IL-12-põhine nanotsütokiin tugevdab ohutult vähivastast immuunsust põletiku ajalise kontrolli kaudu, et kõrvaldada kaugelearenenud külmetuskasvajad

Immunoloogiliselt külmade kasvajate ravi on immuunkontrollpunkti inhibiitorite (ICI) jaoks suur väljakutse. Interleukiin 12 (IL-12) võib turgutada ICI-sid külmakasvajate vastu, luues tugeva kasvajavastase immuunsuse. Selle toksilisus ja immunosupressiivsete signaalide süsteemne esilekutsumine on aga translatsiooni takistanud. Siin kontrollitakse IL-12 aktiivsust spatiotemporally, et tõhusust ohutult suurendada ilma häirivate immuunvastuste stimuleerimiseta, tekitades nanotsütokiini, mis jääb füsioloogilise pH juures passiivseks, kuid vallandab oma täieliku aktiivsuse happelise kasvaja pH juures. IL-12-põhine nanotsütokiin (Nano-IL-12) akumuleerub ja vabastab IL-12 kasvajakudedes, kutsudes esile lokaalse kasvajavastase põletiku, hoides ära süsteemse immuunvastuse, vastuaktiivsed immuunreaktsioonid ja kõrvaltoimeid isegi pärast korduvat intravenoosset manustamist. Nano-IL{8}}vahendatud põletike spatiotemporaalne kontroll tagab parema vähivastase efektiivsuse ja sünergiseerib ICI-dega, et põletikku sügavalt tekitada kasvaja mikrokeskkond ja likvideerida täielikult ICI-resistentsed primaarsed ja metastaatilised kasvajad. Strateegia võib olla paljutõotav lähenemisviis ohutumate ja tõhusamate immuunteraapiate suunas.

Cistanche tubulosa-Antitumor eelised

1. Sissejuhatus

Immuunsuse kontrollpunkti inhibiitorid (ICI), nagu anti-PD-1 (nivolumab) ja anti-CTLA- 4 (ipilimumab) antikehad, on muutnud vähiravis revolutsiooni.[1,2] Siiski on suur hulk patsiendid ei saa ikka veel sellest ravist kasu.[3] Sellist puudulikku vastust on seostatud külmakasvaja fenotüübiga, mis ei ole ICI-de suhtes tundlik.[4,5] Nendel külmakasvajatel on tavaliselt immunosupressiivne mikrokeskkond ja madal T-rakkude infiltratsiooni tase, mis nõrgendab ICI-de mõju.[5–7] Seega on tungiv vajadus ainete järele, mis viiksid kasvaja külmast fenotüübist põletikulise (kuuma) fenotüübi vastu, millel on kõrge T-rakkude infiltratsioon, et suurendada ICI-de efektiivsust ja laiendada ravimaastikku. Interleukiin-12 (IL-12), mis on üks tugevamaid põletikuvastaseid tsütokiine, omab suurt potentsiaali kasvajavastase immuunsuse tugevdamisel ja ICI-resistentsuse ületamisel.[8–10] Kuid IL-12 indutseerib rasked immuunsüsteemiga seotud kõrvalnähud (irAE) süsteemse süstimise korral.[8,10] Seega kasutatakse mitmesuguseid valgutehnoloogia meetodeid, sealhulgas immuuntsütokiine, [11–13] sulandvalke[14] ja proteaasitundlikke tsütokiine[15]. ] on intensiivse uurimise all, et parandada IL-12 ohutust, vähendades süsteemset kokkupuudet ja suurendades kasvaja selektiivsust. Teisest küljest on IL-12-l endiselt kriitilised puudused, mis on seotud põletiku spatiotemporaalse dünaamikaga, mis põhjustavad vastuaktiivseid immuunreaktsioone, mis kahjustavad selle efektiivsust.[16–19] Näiteks soodustati korduvat IL-12 süstimist. põletikuvastase interleukiini -10 (IL-10) süsteemne laienemine patsientidel, mis piiras kasvajavastast efektiivsust.[20–22] Seoses sellega töötatakse välja süsteemid, mis suudavad IL-i aeg-ruumiliselt kontrollida{36. }}vahendatud põletik võib maksimeerida efektorfunktsioone ja stimuleerida tugevat kasvajavastast immuunsust, vältides samal ajal häirivaid immuunreaktsioone. Kahjuks ei ole ülalnimetatud valguga konstrueeritud süsteemide põletikuline dünaamika täielikult mõistetav ja nende seost sekundaarsete reaktsioonidega tuleb veel selgitada. Siin töötasime välja stiimulitele reageerivad nanoskaalaga tsütokiinid (nanotsütokiinid), kapseldades natiivse IL-12 bioühilduvate polümeeridega, et saavutada selle aktiivsuse ajaline kontroll. IL-12-põhised nanotsütokiinid (Nano-IL-12) loodi pärast happelise kasvajasisese pH tuvastamist täielikult aktiivse IL-12 vallandamiseks, kuna atsidoos on vähi tunnuseks[23]. ja on seotud immunosupressiooniga.[24,25] Tegelikult avastasime hiljuti, et pH-ga ümberlülitatav funktsioon võib võimaldada kõrget ja selektiivset aktivatsiooni ICI-resistentsete kasvajate korral.[26] Nano-IL{51}} farmakokineetikat, ohutust ja efektiivsust hinnati külma melanoomi ja rinnavähi hiiremudelites. Meie tulemused näitasid, et NanoIL{52}} kutsub kasvajakudedes esile püsiva põletikulise reaktsiooni, suurendades IL-12-ga kokkupuute intensiivsust ja kestust, vältides samal ajal koostoimet immuunrakkudega tervetes kudedes, et pärssida immuunpuudulikkust. sihtimmuunvastus. Seega blokeeris Nano-IL{56}} tõhusalt sekundaarseid reaktsioone nii süsteemselt kui ka intratumoraalselt, näidates efektiivsust annustes, mis on 10- korda väiksemad kui natiivse IL-12. Nano-IL{60}} tugevdatud kasvajavastane immuunsus sünergiseerub ohutult ICI-dega, et tekitada tuumori mikrokeskkonna (TME) intensiivset põletikku, mille tulemuseks on täielikud reaktsioonid (CR) ICI-resistentsetes melanoomimudelites ning primaarsed ja kopsumetastaasid kolmik- negatiivne rinnavähk (TNBC).

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

2. Tulemused

2.1. Nano-IL-12 tunneb intratumoraalset pH-d, et vabastada täielikult aktiivsed tsütokiinid

Nano-IL-12 konstrueerimiseks sünteesisime kirjeldatud meetodi[27] abil karboksüdimetüülmaleiinanhüdriidiga (CDM) modifitseeritud polü(etüleenglükool)-polü(LLüsiini) (PEG-pLL(CDM)) (skeem S1, toetav teave). Polümeeril on pooled pLL-ploki aminorühmadest konjugeeritud CDM-iga amiidsideme kaudu (joonised S1–S3, tugiteave). Nano-IL{{10}} moodustub lihtsalt polümeeri segamisel tsütokiiniga vesikeskkonnas ilma orgaanilisi lahusteid lisamata (joonis 1a). Polümeeris olevad aminorühmad moodustavad ioonkomplekse valkude karboksülaadiosadega, samas kui CDM rühmad reageerivad aminorühmadega IL-12-s ja polümeeriahelates, moodustades pH-tundlikke amiidsidemeid. IL-12 kapseldamise efektiivsus nanotsütokiinides määrati olevat ligikaudu 80%, mõõdetuna HPLC-ga, võrreldes Alexa Fluor 647 (A647)-märgistatud vaba IL-12 piikide pindalasid. Nanotsütokiini laetud IL-12 (joonis 1b). Mittefluorestsentsmärgistusega IL-12 puhul kinnitati kapseldamise efektiivsus ELISA mõõtmisega, kuna ELISA meetod suudab reageerinud segus tuvastada ainult kapseldamata vaba IL-12, kuna Nano polümeerkate -IL-12 blokeerib laaditud IL-12 tuvastamise tuvastamisantikehaga. Seega, arvutades kapseldamata IL-12 ja kogu IL-12 voo suhte, määrati kapseldamise efektiivsuseks samuti ligikaudu 80% (joonis S4a, tugiteave), mis on kooskõlas tulemusega HPLC mõõtmised. NanoIL-12 puhastati tsentrifugaalfiltrimisega, et eemaldada vaba IL-12 ja suhteliselt väikesed polümeer-IL-12 konjugaadid (joonis S4b, lisateave). Puhastamine kinnitati HPLC abil (joonis 1b, alumine paneel). Nano-IL-12 polümeerse kilbi moodustumist kinnitati transmissioonielektronmikroskoopia (TEM) ja dünaamilise valguse hajumise (DLS) abil. TEM-is värviti polümeeri pLL-plokist ja IL-12-st moodustatud NanoIL-i -12 IL-12-tuum uranüülatsetaadiga[28] ja visualiseeriti ühtlaste mustade täppidena. keskmine läbimõõt 23,2 ± 4 nm juures (joonis 1c, d). DLS-i abil mõõdeti nano-IL-12 hüdrodünaamiliseks läbimõõduks 42 ± 2 nm (joonis 1e). Võrreldes TEM-i ja DLS-iga mõõdetud suurust, saame arvutada, et PEG-i kesta paksus nendes osakestes on ligikaudu 10 nm. See tulemus näitab tihedat PEGüülimist, mis oleks kasulik farmakokineetika parandamiseks.[29] Lisaks kinnitasid A647-märgistatud nano-IL-12 fluorestsentskorrelatsioonispektroskoopia (FCS) uuringud suurema molekulmassiga assotsiatsioonide moodustumist kui vaba A647-märgistatud IL-12 (Tabel S1, tugiteave). Võrreldes A647-märgistatud IL-12 ja A647-märgistatud Nano-IL-12 proovide FCS-i mõõtmisel saadud arvu molekulide kohta, tegime kindlaks, et iga Nano-IL{ {67}} sisaldab keskmiselt umbes 1,5 IL-12 molekuli. Lisaks leiti, et Nano-IL-12 pinnalaeng on neutraalsele lähedane (tabel S2, tugiteave), mis viitab sellele, et polümeer varjestab negatiivselt laetud IL-12. CDM fragmentide ja primaarsete amiinide vahel moodustunud nano-IL-12 amiidsidemed on väidetavalt pH suhtes tundlikud.[30] Seega eeldatakse, et Nano-IL-12 dissotsieerub happelistes tingimustes, et vabastada kapseldatud tsütokiin. Esmalt skriinisime FCS-i mõõtmise abil Nano-IL-12 pH-tundlikkust erinevatel pH väärtustel vahemikus pH 4,5 kuni 8,5, et kajastada Nano-IL-12 dissotsiatsiooniseisundit difusioonikoefitsient. Happelistes tingimustes alla pH 7,0 võib täheldada difusioonikoefitsiendi suurenemist, mis vastab osakeste molekulmassi vähenemisele, mis viitab sellele, et Nano-IL-12 on füsioloogilise pH juures stabiilsed, kuid võivad oma väärtuse kaotada. terviklikkus kasvajasiseste kahjustuste korral hapendatud keskkonnaga[23,31] (joonis 1f). Järgmisena uurisime Nano-IL-12 dissotsiatsioonikineetikat füsioloogilise pH 7,4 ja kasvajasisese pH 6,5 juures FCS-i mõõtmise abil. FCS-i mõõtmine võimaldab täpselt hinnata nano-IL{104}} ja vabanenud IL{105}} difusioonikoefitsiente. Uus tulemus näitas, et Nano-IL{107}} kaotas kiiresti terviklikkuse pH 6,5 juures ja proovi difusioonikoefitsient jõudis pärast 4-tunnist inkubeerimist vaba IL{110}} väärtuseni, mis viitab Nano-IL täielikule aktiveerimisele. -12 sellistel tingimustel. Veelgi enam, pH 7,4 juures olid nano-IL{117}} stabiilsed (joonis 1g), säilitades oma difusioonikoefitsiendi isegi mitme päeva pärast (joonis S4c, lisateave). Need tähelepanekud toetavad Nano-IL{121}} selektiivset aktiveerimist kasvajasisese pH tingimustes ja stabiilsust füsioloogilistes tingimustes. Kuna IL-12 võib stimuleerida IFN-𝛾 sekretsiooni splenotsüütidest,[32] hinnati polümeeri varjestuse/varjestuse eemaldamise mõju Nano-IL-12 bioaktiivsusele in vitro splenotsüütide testiga ( Joonis 1h). Nano-IL{130}} kutsus esile madalama IFN-𝛾 produktsiooni taseme hiire splenotsüütides, mis näitab IL-12 bioaktiivsuse blokeerimist polümeeri kapseldamise tõttu. Teisest küljest näitas Nano-IL{134}}, mis aktiveeriti eelinkubeerimisega happes (pH 6,5), bioaktiivsust sarnaselt natiivse IL-12 bioaktiivsusega, mis viitab aktiveeritud nano-IL{140}} suudab täielikult taastada tsütokiini bioaktiivsuse.

Joonis 1. Nano-IL-12 aktiveerub intratumoraalse pH juures, vabastades täielikult aktiivse tsütokiini. a) IL-12-põhise nanotsütokiini (nano-IL- 12) moodustumine ja struktuur. Nano-IL-12 monteeritakse ise vesitingimustes, segades polümeeri lihtsalt IL-12-ga. Koostu juhivad pH-tundlikud amiidsidemed ja elektrostaatilised interaktsioonid. b) vaba IL-12 valgu, PEG-pLL(CDM) + IL-12 segu ja puhastatud Nano-IL-12 HPLC tulemused. IL-12 valgud on märgistatud A647-ga. c) Puhastatud Nano-IL-12 tüüpiline TEM-pilt näitab selgelt osakeste põhistruktuuri. d) TEM-piltidelt mõõdetud osakeste südamiku läbimõõdu jaotus. n=100 osakest loetud. e) Nano-IL-12 hüdrodünaamiliste läbimõõtude jaotus mõõdetuna DLS-iga. f) pH-st sõltuv Nano-IL-12 disassotsiatsioon, mida näitab Nano-IL-12 FCS-i mõõtmine, mida inkubeeriti erineva pH all 24 tundi. Punktiirjoon 5,3 × 107 cm2 s-1 juures viitab vaba IL-12 difusioonikoefitsiendile. g) Nano-IL-12 IL-12 vabanemisprofiil, mõõdetuna FCS-meetodil. Punktiirjooned 1,2 × 107 cm2 s−1 ja 5,3 × 107 cm2 s−1 viitavad vastavalt puutumata nano-IL-12 ja vabanenud vaba IL-12 difusioonikoefitsientidele. h) IFN-𝛾 sekretsioon hiire splenotsüütide poolt, mida on töödeldud Nano-IL-12, aktiveeritud Nano-IL-12 ja natiivse IL-12-ga. IFN-𝛾 mõõdeti ELISA abil. Andmed on näidatud kui keskmine ± SD; f ja g, n=3 paralleelmõõtmised. h, n=5 paralleelmõõtmise korral.

Preparaadi säilivus ja stabiilsus on samuti olulised Nano-IL-12 muutmisel ravimiks. Seetõttu töötasime välja Nano-IL-12 lüofiliseeritud versiooni, kasutades krüoprotektorina trehaloosi.[33] Taastatud Nano-IL-12 näitas võrreldavat suurust ja pinnalaengut värske Nano-IL-12-ga, ilma lastilekketa, ja jagas võrreldavat pH-tundlikkust ja in vitro IFN-𝛾 indutseerimisvõimet (joonis S4d–g ja Tabel S2, tugiteave). Need tulemused toetavad lüofiliseeritud preparaati kui elujõulist Nano-IL{13}} vastet.

Joonis 2. Nano-IL-12 parandab farmakokineetikat ja kasvajavastast efektiivsust. a) IVCLSM kujutised hiirte kõrvapulga nahast pärast 10 ug A647-märgistatud IL-12 või Nano-IL-12 (punane värv) iv süstimist. Skaalariba=50 μm. Keskmine fluorestsentsi intensiivsus koe piirkonnas (valged kastid) 5 tundi pärast süstimist kvantifitseeriti ja normaliseeriti kohe pärast süstimist veresoonkonna maksimaalse intensiivsusega (Vmax). b) Vaba IL-12 ja Nano-IL-12 vereringeprofiilid pärast 10 ug IL-12 või samaväärse Nano-IL-12 intravenoosset süstimist ELISA abil. Samuti joonistatakse Nano-IL-12-st vabanenud IL-12 kontsentratsioon veres (andmed on näidatud keskmisena ± SD, n=5 hiirt rühma kohta). c) IVIS-kujutis B16F10 melanoomi kasvajatest, mis lõigati välja 24 tundi pärast 10 ug IL-12 või samaväärse A647-ga märgistatud Nano-IL-12 iv süstimist. d) IL-12 taseme kvantifitseerimine 4T1 TNBC kasvajates 24- ja 48 tundi pärast 10 ug IL-12 või samaväärse Nano-IL-12 iv süstimist ELISA abil ( Andmed on näidatud kui keskmine ± SD; n=3 hiirt rühma kohta; p väärtused arvutati ühesuunalise ANOVA abil). e) 10 ug IL-12 või samaväärse Nano-IL{ ühekordse iv süstimise kasvajavastane toime (süstimise päevad on näidatud noolega (8. päev mudelil B16F10 ja 7. päev mudelil 4T1)) {51}}. B16F10 melanoomi tulemused on näidatud ülemisel paneelil ja 4T1 TNBC tulemused alumisel paneelil. Individuaalsed kasvaja kasvukõverad on näidatud vasakpoolsetel paneelidel. Kasvaja keskmise mahu kõverad on näidatud keskpaneelidel ja ellujäämiskõverad on näidatud parempoolsel paneelil (Andmed on näidatud keskmisena ± SEM; n=5 hiirt rühma kohta, p väärtused arvutatakse log-rank analüüsi abil ).

2.2. Nano-IL-12 parandab IL-12 farmakokineetikat ja aktiveerub kasvajates, et tugevdada kasvajavastast toimet

Nano-IL-12-sse kapseldamine võib parandada IL-12 farmakokineetikat. Nano-IL-12 vereringe visualiseerimiseks intravenoossel (iv) süstimisel kasutati A647-IL-12--põhise Nano-IL jälgimiseks in vivo konfokaalset laserskaneerivat mikroskoopiat (IVCLSM). -12 hiire kõrvanibude veresoontes pärast sabaveeni süstimist. Vaba IL-12 näitas pärast süstimist ekstravasatsiooni (joonis 2a), mida näitab suurenenud fluorestsentsi intensiivsus koe interstitsiumis. Arvestades, et makromolekulidel, mille suurus on võrreldav IL-12-ga (75 kDa), nagu 70 kDa dekstraan ja albumiin (65 kDa), on piiratud juurdepääs nahale,[34] IL-i leke{16}} veresoontest, viitab IL-12 ebastabiilsusele vereringe ajal. Tegelikult on varasemad uuringud näidanud IL-12 proteolüüsi seerumis sisalduvate ensüümide poolt.[35,36] Et toetada IL-12 lagunemist meie katsetes, on A{{22 stabiilsus }} märgistatud IL-12 hiire plasmas uuriti suuruseralduskromatograafia (SEC) abil. Hiire plasmaga inkubeerimisel avastasime, et IL-12 lagunes väiksema molekulmassiga fragmentideks (joonis S5, tugiteave), mis kinnitab IL-12 ebastabiilsust veres. Teisest küljest näitas Nano-IL{28}} minimaalset leket nahka, mis näitab nende stabiilsust vereringes. ELISA testiga mõõdetud kvantifitseeritud tsirkulatsiooniprofiil kinnitas, et üldine Nano-IL-12 on pikema tsirkulatsiooniga kui vaba IL-12 (joonis 2b). Samal ajal oli aktiveeritud Nano-IL-12 tase, mille määras vabanenud IL-12, veres väga piiratud, mis näitab Nano-IL-12 in vivo stabiilsust süsteemse ravi ajal. vereringet, mis aitab vähendada süsteemseid kõrvaltoimeid. Nano-IL-12 akumuleerumine südames, põrnas, kopsus ja neerudes oli nii 24 kui 48 tundi pärast manustamist sarnane vaba IL-12 omaga, samas kui maksas akumuleerus Nano-IL-12 oli kõrgem kui vaba IL-12 24 tunni pärast, kuid võrreldav 48 tunni pärast (joonis S6, tugiteave). Nano-IL{50}} näitas 24 tundi pärast süstimist oluliselt suuremat kasvaja kuhjumist kui vaba IL{51}} (joonis 2c). Veelgi enam, kuigi vaba IL{54}} eemaldati kasvajatest 48 tundi pärast süstimist, jäi Nano-IL-12 kontsentratsioon kõrgeks (umbes 4- korda kõrgem kui vaba IL{{59} }) (joonis 2d), mis viitab sellele, et Nano-IL-12 suurendas kasvajate sees olevat IL-12 kontsentratsioonikõvera alust pindala (AUC). Kooskõlas suurenenud akumulatsiooni ja elujõulise aktivatsiooniga kasvajates näitas Nano-IL-12 paremat kasvajavastast efektiivsust võrreldes vaba IL-12-ga subkutaanse B16F10 melanoomi ja ortotoopse 4T1 kolmiknegatiivse rinnavähi (TNBC) mudelite korral (joonis 2e). Mõlemas mudelis viis Nano-IL-12 ühekordne iv süstimine 10 ug IL-12 ekvivalendiga oluliselt parema tuumori kasvu pärssimisele kui IL-12, mis pikendas elulemusaega. . Märkimisväärne on see, et 4T1 TNBC mudelis, mis on kurikuulus oma tugeva immunosupressiooni ja resistentsuse poolest ICI-ravi suhtes,[37] andis ravi Nano-IL-12-ga selgelt olulise raviefekti, samas kui vaba IL{{83} } oli kasvaja kasvu vastu kasutu.

2.3. Nano-IL-12 kontrollis ruumiliselt põletikulist reaktsiooni

Nano-IL-12 ja vaba IL-12 bioloogiliste mõjude erinevuse edasiseks uurimiseks hinnati ravist esile kutsutud põletikureaktsiooni taset tsütokiini vastuse alusel mõlemas sihtmärgist väljas, st. , veri ja terved elundid ning kasvajad (ortotoopne 4T1 mudel). Neli IL-12 allavoolu tsütokiini, nimelt IFN-𝛾, tuumori nekroosifaktor-𝛼 (TNF-𝛼), interleukiin{{10}} (IL-6) ja interleukiin -10 (IL-10) valiti põletikuvastuse indikaatoriteks. Nende hulgas on IFN-𝛾, TNF- 𝛼 ja IL-6 olulised põletikueelsed tsütokiinid, mis on seotud IL-12,[20,38] kasvajavastase toimega, samas kui IL{{20 }} on põletikuvastane tsütokiin, mis on negatiivne tagasiside antagoniseeriv IL-12 stimulatsioon.[20,39] Nano-IL-12 ja vaba IL-12 süstiti kaks korda 0. päeval ja 3 ja põletikuvastust jälgiti iga päev 1 nädala jooksul. See eksperimentaalne seade võimaldas meil määrata nii ühekordse süstimise kui ka korduva annustamise mõju spatiotemporaalsele põletikulisele vastusele. Esimene vaba IL-12 süstimine päeval 0 viis nelja tsütokiini sekretsioonini veres ja elundites, 2. päeval täheldati plasmakontsentratsiooni tippu (joonis 3a–e,g), mis näitab tugevat väljalülitamist. - IL-12 immuunsüsteemiga seotud kõrvalnähtudega (irAE) seotud sihtpõletik.[8,10] Teisest küljest näitas Nano-IL- 12 esimene süst oluliselt madalamat tsütokiini taset kui vaba IL-12 veres ja tervetes organites, mis viitab sihtmärgivälise põletikuvastuse reguleerimisele. Teine vaba IL-12 süst 3. päeval stimuleeris taas IFN-𝛾, TNF-𝛼 ja IL-6 sekretsiooni. 5. päeval täheldatud IFN-𝛾 ja TNF-𝛼 tipptasemed olid aga selgelt madalamad kui 2. päeval pärast esimest IL{52}} süsti. Veelgi enam, vaba IL-12 teine ​​süst tõstis äärmiselt põletikuvastase IL-10 taset plasmas, organites ja kasvajates, mida on seostatud Th1-rakkude süsteemse hüperekspansiooniga, et esile kutsuda reguleerimise etapp.[40] Selline korduvast IL-12-ravist tingitud diferentseeritud vastus on leidnud kinnitust inimeste kliinilistes uuringutes ja see aitab kaasa IL-12 bioloogiliste mõjude, sealhulgas kasvajavastase toime vähenemisele.[20] Vastupidiselt IL-12-le ei suurendanud Nano-IL-12 teine ​​süst IL-10 sekretsiooni veres ja elundites. Samuti oli põletikuliste tsütokiinide kontsentratsioon veres ja tervetes kudedes oluliselt madalam kui vaba IL-12. Need tulemused viitavad sellele, et Nano-IL-12 ei suutnud mitte ainult vähendada süsteemset põletikulist vastust, vaid ületada ka korduva IL-12 manustamise piirangud, mis kutsus esile vastupidise põletikuvastase vastuse. Kasvajate puhul suurendas üks Nano-IL{72}} intravenoosne süstimine põletikuliste IFN-𝛾, TNF-𝛼 ja IL-6 tootmist, saavutades oluliselt kõrgema kasvajasisese kontsentratsiooni kui vaba IL{77} } ravi (joonis 3f,g). Vahepeal põhjustas ravi Nano-IL{80}} kasvajates madalama põletikuvastase IL-10 kui vaba IL-12, vältides põletikuvastase vastuse teket. Veelgi enam, pärast teist Nano-IL-12 süstimist säilitati kasvajates põletikuliste tsütokiinide kõrge tase, samas kui kasvajasisene IL-10 kontsentratsioon hoiti madalal. See IFN-𝛾, TNF-𝛼 ja IL-6 ülesreguleerimine ning IL-10 alareguleerimine kasvajates on korrelatsioonis nano-IL-12 kõrge ja püsiva intratumoraalse tasemega ja toega. Nano-IL-12 suurenenud põletikuline reaktsioon, mis on kasvajavastase efektiivsuse suurendamiseks ülioluline.[41]

Et testida, kas Nano-IL-12 võib tõhusust parandada põletiku kontrollimise kaudu, kordasime joonisel 2e näidatud katset, kuid seekord ravisime hiiri 10- korda väiksema annusega, st 1 ug IL-12 ekvivalenti, kasutades korduvat annustamisskeemi, mis käivitab vaba IL- 12 vastumõjutava immuunvastuse. Selle korduva väikese annusega ravi ajal suurendas Nano-IL-12 selgelt kasvajavastast efektiivsust võrreldes IL-12-ga 4T1 TNBC kasvajate korral (joonis 3h), mis viis kasvaja kasvu aeglustumiseni ja elulemuse pikenemiseni. Teisest küljest näitas vaba IL-12-ravi ebaolulist efektiivsust isegi pärast kuuekordset intensiivset süstimist, mida võis seostada põletikuvastaste tsütokiinide, nagu IL-10, laienemisega. Need tulemused toetavad Nano-IL{19}} võimet tugevdada kasvajavastast efektiivsust, kontrollides põletikku spatiotemporally. Põletikulise reaktsiooni kontroll suurendas ka ohutust. Viisime läbi histoloogilise hindamise ja vereanalüüsi, et määrata IL{{20}} ja Nano-IL-12 toksilisus pärast kahte süsti 0. ja 3. päeval (joonis S7a,c, lisateave) . Tulemused näitasid Nano-IL-12-ravi korral oluliselt väiksemat toksilisust maksale, neerudele ja kõhunäärmele, võrreldes vaba IL-12-ga. Samuti jälgiti toksilisuse parameetrina kehamassi muutusi ravi ajal. Nano-IL-12-ga ravitud loomad võtsid ravi ajal veidi kaalus juurde, samas kui hiired, kes said vaba IL-12, kannatasid kehakaalu languse all (joonis S7b, lisateave). Seega näitavad need tähelepanekud, et Nano-IL- 12 võib eelistatavalt soodustada põletikulist vastust kasvajates, et suurendada kasvajavastast efektiivsust, piirates samal ajal kõrvaltoimeid tervetes kudedes, et vähendada toksilisust ja vähendada vastuaktiivset põletikuvastast vastust.

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Nano-IL-12 ravi kutsub esile kasvajavastase immuunrakkude infiltratsiooni TME-s

IL-12 on tuntud ka kui T-rakke stimuleeriv faktor, kuna see võib stimuleerida T-rakkude kasvu ja funktsiooni, et algatada tõhustatud kasvajavastaseid immuunreaktsioone. Seega hindasime CD8+ rakkude infiltratsiooni kasvajatesse pärast korduvat Nano-IL-12-ravi. B16F10 melanoomi voolutsütomeetria analüüs, mida raviti vaba IL-12 või Nano-IL-12 kahe iv süstiga 1 ug IL-12 ekvivalentsusega süsti kohta, näitas, et Nano-IL{{13} } suurendas oluliselt CD8+ T-rakkude infiltratsiooni kasvajasse võrreldes vaba IL-12-ga (joonis 4a). Tehes immuunrakkude ammendumise katse hiirel, kellel oli 4T1 TNBC kasvaja, uurisime erinevate immuunrakkude populatsioonide panust Nano-IL-12-ravi vastusesse. Nano-IL-12 süstiti iv viis korda päevadel 7, 9, 11, 13 ja 15 (1 ug IL-12 ekvivalents süsti kohta). Veelgi enam, hiirtele süstiti 6., 8. ja 10. päeval intraperitoneaalselt (ip) anti-CD4, anti-CD8 või anti-asiago GM1 antikehi, et kahandada CD4+, CD8+ või vastavalt NK-rakud. Tulemused näitasid, et CD8+ tsütotoksiliste T-rakkude, CD4+ T-rakkude ja NK-rakkude vähenemine vähendas oluliselt Nano-IL-12 terapeutilist efektiivsust, mida näitab kasvaja kiirem kasv. ja vähenenud elulemus ammendunud rühmades võrreldes ainult Nano-IL-12-ravi saanud hiirtega (joonis 4b). See tulemus on kooskõlas IL-12 bioloogilise funktsiooniga, sealhulgas CD8 T-rakkude[42] ja NK-rakkude [43] tsütotoksilise aktiivsuse suurendamisega ning naiivsete T-rakkude diferentseerumise vahendamisega T-abistajarakkudeks (Th). [44]

Veelgi enam, ammendumiskatsest tulenev kasvajavastase toime erinev leevendamise tõhusus viitab iga rakupopulatsiooni olulisusele Nano-IL-12 efektiivsuse seisukohalt, kusjuures CD8+ tsütotoksilised T-rakud on kõige olulisem fraktsioon. . 4T1 TNBC kasvajaosade immunohistokeemiline analüüs näitas kasvajasse infiltreeruvate efektorrakkude ruumilist jaotumist (joonis 4c). Kui vaba IL-12 ei parandanud CD8+ tsütotoksiliste T-rakkude ja Tbet+ (Th1) rakkude esinemist kasvajates, soodustas Nano-IL-12 mõlema raku kõrget infiltratsiooni sügavale. kasvaja piirkonnad. Samuti viitas gransüüm B ülesreguleerimine CD8+ rakkudes tsütotoksiliste T-rakkude kõrgemale aktivatsioonitasemele pärast NanoIL-12-ravi (joonis 4d). Lisaks täheldasime, et Nano-IL-12-ravi suurendas kasvajates PD-L1 ekspressiooni võrreldes PBS-i ja vaba IL{{20}}-ga ravitud kasvajatega. See suurenenud PD-L1 tase võib olla tingitud Nano-IL-12 poolt indutseeritud kõrgemast kasvaja IFN-𝛾-st, mis on väidetavalt stimuleerinud PD-L1 ekspressiooni kasvajakoes,[45] toimides immunosupressiooni mehhanismina. lümfotsüütide infiltratsiooni vastu. See kasvajasisene PD-L1 ülesreguleerimine viitab võimalusele sünergiseerida Nano-IL-12 kasvajavastast efektiivsust, kombineerides seda anti-PD-1 või anti-PD-L1 ICI-dega. Tuginedes ülaltoodud tähelepanekule, uurisime Nano-IL-12 mõju monoteraapiana ja kombinatsioonis antiPD-1 antikehadega TME-le (joonis 4e). Katse viidi läbi ortotoopiliste TNBC kasvajatega, mis valmistati hemaglutiniini (4T1-HA) ekspresseerivatest 4T1 rakkudest, kuna hemaglutiniin on täpselt määratletud immunogeen, mis võib hiiremudelis esile kutsuda antigeenispetsiifilise tsütotoksilise T-lümfotsüütide vastuse.[46] ,47] Hiiri raviti päevadel 0 ja 3 kaks korda 10 ug IL-12 või samaväärse Nano-IL-12-ga ning kombineeritud ravi korral süstiti hiirtele samaaegselt kaks korda 100 ug anti-PD. -1 antikeha. 7. päeval koguti kasvajaproovid voolutsütomeetria jaoks.

Tulemused kinnitasid, et Nano-IL-12-ravi kutsus esile suurema leukotsüütide (CD45+) infiltratsiooni kasvajas kui IL-12. Nano-IL-12 ja anti-PD-1 antikehade kombinatsioon näitas kasvajates ka kõrgemaid CD45+ rakke. Leukotsüütide hulgas olid lümfoidrakud ja T-rakud ülesreguleeritud Nano-IL-12 ja Nano-IL- 12/anti-PD-1antikehade kombinatsiooniga. Nano-IL-12-ravi põhjustas NK-rakkude populatsioonis tagasihoidliku muutuse, kuid põhjustas olulisi muutusi T-rakkude alarühmas võrreldes vaba IL{17}}-ga. Nimelt suurendas Nano-IL-12 selgelt CD8+ T-rakkude infiltratsiooni 4T1-HA kasvajatesse kui vaba IL-12. Veelgi enam, HA-tetrameer+ T-rakud, mis vastavad antigeenispetsiifilistele T-rakkudele, suurenesid oluliselt Nano-IL-12 pluss anti-PD- 1 antikehade kombinatsioonis, mis viitab adaptiivse immuunsüsteemi edendamisele. reaktsioon nano-IL-12 ja ICI-de sünergia kaudu. Üldised CD4+ T-rakud näitasid NanoIL-12-ga ravitud rühmades ülesreguleerimist. CD4+ T-rakkude alampopulatsiooni täpsustamiseks kasvajates värvisime rakud anti-Foxp3-ga, et uurida regulatiivseid T-rakke (Tregs). Kuigi anti-PD-1 monoteraapia ei näidanud 4T1- HA kasvaja mudelis Tregide pärssimist, on Nano-IL-12 ja anti-PD-1 kombinatsioon dramaatiliselt kurnasid Tregid. Veelgi enam, Nano-IL-12-ga töödeldud kasvajad sisaldasid rohkem Th-rakke kui vaba IL-12. Need tulemused näitavad, et ravi Nano-IL{50}} tugevdas kasvajavastaseid immuunrakke filtreerimisel ja sünergiseeris anti-PD-1 antikehadega, et ületada immunosupressiivne TME.

Joonis 3. Nano-IL-12 kontrollis põletikulist vastust spatiotemporally. a) Põletikuvastaste (IFN-𝛾, TNF-𝛼, IL-6) ja põletikuvastaste (IL-10) tsütokiinide tase veres 4T1-kandvatel hiirtel, kellele on süstitud 1{{14 }} ug IL-12 või samaväärne Nano-IL-12 kaks korda päevadel 0 ja 3. Tsütokiinide taset mõõdeti ELISA abil. Maksimaalsed väärtused pärast kahte süsti (2. ja 5. päeval IFN-𝛾, TNF-𝛼 ja IL-10 puhul; 2. ja 6. päeval IL-6 puhul) kuvatakse tulpdiagrammidena parem paneel. b–f) Tsütokiinide tase 4T1-kandvate hiirte organites ja kasvajates, kellele süstiti päeval 0 ja 3 kaks korda 10 ug IL-12 või samaväärset Nano-IL-12. ohverdati 2. ja 5. päeval kudede kogumiseks. (Andmed on näidatud keskmisena ± SD; n=6 hiirt rühma kohta; p väärtused on arvutatud paaritu t-testi abil.) g) Tsütokiinitasemete soojuskaardid veres, elundites ja kasvajates af keskmistest väärtustest teisendatuna Z-skooriks. h) 1 ug IL-12 või samaväärse Nano-IL-12 korduva intravenoosse süstimise (süstitud 7., 9., 11., 13., 15. ja 25. päeval, näidatud nooltega) kasvajavastane toime hiire TNBC vastu. Üksikud kasvaja kasvukõverad on näidatud vasakpoolsel paneelil. Kasvaja keskmise mahu kõverad on näidatud keskpaneelil ja ellujäämiskõverad on näidatud parempoolsel paneelil (andmed on näidatud keskmisena ± SEM; n=6 hiirt rühma kohta, p väärtused arvutatakse log-rank analüüsi abil ).

Joonis 4. Nano-IL-12 kasvajavastane toime tuleneb efektorrakkude suurenenud infiltratsioonist TME-s. a) CTL-ide infiltratsiooni voolutsütomeetriline analüüs melanoomiga pärast Nano-IL{5}}-ravi. Hiiri inokuleeriti B16F10 rakkudega päeval 0. IL-12 (1 ug) või samaväärset Nano-IL-12 süstiti iv kaks korda 8. ja 11. päeval. Kasvajaproovid koguti ja analüüsiti 15. päeval (andmed on näidatud keskmisena ± SD; n {{ 16}} hiirt rühma kohta; p-väärtused arvutati ühesuunalise ANOVA abil). b) Nano-IL-12 kasvajavastane toime CD4+, CD{8+ ja NK-rakkude ammendumisel. 4T1 kasvajatega hiirtele süstiti 7., 9., 11., 13. ja 15. päeval intravenoosselt Nano-IL-12 (1 ug IL-12 ekvivalenti). Lisaks süstiti hiirtele anti-CD4 , anti-CD8 ja anti-asiago GM1 antikehad 6., 8. ja 10. päeval. Kasvaja kasvukõverad (andmed on näidatud keskmisena ± SEM) ja ellujäämiskõverad (n=6 hiirt rühma kohta, p väärtused arvutatakse log-rank analüüsi abil). c) 4T1 kasvaja lõikude IHC kujutised. 4T1 TNBC kasvajaga hiirtele (kasvaja keskmine maht: 200 mm3) süstiti päevadel 0 ja 3 kaks korda iv PBS-i, 10 ug IL-12 või samaväärset Nano-IL-12. 7. päeval hiired ohverdati kasvajate kogumiseks. Kasvajate CD8+, Tbet või PD-L1+ rakud on visualiseeritud kollasena. Rakkude tuumad värviti Hoechstiga (sinine). Skaalariba=1 mm. d) Granzyme B (roheline) ja CD8 (punane) immunovärvimine 4T1 kasvaja lõikudes. Rakkude tuumad värviti Hoechstiga (sinine). Kollased pikslid näitavad aktiveeritud CD{65}} T-rakke. Skaalariba=100 μm. e) Lümfoidrakkude infiltratsiooni analüüs 4T1-HA kasvajates, mida on ravitud PBS-iga, PD1-vastaste antikehadega, IL-12, Nano-IL-12, IL-12 pluss anti- PD1 antikehad ja Nano-IL-12 pluss anti-PD1 antikehad. IL-12 ja Nano-IL-12 süstiti iv 10 ug 7. ja 9. päeval pärast inokuleerimist. Anti-PD-1 süstiti ip 100 ug 8. ja 10. päeval pärast inokuleerimist. 17. päeval hiired surmati ja kasvajad homogeniseeriti voolutsütomeetria mõõtmiseks (andmed on näidatud kui keskmine ± SD, n=5 proovi rühma kohta, p väärtused arvutati ühesuunalise ANOVA abil).

2.5. Nano-IL-12 ravi aktiveerib TME transkriptsioonitasemelt, et võimendada ICI vastust

Seejärel uurisime transkriptoomianalüüsi abil 4T1-HA kasvajate TME aktiveerimist pärast ravi geeniekspressiooni tasemelt. Kasvaja kudedest ekstraheeritud kogu RNA proovide sekveneerimine viidi läbi pärast töötlemist PBS-iga, anti-PD-1 antikehadega, IL-12, Nano-IL-12 ja tsütokiinide kombinatsioonidega ICI-d. Globaalse geeniekspressiooni soojuskaart näitas selgelt diferentseeritud geeniprofiile kasvajates, mis said Nano-IL-12 ja Nano-IL-12 kombinatsiooni anti-PD- 1-ga (joonis S11, tugiteave ). Nano-IL-12-ravi mõjutatud bioloogiliste protsesside täpsustamiseks analüüsisime igas rühmas erinevalt ekspresseeritud geene ja viisime läbi üles- ja allareguleeritud geenide rikastusanalüüsi (joonis 5a, b). Nii GOBP kui ka KEGG analüüs näitas, et võrreldes IL-12 ja PBS-iga reguleeris Nano-IL-12 ravi selgelt erinevate efektorimmuunrakkude, näiteks T-rakkude proliferatsiooni, diferentseerumise ja funktsionaalse aktiveerimise stimuleerimist. proliferatsioon, T-rakkude diferentseerumine Th-rakkudeks ning T-rakkude aktiveerimine ja T-raku retseptori signaaliülekande rada. Lisaks leiti, et PD-L1 ekspressiooni ja PD-1 kontrollpunkti rajaga seotud geenid on Nano-IL-12 ravil ülesreguleeritud. Need tulemused toetavad NanoIL-12 tugevat stimuleerimist T-rakkudele, mida täheldati voolutsütomeetria ja immunohistoloogia uuringutes. Samal ajal mõjutas Nano-IL-12-ravi positiivselt geene, mis on seotud teiste immuunrakkudega, nagu monotsüütide ja NK-rakkudega. Samuti reguleeriti Nano-IL-12-ravi tõttu üles tsütokiinivastus ja muud immuunprotsessid, nagu antigeeni esitus. Teisest küljest vähendas Nano-IL{31}} rakkude jagunemisega seotud radasid, mis viitab sellele, et ravi võib pärssida kasvajarakkude proliferatsiooni (joonis S11, tugiteave). Need tulemused näitavad Nano-IL-12 eeliseid nii kaasasündinud kui ka kohanemisvõimelise kasvajasisese immuunsuse aktiveerimisel.

Kombineeritud ravi edasine uurimine näitas, et kombineeritud ravi Nano-IL-12 pluss anti-PD-1 antikehadega suurendas kasvajasisest immuunsust võrreldes IL-12 pluss anti-PD{{6} } antikehi või anti-PD-1 monoteraapiat, stimuleerides nii kaasasündinud kui ka adaptiivseid immuunradasid (joonis 5b ja joonis S11c, tugiteave). Muljetavaldavalt põhjustas NanoIL-12 pluss anti-PD-1 antikehade kombinatsioon mitoosiga seotud radade tugevamat inhibeerimist, järeldades, et see kombinatsioon võib vahendada infiltreerunud efektorrakkude tugevamat tapmisaktiivsust kasvajarakkude vastu. RNA-seq tulemuste põhjal analüüsisime ka kasvajasse infiltreeruvate immuunrakkude populatsioone (joonis 5c, d). Nagu voolutsütomeetria tulemused, näitasid nano-IL{18}}-ga töödeldud rühmad CD8+ T-rakkude suurenenud infiltratsiooni. Lisaks näitasid tulemused ka monotsüütide ja granulotsüütide ülesreguleerimist, kinnitades kasvajate suurenenud põletikku, mis tuleneb võimendatud kaasasündinud immuunradadest. Need tulemused kinnitasid, et Nano-IL{21}} loob tugeva immuunvastuse kasvajate vastu ja kombinatsioon anti-PD-1-ga võib seda protsessi tugevdada.

Joonis 5. Nano-IL-12 ravi suurendab immuunaktivatsiooni TME-s, et tugevdada PD1-vastaseid antikehi. a) Erinevalt ekspresseeritud geenide vulkaanidiagrammid Nano-IL-12 versus IL-12 ja Nano-IL-12 + anti-PD-1 versus IL{{12} } anti-PD-1. Diagrammid saadi erinevate ravimeetoditega ravitud 4T1-HA kasvajate RNA-seq analüüsist: 7. ja 9. päeval pärast inokuleerimist süstiti 10 ug IL-12 ja samaväärne Nano-IL-12. . Anti-PD-1 süstiti ip 100 ug 8. ja 10. päeval pärast inokuleerimist. 17. päeval hiired surmati kasvajaproovide kogumiseks. b) Rikastamisanalüüs, mis näitab ülesreguleeritud radu kahes võrdluspaaris punktis a. c) TME rakupopulatsioonide soojuskaart, mis on määratud RNA-seq. Populatsioonid teisendati joonise joonistamiseks Z-skoorideks. d) rakupopulatsioonide histogrammid, mis näitavad olulisi erinevusi mitmes võrdluses (andmed on näidatud keskmisena ± SD; PBS rühma puhul n=5 proovi; teiste rühmade puhul n=4 proovi rühma kohta; p väärtused arvutatakse ühesuunalise ANOVA abil).

2.6. Nano-IL-12 sünergiseerub ICI-dega, et tõhusalt likvideerida primaarsed ja metastaatilised kasvajad

Nano-IL-12 terapeutilise potentsiaali uurimiseks sünergiseerida ICI-dega, tuvastati hiirtel ortotoopsed primaarsed TNBC kasvajad, inokuleerides rinnanäärme rasvapadjale 4T1 rakke. Hiiri raviti Nano-IL{5}}-ga erinevate annustamisskeemide ja ICI-de kombinatsioonide järgi, et testida vastavate ravimeetodite kasvajavastast efektiivsust. Leidsime, et isegi väikese annuse (1 ug IL-12 ekvivalentsus/süst) korral avaldas korduv ravi Nano-IL-12-ga monoteraapiana selget kasvajavastast toimet primaarsete TNBC kasvajate vastu. seda näitab kasvaja kasvukiiruse pärssimine ja pikenenud elulemus (joonis S12, lisateave). Selle annusega tasuta IL-12-ravi ei näidanud aga mingit efektiivsust, isegi kui seda kombineeriti anti-PD-1-raviga. Nano-IL- 12 ja anti-PD-1 kombinatsioon suurendas veelgi efektiivsust ja saavutati CR. Seejärel uurisime suuremat Nano-IL-12 annust (10 ug IL-12 ekvivalenti süsti kohta) ja kombineerisime seda ICI kokteilidega (antiPD-1 ja anti-CTLA4 antikehad), et täita terapeutilist eesmärki. potentsiaal. Nimelt peatas selle annuse juures kombineeritud ravi Nano-IL-12 ICI-dega kasvaja kasvu ja likvideeris kasvajad täielikult (joonis 6a), kusjuures kõigil hiirtel ilmnes selles ravirühmas CR. Lisaks näitasid paranenud hiired resistentsust tuumori uuesti nakatamise vastu 4T1 rakkudega, toetades tugeva immuunmälu olemasolu Nano-IL-12 ja ICI-de kombineeritud raviga.

cistanche taime suurendav immuunsüsteem

TNBC on tuntud kui agressiivne kasvaja, millel on suur kaugmetastaaside määr.[48,49] Seega uurisime järgmisena Nano-IL-12 toimivust metastaatilise TNBC mudelis. Primaarsete ortotoopsete 4T1 kasvajate resektsiooniga loodi spontaanne metastaatiline TNBC mudel, mis viib metastaaside tekkeni mitmes elundis, peamiselt kopsudes.[50] Selles mudelis näitas Nano-IL-12 kombineeritud ravi ICI-dega ka rahuldavaid tulemusi, mis peatas kopsumetastaaside progresseerumise (joonis 6b) ja viis CR-i kõigil ravitud hiirtel. Veelgi enam, pärast 4T1 rakkude intravenoosset süstimist ilmnes enamikul paranenud hiirtel tugev resistentsus, mis viitab tõhusale immuunmälule Nano-IL-12 ja ICI-de kombinatsioonist. Lisaks TNBC-le testisime primaarses B16F10 melanoomimudelis ka Nano-IL{15}} koos ICI-ga (joonis S13, tugiteave). Tulemused näitasid, et Nano-IL-12 (10 ug IL-12 ekvivalentsus süsti kohta) anti-PD-1 antikehaga põhjustas CR-i 4 hiirel 6-st rühmas. , ja ravitud hiired näitasid resistentsust B16F10 rakkudega uuesti nakatumise vastu, mis viitab tugevale immunoloogilisele mälule.

3. Arutelu

Oleme välja töötanud kasvajaga aktiveeritava IL-12 strateegia, milles kasutatakse tundlikke nanotsütokiine (Nano-IL-12), mis võivad vaigistada IL-12 bioaktiivsust pH 7,4 juures, kuid taastada täielikult aktiivse tsütokiini intratumoraalne pH. Süsteemse süstimise korral ringles Nano-IL-12 stabiilselt vereringes, vähendades immuunvastust mittepatoloogilistes kohtades ja irAE esinemissagedust isegi pärast korduvat manustamist. Teisest küljest suurendab nano-IL-12 suur akumuleerumine ja aktiveerumine kasvajates oluliselt ICI-de efektiivsust ja sünergiat, saavutades CR külmakasvaja mudelites, mis on resistentsed ICI-de suhtes, ja andes tahke immuunmälu pärast ravi.

Nano-IL-12 aktiveeris põhjalikult TME, kutsudes esile põletikuliste tsütokiinide tugeva sekretsiooni, suurendades efektorrakkude infiltratsiooni ja vähendades immunosupressiivsete rakkude olemasolu. Lisaks reguleeris Nano-IL-12 üles PD-L1 taset kasvajarakkudes, mis võib soodustada anti-PD-1 antikehade aktiivsust. Nano-IL-12 põhjustatud TME muutused tegid koostööd antiPD-1 antikehadega, et stimuleerida vähi immuunsust antigeeni esitluse tõhustamise, efektorrakkude suurenenud esinemise ja nende aktiivsuse tugevdamise kaudu ning immuunrakkude interaktsiooni edendamine. Kliinilised uuringud on näidanud, et PD1/anti-PD-L1 kontrollpunkti blokaadil on kõrgem ravivastuse määr PD-L{17}}positiivsetel TNBC patsientidel, kellel on suur arv kasvajasse infiltreeruvaid lümfotsüüte.[51,52] Immuunkontrollpunkti blokaadi üldine tulemuslikkus TNBC monoteraapiana ei olnud rahuldav[53,54] TNBC üldiselt madala ekspressiooni ja oluliselt heterogeense TME tõttu[55,56] Tegelikult ainult PD-L1 blokeerimine kombinatsioonis keemiaraviga. (Nab-Paclitaxel) on heaks kiidetud metastaatilise TNBC-ga patsientidel, mis annab väikese osa TNBC-ga patsientide üldisest ellujäämisest mõõdukalt.[57] Seega võib Nano-IL{30}} potentsiaal alistada immunosupressiivne TME ja võimendada TNBC PD-L1 ekspressiooni, olla kindel alternatiiv kontrollpunkti blokaadi reageerimiskiiruste suurendamiseks. Nano-IL-12 suurem ohutus on ka terapeutilisel kasutamisel oluline eelis. Varasemad kliinilised uuringud on näidanud, et süsteemselt süstitud IL-12 kutsub esile tugeva hematoloogilise ja maksatoksilisuse.[58,59] Sellised kõrvaltoimed on peamiselt seotud IL-i poolt indutseeritud IFN-𝛾 ja TNF-𝛼 tootmisega{40} } ravi.[42,60] Meie uuringus näitas Nano-IL-12 veres ja elundites oluliselt madalamat tsütokiini taset kui vaba IL-12, mis piiras elundikahjustusi. Seega suutsime Nano-IL- 12 mitu korda süstida 10 ug IL-12 hiire kohta, st umbes 500 ug kg-1, mis on ligikaudu {{52} } korda suurem kui IL{53}} maksimaalne talutav annus (MTD) inimestel, st 500 ng kg-1. [61] Kliinilistes uuringutes täheldatud süsteemse IL-12-ravi teine ​​oluline kõrvalmõju on adaptiivse põletikuvastase reaktsiooni tekkimine pärast IL-12 teistkordset manustamist, mis viib efektiivsuse vähenemiseni. [20,21] Sellist nähtust on seostatud negatiivse tagasiside mehhanismidega, mis on seotud põletikuvastase IL-10 ületootmisega ja põletikueelsete tsütokiinide, nagu IFN-𝛾, TNF-𝛼 ja IL{{ 67}}.[20,22] Nano-IL-12 vältis IL-10 sisalduse suurenemist veres ja elundites pärast teist manustamist, mis võib olla mugav korduvate manustamisskeemide täitmiseks ilma, et annus väheneks. kasvajavastased toimed. Eelkõige ei suurendanud ravi Nano-IL-12-ga IL-10 kontsentratsiooni kasvajates, säilitades IFN-𝛾, TNF-𝛼 ja IL-6 kõrge kasvajasisese taseme.

Joonis 6. Nano-IL-12 sünergiseerub immuunsüsteemi kontrollpunkti inhibiitoritega, et likvideerida rinnakasvajaid. Nii ortotroopsetes kui ka metastaatilistes TNBC mudelites rühmitati hiired PBS-i, IL-12 + ICI-de (anti-CTLA4 ja anti-PD-1) ja Nano-IL-12 + ICI-ravi (annus) saamiseks. ja raviskeem olid näidatud vastavalt ülemiste paneelide skeemis). a) Nano-IL-12 ja ICI-de kombineeritud ravi viis ortotoopsete kasvajate täieliku likvideerimiseni kõigil ravitud hiirtel. Üksikud kasvaja kasvukõverad on näidatud vasakpoolsel paneelil. Kasvaja keskmine maht ja ellujäämiskõverad on näidatud paremas ülanurgas. Ravitud hiirtel oli tugev kaitse 4T1 rakkude uuesti süstimise vastu rinnanäärmesse, ilma kasvaja kasvuta ravitud hiirtel (alumine parem paneel). b) Nano-IL-12 ja ICI-de kombinatsioonravi inhibeeris tugevat metastaatilise kasvaja progresseerumist. Pärast ravi (23. päev) ilmnes Nano-IL-12 + ICI-de kombinatsioonravi saanud hiirte kopsudes selgelt vähem metastaase, mida näitasid tüüpilised fotod (rohelised nooled: makroskoopilised metastaasid) ja histoloogiline hinnang (skaala riba {{21) }} μm), mis on esitatud vasakpoolsel paneelil. Nano-IL-12 + ICI kombinatsioonravi viis lõpuks kõigi ravitud hiirte täieliku ravivastuseni, nagu näitavad ellujäämiskõverad (ülemine parem paneel). Samuti näitasid paranenud hiired 4T1 rakkude süstimisega tugevat kaitset kasvaja taasnakke vastu (alumine parem paneel). (Andmed on näidatud kui keskmine ± SEM; n=6 hiirt rühma kohta; p väärtused arvutati log-rank analüüsi abil).

Kuna IL-12 peetakse üheks võimsamaks immunostimuleerivaks tsütokiiniks, uuritakse intensiivselt mitmeid meetodeid IL-12-indutseeritud toksilisuse leevendamiseks ja selle tõhususe suurendamiseks. Strateegiad, mis kasutavad tsütokiini in situ tootmiseks otsest kasvajasisest süstimist, näiteks IL-12 ja adjuvantide[62] ja plasmiidse DNA[63] või IL-12 kodeeriva messenger-RNA[64] baasil valmistatud preparaate. maksimeerida terapeutilist indeksit.[8] Siiski võib kohalik manustamine kliinikus seista silmitsi mitmete piirangutega, sealhulgas mittesüstitavates asendites kasvavate kasvajate raviga, [65] operaatorist sõltuva toimega,[66] süstitavate ravimite ebaühtlase jaotumisega kasvajas[67] ja lekkest tingitud sihtmärgist kõrvalekaldumine.[68] Veelgi enam, intratumoraalselt süstitavate preparaatide vähivastane toime kaugete metastaaside vastu sõltub suuresti abskopaalse toime muutuvast efektiivsusest, [69] mis on kliinilistes uuringutes [70–72] näidanud madalat esinemissagedust ja ei pruugi olla võimeline ületama immunosupressiivseid signaale. metastaasides.[73] Võimalus ohutult manustada Nano-IL-i{21}} süsteemse intravenoosse süstiga, mis on standardne kliiniline protseduur, võimaldab prognoositavat farmakokineetikat ja võimaldab verevarustuse kaudu juurdepääsu kõikidele kasvajakohtadele. IL-12-põhised Fc-liitvalgud[14] ja immunotsütokiinid[11–13] jagavad neid eeliseid ka NanoIL-iga-12. Nendes ühendites sisalduv IL-12 on aga süsteemselt aktiivne, mis tekitab ohutusega seotud probleeme. Näiteks on pika tsirkulatsiooniga IL-12 sulandvalgud näidanud kõrget seerumi IFN-𝛾[74,75] ja IL-12 immuuntsütokiinide akumuleerumist sihtmärgivälistele kohtadele.[76, 77] Nano-IL-12 võime kontrollida spatiotemporaalset aktivatsiooni võib pakkuda turvalise ja tõhusa strateegia, mis on spetsiifiline kasvaja sihtimisel.

Cistanche tubulosa-Antitumor eelised

Meie praeguse uuringu piirang seisneb selles, et Nano-IL-12 põhineb hiire IL-l-12. Arvestades, et hiire IL-12 ja inimese IL-12 homoloogia on ligikaudu 60–70%, oleks vaja täiendavaid uuringuid, et määrata kindlaks inimese IL-12--põhise aktiivsusega nanotsütokiini koostis. ohutusprofiilid, mis on võrreldavad hiirepõhise süsteemiga. Hea on, et esialgsed testid on näidanud, et meie uuringus kasutatud polümeerid võivad katta ka inimese IL-12 sarnase pH-tundlikkusega. Pealegi, kuna polümeere saab täpselt konstrueerida, oleks võimalik välja töötada inimese IL{10}}põhine süsteem, millel on inimestele sobivad ajaruumilised profiilid. Kokkuvõtteks võib öelda, et Nano-IL-12 kui nanotsütokiinid saavutasid süsteemsel manustamisel tõhusa IL-12 aktiivsuse spatiotemporaalse kontrolli, tagades kasvajasisese immuunsuse täpse stimuleerimise, et saada rahuldav ohutus ja ravitulemused primaarse ja metastaatilise külmakasvaja korral. mudelid, mis sünergiseerivad kontrollpunkti blokaadiga. Kuna Nano-IL-12 kokkupanemiseks kasutatavaid polümeere saab konstrueerida paljude erinevate molekulmassi ja pinnalaenguga valkude kapseldamiseks, on süsteemil potentsiaali laiemateks rakendusväljavaadeteks, näiteks kapseldada teisi terapeutilisi tsütokiine või isegi tsütokiini kokteilid. Veelgi enam, kuna polümeerset süsteemi saab konstrueerida lisaks pH-le ka muude stiimulite tajumiseks,[78] saab nanotsütokiine kavandada mitmesuguste kasvajate mikrokeskkondade sihtimiseks. Lõpuks, arvestades kasutatavate polümeeride ja nanotsütokiinide translatsioonipotentsiaali, on sellel strateegial vähi immunoteraapia tuleviku jaoks paljutõotav.

viited

[1] AJ Korman, SC Garrett-Thomson, N. Lonberg, Nat. Rev. Drug Discovery 2021, 21, 509.

[2] A. Ribas, JD Wolchok, Science 2018, 359, 1350.

[3] A. Haslam, V. Prasad, JAMA Network Open 2019, 2, e192535.

[4] P. Sharma, BA Siddiqui, S. Anandhan, SS Yadav, SK Subudhi, J. Gao, S. Goswami, JP Allison, Cancer Discovery 2021, 11, 838.

[5] JD Martin, H. Cabral, T. Stylianopoulos, RK Jain, Nat. Rev. Clin. Oncol. 2020, 17, 251.

[6] CM Fares, EM Van Allen, CG Drake, JP Allison, S. HuLieskovan, Am. Soc. Clin. Oncol. Education. Raamat. 2019, 39, 147.

[7] K. Chamoto, R. Hatae, T. Honjo, Int. J. Clin. Oncol. 2020, 25, 790.

[8] KG Nguyen, MR Vrabel, SM Mantooth, JJ Hopkins, ES Wagner, TA Gabaldon, DA Zaharoff, esiosa. Immunol. 2020, 11, 2510.

[9] EA Chiocca, AB Gelb, CC Chen, G. Rao, DA Reardon, PY Wen, WL Bi, P. Peruzzi, C. Amidei, D. Triggs, L. Seften, G. Park, J. Grant, K. Truman, JY Buck, N. Hadar, N. Demars, J. Miao, T. Estupinan, J. Loewy, K. Chadha, J. Tringali, L. Cooper, R. V Lukas, Neuro-Oncology 2021, 24, 951.

[10] B. Mirlekar, Y. Pylayeva-Gupta, Cancers 2021, 13, 167.

[11] A. Mansurov, J. Ishihara, P. Hosseinchi, L. Potin, TM Marchell, A. Ishihara, J.-MM Williford, AT Alpar, MM Raczy, LT Gray, MA Swartz, JA Hubbell, Nat. Biomed. Eng. 2020, 4, 531.

[12] N. Pasche, D. Neri, Drug Discovery Today 2012, 17, 583.

[13] J. Strauss, CR Heery, JW Kim, C. Jochems, RN Donahue, AS Montgomery, S. McMahon, E. Lamping, JL Marte, RA Madan, M. Bilusic, MR Silver, E. Bertotti, J. Schlom, JL Gulley, Clin. Cancer Res. 2019, 25, 99.

[14] K. Jung, JH Ha, JE Kim, JA Kim, YJ Kim, CH Kim, YS Kim, OncoImmunology 2018, 7, e1438800.

[15] A. Mansurov, P. Hosseinchi, K. Chang, AL Lauterbach, LT Gray, AT Alpar, E. Budina, AJ Slezak, S. Kang, S. Cao, A. Solanki, S. Gomes, J.- M. Williford, MA Swartz, JL Mendoza, J. Ishihara, JA Hubbell, Nat. Biomed. Eng. 2022, 6, 819.

[16] HD Chang, A. Radbruch, ekspert Rev. Clin. Immunol. 2014, 3, 709.

[17] H. Chang, A. Radbruch, D. Rheumaforschungszentrum, Ann. NY Acad. Sci. 2007, 1109, 40.

[18] S. Tugues, SH Burkhard, I. Ohs, M. Vrohlings, K. Nussbaum, J. Vom Berg, P. Kulig, B. Becher, Cell Death Differ. 2014, 22, 237.

[19] C. Asselin-Paturel, M. Isabelle Vergnon, B. Hamid Echchakir, M. Guillaume Dorothé, M. Sé vrine Blesson, M. Franç oise Gay, B. Fathia Mami-Chouaib, S. Chouaib, Cancer 2001, 91, 113.

[20] JEA Portielje, CHJ Lamers, WHJ Kruit, A. Sparreboom, RLH Bolhuis, G. Stoter, C. Huber, JW Gratama, Clin. Cancer Res. 2003, 9, 76.

[21] JP Leonard, ML Sherman, GL Fisher, LJ Buchanan, G. Larsen, MB Atkins, JA Sosman, JP Dutcher, NJ Vogelzang, JL Ryan, Blood 1997, 90, 2541.

[22] E. Bajetta, M. Del Vecchio, R. Mortarini, R. Nadeau, A. Rakhit, L. Rimassa, C. Fowst, A. Borri, A. Anichini, G. Parmiani, Clin. Cancer Res. 1998, 4, 75.

[23] C. Corbet, O. Feron, Nat. Rev. Cancer 2017, 17, 577. [24] M. Bellone, A. Calcinotto, P. Filipazzi, A. De Milito, S. Fais, L. Rivoltini, Oncoimmunology 2013, 2, e22058.

[25] S. Damgaci, A. Ibrahim-Hashim, PM Enriquez-Navas, S. PilonThomas, A. Guvenis, RJ Gillies, Immunology 2018, 154, 354.

[26] J. Liu, H. Cabral, B. Song, I. Aoki, Z. Chen, N. Nishiyama, Y. Huang, K. Kataoka, P. Mi, ACS Nano 2021, 15, 13526.

[27] A. Tao, GLo Huang, K. Igarashi, T. Hong, S. Liao, F. Stellacci, Y. Matsumoto, T. Yamasoba, K. Kataoka, H. Cabral, Macromol. Biosci. 2020, 20, 1900161.

[28] Y. Mochida, H. Cabral, Y. Miura, F. Albertini, S. Fukushima, K. Osada, N. Nishiyama, K. Kataoka, ACS Nano 2014, 8, 6724.

[29] JS Suk, Q. Xu, N. Kim, J. Hanes, LM Ensign, adv. Drug Delivery Rev. 2016, 99, 28.

[30] CY Sun, Y. Liu, JZ Du, ZT Cao, CF Xu, J. Wang, Angew. Chem., Int. Ed. 2016, 55, 1010.

[31] A. Ibrahim-Hashim, V. Estrella, Cancer Metastasis Rev. 2019, 38, 149.

[32] G. Trincieri, F. Gerosa, J. Leukocyte Biol. 1996, 59, 505.

[33] T. Starciuc, B. Malfait, F. Danede, L. Paccou, Y. Guinet, NT Correia, A. Hedoux, J. Pharm. Sci. 2020, 109, 496.

[34] G. Egawa, S. Nakamizo, Y. Natsuaki, H. Doi, Y. Miyachi, K. Kabashima, Stem Cells Int. 2013, 3, 1932.

[35] S. Jayanthi, BP Koppolu, KG Nguyen, SG Smith, BK Felber, TKS Kumar, DA Zaharoff, Stem Cells Int. 2017, 7, 5360.

[36] Parlamendisaadik Hwuang, RJ Fecek, T. Qin, WJ Storkus, Y. Wang, J. Kontrollitud väljalase 2019, 318, 270.

[37] Q. Wang, Y. Wang, J. Ding, C. Wang, X. Zhou, W. Gao, H. Huang, F. Shao, Z. Liu, Nature 2020, 579, 421.

[38] G. Trincieri, Annu. Rev. Immunol. 1995, 13, 251.

[39] L. Meyaard, E. Hovenkamp, ​​SA Otto, F. Miedema, J. Immunol. 1996, 156, 2776.

[40] A. Cope, GLe Friec, J. Cardone, C. Kemper, Trends Immunol. 2011, 32, 278.

[41] SP Kerkar, RS Goldszmid, P. Muranski, D. Chinnasamy, Z. Yu, RN Reger, AJ Leonardi, RA Morgan, E. Wang, FM Marincola, G. Trinchieri, SA Rosenberg, NP Restifo, J. Clin . Investeeri. 2011, 121, 4746.

[42] W. Lasek, R. Zago˙zd˙zon, M. Jakobisiak, Cancer Immunol. Immuunsus. 2014, 63, 419.

[43] C. Zhang, J. Zhang, J. Niu, Z. Zhou, J. Zhang, Z. Tian, ​​Hum. Immunol. 2008, 69, 490.

[44] NG Jacobson, SJ Szabo, RM Weber-Nordt, Z. Zhong, RD Schreiber, JE Darnell, KM Murphy, J. Exp. Med. 1995, 181, 1755.

[45] K. Mimura, JL Teh, H. Okayama, K. Shiraishi, LF Kua, V. Koh, DT Smoot, H. Ashktorab, T. Oike, Y. Suzuki, Z. Fazreen, BR Asuncion, A. Shabbir , WP Yong, J. So, R. Soong, K. Kono, Cancer Sci. 2018, 109, 43.

[46] T. Watanabe, S. Watanabe, G. Neumann, H. Kida, Y. Kawaoka, J. Virol. 2002, 76, 767.

[47] AS Bergot, A. Durgeau, B. Levacher, BM Colombo, JL Cohen, D. Klatzmann, Cancer Gene Ther. 2010, 17, 645.

[48] ​​R. Dent, M. Trudeau, KI Pritchard, WM Hanna, HK Kahn, CA Sawka, LA Lickley, E. Rawlinson, P. Sun, SA Narod, Clin. Cancer Res. 2007, 13, 4429.

[49] BG Haffty, Q. Yang, M. Reiss, T. Kearney, SA Higgins, J. Weidhaas, L. Harris, W. Hait, D. Toppmeyer, J. Clin. Oncol. 2006, 24, 5652.

[50] AV Paschall, K. Liu, J. Visualized Exp. 2016, 2016, 54040.

[51] A. Marra, G. Viale, G. Curigliano, BMC Med. 2019, 17, 90.

[52] R. Thomas, G. Al-Khadairi, J. Decock, Front. Oncol. 2021, 10, 3464.

[53] S. Adams, P. Schmid, HS Rugo, EP Winer, D. Loirat, A. Awada, DW Cescon, H. Iwata, M. Campone, R. Nanda, R. Hui, G. Curigliano, D. Toppmeyer, J. O'Shaughnessy, S. Loi, S. Paluch-Shimon, AR Tan, D. Card, J. Zhao, V. Karantza, J. Cortés, Ann. Oncol. 2019, 30, 397.

[54] LY Dirix, I. Takacs, G. Jerusalem, P. Nikolinakos, HT Arkenau, A. Forero-Torres, R. Boccia, ME Lippman, R. Somer, M. Smakal, LA Emens, B. Hrinczenko, W Edenfield, J. Gurtler, A. von Heydebreck, HJ Grote, K. Chin, EP Hamilton, Breast Cancer Res. Ravida. 2018, 167, 671.

[55] EA Mittendorf, AV Philips, F. Meric-Bernstam, N. Qiao, Y. Wu, S. Harrington, X. Su, Y. Wang, AM Gonzalez-Angulo, A. Akcakanat, A. Chawla, M. Curran, P. Hwu, P. Sharma, JK Litton, JJ Molldrem, G. Alatrash, Cancer Immunol. Res. 2014, 2, 361.

[56] MT Barrett, E. Lenkiewicz, S. Malasi, A. Basu, JH Yearley, L. Annamalai, AE McCullough, HE Kosiorek, P. Narang, MA Wilson Sayres, M. Chen, KS Anderson, BA Pockaj, Breast Cancer Res. 2018, 20,71.

[57] P. Schmid, S. Adams, HS Rugo, A. Schneeweiss, CH Barrios, H. Iwata, V. Diéras, R. Hegg, S.-A. Im, GS Wright, V. Henschel, L. Molinero, SY Chui, R. Funke, A. Husain, EP Winer, S. Loi, LA Emens, N. Engl. J. Med. 2018, 379, 2108.

[58] MK Gately, U. Gubler, MJ Brunda, RR Nadeau, TD Anderson, JM Lipman, U. Sarmiento, Ther. Immunol. 1994, 1, 187.

[59] UM Sarmiento, JH Riley, PA Knaack, JM Lipman, JM Becker, MK Gately, R. Chizzonite, TD Anderson, Lab. Investeeri. 1994, 71, 862.

[60] VM Eng, BD Car, B. Schnyder, M. Lorenz, S. Lugli, M. Aguet, TD Anderson, B. Ryffel, VFJ Quesniaux, J. Exp. Med. 1995, 181, 1893.

[61] JA Gollob, KG Veenstra, RA Parker, JW Mier, DF McDermott, D. Clancy, L. Tutin, H. Koon, MB Atkins, J. Clin. Oncol. 2003, 21, 2564.

[62] Y. Agarwal, LE Milling, JYH Chang, L. Santollani, A. Sheen, EA Lutz, A. Tabet, J. Stinson, K. Ni, KA Rodrigues, TJ Moyer, MB Melo, DJ Irvine, KD Wittrup , Nat. Biomed. Eng. 2022, 6, 129.

[63] ML Lucas, L. Heller, D. Coppola, R. Heller, Mol. Seal. 2002, 5, 668.

[64] SL Hewitt, D. Bailey, J. Zielinski, A. Apte, F. Musenge, R. Karp, S. Burke, F. Garcon, A. Mishra, S. Gurumurthy, A. Watkins, K. Arnold, J. Moynihan, E. Clancy-Thompson, K. Mulgrew, G. Adjei, K. Deschler, D. Potz, G. Moody, DA Leinster, S. Novick, M. Sulikowski, C. Bagnall, P. Martin, JM Lapointe, H. Si, C. Morehouse, M. Sedic, RW Wilkinson, R. Herbst jt, Clin. Cancer Res. 2020, 26, 6284.

[65] RS Riley, CH June, R. Langer, MJ Mitchell, Nat. Rev. Drug Discovery 2019, 18, 175.

[66] I. Melero, E. Castanon, M. Alvarez, S. Champiat, A. Marabelle, Nat. Rev. Clin. Oncol. 2021, 18, 558.

[67] LM Wein, JT Wu, DH Kirn, Cancer Res. 2003, 63, 1317.

[68] J. Hong, C.-O. Yun, BMC Biomed. Eng. 2019, 1., 17.

[69] A. Mukhopadhyay, J. Wright, S. Shirley, DA Canton, C. Burkart, RJ Connolly, JS Campbell, RH Pierce, Gene Ther. 2018, 26, 1.

[70] MA Postow, MK Callahan, CA Barker, Y. Yamada, J. Yuan, S. Kitano, Z. Mu, T. Rasalan, M. Adamow, E. Ritter, C. Sedrak, AA Jungbluth, R. Chua , AS Yang, R.-A. Roman, S. Rosner, B. Benson, JP Allison, AM Lesokhin, S. Gnjatic, JD Wolchok, N. Engl. J. Med. 2012, 366, 925.

[71] EF Stamell, JD Wolchok, S. Gnjatic, NY Lee, I. Brownell, Int. J. Radiat. Oncol., Biol., Phys. 2013, 85, 293.

[72] EB Golden, S. Demaria, PB Schiff, A. Chachoua, SC Formenti, Cancer Immunol. Res. 2013, 1, 365.

[73] TY Seiwert, AP Kiess, J. Clin. Oncol. 2021, 39, 1.

[74] E. Gutierrez, M. Bigelow, C. LaCroix, P. Kirby, L. Markowitz, M. Naill, S. O'Neil, PA Hull, J. Engelhardt, J.-M. Cuillerot, A. Cheung, A. Grinberg, N. Wagtmann, Cancer Res. 2021, 81, 1714

[75] R. Varma, K. Liu, C. Bonzon, R. Rashid, N. Rodriguez, N. Hassanzadeh-Kiabi, C. Ardila, SY Chu, US Muchhal, JR Desjarlais, MJ Bernett, Cancer Res. 2020, 80, 5549.

[76] J. Sharifi, LA Khawli, P. Hu, S. King, AL Epstein, Hybrid Hybridomics 2001, 20, 305.

[77] C. Halin, S. Rondini, F. Nilsson, A. Berndt, H. Kosmehl, L. Zardi, D. Neri, Nat. Biotehnoloogia. 2002, 20, 264.

[78] S. Mura, J. Nicolas, P. Couvreur, Nat. Mater. 2013, 12, 991.

[79] E. Becht, NA Giraldo, L. Lacroix, B. Buttard, N. Elarouci, F. Petitprez, J. Selves, P. Laurent-Puig, C. Sautès-Fridman, WH Fridman, A. de Reyniès, Genome Biol. 2016, 17, 218