s{{5} } sööde, millele on lisatud 10% FBS-i, 1% penitsilliini-streptomütsiini, 1% asendamatuid aminohappeid, 1% GlutaMAX-i, 1 mM naatriumpüruvaati, 0,1 M HEPES-i ja 50 µM merkaptoetanooli hiire IL-i juuresolekul -2 (20 U/ml, Peprotech). Ühes sõltumatus in vitro katses sobitati isased ja emased hiired (6–12 nädalat) soo järgi. Puhastatud rakud aktiveeriti hiire CD3 (2 ug/ml, BioLegend) ja hiire CD28 (1 ug/ml, BioLegend) antikehadega 48 tundi. Tervetelt doonoritelt saadud inimese perifeerse vere mononukleaarsed rakud (PBMC-d) osteti ettevõttest Sailybio ja neid kultiveeriti RMPI{28}} söötmes, millele oli lisatud 5% Human Serum AB (Gemini), 1% penitsilliini-streptomütsiini, 1% asendamatuid aminohappeid, 1% GlutaMAX, 1 mM naatriumpüruvaat, 0,1 M HEPES ja 50 μM -merkaptoetanool inimese IL-2 juuresolekul (100 U/ml, Peprotech). PBMC-de aktiveerimiseks 3 päeva jooksul kasutati inimese CD3 (1 ug/ml, BioLegend) ja inimese CD28 (1 ug/ml, BioLegend) monoklonaalseid antikehi. Puhastatud hiire ja inimese T-rakud aktiveeriti ja paljundati näidatud kultiveerimistingimustes: pH 7,4, pH 6,6, piimhape (Sangon) või naatriumlaktaat (Sangon). pH 6,6 või piimhappe (10 mM) söötme lisamiseks kasutati järgmisi metaboliite: metioniin 800 µM (MCE), SAM 100 µM (MCE) või SAH 100 µM (Sigma). Viiruse transduktsiooniks aktiveeriti 1 × 106 PBMC-d 24-süvendiplaatide süvendi kohta. Pärast 48-tunnist aktiveerimist asendati suurem osa söötmest kontsentreerimata retroviiruse supernatandiga, milles oli 10 ug/ml polübreeni (Santa Cruz). Pärast tsentrifuugimist 600 g juures 90 minutit temperatuuril 30 °C kultiveeriti rakke inkubaatoris 24 tundi värske söötmega. Transduktsiooni korrati 24 tundi hiljem ja viidi seejärel uuesti kultuurisöötmesse. Nakkuse efektiivsuse kvantifitseerimiseks kasutati madala afiinsusega närvi kasvufaktori retseptorit (LNGFR).

Voolutsütomeetria

Rakud värviti fluorestseeruvate antikehadega ja seejärel analüüsiti voolutsütomeetria abil. Pinnamarkeri värvimiseks värviti rakud fluorestseeruvalt konjugeeritud antikehade ja Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit (Invitrogen) FACS puhvris (fosfaatpuhverdatud soolalahus (PBS) 2% FBS-iga), seejärel fikseeriti 2% paraformaldehüüdiga (Casmart). 20 min toatemperatuuril. Fosfovalkude intratsellulaarseks värvimiseks fikseeriti eelnevalt värvitud rakud fikseerimispuhvriga (BioLegend) ja värviti seejärel fosfospetsiifiliste antikehadega permeabiliseerimispuhvris (Invitrogen). Intratsellulaarsete tsütokiinide tuvastamiseks stimuleeriti rakke forbolmüristaatatsetaadiga (PMA) Brefeldin A (BFA) (BioLegend) juuresolekul 4, 5 tundi. Seejärel fikseeriti eelnevalt värvitud rakud ja värviti tsütokiinide antikehadega permeabiliseerimispuhvris. Intratsellulaarse transkriptsioonifaktoriga värvimiseks värviti rakud pinnamarkerite tuvastamiseks eelnevalt Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit'iga ja fluorestseeruvalt konjugeeritud antikehadega FACS puhvris. Seejärel fikseeriti rakud 30 minutit jääl, kasutades FOXP3/Transcription Factor Fixation Buffer (Invitrogen) ja värviti transkriptsioonifaktori antikehadega permeabiliseerimispuhvris. Pärast värvimist resuspendeeriti rakud voolutsütomeetria jaoks FACS puhvris. Voolutsütomeetria andmed kogusid BD LSR Fortessa ja BD FACSDiva (v8.0.2) ning analüüsiti FlowJo (v10.4) tarkvaraga. Tüüpilised väravastrateegiad on esitatud laiendatud andmetel joonisel 10b.

RNA sekveneerimine

RNA-seq analüüs viidi läbi, kasutades 12-päeva laiendatud T-rakke, mida kultiveeriti näidatud tingimustes, nagu on näidatud joonisel 1a. Lühidalt, 12 päeva pärast T-rakkude laienemist ekstraheeriti kogu RNA homogeniseerimisega TRIzolis (Takara) ja külmutamisega RNaasivabades torudes vedela lämmastikuga. RNA terviklikkust hinnati seadmega Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). Teegid koostati TruSeq RNA proovide ettevalmistamise komplekti (FC-122-1001, Illumina) abil. Seejärel sekveneeriti raamatukogud Illumina NovaSeq 6000 (PE150) platvormi abil ja genereeriti ligikaudu 40 miljonit paarisotsa lugemist (Novogene). Toores lugemisloend ekstraheeriti ja seejärel normaliseeriti nende raamatukogu suuruse teguritega, kasutades DESeq2 (v1.28.1). Proovide dispersiooni stabiliseerimiseks kasutati normaliseeritud logaritmi (r-log) teisendust. Diferentsiaalselt ekspresseeritud geenide GO ja KEGG raja rikastamise analüüs viidi läbi klastriprofiiliga (v3.16.0). Väljendi soojuskaardid genereeriti R-paketiga 'pheatmap' (v1.0.12). GSEA analüüsiks kasutati GSEA v.4.0.

CUT&Tag-seq

CUT&Tag-seq viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud75, kasutades Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina (TD903, Vazyme). Lühidalt, inimese T-rakke paljundati 12 päeva kontrolltingimustes piimhappe või piimhappega 800 µM metioniiniga. Seejärel lüüsiti 1 × 105 T-rakku nukleiinmaterjalide ekstraheerimiseks ja inkubeeriti ConA helmestega toatemperatuuril 10 minutit. Rakud resuspendeeriti 50 ui antikehapuhvris, mis oli eelnevalt segatud primaarse antikehaga (anti-H3K27me3 või anti-H3K4me3) ja inkubeeriti üleöö temperatuuril 4 °C. Proove inkubeeriti sekundaarse antikehaga toatemperatuuril 30 minutit ja seejärel inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril valgu A/G-Tn5 transposaasiga, et häirida DNA fragmentatsiooni. Puhastatud DNA-d kasutati raamatukogu valmistamiseks ja sekveneeriti, kasutades Illumina Nova6000 sekvenaatorit PE150.

CUT&Tag-seq analüüs

Järjestuse lugemiskvaliteedi kontrollimiseks kasutati FastQC-d (v{{0}}.11.4) (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Kasutades trimmomaticu (v0.39) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) lõigati lugemite kvaliteet minimaalseks Phred-skooriks 20 . Kõik H3K27me3 ja H3K4me3 CUT&Tag-seqi poolt toodetud lugemised joondati hg38 inimese genoomiga, kasutades Bowtie2 (v2.2.8) (https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml) valikutega: –local– väga-sensitive-local–no-unal–no-mixed–no-discordant–phred33 -I 10 -X 700. Proovid, millel puudus spike-in DNA, normaliseeriti ChIPseqSpikeInFree meetodiga, mis on uudne normaliseerimismeetod proovide skaleerimistegurite tõhusaks määramiseks erinevates tingimustes ja ravides76. H3K27me3 puhul kutsuti piigid välja MACS2 (v2.2.6) abil (https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lesssons/05_ peak_calling_macs .html) valikutega „-g hs -f BAMPE–keep-dup all– wide–broad-cutoff 0.1”. H3K4me3 puhul kasutas tippkõne MACS2 parameetritega '-g hs -q 0.{56}}f BAMPE–keep-dup all. Tipud märgiti ChIPseekeriga (v1.22.1) (https://guangchuangyu.github.io/software/ ChIPseeker/) ja visualiseeringud loodi deepToolsi (v3.5.1) abil (https://deeptools.readthedocs.io/en /develop/) ja pyGenomeTracks (v3.7) (https://pygenometracks.readthedocs.io/en/latest/).

qRT-PCR

Kogu RNA eraldati TRIzoliga (Takara) ja pöördtranskribeeriti cDNA-ks HiScript pöördtranskriptaasiga (Vazyme) vastavalt tootja juhistele. Kvantitatiivseks reaalajas PCR-iks kasutati vastavalt tootja juhistele ABI prism 7500 reaalajas PCR-süsteemi (Thermo Fisher) ja 2×SYBR Green qPCR Master Mix (Bimake). Sisestandardina kasutati ACTB-d. MRNA suhteline ekspressioon arvutati 2-ΔΔCT meetodi abil. QPCR-i jaoks kasutatavad praimerijärjestused leiate täiendavast tabelist 1.

Western blotting

Valguekspressiooni analüüsiks koguti rakud ja pesti külma PBS-ga ning kogu valk ekstraheeriti jääl 1% SDS-i (Sangon) abil. Valgu kontsentratsiooni mõõdeti BCA valguanalüüsi komplektiga (Merck). Valguproovid eraldati SDS-PAGE geelidega ja kanti seejärel PVDF membraanidele (Millipore). Membraanid blokeeriti 5% rasvavaba piimaga PBS-is, mis sisaldas Tween20. Pärast blokeerimist inkubeeriti membraane primaarsete antikehadega üleöö temperatuuril 4 kraadi ja HRP-ga seotud sekundaarsete antikehadega 2 tundi toatemperatuuril. HRP signaal töötati välja elektrokemoluminestsentsi abil (ChemeMINI610) ja koguti Sage Capture'iga (v2.19.12). Andmete analüüs viidi läbi ImageJ (v1.8.0) tarkvara abil.

Mitokondriaalne morfoloogia analüüs

Igas {{0}}süvendiga plaadi süvendis aktiveeriti PBMC-d inimese CD3- ja CD28-vastaste antikehadega 3 päeva ja neid kultiveeriti RPMI-1640 söötmes erinevates tingimustes 12 päeva. Seejärel koguti 1 × 106 PBMC-d ja fikseeriti eeljahutatud fikseerimispuhvris (2,5% glutaaraldehüüd, 0,1 M fosfaatpuhver (PB), pH 7,4) üleöö temperatuuril 4 °C. Pärast kolm korda PBS-iga pesemist fikseeriti rakud 2 tundi 1% osmiumtetroksiidis PBS-is, dehüdreeriti ja sisestati standardprotseduuri kohaselt Spurri vaiku. Üliõhukesed lõigud värviti uranüülatsetaadi ja pliitsitraadiga. Mitokondriaalne morfoloogia pildistati Hitachi HT-7800 transmissioonielektronmikroskoopia (TEM) (v01.20) ja AMT-XR81DIR kaameraga.

Antikehad ja reaktiivid

Voolutsütomeetriliseks analüüsiks kasutatud antikehad olid järgmised. APC inimesevastane NGFR (kat. nr 345108, 1:1, 000 FACS jaoks), FITC inimesevastane CD4 (kat. nr 357406, 1:200 FACS jaoks), Pacific Blue inimesevastane CD8 (kat. nr 300928, 1:200 FACS jaoks), APC-Cy7 inimese/hiire vastane CD44 (kat. nr 103028, 1:200 FACS jaoks), PE inimese-vastane CCR7 (kat. nr 353204, 1 :200 FACS jaoks), PE inimesevastane TNF- (kat. nr 502909, 1:200 FACS jaoks), PE-Cy7 inimesevastane CD45RO (kat. nr 304230, 1:200 FACS jaoks), APC anti- inimese IFN- (kat. nr 502512, 1:200 FACS jaoks), PE-Cy7 inimese vastane LAG-3 (kat. nr 369310, 1:200 FACS jaoks), PE inimese vastane TIM{{ 52}} (kat. nr 345006, 1:200 FACS jaoks), BV711 inimese vastane PD-1 (kat. nr 329928, 1:200 FACS jaoks), Percp-Cy5.5 inimesevastane CD62L (kat. nr 304824, 1:200 FACS jaoks), APC inimesevastane CD27 (kat. nr 302810, 1:200 FACS jaoks), BV711 hiirevastane CD8 (kat. nr 100748, 1:200 FACS jaoks) ), PE-Cy7 hiirevastane CD62L (kat. nr 104418, 1:200 FACS jaoks), APC-Cy7 hiirevastane CD45.2 (kat. nr 830789, 1:200 FACS jaoks), Pacific Blue anti- hiire CD45.1 (kat. nr 110722, 1:200 FACS jaoks), APC hiirevastane Ly108 (kat. ei. 134610, 1:200 FACS jaoks), PE hiirevastane LAG-3 (kat. nr 125207, 1:200 FACS jaoks), Alexa Fluor 488 anti-c-MYC antikeha (kat. nr 626811, 1 :200 FACS jaoks), PE hiirevastane TNF- (kat. nr 506306, 1:200 FACS jaoks) ja APC hiirevastane IFN- (kat. nr 505810, 1:200 FACS jaoks) osteti ettevõttelt BioLegend . Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit, PerCP-eFluor710 hiirevastane PD-1 (kat. nr 46-9981-82, 1:200 FACS jaoks), PE phosphor-S6 (Ser235/236) (kat. . nr 12-9007-42, 1:200 FACS-i jaoks), PE anti-inimese/hiire TOX (kat.nr 12-6502-82, 1:200 FACS-i jaoks) ja PE-Cy7 hiirevastane TIM{ {149}} (kat. nr 25-5870-82, 1:200 FACS jaoks) osteti firmalt Thermo Fisher. Alexa Fluor 647 anti-TCF1 (kat. nr 6709, 1:200 FACS jaoks) ja fosfor-4E-BP1 (Thr37/46) (kat. nr 2846, 1:200 FACS jaoks) osteti Rakkude signaalimise tehnoloogia. Alexa Fluor 647 anti-puromütsiin (kat. nr MABE343-AF647, 1:800 FACS jaoks) osteti Merckist. Western blot'i jaoks kasutatud antikehad olid järgmised. Küüliku anti-fosfo-Akt (Ser473) (kat. nr 4060, 1:1, 000 IB jaoks), anti-fosfo-NF-κB p65 (Ser536) (kat. nr 3033, 1:1 ,000 IB jaoks), anti-c-MYC (kat. nr 18583, 1:1, 000 IB jaoks), anti-EZH2 (kat. nr 5246, 1:1,{ {200}} IB jaoks), anti-tri-metüülhistoon H3 (Lys27) (kat. nr 9733, 1:1, 000 IB jaoks), anti-tri-metüülhistoon H3 (Lys4) (kat. nr 9751, 1:1, 000 IB jaoks), anti-dimetüülhistoon H3 (Lys9) (kat. nr 4658, 1:1, 000 IB jaoks) , anti-di-metüül-histoon H3 (Lys79) (kat. nr 5427, 1:1, 000 IB jaoks), anti-histoon H3 (kat. nr 9715, 1:1, {{242 }} IB jaoks), COXIV-vastane (kat. nr 850, 1:1, 000 IB jaoks), küülikuvastane IgG (HRP-ga seotud) (kat. nr 7074, 1:2,{ {253}} IB jaoks) ja hiirevastane IgG (HRP-seotud) (kat. nr 7076, 1:2, 000 IB jaoks) osteti ettevõttelt Cell Signaling Technology. Hiire anti-Tim23 (kat. nr 611223, 1:1, 000 IB jaoks) pärines ettevõttest BD Biosciences. Hiire anti- -aktiin (kat. nr 66009-1-Ig, 1:5,000 IB jaoks), anti-SLC7A5 (kat. nr 67951-1-Ig, 1: 1, 000 IB jaoks) ja küüliku anti-SLC38A1 (kat. nr 12039-1-AP, 1:1, 000 IB jaoks) olid firmalt Proteintech. Küüliku anti-SLC38A2 (kat. nr BMP081, 1:1, 000 IB jaoks) osteti ettevõttest Medical & Biological Laboratories.

T-rakkude metaboolne test

BODIPY FL C16 omastamise kontrollimiseks kontroll- või ↑[H+]-ga töödeldud T-rakkudes kultiveeriti T-rakke värskelt lahustatud 1 μM BODIPY FL C16-ga (Invitrogen) 1 tund, seejärel pesti kaks korda enne pinna värvimist PBS-iga. Metaboolse sõltuvuse edasiseks uurimiseks erinevates ravirühmades viidi läbi katsed, kasutades SCENITH-meetodit (ühe raku energeetiline metabolism translatsiooni inhibeerimise profiiliga)42. Lühidalt, T-rakud külvati 96-süvendiga plaatidele tihedusega 1 × 106 rakku/ml. Seejärel töödeldi rakke kontroll- (Ctrl), 2-desoksü-d-glükoosi (lõppkontsentratsioon 100 mM), oligomütsiini (lõppkontsentratsioon 5 μM) või inhibiitorite seguga lõppkontsentratsiooniga 40 minutit 37 °C juures. kraadi . Puromütsiini (lõppkontsentratsioon 10 ug/ml) lisati viimase 30 minuti jooksul. Pärast puromütsiiniga töötlemist pesti rakke külma PBS-ga ja värviti eelnevalt Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit ja pinnamarkerite vastaste antikehadega. Intratsellulaarse puromütsiini värvimisele järgnes intratsellulaarsete transkriptsioonifaktorite värvimisprotsess.

Metaboolne analüüs LC-MS/MS-ga

Metaboolne analüüs ja proovide kogumine viidi läbi nagu eelmistes aruannetes77. Lühidalt, PBMC-d aktiveeriti individuaalselt 24-süvendiplaatidel inimese anti-CD3/CD28 abil 3 päeva ja neid kultiveeriti RPMI 1640 söötmes kontroll- või piimhappega kuni 12. päevani. Seejärel 8 × 106 rakku proovi kohta (n=4 sõltumatut proovi rühma kohta) koguti ja viidi 15-ml katsutisse tsentrifuugimiseks 300 g juures 5 minutit 4 kraadi juures ja seejärel pestakse külma PBS-ga. Pärast 5-minutilist tsentrifuugimist 300 g juures lisati 80% külma metanooli ja segati intensiivselt, et rakusade täielikult lõhkuda, ning seejärel viidi rakud -80 kraadi sügavkülma. Proove tsentrifuugiti 12, 000 g juures 10 minutit 4 kraadi juures. Supernatant koguti. Lõpuks ekstraktid lüofiliseeriti ja analüüsiti UHPLC-MS/MS-ga Novogene'is. UHPLC-MS/MS-ga genereeritud algandmefaile töödeldi Compound Discovereri (v3.1, Thermo Fisher) abil, et teostada iga metaboliidi piikide joondamine, piikide valimine ja kvantifitseerimine. Edasiseks andmeanalüüsiks kasutati tarkvara Metaboanalyst (v5.0) ja seejärel valiti oluliselt rikastatud rajad, kasutades P <0,05.

Stabiilse isotoobi märgistamise katsed

13C metaboolne voog viidi läbi T-rakkudega, kasutades eelnevalt kirjeldatud meetodeid60,78,79. Lühidalt, PBMC-d aktiveeriti süvendi kohta 24-süvendiplaatidel inimese anti-CD3/CD28-ga 3 päeva jooksul, nagu ülalpool kirjeldatud. [13C6] glükoosi jälgimiseks lülitati sööde 11 päeva pärast üle glükoosivabale RPMI-le (Gibco), millele oli lisatud 10% dialüüsitud FBS-i (Thermo Fisher Scientific), 1% penitsilliini-streptomütsiini, 1% asendamatuid aminohappeid, 50 μM. - merkaptoetanool ja 0,1 M HEPES, mis sisaldab 11 mM [13C6]glükoosi (Cambridge Isotope Laboratories) koos kontroll- või 10 mM piimhappega, 24 tundi. [13C16]palmitaadi jälgimiseks aktiveeriti 2 × 107 T-rakku ja pandi 12. päeval lõpetatud söötmesse kontroll- või 10 mM piimhappetingimustega, mis sisaldas 200 µM [13C16]palmitaadi (Cambridge Isotope Laboratories) 8. h. [13C5]metioniini jälgimiseks paljundati T-rakke kontrolli all, piimhappe või piimhappega 800 µM metioniini tingimustes 12 päeva. Seejärel lülitati 4 × 107 T-rakku metioniinivabale täielikule RPMI söötmele (Gibco) ja kultiveeriti kontrolltingimustes, piimhappes või piimhappes, millele oli lisatud metioniini (sisaldab 100 μM, 100 μM või 800 μM [13C5] metioniini) (Cambridge Isotope Laboratories), 8 tundi. Vastavad supernatandid koguti ja säilitati seejärel -80 kraadi juures. Rakud sadestati tsentrifuugimisega (300 g, 4 kraadi, 5 min), pesti kaks korda soolalahusega ja kiirkülmutati kohe vedelas lämmastikus ja säilitati temperatuuril -80 kraadi. Metaboliidid ekstraheeriti jääkülma HPLC-puhtusastmega 80% metanooliga ja segati lühiajaliselt keerisega, millele järgnes 200 ml HPLC-puhta vee ja seejärel 500 ml HPLC-puhta kloroformi lisamine (metanool:vesi:kloroformi suhe, 5:2:5). ). Segu segati vorteksiga ja tsentrifuugiti faaside eraldumise saavutamiseks. Supernatandid kuivatati järgnevaks derivatiseerimiseks vaakumtsentrifuugimisega ja inkubeeriti seejärel 2% (mass/maht) metoksüamiinvesinikkloriidiga (226904, Sigma-Aldrich) püridiinis 60 minutit 37 kraadi juures ja silüüliti N-metüül-N-( tert-butüüldimetüülsilüül) trifluoroatseetamiid 1% tert-butüüldimetüülklorosilaaniga (TBDMS, 18162-48-6, Regis Technologies) 30 minutit 45 kraadi juures. [13C6] glükoosi derivaate analüüsiti GC-HRMS, Trace 1310 gaasikromatograafi (Thermo Fisher) DB-35MS kolonniga (Agilent Technologies) ja Q Exactive GC Orbitrap GC-MS/MS süsteemiga (Thermo Fisher). GC-MS/MS metaboolsed testid viidi läbi Metabo-Profile'i abil. Metaboliidid tuvastati ja kvantifitseeriti Xcaliburi (v4.1) ja TraceFinderi (v5.1) (Thermo Fisher) abil, sealhulgas retentsiooniaeg, ioonifragmentide laengu ja massi suhe ning piigi intensiivsus. [13C16]palmitaadi ja [13C5]metioniini derivaate analüüsiti ülikõrgsurvevedelikkromatograafia – kolmekordse kvadrupoolse massispektromeetriga (UPLC-TQMS). UPLC-TQMS-i algandmeid analüüsiti, kasutades Watersi MassLynxi tarkvara (v4.1, Waters), et ekstraheerida, integreerida, tuvastada ja kvantifitseerida metaboliitide piigid. Järgneva statistilise analüüsi jaoks kasutati R-keelt (v4.1.1).

B16 kasvaja mudel ja adoptiivne rakuülekande immunoteraapia

T-rakkude kasvajavastase toime uurimiseks in vivo süstiti emastele C57BL/6N hiirtele subkutaanselt 0,2 × 106 B16-OVA melanoomirakke. Üheksa päeva pärast kasvaja implanteerimist süstiti hiirtele intravenoosselt 5 × 106 T-rakku emastelt OT-I hiirtelt, mida paisutati 7 päeva erinevates tingimustes. Kasvajat kandvad hiired said enne ACT-d 5 Gy subletaalset kiiritust. Kasvaja pindala mõõdeti iga 2 päeva järel ja arvutati pikkusena (mm) × laiuse (mm). Hiired, kelle kasvaja pindala lähenes 300 mm2, tapeti. Laienenud T-rakkude püsivuse uurimiseks erinevates tingimustes viidi 4 × 106 CD45.{19}} Emaste OT-I hiirte T-rakud kanti adoptiivselt emastele C57BL/6N hiirtele. Nädal hiljem hiired surmati ning isoleeritud vere, põrna ja lümfisõlmede rakud loendati. Ülekantud T-rakkude osakaal määrati CD45.1+ ja CD45.2+ ekspresseerivate T-rakkude väravaga voolutsütomeetria abil.

NCG hiirte mudel ja CD{0}}CAR-T ravi

Emastele NCG hiirtele implanteeriti subkutaanselt 1 × 106 CD19-K562 rakku. Kui kasvaja maht jõudis 75 mm3-ni, said hiired 5 × 106 transdutseerimata T-rakku ja CD19-CAR T-rakku, mida kultiveeriti kontroll- või 10 mM piimhapet sisaldavas söötmes. Kasvaja kasvu mõõdeti iga 2 päeva järel elektrooniliste nihikutega ja arvutati pikkuse (mm) × laiuse (mm) järgi. Hiired, kelle kasvaja pindala oli suurem kui 300 mm2, tapeti. Kasvajad koguti, seediti ja töödeldi Percolliga (Sigma) ning seejärel määrati T-rakkude funktsioon ja fenotüüp voolutsütomeetria abil.

Baashapniku tarbimise määra ja rakuvälise hapestumise määra analüüs

Metaboolsete omaduste analüüsimiseks hinnati OCR-i ja ECAR-i merihobu XF24 analüsaatoriga (Agilent). Lühidalt, 12 päeva erinevatel tingimustel kultiveeritud inimese T-rakke töödeldi eelnevalt puhverdamata XF söötmega (puhverdamata RPMI 1640, mis sisaldas 10 mM glükoosi, 1 mM naatriumpüruvaati ja 2 mM glutamiini). . Järgmisena külvati inimese T-rakud XF24 rakukultuuri mikroplaadi süvendi kohta 0,5 × 106 rakku ja inkubeeriti mitte-CO2 inkubaatoris 1 tund 37 kraadi juures. Rakkude kleepumise suurendamiseks tsentrifuugiti plaate toatemperatuuril 5 minutit 100 g juures nullpiduriga. Hapnikutarbimist ja rakuvälist hapestumist analüüsiti põhitingimustes ning vastuseks 1,25 µM oligomütsiini, 50 mM 2-deoksü-d-glükoosi, 1,5 µM FCCP, 0,5 µM rotenooni ja 0,5 µM antimütsiini A subtrakti abil. basaal OCR maksimaalsest OCR-ist.

ChIP-qPCR

Kromatiini immunosadestamine (ChIP) viidi läbi vastavalt tootja juhistele, mis olid kaasas ChIP-IT ekspress-ensümaatilise lõikamiskomplektiga (Active Motif). Lühidalt, 15 miljonit inimese T-rakku, mida kasvatati kontroll- või 10 mM piimhappe tingimustes, fikseeriti formaldehüüdiga 10 minutit toatemperatuuril ja fikseerimisreaktsioon peatati 1 × glütsiini lisamisega. Fikseeritud rakud sadestati PMSF-i ja valgu inhibeerimise kokteiliga ning säilitati enne rakkude lüüsimist temperatuuril –80 kraadi. Seejärel resuspendeeriti sulatatud pellet 1 ml jääkülmas lüüsipuhvris PMSF-i ja valgu inhibeerimiskokteiliga jääl 30 minutiks tuumamaterjali saamiseks. Tuumapellet resuspendeeriti ja digereeriti ensümaatilise kokteiliga, et nihutada kromatiini 15 minutit temperatuuril 37 kraadi. Lõigatud kromatiini inkubeeriti proteiin G magnethelmestega koos anti-c-MYC (CST, kat. nr 18583, 1:100 ChIP jaoks) ja anti-IgG (CST, kat. nr 2729, 1:100 ChIP jaoks) 4 kraadi öösel. Seejärel pesti magnethelmeid neli korda ChIP puhvriga ja elueeriti 50 ul elueerimispuhvriga. Elueeritud DNA-d ristsillati 2,5 tundi 65 kraadi juures ja seejärel puhastati fenool-kloroformi ekstraheerimisega. Puhastatud DNA-d kasutati ChIP-qPCR läbiviimiseks, et tuvastada MYC rikastumine sihtgeenide promootorites. ChIP-qPCR jaoks kasutatud praimerid leiate täiendavast tabelist 2.

Mitokondriaalse massi ja membraanipotentsiaali analüüs

Mitokondriaalset massi ja membraanipotentsiaali analüüsiti MitoTracker Greeni ja tetrametürodamiinmetüülestri (TMRM) abil. Rakud värviti 250 nM MitoTracker Greeniga (Thermo Fisher) või 50 nM TMRM-iga (Thermo Fisher) inkubaatoris temperatuuril 37 kraadi (5% CO2) 1 tund enne rakupinna värvimist. Rakke pesti kolm korda FACS puhvriga, millele järgnes pinnamarkerite värvimine edasiseks FACS analüüsiks.

Statistiline analüüs

Statistiline analüüs viidi läbi, kasutades GraphPad Prism versiooni 8.0. Tulemused kuvatakse keskmisena ± sem. Ravi võrdlemiseks kontrollrühmadega kasutati kahepoolse Studenti t-testi. Mitme võrdluse jaoks kasutati kahesuunalist ANOVA-d Tukey Sidaki või Dunnetti mitme võrdluse testiga. P < 0,05 loeti statistiliselt oluliseks.

Viited

1. Gattinoni, L., Speiser, DE, Lichterfeld, M. & Bonini, C. T-mälu tüvirakud tervises ja haigustes. Nat. Med. 23, 18–27 (2017).

2. Gao, S. et al. Tüvirakkudega sarnased mälu T-rakud: vaatenurk pimedast küljest. Cell Immunol. 361, 104273 (2021).

3. Rosenberg, SA & Restifo, NP Adoptiivne rakuülekanne inimese vähi isikupärastatud immunoteraapiana. Science 348, 62–68 (2015).

4. Ribas, A. & Wolchok, JD Vähi immunoteraapia kontrollpunkti blokaadi abil. Science 359, 1350–1355 (2018).

5. Lugli, E., Galletti, G., Boi, SK & Youngblood, BA Mälu CD8+ T-rakkude tüvi-, efektor- ja hübriidseisundid. Trends Immunol. 41, 17–28 (2020).

6. Galletti, G. et al. Tüvilaadsete CD8+ mälu T-rakkude eellasrakkude kaks alamhulka, millel on inimeste saatus erinevad. Nat. Immunol. 21, 1552–1562 (2020).

7. Gattinoni, L. et al. Inimese mälu T-rakkude alamhulk, millel on tüvirakkudele sarnased omadused. Nat. Med. 17, 1290–1297 (2011).

8. Franco, F., Jaccard, A., Romero, P., Yu, YR & Ho, PC T-rakkude kurnatuse metaboolne ja epigeneetiline regulatsioon. Nat. Metab. 2, 1001–1012 (2020).

9. Kaech, SM & Cui, W. Efektor- ja mälu-CD8+ T-rakkude diferentseerumise transkriptsiooniline kontroll. Nat. Rev. Immunol. 12, 749–761 (2012).

10. Huang, Q. et al. Kasvaja-spetsiifiliste mälu-CD8+ T-rakkude ürgne diferentseerumine PD-1/PD-L1 blokaadile heausksete reageerijatena dreneerivates lümfisõlmedes. Cell 185, 4049–4066 (2022).

11. Siddiqui, I. et al. Tüvisarnaste omadustega intratumoraalsed Tcf1+ PD-1+ CD8+ T-rakud soodustavad kasvaja kontrolli vastusena vaktsineerimisele ja kontrollpunktide blokaadi immunoteraapiale. Immunity, 50, 195–211 (2019).

12. Jeannet, G. et al. Wnt raja efektori Tcf-1 oluline roll funktsionaalse CD8 T-rakkude mälu loomisel. Proc. Natl Acad. Sci. USA 107, 9777–9782 (2010).

13. Henning, AN, Roychoudhuri, R. & Restifo, NP CD8+ T-rakkude diferentseerumise epigeneetiline kontroll. Nat. Rev. Immunol. 18, 340–356 (2018).

14. Crompton, JG et al. CD8+ T-rakkude alamhulkade põlvnemise seos ilmneb järkjärguliste muutuste kaudu epigeneetilises maastikus. Cell Mol. Immunol. 13, 502–513 (2016).

15. Yu, B. et al. Epigeneetilised maastikud paljastavad transkriptsioonifaktorid, mis reguleerivad CD8+ T-rakkude diferentseerumist. Nat. Immunol. 18, 573–582 (2017).

16. Araki, Y. et al. Histooni metüülimise genoomi hõlmav analüüs paljastab kromatiini olekupõhise geeni transkriptsiooni reguleerimise ja mälu-CD8+ T-rakkude funktsiooni. Immunity 30, 912–925 (2009).

17. Moller, SH, Hsueh, PC, Yu, YR, Zhang, L. & Ho, PC Metaboolsed programmid kohandavad T-rakkude immuunsust viirusnakkuste, vähi ja vananemise korral. Lahtri metab. 34, 378–395 (2022).

18. Phan, AT et al. Konstitutiivne glükolüütiline metabolism toetab CD8+ T-rakkude efektori mälu diferentseerumist viirusinfektsiooni ajal. Immunity 45, 1024–1037 (2016).

19. Sinclair, LV et al. Metioniini metabolismi antigeeniretseptori kontroll T-rakkudes. eLife 8, e44210 (2019).

20. O'Sullivan, D. et al. Mälu CD8+ T-rakud kasutavad rakusisemist lipolüüsi, et toetada arenguks vajalikku metaboolset programmeerimist. Immunity 41, 75–88 (2014).

21. Pearce, EL et al. CD8 T-rakkude mälu parandamine rasvhapete metabolismi moduleerimise kaudu. Nature 460, 103–107 (2009).

22. Van der Windt, GJ et al. Mitokondriaalne hingamisvõime on CD8+ T-rakkude mälu arengu kriitiline regulaator. Immunity 36, 68–78 (2012). 23. Boedtkjer, E. & Pedersen, SF Happeline kasvaja mikrokeskkond kui vähi põhjustaja. Annu. Rev. Physiol. 82, 103–126 (2020). 24. Thommen, DS ja Schumacher, TN T-rakkude düsfunktsioon vähi korral. Cancer Cell 33, 547–562 (2018).

25. Scharping, NE et al. Kasvaja mikrokeskkond represseerib t-rakkude mitokondriaalset biogeneesi, et juhtida kasvajasisest t-raku metaboolset puudulikkust ja düsfunktsiooni. Immunity 45, 374–388 (2016).

26. Yu, YR et al. CD8+ TIL-ide häiritud mitokondriaalne dünaamika tugevdab T-rakkude kurnatust. Nat. Immunol. 21, 1540–1551 (2020).

27. Chang, CH et al. Metaboolne konkurents kasvaja mikrokeskkonnas on vähi progresseerumise tõukejõud. Cell 162, 1229–1241 (2015).

28. Scharping, NE et al. Pidevast stimulatsioonist hüpoksia all põhjustatud mitokondriaalne stress põhjustab kiiresti T-rakkude kurnatuse. Nat. Immunol. 22, 205–215 (2021).

29. Jansen, CS et al. Kasvajasisene nišš säilitab ja eristab tüvilaadseid CD8 T-rakke. Nature 576, 465–470 (2019).

30. Im, SJ et al. CD8+ T-rakkude määratlemine, mis tagavad pärast PD-1-ravi proliferatsiooni. Nature 537, 417–421 (2016).

31. Haas, R. et al. Laktaat reguleerib metaboolseid ja põletikuvastaseid ahelaid T-rakkude migratsiooni ja efektorfunktsioonide kontrollimisel. PLoS Biol. 13, e1002202 (2015).

32. Wu, H. et al. T-rakud toodavad lümfisõlmedes happelisi nišše, et pärssida oma efektorfunktsioone. Nat. Commun. 11, 4113 (2020).

33. Calcinotto, A. et al. Mikrokeskkonna happesuse moduleerimine muudab inimese ja hiire kasvajasse infiltreeruvate T-lümfotsüütide anergiat. Cancer Res. 72, 2746–2756 (2012). 34. Gottfried, E. et al. Kasvajast pärinev piimhape moduleerib dendriitrakkude aktivatsiooni ja antigeeni ekspressiooni. Blood 107, 2013–2021 (2006).

35. Colegio, OR et al. Kasvajaga seotud makrofaagide funktsionaalne polarisatsioon kasvajast pärineva piimhappega. Nature 513, 559–563 (2014).

36. Erra Diaz, F. et al. Ekstratsellulaarne atsidoos ja mTOR-i inhibeerimine soodustavad inimese monotsüütidest pärinevate dendriitrakkude diferentseerumist. Cell Rep. 31, 107613 (2020).

37. Sukumar, M. et al. Glükolüütilise metabolismi pärssimine suurendab CD8+ T-rakkude mälu ja kasvajavastast funktsiooni. J. Clin. Investeeri. 123, 4479–4488 (2013).

38. Scholz, G. et al. MTOR-i signaalimise moduleerimine käivitab tüvirakkudetaoliste mälu-T-rakkude moodustumise. EBioMedicine 4, 50–61 (2016).

39. Pollizzi, KN et al. mTORC1 ja mTORC2 reguleerivad selektiivselt CD8+ T-rakkude diferentseerumist. J. Clin. Investeeri. 125, 2090–2108 (2015).

40. Zhang, L. et al. Imetajate rapamütsiini kompleksi 2 sihtmärk kontrollib CD8 T-rakkude mälu diferentseerumist Foxo1-sõltuval viisil. Cell Rep. 14, 1206–1217 (2016).

41. Zhou, H. & Huang, S. mTOR signaalimise roll kasvajarakkude liikuvuses, invasioonis ja metastaasides. Curr. Protein Pept. Sci. 12, 30–42 (2011).

42. Arguello, RJ et al. SCENITH: voolutsütomeetrial põhinev meetod energia metabolismi funktsioneerimiseks üherakulise eraldusvõimega. Lahtri metab. 32, 1063–1075 (2020).

43. Ron-Harel, N. et al. Mitokondriaalne biogenees ja proteoomide ümberkujundamine soodustavad ühe süsiniku metabolismi T-rakkude aktiveerimiseks. Lahtri metab. 24, 104–117 (2016).

44. Han, C., Ge, M., Ho, PC & Zhang, L. Fueling T-cell antitumor immunity: amino acid metabolism revisited. Cancer Immunol. Res. 9, 1373–1382 (2021).

45. Kakaradov, B. et al. CD8+ T-rakkude diferentseerumise varane transkriptsiooniline ja epigeneetiline regulatsioon, mis ilmnes üherakulise RNA sekveneerimisega. Nat. Immunol. 18, 422–432 (2017).

46. ​​Wang, W. & Zou, W. Aminohapped ja nende transporterid T-rakulise immuunsuse ja vähiravis. Mol. Cell 80, 384–395 (2020).

47. Marchingo, JM, Sinclair, LV, Howden, AJ & Cantrell, DA Kvantitatiivne analüüs selle kohta, kuidas Myc kontrollib T-rakkude proteoome ja metaboolseid teid T-rakkude aktiveerimise ajal. eLife 9, e53725 (2020).

48. Sukumar, M. et al. Mitokondriaalse membraani potentsiaal tuvastab rakuteraapia jaoks täiustatud tüvega rakud. Lahtri metab. 23, 63–76 (2016).

49. Alizadeh, D. et al. IL15 suurendab CAR-T-rakkude kasvajavastast toimet, vähendades mTORC1 aktiivsust ja säilitades nende tüvirakkude mälu fenotüübi. Cancer Immunol. Res. 7, 759–772 (2019).

50. Buck, MD et al. Mitokondriaalne dünaamika kontrollib T-rakkude saatust metaboolse programmeerimise kaudu. Cell 166, 63–76 (2016).

51. Krishna, S. et al. Tüvilaadsed CD8 T-rakud vahendavad adoptiivse raku immunoteraapia vastust inimese vähi vastu. Science 370, 1328–1334 (2020).

52. Burger, ML et al. Antigeeni domineerimise hierarhiad kujundavad TCF1+ eellas-CD8 T-rakkude fenotüüpe kasvajates. Cell 184, 4996–5014 (2021).

53. Guo, Y. et al. Lõplikult kurnatud CD8+ T-rakkude metaboolne ümberprogrammeerimine IL-10 poolt suurendab kasvajavastast immuunsust. Nat. Immunol. 22, 746–756 (2021).

54. Klein Geltink, RI et al. CD8+ efector T-rakkude metaboolne konditsioneerimine adoptiivse rakuteraapia jaoks. Nat. Metab. 2, 703–716 (2020).

55. Suzuki, J., Nabe, S., Yasukawa, M. & Yamashita, M. Glutamiin reguleerib CD8 T-rakkude kasvajavastast toimet. Gan To Kagaku Ryoho 47, 11–15 (2020).

56. Vodnala, SK jt. T-raku tüvi ja düsfunktsiooni kasvajates käivitab ühine mehhanism. Science 363, eaau0135 (2019).

57. Bosticardo, M. et al. Inimese T-lümfotsüütide kallutatud aktiveerimine madala ekstratsellulaarse pH tõttu on antagoniseeritud B7/CD28 kostimulatsiooniga. Eur. J. Immunol. 31, 2829–2838 (2001).

58. Pucino, V. et al. Laktaadi kogunemine kroonilise põletiku kohas soodustab haigusi, kutsudes esile CD4+ T-rakkude metaboolse juhtmestiku. Lahtri metab. 30, 1055–1074 (2019).

59. Feng, Q. et al. Laktaat suurendab CD8+ T-rakkude tüve, et suurendada kasvajavastast immuunsust. Nat. Commun. 13, 4981 (2022).

60. Roy, DG et al. Metioniini metabolism kujundab T-abistajarakkude vastuseid epigeneetilise ümberprogrammeerimise reguleerimise kaudu. Lahtri metab. 31, 250–266 (2020).

61. Zhang, L. & Romero, P. CD8+ T-rakkude saatuse otsuste ja kasvajavastase immuunsuse metaboolne kontroll. Trends Mol. Med. 24, 30–48 (2018).

62. Cham, CM, Driessens, G., O'Keefe, JP & Gajewski, TF Glükoosipuudus pärsib mitut peamist geeniekspressiooni sündmust ja efektorfunktsioone CD8+ T-rakkudes. Eur. J. Immunol.38, 2438–2450 (2008).

63. O'Sullivan, D. et al. Mälu CD8+ T-rakud kasutavad rakusisemist lipolüüsi, et toetada arenguks vajalikku metaboolset programmeerimist. Immunity 49, 375–376 (2018).

64. Lin, R. et al. Rasvhapete oksüdatsioon kontrollib CD8+ koe-residentide mälu t-rakkude ellujäämist mao adenokartsinoomi korral. Cancer Immunol. Res 8, 479–492 (2020).

65. Raud, B. jt. Etomoksiiri toime reguleerivatele ja mälu T-rakkudele ei sõltu Cpt1a-vahendatud rasvhapete oksüdatsioonist. Lahtri metab. 28, 504–515 (2018).

66. Sharma, U. & Rando, OJ Metaboolsed sisendid epigenoomi. Lahtri metab. 25, 544–558 (2017).

67. Tyrakis, PA et al. S-2-hüdroksüglutaraat reguleerib CD8+ T-lümfotsüütide saatust. Nature 540, 236–241 (2016).

68. Zhang, H. et al. Ketogeneesi teel genereeritud beeta-hüdroksübutüraat on CD8+ T-rakkude mälu arengu epigeneetiline regulaator. Nat. Cell Biol. 22, 18–25 (2020).

69. Bian, Y. et al. Vähk SLC43A2 muudab T-rakkude metioniini metabolismi ja histooni metüülimist. Nature 585, 277–282 (2020).

70. Wall, M. et al. C-MYC translatsiooniline kontroll rapamütsiini poolt soodustab terminaalset müeloidset diferentseerumist. Blood 112, 2305–2317 (2008).

71. Yerinde, C., Siegmund, B., Glauben, R. & Weidinger, C. Metabolic control of epigenetics ja selle roll CD8+ T-rakkude diferentseerumises ja funktsioonis. Esiosa. Immunol. 10, 2718 (2019).

72. Eil, R. et al. Ioonne immuunsupressioon kasvaja mikrokeskkonnas piirab T-rakkude efektori funktsiooni. Nature 537, 539–543 (2016).

73. Guo, A. et al. cBAF-i komplekskomponendid ja MYC teevad CD8+ T-rakkude saatuse alguses koostööd. Nature 607, 135–141 (2022).

74. Raynor, JL, Chapman, NM & Chi, H. Metabolic control of memory T-cell generation and stemness. Cold Spring Harb. Perspektiiv. Biol. 13, a037770 (2021).

75. Kaya-Okur, HS et al. CUT&Tag väikeste proovide ja üksikute rakkude tõhusaks epigenoomiliseks profileerimiseks. Nat. Commun. 10, 1930 (2019).

76. Jin, H. et al. ChIPseqSpikeInFree: ChIP-seq-i normaliseerimisviis, et paljastada globaalsed muutused histooni modifikatsioonides ilma spike-in. Bioinformatics 36, 1270–1272 (2020).

77. Sellick, CA, Hansen, R., Stephens, GM, Goodacre, R. & Dickson, AJ. Metaboliitide ekstraheerimine suspensioonis kultiveeritud imetajarakkudest globaalseks metaboliitide profileerimiseks. Nat. Protoc. 6, 1241–1249 (2011).

78. Li, C. et al. Aminohapete katabolism reguleerib hematopoeetiliste tüvirakkude proteostaasi GCN2 – eIF2 telje kaudu. Cell Stem Cell 29, 1119–1134 (2022).

79. Wenes, M. et al. Mitokondriaalne püruvaadi kandja reguleerib mälu T-rakkude diferentseerumist ja kasvajavastast funktsiooni. Lahtri metab. 34, 731–746 (2022).