Uudse interleukiini-17 homoloogi rolli uurimine selgrootutest merekarpidest Mytilus Coruscusest kaasasündinud immuunreaktsioonis: kas Mc-Novel_miR_145 negatiivne reguleerimine on võti?
Dec 11, 2023
Abstraktne: Interleukiin-17 (IL-17) esindab põletikueelsete tsütokiinide klassi, mis on seotud krooniliste põletikuliste ja degeneratiivsete häiretega. Enne seda uuringut ennustati, et Mc-novel_miR_145 võib olla suunatud IL-17 homoloogile, et osaleda Mytilus coruscus'e immuunvastuses. Selles uuringus kasutati mitmesuguseid molekulaar- ja rakubioloogia uurimismeetodeid, et uurida seost Mc-novel_miR_145 ja IL-17 homoloogi ning nende immunomoduleeriva toime vahel. Bioinformaatika ennustus kinnitas IL-17 homoloogi seotust rannakarbi IL-17 perekonnaga, millele järgnesid kvantitatiivsed reaalajas PCR-analüüsid (qPCR), et näidata, et McIL-17-3 ekspresseerub kõrgelt immuunsüsteemiga seotud kudesid ja reageeris bakteriaalsetele väljakutsetele. Lutsiferaasi reportertestide tulemused kinnitasid McIL{15}} potentsiaali aktiveerida allavoolu NF-κb ja selle sihtimist Mc-novel_miR_145 poolt HEK293 rakkudes. Uuringus toodeti ka McIL-17-3 antiseerumit ja leiti, et Mc-novel_miR_145 reguleerib negatiivselt McIL-17-3 Western blot analüüsi ja qPCR analüüside kaudu. Lisaks näitas voolutsütomeetria analüüs, et Mc-novel_miR_145 reguleeris negatiivselt McIL-17-3-d, et leevendada LPS-i indutseeritud apoptoosi. Praegused tulemused näitasid ühiselt, et McIL{31}} mängis olulist rolli molluskite immuunkaitses bakterite rünnaku vastu. Lisaks reguleeris Mc-novel_miR_145 negatiivselt McIL- 17-3-d, et osaleda LPS-i indutseeritud apoptoosis. Meie leiud annavad uue ülevaate mittekodeeriva RNA regulatsioonist selgrootute mudelites.
Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi
Märksõnad: Mytilus couscous; interleukiin-17; mikroRNA; apoptoos; kaasasündinud immuunsus
1. Sissejuhatus
Immuunsüsteemil on ülioluline roll organismi kaitses eksogeensete patogeenide sissetungi vastu. Tavapäraselt jaguneb kaitsesüsteem kaasasündinud immuunsuseks ja omandatud immuunsuseks. Kaasasündinud immuunsus on keha esimene kaitseliin patogeenide vastu, mis suudab tuvastada patogeenide sissetungi ja need osaliselt kõrvaldada [1]. Kaasasündinud immuunsust vahendavad väga erinevad rakud, sealhulgas looduslikud tapjarakud, monotsüüdid, neutrofiilid, eosinofiilid, basofiilid ja ringlevad dendriitrakud, mida ühiselt tuntakse kaasasündinud immuunrakkudena. Need rakud vabastavad suure hulga tsütokiine, mis osalevad rakuvahelises suhtluses ja aitavad seeläbi immuunvastuseid koordineerida [2]. Infektsiooni ja põletiku korral toimivad tsütokiinid modulaatoritena: mõned tsütokiinid muudavad haigust hullemaks (proinflammatoorsed), teised aga soodustavad tervist (põletikuvastane) [3]. Tsütokiinid on allutatud kõrgele evolutsioonilisele survele ja seega on nende järjestus mitmekesine [4], samas kui IL-17 tsütokiinide perekond näitab kõrget säilivust, mis väljendub tsüsteiinisõlme voldis funktsionaalses arhitektuuris, mis on moodustunud nelja interaktsiooni kaudu. konserveerunud tsüsteiinijäägid [5]. Hiljutised uuringud on näidanud, et IL-17 on põletikueelsete tsütokiinide klass, mis on seotud krooniliste põletikuliste ja degeneratiivsete häiretega [6]. IL{10}} toimivad spetsiifiliselt retseptoritega seondudes, et soodustada põletiku teket, immuunsüsteemi äratõukereaktsiooni ja vereloomet. Inimeste IL-17 tsütokiinide perekond koosneb kuuest liikmest (IL-17A kuni IL-17F), mida toodavad vastusena IL-ile aktiveeritud T-lümfotsüüdid ja muud kaasasündinud rakupopulatsioonid. -1 ja IL-23 [7,8]. Üha rohkem tõendeid viitab aga sellele, et IL-17 perekond koges meremolluskite ja okasnahksete liikide arvu märgatavat laienemist. Purpurse merisiiliku Strongylocentrotus purpuratus genoomis tuvastati umbes 30 IL-17 geeni [9]. Sarnaselt leiti 31 kaheksajala IL-17-sarnast geeni Coleoid peajalgsetel, kusjuures 27 geenil on võimas ekspressioon imejates ja nahas [10]. Saco et al. [11] otsis 15 uuesti sekveneeritud rannakarbi genoomist ja M. galloprovincialise võrdlusgenoomist [12] 379 ainulaadset IL-17 järjestust ning jagas need fülogeneetilise analüüsi abil 23 isovormiks. Lisaks leidsid nad, et Mytilidae liikide IL-17 isovormid säilisid üksikisikute seas ja jagati lähedaste liikide vahel. Lisaks Mytilidae liikidele leiti suuri IL-17 perekondi ka teistel molluskiliikidel, sealhulgas Crassostrea gigas, Mizuhopecten yessoensis ja Pinctada fucata martensii [13]. Merevesi kubiseb patogeenidest ja meremolluskid on nendega pidevas kontaktis ning seetõttu on vaja võimsat immuunmolekulide arsenali, misjärel IL-17 perekonna laienemine annab neile loomadele tõhusamad immuunvastused.
On tehtud mitmeid uuringuid, mis näitavad IL{0}}-de olulist rolli molluskiloomade kaasasündinud immuunsuses. Näiteks on uuringud leidnud, et Vibrio harveyi'ga nakatumisel oli IL-17D mRNA tase oluliselt ülesreguleeritud Tegillarca granulosa [14] puhul, samas kui C. gigas'is näitas CgIL17-5 selge reaktsioon Vibrio splendidusele [15]. Lisaks on näidatud, et molluski IL{6}} reageerivad paljudele patogeeniga seotud molekulaarsetele mustritele (PAMP), nagu lipopolüsahhariid (LPS), polüinosiin: polütsütidüülhape (polüI: C) ja peptidoglükaan (PGN). LPS on gramnegatiivsete bakteriraku seinte välisseina põhikomponent ja üks kõige sagedamini kasutatavatest immuunstimulaatoritest. Teisest küljest on polüI: C kaheahelaline RNA analoog, mida kasutatakse teadusuuringutes sageli viiruse simulaatorina. Pärast LPS-i stimuleerimist vallandus kiiresti IL-17 perekonna geenide transkriptsiooniline ekspressioon Vaikse ookeani austri C. gigas ja pärlaustri P. fucata puhul [16,17]. Ka pärlaustritel leiti, et PfIL-17 osaleb immuunvastuses polüI:C stimulatsioonile [17].
cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi
Lisaks näitas lutsiferaasi kahekordne test, et PfIL{0}} suutis aktiveerida selgroogsete sihtmärkgeene, mis sisaldasid NF-kB sidumissaite, ja osaleda NF-kB signaaliülekande rajas HEK293 rakkudes [17]. PGN esineb grampositiivsete bakterite rakuseinas ja seda kasutatakse sageli grampositiivsete bakterite jäljendajana. On tõestatud, et rekombinantsel C. gigas IL17-5-l on tugev afiinsus PGN-i suhtes, mida selgroogsete interleukiinide puhul ei ole kunagi kirjeldatud [18]. Need uuringud andsid eelmängu IL-17 immunomoduleeriva funktsiooni paljastamisele molluskitel. Põletikueelsete tsütokiinide klassina võib IL-17 liigne ekspressioon põhjustada rakkude tõsist kahjustust. Organismid on välja töötanud erinevaid mehhanisme, et kontrollida IL-17 ülereageerimist, millest mikroRNA-d (miRNA-d) esindavad kõige tõhusamat ja paremini uuritud mittekodeerivate RNA-de klassi. MiRNA-d on lühikeste RNA-de perekond, mille pikkus on umbes 22 nt ja mis võivad reguleerida sihtgeenide ekspressiooni translatsioonilise repressiooni või mRNA degradatsiooni kaudu [19]. Praegused uuringud IL-17de reguleerimise kohta miRNA-de poolt keskenduvad peamiselt nende sünergilistele mõjudele inimese autoimmuunhaiguste korral, nagu hulgiskleroos, reumatoidartriit, psoriaas ja teised [20]. Suure läbilaskevõimega sekveneerimise ja bioloogilise arvutuse tehnika väljatöötamine võimaldab skaneerida molluskite miRNA-sid genoomsel tasemel ning molluskiliikidelt, nagu lameauster Ostrea edulis, vaikne auster C. gigas, on tuvastatud suur hulk konserveerunud ja uudseid miRNA-sid. , Lymnaea stagnalis, rannakarp M. galloprovincialis jt [21–29]. Need uuringud pakuvad põhiandmeid ja suurt tuge miRNA-de funktsionaalseks tõlgendamiseks molluskites. Seoses teatud miRNA-de immunoregulatoorse rolliga molluskites, Tian et al. [30] leidis, et Pm-miR-29a võib Pinctada martensii IL-17 positiivselt reguleerida; pärast Pm-miR-29a üleekspressiooni reguleeriti IL-17 ekspressioon liigi vahevöös ja lõpuses üles. C. gigas'is suurendas cgi-miR-2d austrite hemotsüütide fagotsütoosi, reguleerides negatiivselt CgIkB2 [31] ja negatiivselt koliini transporteri sarnase geeni ekspressiooni infektsiooni varases staadiumis, mis osales keerukas immunomodulatsioonis. [32].
cistanche taime suurendav immuunsüsteem
Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin
【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Kuivatamise ajal leiti, et norepinefriin indutseerib cgi-miR-365 ja see soodustas otseselt CgHSP90AA1 ekspressiooni [33]. Hiljutised uuringud näitasid, et miRNA karkass659_26519 on suunatud kalmoduliinile, et reguleerida IL-17 ekspressiooni C. gigas'e immuunvastuse varases faasis [34]. Lisaks on teatud miRNA-de spetsiifilisi funktsioone kirjeldatud ka teistel selgrootutel, nagu merikurk Apostichopus japonicus [35–39] ja krevett Litopenaeus vannamei [40]. Need uuringud on avanud loori selgrootute miRNA-de aluseks olevatele mehhanismidele ning pakkunud ka tehnilisi ja metoodilisi viiteid meie praegustele uuringutele. Meie eelmises uuringus arvutati pärast Vibrio alginolyticus'e nakatamist bioloogiliselt 26 M. coruscus'e miRNA-d ja 667 geeni, millest Mcnovel_miR_145 võib sihtida IL-17 homoloogi. ja osaleda immuunvastuses bakteriaalsele infektsioonile [41]. Käesoleva uuringu eesmärk on identifitseerida IL-17 geen ja uurida selle potentsiaalset rolli kaasasündinud immuunsuses ja selle reguleerimist miRNA Mcnovel_miR_145 poolt M. coruscus'es. Selle uuringuga püüame paremini mõista molluskite immuunvastuse mehhanisme ja valgustada nende patogeenide vastase immuunkaitse molekulaarset alust. See uuring võib anda ülevaate ka mittekodeeriva RNA regulatsioonist selgrootute mudelites.
2. Tulemused
2.1. McIL-i iseloomustus-17-3
McIL-17-3 cDNA järjestus, mis sisaldab täielikku ORF-i, 30 -UTR-i ja osalist 50 --UTR-i, klooniti in silico M. coruscus'e täispikast transkriptoomist (juurdepääsunumber: PRJNA798880, F{ {5}}transkriptsioon_12404). McIL-17-3 sisaldab 585 bp ORF piirkonda, mis kodeerib 194 aminohapet. Prognoositav molekulmass on 21,77 kDa ja isoelektriline punkt on 5,21. SMART-analüüs näitas, et selles valgus on tüüpiline IL{14}} domeen (joonis 1A). Fülogeneetiline puu konstrueeriti selgroogsete ja Mytilidae liikide IL-17 liikmete värbamisega ning välisrühmana kasutati IL2-sid. Nagu on näidatud joonisel 1B, on need IL-17-d koondatud kindlasse haru, et eristada neid IL-2-dest. IL-17 klastris näidati kahte nähtavat klade, millest üks koosnes selgroogsete IL-17-idest ja teine rannakarpide IL-17-dest. Rannakarbi IL-17 rühmas koondus McIL-17-3 kõigepealt teise Mytiluse liigi M. galloprovincialis vastava molekuliga (joonis 1B).
2.2. Mitme joonduse ja tertsiaarse struktuuri ennustamine
McIL{0}} tuum koosneb kahest antiparalleelsete ahelate paarist; üks paar sisaldab ahelaid 1 (jäägid 52–58) ja 2 (jäägid 66–72 ja 77–79), teine paar aga ahelaid 3 (jäägid 89–103) ja 4 (jäägid 110–125) (joonis 2B, C) . Kaks disulfiidsilda (Cys97/Cys134 ja Cys125/Cys169) ühendavad ahelaid 1 ja 3, 2 ja 4 vastavalt (joonis 2A, C). Järjekindlalt on ka teistel molluski IL{26}}-del need kaks disulfiidsilda ahelate 1 ja 3, 2 ja 4 vahel (joonis 2A, C). Märkimisväärne on see, et kuigi selgroogsete IL{32}}-del on samuti kaks disulfiidsilda, leidub neid 2 ja 4 vahel (joonis 2A, C).
2.3. McIL-i transkriptsiooniline ekspressioon-17-3
McIL{{0}} transkriptide kudede jaotumise profiili hinnati qPCR-ga. McIL-17-3 transkripte ekspresseeriti kõigis testitud kudedes ning ekspressioonitasemed hemotsüütides ja lõpustes olid oluliselt kõrgemad kui adduktorlihastes (joonis 3A). Samuti hinnati hemotsüütide McIL-17-3 transkriptide ajalist ekspressiooni vastuseks V. alginolyticuse nakatamisele. McIL-17-3 mRNA tase oli 3 ja 12 HPC juures oluliselt ülesreguleeritud (vastavalt 313- või 435-kordne tõus võrreldes 0 HPC-ga), kuid seda ei olnud ilmselge ajaline korrapärasus üldiselt (joonis 3B).
Joonis 1. McIL-17-3 molekulaarne iseloomustus. (A) McIL-i-17-3 konserveeritud domeenide arhitektuurianalüüs SMARTi abil. Näidati konserveeritud IL-17 domeeni. (B) McIL-17-3 fülogeneetiline analüüs. Fülogeneetiline puu konstrueeriti tarkvara MEGAX abil 2000 alglaadimise kordusega, kasutades naabriga liitumise meetodit. McIL-17-3 oli märgistatud rohelise kolmnurgaga. Fülogeneetilises puus sisalduvad liigid saadi kõik Geenivaramu andmebaasist ja puusse märgiti ka liitumisnumbrid. Roheline kolmnurk McIL-17-3 nimel. (Selle joonise legendi värviviidete tõlgendamiseks viitab lugeja selle artikli veebiversioonile.)
2.4. Allvoolu aktiveerimine McIL-i poolt-17-3
Nagu on näidatud joonisel 4, suurendas rekombinantne McIL-17-3 pGLNF-κB-luc lutsiferaasi aktiivsust annusest sõltuval viisil. 0,5 ja 1.0 µg süvendi kohta suurenes pGLNF-κB-luc lutsiferaasi aktiivsus vastavalt 207- ja 1107- korda.
2.5. McIL-17-3 kui Mc-romaani_miR_145 sihtgeeni kinnitamine
Bioinformaatika ennustamise kaudu sisaldab McIL{{0}} geen standardset sihtjärjestust Mc-novel_miR_145 jaoks oma 30 UTR-is (joonis 5A). Mc-novel_miR_145 miimika ja inhibiitor transfekteeriti koos metsiktüüpi McIL-17-3-30 UTR reporterplasmiidiga HEK293 rakkudesse, et kinnitada nende korrelatsiooni. Nagu on näidatud joonisel 5B, võib Mc-novel_miR_145 miimika pärssida McIL-17-3-30 UTR-WT (0) lutsiferaasi aktiivsust (0.{{2{{58} }}}kordne vähenemine võrreldes kontrolliga), samas kui Mc-novel_miR_145 inhibiitor leevendab mõju märkimisväärselt (164-kordne tõus võrreldes Mc-novelliga_ miR_145 mimic lihtsalt lisatud rühmana). Et hinnata, kas Mc-novel{{30}}miR_145 sihib otseselt McIL-17-3 geeni 30. UTR-i sihtpunkti kaudu, konstrueerisime lutsiferaasi reporterplasmiidide mutantse versiooni. mis muteeris Mc-novel_miR_145 sihtimisjärjestusi McIL-17-3 30 UTR-is. Nagu on näidatud joonisel 5C, vähendas Mc-novel_miR_145 mimic oluliselt McIL-17-3-30 UTR-WT-ga transfekteeritud rakkude lutsiferaasi aktiivsust (0,{45}} korda). vähenemine), samas kui McIL-17-3-30 UTR-MUT-ga transfekteeritud rakkudes lutsiferaasi aktiivsuses muutusi ei täheldatud. Lisaks võis 24 tundi pärast transfektsiooni täheldada Mc-novel_miR_145 annusest sõltuvat mõju McIL-17-3-30 UTR-WT lutsiferaasi aktiivsuse pärssimisele (0 .71-, 0.43- ja 0.20--kordne vähenemine võrreldes kontrolliga, joonis 5D).
Joonis 2. McIL-17-3 mitu joondust teiste IL-17 pereliikmetega. (A) McIL-17-3 aminohappejärjestus joondati teiste IL-17-de omaga, mis saadi rannakarpidelt ja selgroogsetelt, sealhulgas hiirtelt ja sebrakaladelt. Need tsüsteiinid, mis moodustavad kanoonilise sõlme, märgiti rohelisega, asendatud aminohappejäägid tähistati punasega. Tsüsteiinisõlme tähistavad värvilised jooned, sinine tähendab nende esinemist molluskitel ja punane tähendab nende olemasolu selgroogsetel. Märkus. Visualiseerimiseks säilitatakse ainult järjestuse joonduse teine pool. (B) McIL-17-3 valgu tertsiaarne struktuur ennustati Šveitsi mudeli ja pyMol tarkvara abil. Need tsüsteiinid, mis moodustavad kanoonilise sõlme, märgiti ära. (C) Kanoonilise tsüsteiinisõlme voldi koomiks. Tsüsteiinijäägid tähistati täidetud ringidega; need, mis esinesid IL-17 valkudes, olid kollased, samas kui kaks jäetud olid hallid. (Selle joonise legendi värviviidete tõlgendamiseks viitab lugeja selle artikli veebiversioonile.)
Joonis 3. McIL-17-3 transkriptide ekspressiooniprofiili analüüs. (A) McIL-17-3 transkriptide jaotus tavalistes rannakarpide kudedes. (B) McIL-17-3 transkriptide ajalised ekspressioonimuutused vastuseks V. alginolyticus'e väljakutsele. Tulemused väljendati keskmisena ± SD (n=3, * p < 0.05, ** p < 0,01). (Selle joonise legendi värviviidete tõlgendamiseks viitab lugeja selle artikli veebiversioonile.)
Joonis 4. NF-κB reporteri aktiveerimine McIL-17-3 poolt. Rekombinantne vektor pEGFP-McIL- 17-3 kolmes kontsentratsioonis (0.1, 0.5 ja 1.{{10}} µg süvendi kohta) kotransfekteeriti HEK293 rakkudesse, kasutades Lipo6000TM 24 tundi. Suhteline lutsiferaasi aktiivsus arvutati normaliseerimisega pRLTK väärtusele. Katsetulemused väljendati kordamiste muutustena, võrreldes rekombinantse vektori poolt indutseeritud rakkude lutsiferaasi aktiivsust tühjade vektori poolt indutseeritud rakkude omadega samal kontsentratsioonil. Iga väärtus näidati keskmisena ± SD (n=3) ja tärnisümboliga tulbad olid oluliselt erinevad (* p < 0,05, ** p < 0,01).
Joonis 5. Mc-novel_miR_145 sihitud McIL-17-3. (A) McIL-17-3 30 UTR järjestus sisestati pmiR-RB-Report™ vektorisse, mis konstrueeriti vastavalt metsiktüüpi ja mutantsesse plasmiidi. Mcnovel_miR{{10}} järjestus ja McIL-17-3-30 UTR sihtsait ja mutantse saidi järjestus märgistati punaste markeritega. (B) McIL-17-3-30 UTR-WT plasmiid transfekteeriti koos Mc-novel_miR_145 mimic või Mc-novel_miR{{2{{37} }}} inhibiitor HEK293 rakkudesse. (C) HEK293 rakud transfekteeriti McIL-17-3-30 UTR-WT või McIL-17-3-30 UTR-MUT mutantse tüübiga koos Mc-novel_miR_145 või NC-ga. , 24 tundi. Lutsiferaasi aktiivsust mõõdeti kahe lutsiferaasi reporteranalüüsi süsteemi abil. (D) Kontsentratsioonigradiendi katsed viidi läbi Mc-novel_miR_145 transfektsiooni jaoks. Kõik andmed on esitatud keskmistena ± SD vähemalt kolmest sõltumatust kolmekordsest katsest. **, p < 0,01, *, p < 0,05 võrreldes kontrollidega. (Selle joonise legendi värviviidete tõlgendamiseks viitab lugeja selle artikli veebiversioonile.)
2.6. Mc-romaan_miR_145 reguleerib negatiivselt McIL-i väljendust-17-3
M. coruscus'e hemotsüüdid transfekteeriti Mc-novel_miR_145 mimic, Mcnovel_miR_145 inhibiitori ja nende vastavate kontrollidega ning muutustega McIL{{ 5}} ekspressiooni hinnati transkriptsiooni ja valgu tasemel. Nagu on näidatud joonisel 6A, oli Mc-novel _miR_145 ekspressioon selle matkimise tõttu oluliselt ülesreguleeritud (883-kordne suurenemine) ja allareguleeritud ({{14} }}.{15}}kordne vähenemine) selle repressori toimel hemotsüütides, mis viitab nende sünteetiliste liitainete tõhusale toimele. Joonisel fig 6B inhibeeris Mc-novel_miR_145 jäljendaja endogeense McIL-17-3 ekspressiooni oluliselt (051-kordne vähenemine). transkriptsiooni tasemel ja Mcnovel_miR_145 inhibiitori poolt indutseeritud (2{24}}kordne suurenemine). Et uurida Mc-novel_miR_145 mõju McIL-17-3 ekspressioonile valgu tasemel, valmistati McIL-17-3 vastane polüklonaalne antikeha. Nagu on näidatud joonisel fig 6C radadel 2 ja 3, ekspresseeriti rekombinantset McIL-17-3 valku edukalt E. coli-s. Antikeha spetsiifilisust uuriti hemotsüütidest pärineva rannakarbi valguga Western blot meetodil. Täheldati ühte umbes 22 kDa suurust riba, mis vastab McIL-17-3 molekulmassile (joonisel 6C rada 4). Western blot'i tulemused joonisel 6D näitasid McIL-17-3 negatiivset reguleerimist valgu tasemel Mc-novel_miR_145 poolt.
Figure 6. Mc-novel_miR_145 inhibeeris McIL-17-3 ekspressiooni M. coruscus'e hemotsüütides. (A) Mc-novel _miR_145 ekspressiooni hinnati qPCR-ga hemotsüütides, mis olid transfekteeritud 145 miimika, 145 inhibiitoriga ja nende vastava kontrolliga. (B) Pärast 24-tunnist transfektsiooni määrati McIL{11}} transkriptsioonitasemed qPCR abil. (C) McIL{12}} rekombinantne ekspressioon, puhastamine ja antiseerumi valmistamine. Rada M, standardne valgu molekulmassi marker. Rada 1, negatiivne kontroll (ilma induktsioonita). Rada 2, indutseeritud rekombinantne valk McIL{15}}. Rada 3, puhastatud McIL{17}}. Rada 4, Western blot anti-McIL{{20}} antikehaga M. coruscus'e hemotsüütides. (D) Pärast 24-tunnist transfektsiooni määrati McIL-17-3 valgu tase Western blot abil. ** p < 0,01 võrreldes kontrollidega
2.7. Hemotsüütide apoptoos
Nelja rühma hemotsüütide apoptootiline määr, st NC+LPS, McIL-17-3+LPS, Mcnovel_miR_145+McIL-17-3+LPS ja Mc-novel{{6} }miR_145-i+McIL-17-3+LPS-i analüüsiti voolutsütomeetria abil, kasutades topeltvärvimist. Pärast McIL{10}} üleekspresseerimist oli LPS-iga nakatatud hemotsüütide apoptoosikiirus kontrollrühmaga võrreldes oluliselt kõrgem (joonis 7A(a,b), B). Kui McIL-17-3 kotransfekteeriti Mc-novel_miR_145-ga, vähenes LPS-i poolt indutseeritud hemotsüütide apoptoosi määr oluliselt võrreldes ainult McIL{17}}-ga transfekteeritud (joonis 7A(). b, c), B). Seevastu hemotsüütide apoptootiline määr näitas Mc-novel_miR_145-i+ McIL-17-3+LPS-i rühmas märkimisväärset tõusu võrreldes McIL-17-3+LPS-rühmaga (joonis 7A (b, d, B).
Joonis 7. Hemotsüütide apoptootilist kiirust hinnati voolutsütomeetria abil, kasutades propiidiumjodiidi (PI) ja FITC-Anneksiin-V värvi
3. Arutelu
IL-17 on tunnistatud üheks oluliseks põletikueelseks tsütokiiniperekonnaks, mis võib tõhusalt osaleda erinevate haiguste patogeneesis [42]. Meie eelmises uuringus näitas M. coruscus IL-17 homoloog erinevat ekspressiooni enne ja pärast V. alginolyticus'e nakatumist transkriptoomilise sekveneerimise kaudu [41], mis viitab selle potentsiaalsele rollile kaasasündinud immuunvastuses bakteriaalsele väljakutsele. Siin iseloomustasime seda IL-17 homoloogi ja andsime sellele nimeks McIL-17-3. Funktsionaalse domeeni ennustus paljastas tüüpilise IL-17 domeeni, andes praegu tuvastatud geeni kuuluvuse IL-17 tsütokiinide perekonda. Fülogeneetilises puus näitas see uudne IL-17 geen väga lähedast sugulust teise Mytiluse liigi M. galloprovincialis IL-17- 3-ga. Lisaks oli neil väga suur 95% aminohappeline identsus ja seetõttu nimetasime praeguse uudse IL-17 geeni McIL-17-3-ks, et järgida Mytiluse liikide puhul kasutatavat nimetamistava. Inimeste IL-17 perekond koosneb kuuest liikmest ja viiest retseptorist [43], kuid mereselgrootute, eriti rannakarpide puhul on selle geneetiline laienemine olnud tohutu [11]. Selle põhjal näitasid meie andmed, et McIL-17-3 ei olnud otseselt seotud teatud geenidega inimese IL-17 perekonnas. Tsüsteiinisõlmvolt, mis asub -sheets, on IL-17 perekonna tüüpiline tunnus [5]. Eeldatavasti näitas tertsiaarse struktuuri ennustamine McIL-17-3 valgu tsüsteiinisõlme voldit, mis süvendab veelgi McIL-17-3 omistamist IL-17 tsütokiinide perekonda. IL-17 aminohappejärjestuste diferentseerumise edasiseks uurimiseks erinevate liikide vahel, mõned tüüpilised rannakarbi IL-17 ja Mus musculus IL-17-A kuni IL-17-F ja Danio rerio Mitme joonduse analüüsi tegemiseks valiti IL-17-1 kuni IL-17-3. Tulemused näitasid huvitavat avastust, et IL-17-de disulfiidsideme asukoht rannakarpide ja selgroogsete puhul oli ebaühtlane: need kaks disulfiidsidemust eksisteerisid rannakarpides vastavalt ahelate 1 ja 3, 2 ja 4 vahel, kuid ainult nende vahel. - ahelad 2 ja 4 selgroogsetel. Esimeses ja neljandas tsüsteiinipiirkonnas asendavad selgroogsete IL{42}}-d tsüsteiini seriiniga; Seevastu teises tsüsteiinipiirkonnas asendavad rannakarpide IL-17-d tsüsteiini rannakarpide ja selgroogsete disulfiidsideme juures treoninentatsiooniga ning selle aluseks olev mehhanism on ebaselge ja vajab edasist uurimist. Arvestades IL-17-de polümorfismi rannakarpides, ei pruugi disulfiidside ahelate 1 ja 3 vahel olla nii tugev kui 2. ja 4. vahel, mis annab neile rannakarpides suurema plastilisuse. Igatahes viitab funktsionaalsete domeenide ja tertsiaarse struktuuri analüüs sellele, et praegu tuvastatud McIL{50}} on tüüpiline rannakarbi IL-17 tsütokiinile ja võib mängida sarnast funktsionaalset rolli kui tema kolleegid molluskites. IL-17 geenide ekspressioon inimese kudedes on väga erinev, mõned ekspresseeruvad vaid mõnes rakus ja teised paljudes kudedes [44,45]. Enamik molluskitega tehtud uuringuid näitas, et IL{55}}-del oli konstitutiivne ekspressiooniprofiil [13,15,17,46,47]. Sellegipoolest näitasid Li, Zhang, Zhang, Xiang, Tong, Qu ja Yu [47] C. gigas IL-17s ebajärjekindlat tulemust: CgIL-17-2, -3, {{ 65}} ja -6 ekspresseerusid tugevalt C. gigas'e lõpustes, seedenäärmetes ja vahevöös, kuid teistes kudedes vähe. Siin leiti McIL-17-3 transkripte kõigist uuritud kudedest, mis viitab selle mitmele funktsionaalsele rollile mitmesugustes füsioloogilistes tegevustes. McIL-17-3 kõrge ekspressioonitase mõnes molluski immuunsüsteemiga seotud kudedes, nagu hemotsüüdid, lõpused ja seedenäärmed, viitab aga selle tihedamale osalemisele immuunvastusega. Selle kiire reageerimine V. alginolyticuse rünnakule süvendab seda punkti. V. alginolyticus'e süstimine reguleeris oluliselt McIL-17-3 ekspressiooni ja sarnaseid tulemusi on täheldatud ka teiste molluski IL-17-de puhul. V. anguillarum'i süstimine C. gigasesse kutsus esile CgIL-17 transkripti arvukuse kiire suurenemise hemotsüütides, mis viitab sellele, et tegemist oli immuunsüsteemi varase faasi geeniga [46]. Kui C. gigas tabas teise patogeeni, V. splendiduse rünnaku, tõusis oluliselt ka CgIL-17-5 mRNA tase hemotsüütides [15]. Bakterite peamise patogeense komponendi LPS-i stimuleerimine suurendas järsult PfIL-17 ekspressiooni pärlaustri P. fucata seedenäärmetes [17]. Lisaks võib LPS indutseerida CgIL-17-3 ekspressiooni C. gigas [47] ja PmIL-17-2 ekspressiooni P. fucata martensii [13]. Need tulemused näitasid ühiselt, et IL-17 mängis olulist rolli molluski immuunkaitses bakterite rünnaku vastu. Selles uuringus näitas McIL{85}} allavoolu NF-κB raja aktiveerimisvõimet. Sarnaseid tulemusi täheldati ka mõnede molluskiliikide puhul. Pärlaustri P. fucata puhul aktiveeris PfIL-17 lutsiferaasi reportertestide abil ka NF-κB raja HEK293 rakkudes [17]. C. gigas'is soodustas CgIL{91}} CgMAPK-de aktivatsiooni ning CgRel ja CgAP-1 tuuma translokatsiooni, et soodustada tsütokiinide ja antibakteriaalsete peptiidide mRNA ekspressiooni [15]. On näidatud, et IL-17 toimemehhanism põhineb selle liitumisel dimeerideks (homodimeerideks või heterodimeerideks), mille aktiivsus sõltub suuresti nende seondumisest retseptoritega (IL-17R). sihtmärk. Need retseptorid sisaldavad konserveerunud tsütoplasmadomeeni (SEFIR), mis interakteerub adaptervalkudega, et käivitada allavoolu signaaliülekande radu transkriptsioonifaktorite (nt NF-κB) aktiveerimiseks ning immuun- ja põletikueelsete sihtgeenide, nagu tsütokiinid ja antimikroobsed peptiidid, ekspressiooni soodustamiseks. 11,48,49].
cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi
Need tulemused viitavad sellele, et molluski IL{0}}-del võib olla sama toimemehhanism kui nende analoogidel selgroogsetel. Seda tuleb tulevastes uuringutes kinnitada. Korrelatsioone miRNA-de ja IL{1}}de vahel on leitud mitmes inimese haigusmudelis. Niimoto et al. [50] kinnitas positiivset korrelatsiooni miR-146a ja IL-17a ekspressiooni vahel perifeerse vere mononukleaarsetes rakkudes ja reumatoidartriidiga patsientide sünooviumis ning tegi kokkuvõtte miR-146a elutähtsast funktsioonist IL-17-tootvate rakkude diferentseerumist. Psoriaasihaigetel toimib miR-146a IL-17- põhjustatud nahapõletiku tugeva inhibiitorina ja selle madal tase võib kaasa aidata geneetiliselt vastuvõtlikel inimestel haiguse varajasele ilmnemisele [51]. MiR-146a võib leevendada parodontiiti, vähendades IL-17 ekspressiooni ja pärssides inimese periodontaalse sideme tüvirakkude proliferatsiooni [52]. MiR-155 reguleerib negatiivselt IL-17 ekspressiooni, et osaleda peremeesorganismi immuunvastuses viirusejärgsele bakteriaalsele kopsupõletikule hiirte kopsudes; miR-155 inhibeeritud hiirtel ilmneb IL-17 tugevam ekspressioon kopsudes, millega kaasneb paranenud bakteriaalne kliirens [53]. Need uuringud viitavad sellele, et IL-17-d reguleerivad mitmed miRNA-d ning see varieerub sõltuvalt haigusest ja rakutüübist [20]. Eelmises uuringus teostasime miRNAome ja transkriptoomi integreeritud analüüsi, et uurida miRNA-mRNA interaktiivset reguleerimist M. coruscus'e poolt vastuseks V. alginolyticus'e infektsioonile. Tulemused ennustasid, et Mc-novel_miR_145 võib olla suunatud McIL-17-3 osalemisele kaasasündinud immuunvastuses bakteriaalse infektsiooni vastu [41]. Eesmärgiga uurida põhjalikult McNovel_miR_145 McIL-17-3 regulatsiooni aluseks olevat mehhanismi, viidi käesolevates uuringutes läbi rida laborikatseid. Arvutused ennustasid, et Mc-novel_miR_145 võib sihtida McIL-17-3 30 UTR-i. Järgmised lutsiferaasi reporteri testid viidi läbi HEK293 rakkudes, mida on kaastransfekteeritud Mc-novel_miR_145 imiteeriva, imiteeriva NC, inhibiitori, inhibiitori NC koos McIL-17-3-30 UTR-WT, -MUT reporteriga plasmiidid kinnitasid seda punkti veelgi. Lisaks transfekteeriti Mc-novel_miR_145 matkiv, imiteeriv NC, inhibiitor ja inhibiitor NC M. coruscus'e hemotsüütidesse, et hinnata nende mõju McIL-17-3 ekspressioonile transkriptsiooni ja valgu tasemel. . McIL-i _145 inhibiitori transfektsiooni rühm, mis viitab McIL-17-3 negatiivsele regulatsioonile Mc-novel_miR_145 poolt. Praegused tulemused olid vastuolus eelmise uuringuga. Teoses Pinctada martensii leidsid Tian, Zheng, Huang, Jiao ja Du [30], et kuigi Pm-miR-29a võib sihtida IL-17, oli regulatsioon positiivne, kuna IL{{ väljendus. 65}} Pinctada martensii vahevöös ja lõpus oli pärast Pm-miR-29a üleekspressiooni ülesreguleeritud. Arvestades, et P. martensii ja M. coruscus kuuluvad mõlemad kahepoolmeliste hulka ja on suhteliselt tihedalt seotud, viitavad need ebajärjekindlad tulemused sellele, et IL-17 regulatsioon molluskites võib sõltuvalt miRNA-dest erineda. Peale selle pole üheski kirjanduses teatatud korrelatsioonist miRNA-de ja IL{70}}-de vahel molluskites ning seetõttu pole praeguste tulemuste võrdlemiseks enam paralleelseid uuringuid. Kuid mõned uuringud on teatanud seostest spetsiifiliste miRNA-de ja spetsiifiliste immuunsüsteemiga seotud geenide vahel molluskites.
Näiteks suurendab cgi-miR-2d austrite hemotsüütide fagotsütoosi, reguleerides negatiivselt Crassostrea gigases CgIκB2 [31]. Lisaks reguleerib cgi-miR-2d negatiivselt ka ühe koliini transporteri sarnase geeni ekspressiooni, et osaleda austrite hemotsüütide keerukas immunomodulatsioonis infektsiooni varases staadiumis [32]. Need uuringud viitavad vähemalt sellele, et miRNA-d mängivad potentsiaalset rolli kaasasündinud immuunsignalisatsioonis, suunates molluskites spetsiifilisi geene, nagu ka selgroogsetel. Järgmisena püüdsime uurida Mcnovel_miR_145 ja McIL{{10}} vahelise interaktsiooni võimalikku funktsiooni M. coruscus'e kaasasündinud immuunsuses ning nende rolli Meie tähelepanu keskmes on LPS-indutseeritud apoptoos. LPS on väga põletikuvastane molekul, mis on kõigi gramnegatiivsete bakterite väliskesta komponent. On näidatud, et LPS kutsub esile apoptoosi erinevates rakkudes ja kudedes, nagu makrofaagid [54], endoteelirakud [55] ja hiire kopsud [56]. Esialgne katse on näidanud, et LPS-i ekspositsioon nominaalkontsentratsioonil 0,1 mg/ml 24 tunni jooksul indutseeris oluliselt M. coruscus'e hemotsüütide apoptoosi. Pärast McIL-17-3 üleekspressiooni tõusis M. coruscus'e hemotsüütide apoptoosi tase kontrollrühmaga võrreldes oluliselt, mis viitab sellele, et McIL-17-3 võib tugevdada LPS-indutseeritud hemotsüütide apoptoosi M. coruscus'es. Praegused tulemused olid kooskõlas mõne varasema uuringuga. Inimese neutrofiilides võib IL-17A vähendada granulotsüütide makrofaagikolooniaid stimuleeriva faktori poolt vahendatud apoptootilist toimet [57]. IL-17 kutsub esile veresoonte endoteelirakkude apoptoosi, mis on ägeda koronaarsündroomi potentsiaalne mehhanism [58]. IL-17A geneetiline deletsioon vähendab II tüüpi alveolaarsete rakkude apoptoosi ja seega leevendab kroonilist obstruktiivset kopsuhaigust [59]. Siiski on endiselt mõned vastupidised argumendid. Kui hiired on nakatunud Theileri hiire entsefalomüeliidi viirusega, soodustavad IL-6 ja IL-17 sünergistlikult viiruse püsivust, pärssides raku apoptoosi [60]. Need konfliktid viitavad sellele, et IL-17-vahendatud apoptoosi aluseks olev mehhanism on keeruline ja IL-17 võivad sõltuvalt infektsiooni tüübist täita vastupidiseid funktsioone.
Kui McIL-17-3 transfekteeriti koos Mc-novel_miR_145-ga, oli LPS-i poolt indutseeritud apoptoosi tase oluliselt allapoole reguleeritud võrreldes ainsa McIL-17-3-ga transfekteeritud. grupis oli vastavalt apoptoosi tase oluliselt ülesreguleeritud pärast seda, kui McIL-17-3 transfekteeriti koos Mc-novel_miR_145 inhibiitoriga. On näidatud, et Mc-novel_miR_145 reguleerib negatiivselt McIL-17-3 ja seetõttu jõudsime järeldusele, et McIL-17-3 süvendas LPS-i poolt indutseeritud hemotsüütide apoptoosi, samas kui Mc-novel _miR_145 leevendas mõju. Viimastel aastatel tuvastati molluskites mitu miRNA-d, mis on osutunud seotud inimese ja hiire rakkude apoptoosiga. Näiteks leiti miR-125b ja miR- 335 lameaustrist Ostrea edulis [21], miR-184 leiti austri Crassostrea gigas [23] hemotsüütidest ja miR{{ 26}}, -29, -96, -182 ja -193 leiti L. stagnalis'e taastuvas kesknärvisüsteemis [25]. Need apoptoosiga seotud miRNA-d, mis tuvastati suure läbilaskevõimega sekveneerimise ja bioloogiliste arvutuste abil, kinnitavad miRNA-vahendatud apoptoosi olemasolu molluskites. Chen et al. teatas miR-2d ülesreguleerimisest pärast Vibrio splendidus'e nakatamist Crassostrea gigas'e hemotsüütides. MiR-2d üleekspressioon oli korrelatsioonis IκB2 ekspressiooni langusega ja hemotsüütide fagotsütoosi määra olulise suurenemisega, mis oli seotud apoptoosi pärssimisega [31]. Tulemused olid kooskõlas meie praeguse uuringuga, mis näib viitavat sellele, et miRNA-d pärsivad molluskite raku apoptoosi. Tegelikult on enamik apoptoosiga seotud miRNA-sid inimestel näidanud apoptoosi pärssivat toimet. MiR-146 kaitseb A549 ja H1975 rakke LPS-i indutseeritud apoptoosi ja põletikuvigastuste eest Sirt1 ülesreguleerimise kaudu, blokeerides seeläbi NF-κB ja Notchi teed [61]. Lisaks nõrgendab miR{50}} kiiritusest ja LPS-ist põhjustatud hepatotsüütide apoptoosi TLR4 raja pärssimise kaudu [62]. MiR{55}} pärsib kondrotsüütide apoptoosi osteoartriidi korral, suunates TLR4/NF-κB signaalirada [63]. MiR-129-5p leevendab seljaaju vigastusi hiirtel, pärssides HMGB1/TLR4/NF-κB raja kaudu apoptoosi [64]. Siiski on veel mõned spetsiifilised miRNA-d, mis näitavad apoptoosi tugevdavat toimet. Näiteks leiti, et miR-203 kiirendab LPS-i indutseeritud apoptoosi, suunates PIK3CA alveolaarsetesse epiteelirakkudesse [65]. Need tulemused viitavad miRNA-vahendatud apoptoosi aluseks oleva mehhanismi keerukusele.
4. Materjalid ja meetodid
4.1. Eksperimentaalne disain
Esiteks tuvastati ja iseloomustati McIL{0}} M. coruscus'est bioinformaatilise analüüsi abil. Pärast seda hinnati kvantitatiivse reaalajas PCR (qPCR) analüüsiga McIL-17-3 transkriptide jaotumist kudedes ja selle vastust bakteriaalsele väljakutsele. Järgmiseks määrati seos McIL-17-3 ja Mc-novel_miR_145 vahel lutsiferaasi reporteranalüüsiga, mis viidi läbi HEK293 rakkudes ja M. coruscus hemotsüütides. Lisaks hinnati nende funktsionaalset rolli LPS-i indutseeritud apoptoosis voolutsütomeetria abil.
4.2. Kunstlik merevesi
Pärast kolmepäevast munitsipaalkraanivee õhustamist lisati lahustuv merekristall (Haiding LTD, Ji'an, Hiina), segati põhjalikult ja sulatati, et saavutada soolsus 30 ‰. Konfigureeritud kunstlikku merevett tuleb enne kasutamist 2 tundi õhutada.
4.3. Loomad
Paksukoorega rannakarp M. coruscus (koore pikkus 9,82 ± 0,53 cm; koore laius 4,68 ± 0,45 cm; märgkaal 71,2 ± 2,7 g) osteti Donghe turult Zhoushanis, Zhejiangi provintsis, Hiinas. Enne järgnevaid katseid hoiti kõiki rannakarpe mahutites, mille temperatuur oli umbes 25 ◦ C ja soolsus 30 ‰.
4.4. McIL-17-3 cDNA identifitseerimine
IL-17 homoloog (McIL-17-3) klooniti in silico M. coruscus'e täispikast transkriptoomist (juurdepääsunumber: PRJNA798880, F01_transkript_12404). Oletatava McIL-17-3 aminohappejärjestuse ennustamiseks viidi läbi Blast-protseduur, millele järgnes funktsionaalse domeeni analüüs SMART-iga ja fülogeneetilise seose hindamine MEGA-X-ga. Mitmekordne joondamine viidi läbi ClustalW protseduuri abil. Šveitsi mudelit ja kogumit kasutati McIL-17-3 valgu tertsiaarse struktuuri ennustamiseks. Üksikasjalik protseduur oli vastavalt meie eelmisele uuringule [66].
4.5. Kvantitatiivsed reaalajas PCR-analüüsid
Kvantitatiivsed reaalajas PCR-analüüsid (qPCR) on võimas tööriist geeniekspressioonitasemete tuvastamiseks ja mõõtmiseks. Siin hinnati McIL-17-3 jaotumist kudedes qPCR-meetodi abil. Lisaks tuvastati qPCR abil muutused McIL-17-3 mRNA ekspressioonis vastusena bakteriaalsele infektsioonile. McIL-17-3 kudede jaotusprofiil määrati lõpustes, vahevöös, seedenäärmetes, sugunäärmetes, adduktorlihastes ja hemotsüütides, kasutades qPCR-i, mis oli programmeeritud 95 ◦C juures 10 minutiks, millele järgnes 40 tsüklit 95 ◦C 10 s, 60 ◦C 45 s. Need koed lõigati üheksalt rannakarbi isendilt lahti ja ühendati individuaalse diferentseerumise leevendamiseks. Bakteriaalse väljakutse katses kasutati immuunstiimulitena elusat V. alginolyticust. Rannakarpide adduktorisse süstiti 100 µl merevees lahustatud baktereid (1 × 108 CFU ml-1). Kontrollina ei kasutatud süstitud rannakarpe. Igast rühmast 0, 3, 6, 12, 24 ja 36 tundi pärast nakatamist (hpc) võeti juhuslikult proovid üheksa rannakarpi. Kolme rannakarbi hemotsüüdid ühendati üheks prooviks ja iga ajapunkti jaoks oli kolm proovi. MikroRNA-d ekstraheeriti miRNA ekstraheerimiskomplekti (HaiGENE, kat. nr: B1802) abil ja cDNA sünteesimiseks kasutati miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA komplekti (Tiangen, kat. nr: 4992786) ja qPCR viidi läbi, kasutades miRcute Plus miRNA qPCR komplekt (Tiangen, kat. nr: 4992887). U6 ja -aktiini geene kasutati vastavalt qPCR ja miRNA-de qPCR sisemiste viidetena. Selles katses kasutatud spetsiifilised praimerite paarid on loetletud tabelis 1. Suhtelised ekspressioonitasemed mõõdeti 2−∆∆Ct meetodil [67].
Tabel 1. Käesolevas uuringus kasutati PCR praimerite paare.
4.6. Rakukultuur
Imetajate HEK293 rakke (RiboBio Ltd., Guangzhou, Hiina) kasutati lutsiferaasi reporteranalüüside läbiviimiseks, et määrata kindlaks McIL- 17-3 poolt allavoolu aktiveerimine ja seos Mc-novel_miR{{ vahel. 4}} ja McIL-17-3. HEK293 rakke kultiveeriti OPTI-MEM söötmes (GIBCO) temperatuuril 37 °C, 5% CO2. Mc-novel_miR_145 poolt McIL-17-3 regulatsiooni ja nende funktsionaalse rolli LPS-indutseeritud apoptoosis edasiseks uurimiseks saadi M. coruscus'e hemotsüüdid iga lihase liitlihasest. rannakarp 0,5 mm läbimõõduga (25 G) ühekordselt kasutatava nõelaga, mis sisaldab 0,5 ml antikoagulanti. Hemotsüüdid koguti tsentrifuugimisega 5 minutit kiirusel 3000 p/min, 4 ◦C ja lisati 0,25% trüpsiini (Solarbio). Hemotsüüdid suspendeeriti L-15 söötmes, mis sisaldas 15% veise loote seerumit (Solarbio) ja kultiveeriti 26 ◦C juures 5% CO2-ga.
4.7. miRNA miimika ja inhibiitori süntees
Mc-novel_miR_145 matkivad, inhibiitorid ja kontrollnukleotiidid koostas GenePharma (Shanghai). Nende järjestus on järgmine: Mc-novel_miR_145 mimic, 52032- UCCAGAAAAGCGCUUCGGACG-30; Mc-novel_miR_145 inhibiitor, 50 -CGUCCGAAGCG CUUUUCUGGA-30 (keemiliselt modifitseeritud 20 Ome'iga); negatiivse kontrolli jäljendaja, 50 -UUGUA CUACACAAAAGUACUG-30; ja negatiivse kontrolli inhibiitor, 50 -CAGUACUUUUGUGU AGUACAA-30 (keemiliselt modifitseeritud 20 Omega).
4.8. Lutsiferaasi reporteri analüüs
Lutsiferaasi reporteranalüüse kasutatakse laialdaselt geeniekspressiooni ja regulatoorse aktiivsuse uurimiseks. Tekkinud valguse hulk on võrdeline toodetud lutsiferaasi ensüümi kogusega, mis omakorda peegeldab regulatoorse elemendi aktiivsust. Seejärel mõõdetakse lutsiferaasi aktiivsust luminomeetriga ning tulemusi analüüsitakse ja tõlgendatakse, et määrata uuritava elemendi regulatiivne aktiivsus. McIL{{0}} allavoolu aktiveerimise analüüsimiseks kasutati lutsiferaasi reporteranalüüse. Selles katses kasutati pEGFP-McIL-17-3 plasmiid (0.1, 0.5 ja 1.0 µg süvendi kohta) koos pGLNF-κb- luc reporterplasmiid (0,25 µg süvendi kohta) kotransfekteeriti HEK293 rakkudesse, kasutades Lipo6000TM 24 tundi. Kontrollina kasutati tühja pEGFP-N1 plasmiidi. Lutsiferaasi aktiivsust mõõdeti Dual-Luciferase® Reporter Assay Systemiga (Promega, Madison, WI, USA) vastavalt spetsifikatsioonile, kusjuures interkontrolliks kasutati Renilla lutsiferaasi. Mc-novel_miR_145 sihtimist McIL-17-3 kinnitasid ka lutsiferaasi reporteri testid. Bioinformaatiline arvutus ennustas, et Mc-novel_miR_145 võib sihtida 30 -McIL-i UTR-i-17-3 ja seejärel kloonida 30 -McIL-i UTR{{ 29}} pmiR-RB-ReportTM lutsiferaasi reportervektorisse, et konstrueerida metsik McIL-17-3-30 UTR-WT reporterplasmiid. Mutant-tüüpi McIL-17-3-30 UTR-MUT reportervektor konstrueeriti nukleotiidi muteerimisel 1023–1040 kohas: TCCGAAGCGCTTTTCTCTGG kuni AGGCTTCGCGAAGACC. RNA oligo (Mc-novel_miR_196 NC, mimic, NCi, inhibiitor) transfekteeriti koos McIL-17-3- 3 0 UTR-WT või McIL-17-3-30 UTR-MUT-ga HEK293-sse rakke kasutades Lipo6000TM.
4.9. Rekombinantne ekspressioon, puhastamine ja antiseerumi valmistamine
Et hinnata Mc-novel_miR_145 mõju McIL-17-3 valgu ekspressioonile, valmistati McIL-17-3 antiseerum. McIL-17-3 avatud lugemisraami (ORF) kattev cDNA fragment amplifitseeriti ühe spetsiifilise praimeripaariga (tabel 1) ja sisestati pET-32a vektorisse. Rekombinantne plasmiid pET-32a-McIL{{10}} transformeeriti Escherichia colisse (DE3) (Takara) ja inkubeeriti LB söötmes (sisaldab 50 mg L-1 kanamütsiin) temperatuuril 37 ◦C loksutades kiirusel 130 p/min 4 tundi. Pärast seda, kui optiline tihedus saavutas 600 nm juures neeldumise 0,6, lisati bakterilahusele rekombinantse McIL{ ekspressiooni esilekutsumiseks sees olev isopropüül-beeta-D-tiogalaktoopia (IPTG) lõppkontsentratsiooniga 1 mM. {24}} valk (rMcIL-17-3). Pärast inkubeerimist temperatuuril 37 °C 6 tundi, tsentrifuugiti söödet 8000 p/min juures 30 minutit bakterite kogumiseks, millele järgnes suspensioon TBS puhvris (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0). rMcIL-17-3 puhastati Ni-nitrilotriäädikhappe (NI-NTA) afiinsuskromatograafiaga ja puhastatud valku dialüüsiti imidasoolist 24 tundi. Saadud valk eraldati redutseerides 12% SDS-polüakrüülamiidi geelelektroforeesi (SDS-PAGE). Puhastatud valk volditi ümber gradiendiga uurea-TBS glütseroolpuhvris (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM redutseeritud glutatiooni, 10% glütserooli, 0,2 mM glutatiooni oksiidi, gradient uurea kontsentratsioon 6, 2, 3). , 1 ja 0 M uureat igas gradiendis, pH 7,4, iga gradient temperatuuril 4 °C 12 tundi). Seejärel kasutati saadud valku 6-nädalaste hiirte immuniseerimiseks, et saada polüklonaalseid antikehi.
4.10. Western Blotting
Valguproovid ekstraheeriti hemotsüütidest RIPA lüüsipuhvriga (Beyotime) ja seejärel tuvastati kontsentratsioon BCA komplektiga. Pärast SDS-PAGE-ga eraldamist kanti valk PVDF-i membraanidele, kanti 5% lõssipulbriga TBST-s (20 Mm Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Tween-20, pH 8.0), millele järgnes McIL-17-3 vastane antikeha inkubeerimine üleöö. Seejärel inkubeeriti membraane kitse hiirevastase IgG antikeha ja leeliselise fosfataasi konjugaadi (Thermo Fisher Scientific, kat. nr 31324) lahjendatud lahusega sekundaarses antikeha lahjenduspuhvris (Beyotime, P0258) 3 tundi. Lõpuks tuvastati immunoreaktiivsed valgud ECL-i tuvastamise süsteemiga.
4.11. Apoptoos
Hemotsüütide apoptoosi hinnati voolutsütomeetria abil vastavalt FITC-Annexin-V Apoptosis Detection Kit (Beyotime) juhendile. Lühidalt, kogutud hemotsüüte töödeldi 24 tundi LPS-iga (0,1 mg/mL), 20 nM pEGFP-McIL-17-3 plasmiidiga, Mc novel_miR{{9}. } mimic ja Mc-novel_miR_145 inhibiitor. Pärast PBS-ga pesemist suspendeeriti rakud uuesti L15 söötmes lõppkontsentratsiooniga 1 × 106 rakku ml-1 ja värviti FITC-Annexin-V ja PI-ga, inkubeerides neid toatemperatuuril 25 minutit pimedas. . Lõpuks kasutati raku apoptoosi tuvastamiseks voolutsütomeetria instrumenti (Beckman CytoFLEX FCM) ja andmeid analüüsiti FlowJoTM 10 tarkvara abil. 4.12. Statistiline analüüs Eksperimentaalsed tulemused esitati kui keskmine ± standardhälve (SD). Tulemusi töödeldi kahesuunalise ANOVA dispersioonanalüüsi abil Tukey mitme võrdluse testiga ning andmete analüüsimiseks ja arvude koostamiseks kasutati tarkvara Origin2021.
cistanche taime suurendav immuunsüsteem
5. Kokkuvõtted
Selles uuringus tuvastati M. coruscus'e uudne IL-17 homoloog McIL-17-3, mis mängib üliolulist rolli molluskite immuunkaitses bakterite rünnaku vastu. Veelgi enam, avastati, et McIL-17-3 on negatiivselt reguleeritud Mc-novel_miR_145 poolt, mis aitab kaasa selle osalemisele LPS-i indutseeritud apoptoosis. Selle uuringu tulemused annavad väärtuslikku teavet IL-17 reguleeriva rolli kohta rannakarpide immuunvastuses ja toovad esile mittekodeeriva RNA potentsiaali selgrootute immuunkaitsemehhanismide reguleerimisel. Siiski on oluline märkida, et selles uuringus on mõned piirangud. Täpsemalt, McIL-17-3 toimemehhanismi aluseks olevat mehhanismi ei uuritud ja see nõuab täiendavat uurimist. Lisaks keskendus see uuring ainult Mc-novel_miR_145 ja McIL-17-3 interaktsioonile ega uurinud teiste miRNA-de võimalikku osalust immuunvastuses. Üldiselt rõhutab see uuring mittekodeeriva RNA olulist rolli immuunkaitsemehhanismides ja viitab sellele, et nende moduleerimine võib olla potentsiaalne strateegia erinevate haiguste sihipäraseks raviks.
Viited
1. Medžitov, R.; Janeway, C., Jr. Kaasasündinud immuunsus. N. Ingl. J. Med. 2000, 343, 338–344. [CrossRef] [PubMed]
2. Lacy, P.; Stow, JL Tsütokiinide vabanemine kaasasündinud immuunrakkudest: seos erinevate membraanidega kaubitsemise radadega. Blood J. Am. Soc. Hematool. 2011, 118, 9–18. [CrossRef] [PubMed]
3. Dinarello, CA Põletikuvastased tsütokiinid. Rind 2000, 118, 503–508. [CrossRef] [PubMed]
4. Rauta, PR; Nayak, B.; Das, S. Kalade immuunsüsteem ja immuunvastused ning nende roll immuunsüsteemi võrdlevas uuringus: Kõrgemate organismide mudel. Immunol. Lett. 2012, 148, 23–33. [CrossRef]
5. Hymowitz, SG; Filvaroff, EH; Yin, J.; Lee, J.; Cai, L.; Risser, P.; Maruoka, M.; Mao, W.; Foster, J.; Kelley, RF IL-17-id võtavad kasutusele tsüstiinisõlme voldi: uudse tsütokiini IL-17F struktuur ja aktiivsus ning mõju retseptoriga seondumisele. EMBO J. 2001, 20, 5332–5341. [CrossRef]
6. Buckley, KM; Ho, ECH; Hibino, T.; Schrankel, CS; Schuh, NW; Wang, GZ; Rast, JP IL17 tegurid on merisiiliku vastsete Vibrio põletikulise vastuse ajal sooleepiteeli varajased regulaatorid. eLife 2017, 6, e23481. [CrossRef]
7. Cua, DJ; Tato, CM Kaasasündinud IL-17-tootvad rakud: immuunsüsteemi valvurid. Nat. Rev. Immunol. 2010, 10, 479–489. [CrossRef]
8. Mills, KH IL-17 ja IL-17-tootvad rakke kaitses versus patoloogia. Nat. Rev. Immunol. 2022, 10, 479–489. [CrossRef]
9. Hibino, T.; Loza-Coll, M.; Messier, C.; Majeske, AJ; Cohen, AH; Terwilliger, DP; Buckley, KM; Brockton, V.; Nair, SV; Berney, K. Immuungeenide repertuaar on kodeeritud purpurse merisiiliku genoomis. Dev. Biol. 2006, 300, 349–365. [CrossRef]
10. Albertin, CB; Simakov, O.; Mitros, T.; Wang, ZY; Pungor, JR; Edsinger-Gonzales, E.; Brenner, S.; Ragsdale, CW; Rokhsar, DS Kaheksajala genoom ja peajalgsete neuraalsete ja morfoloogiliste uuenduste areng. Loodus 2015, 524, 220–224. [CrossRef]
11. Saco, A.; Rey-Campos, M.; Rosani, U.; Novoa, B.; Figueras, A. Interleukiini-17 areng ja mitmekesisus rõhutavad mereselgrootute arvu suurenemist ja selle säilinud rolli limaskestade immuunsuses. Esiosa. Immunol. 2021, 12, 692997. [CrossRef] [PubMed]
12. Gerdol, M.; Moreira, R.; Cruz, F.; Gómez-Garrido, J.; Vlasova, A.; Rosani, U.; Venier, P.; Naranjo-Ortiz, MA; Murgarella, M.; Greco, S. Massiivne geeni olemasolu ja puudumise variatsioon kujundab Vahemere rannakarbil avatud pan-genoomi. Genome Biol. 2020, 21, 1.–21. [CrossRef]
13. Cao, Y.; Yang, S.; Feng, C.; Zhan, W.; Zheng, Z.; Wang, Q.; Deng, Y.; Jiao, Y.; Du, X. Pinctada fucata martensii interleukiini-17 geeni evolutsioon ja funktsioonide analüüs. Fish Shellfish Immunol. 2019, 88, 102–110. [CrossRef] [PubMed]
14. Wang, Q.; Xiao, G.; Hu, G.; Chen, R.; Li, M.; Teng, S. Interleukin-17D vahendab Vibrio harveyi infektsiooniga seotud muutusi Tegillarca granulosa's aktivaatorvalgu 1 in vivo aktiveerimise kaudu. Vesiviljelus 2023, 566, 739178. [CrossRef]
15. Lv, X.; Sun, J.; Li, Y.; Yang, W.; Wang, L.; Leng, J.; Yan, X.; Guo, Z.; Yang, Q.; Wang, L. CgIL17-5 reguleerib immuunefektorite mRNA ekspressioone, kutsudes esile CgMAPK-de fosforüülimise ning CgRel ja CgAP-1 tuuma translokatsiooni Vaikse ookeani austri Crassostrea gigas. Dev. Comp. Immunol. 2022, 127, 104263. [CrossRef] [PubMed]
16. Wang, L.; Sun, J.; Wu, Z.; Lian, X.; Han, S.; Huang, S.; Yang, C.; Wang, L.; Song, L. AP-1 reguleerib IL17-4 ja IL17-5 ekspressiooni Vaikse ookeani austrites Crassostrea gigas. Fish Shellfish Immunol. 2020, 97, 554–563. [CrossRef]
17. Wu, S.-Z.; Huang, X.-D.; Li, Q.; Tema, M.-X. Interleukiin-17 pärlaustris (Pinctada fucata): molekulaarne kloonimine ja funktsionaalne iseloomustus. Fish Shellfish Immunol. 2013, 34, 1050–1056. [CrossRef]
18. Xin, L.; Zhang, H.; Zhang, R.; Li, H.; Wang, W.; Wang, L.; Wang, H.; Qiu, L.; Song, L. CgIL17-5, Crassostrea gigas'e iidne põletikuline tsütokiin, millel on selgroogsete interleukiini17 molekulidega võrreldes heterogeensusfunktsioonid. Dev. Comp. Immunol. 2015, 53, 339–348. [CrossRef]
19. Denli, AM; Topid, BB; Kips, RH; Ketting, RF; Hannon, GJ Primaarsete mikroRNA-de töötlemine mikroprotsessorikompleksi abil. Loodus 2004, 432, 231–235. [CrossRef]
20. Khan, D.; Ansar Ahmed, S. IL-17 reguleerimine autoimmuunhaiguste korral transkriptsioonifaktorite ja mikroRNA-de abil. Esiosa. Genet. 2015, 6, 236. [CrossRef]
21. Martín-Gómez, L.; Villalba, A.; Kerkhoven, RH; Apollo, E. MikroRNA-de roll lameaustri Ostrea edulis immuunsusprotsessis bona mioosi vastu. Nakata. Genet. Evol. 2014, 27, 40–50. [CrossRef] [PubMed]
22. Xu, F.; Wang, X.; Feng, Y.; Huang, W.; Wang, W.; Li, L.; Fang, X.; Que, H.; Zhang, G. Konserveeritud ja uudsete mikroRNA-de tuvastamine Vaikse ookeani austri Crassostrea gigas sügava sekveneerimise abil. PLoS ONE 2014, 9, e104371. [CrossRef]
23. Zhou, Z.; Wang, L.; Laul, L.; Liu, R.; Zhang, H.; Huang, M.; Chen, H. Immuunsüsteemiga seotud mikroRNA-de tuvastamine ja omadused austri Crassostrea gigas hemotsüütides. PLoS ONE 2014, 9, e88397. [CrossRef] [PubMed]
24. Burgos-Aceves, MA; Cohen, A.; Smith, Y.; Faggio, C. Immuunsüsteemiga seotud geenide potentsiaalne mikroRNA reguleerimine selgrootute hemotsüütides. Sci. Täielik keskkond. 2018, 621, 302–307. [CrossRef]
25. Walker, SE; Spencer, GE; Necakov, A.; Carlone, RL MikroRNA-de identifitseerimine ja iseloomustamine molluski kesknärvisüsteemi retinoehappe poolt indutseeritud regeneratsiooni ajal. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 2741. [CrossRef] [PubMed]
26. Abo-Al-Ela, HG; Faggio, C. MicroRNA-vahendatud stressireaktsioon kahepoolmelistel liikidel. Ökotoksikool. Keskkond. Saf. 2021, 208, 111442. [CrossRef] [PubMed]
27. Huang, S.; Yoshitake, K.; Asaduzzaman, M.; Kinoshita, S.; Watanabe, S.; Asakawa, S. MiRNA-de avastamine ja funktsionaalne mõistmine molluskites: genoomi hõlmav profiilide koostamise lähenemisviis. RNA Biol. 2021, 18, 1702–1715. [CrossRef]
28. Rosani, U.; Bortoletto, E.; Bai, C.-M.; Novoa, B.; Figueras, A.; Venier, P.; Fromm, B. Kahepoolmeliste miRNAoomide uurimine: kaitse ja innovatsiooni vahel. Philos. Trans. R. Soc. B 2021, 376, 20200165. [CrossRef]
29. Pühap, X.; Zhang, T.; Li, L.; Tu, K.; Yu, T.; Wu, B.; Zhou, L.; Tian, J.; Liu, Z. MicroRNA ekspressioonisignatuur Yesso kammkarbi Patinopecten yessoensis vööt- ja silelihastes. Genomics 2022, 114, 110409. [CrossRef]
30. Tian, R.; Zheng, Z.; Huang, R.; Jiao, Y.; Du, X. miR-29a osales pärlmutrite moodustumisel ja immuunvastusest, sihtides Pinctada martensii Y2R-i. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 29436–29445. [CrossRef]
31. Chen, H.; Zhou, Z.; Wang, H.; Wang, L.; Wang, W.; Liu, R.; Qiu, L.; Song, L. Selgrootuspetsiifiline ja immuunsüsteemile reageeriv mikroRNA suurendab austrite hemotsüütide fagotsütoosi, suunates CgIκB2. Sci. Vabariik 2016, 6, 1–10. [CrossRef] [PubMed]
32. Chen, H.; Zhou, Z.; Wang, L.; Wang, H.; Liu, R.; Zhang, H.; Song, L. Selgrootutele spetsiifiline miRNA oli suunatud austrite iidsele kolinergilisele neuroendokriinsüsteemile. Ava Biol. 2016, 6, 160059. [CrossRef]
33. Chen, H.; Xin, L.; Laul, X.; Wang, L.; Wang, W.; Liu, Z.; Zhang, H.; Wang, L.; Zhou, Z.; Qiu, L. Norepinefriinile reageeriv miRNA soodustab otseselt CgHSP90AA1 ekspressiooni austrite hemotsüütides kuivamise ajal. Fish Shellfish Immunol. 2017, 64, 297–307. [CrossRef] [PubMed]
34. Han, Z.; Li, J.; Wang, W.; Li, J.; Zhao, Q.; Li, M.; Wang, L.; Song, L. Kalmoduliin, mille sihtmärgiks on miRNA karkass659_26519, reguleerib IL-17 ekspressiooni austri Crassostrea gigas varases immuunvastuses. Dev. Comp. Immunol. 2021, 124, 104180. [CrossRef] [PubMed]
35. Lv, Z.; Li, C.; Zhang, P.; Wang, Z.; Zhang, W.; Jin, C.-H. miR-200 moduleerib tsöelomotsüütide antibakteriaalset aktiivsust ja LPS-i praimimist, sihtides Tollipi Apostichopus japonicuses. Fish Shellfish Immunol. 2015, 45, 431–436. [CrossRef]
36. Li, C.; Zhao, M.; Zhang, C.; Zhang, W.; Zhao, X.; Duan, X.; Xu, W. miR210 moduleerib hingamisteede lõhkemist Apostichopus japonicus coelomotsüütides, sihtides Toll-sarnast retseptorit. Dev. Comp. Immunol. 2016, 65, 377–381. [CrossRef]
37. Lv, M.; Chen, H.; Shao, Y.; Li, C.; Zhang, W.; Zhao, X.; Jin, C.; Xiong, J. miR-92a reguleerib tselomotsüütide apoptoosi merikurgis Apostichopus japonicus, sihtides Aj14-3-3ζ in vivo. Fish Shellfish Immunol. 2017, 69, 211–217. [CrossRef]
38. Shao, Y.; Li, C.; Xu, W.; Zhang, P.; Zhang, W.; Zhao, X. miR-31 seob lipiidide metabolismi ja raku apoptoosi bakteritega nakatunud Apostichopus japonicus'es, sihtides CTRP9. Esiosa. Immunol. 2017, 8, 263. [CrossRef]
39. Guo, M.; Wang, Y.; Fu, X.; Tao, W.; Li, C. circRNA1149 pärineb Apostichopus japonicusest, mis pärsib tselomotsüütide apoptoosi, toimib miR-92käsnana, mis reguleerib Baxi ekspressiooni vastuseks Vibrio splendidus'e infektsioonile. Vesiviljelus 2023, 562, 738812. [CrossRef]
40. Zuo, H.; Weng, K.; Luo, M.; Yang, L.; Weng, S.; Tema, J.; Xu, X. A MicroRNA-1 – NF-κB raja vahendatud pärssimine JAK-STAT raja poolt selgrootute Litopenaeus vannameis. J. Immunol. 2020, 204, 2918–2930. [CrossRef]
41. Yang, H.; Xu, Z.; Guo, B.; Zhang, X.; Liao, Z.; Qi, P.; Yan, X. MiRNAome ja transkriptoomi integreeritud analüüs paljastab miRNA-mRNA võrgu reguleerimise Vibrio alginolyticusega nakatunud paksu kestaga rannakarp Mytilus coruscus. Mol. Immunol. 2021, 132, 217–226. [CrossRef] [PubMed]
42. de Morales, JMGR; Puig, L.; Daudén, E.; Cañete, JD; Pablos, JL; Martín, AO; Juanatey, CG; Adán, A.; Montalbán, X.; Borruel, N. Interleukiini (IL)-17 kriitiline roll põletikulistes ja immuunhäiretes: vaidlustele keskenduvate tõendite uuendatud ülevaade. Autoimmuun. Rev. 2020, 19, 102429. [CrossRef] [PubMed]
43. Kawaguchi, M.; Adachi, M.; Oda, N.; Kokubu, F.; Huang, S.-K. IL-17 tsütokiinide perekond. J. Allergy Clin. Immunol. 2004, 114, 1265–1273. [CrossRef] [PubMed]
44. Starnes, T.; Broxmeyer, HE; Robertson, MJ; Hromas, R. Tipptasemel: IL-17D, IL-17 perekonna uus liige, stimuleerib tsütokiinide tootmist ja pärsib hemopoeesi. J. Immunol. 2002, 169, 642–646. [CrossRef] [PubMed]
45. Gaffen, SL; Kramer, JM; Jeffrey, JY; Shen, F. IL-17 tsütokiinide perekond. Vitam. Horm. 2006, 74, 255–282. [PubMed]
46. Roberts, S.; Gueguen, Y.; de Logeril, J.; Goetz, F. Interleukiin 17 homoloogi transkripti kiire kogunemine Crassostrea gigas hemootsüütides pärast bakteriaalset kokkupuudet. Dev. Comp. Immunol. 2008, 32, 1099–1104. [CrossRef] [PubMed]
47. Li, J.; Zhang, Y.; Zhang, Y.; Xiang, Z.; Tong, Y.; Qu, F.; Yu, Z. Viie uudse IL-17 geeni genoomne iseloomustus ja ekspressioonianalüüs Vaikse ookeani austris, Crassostrea gigas. Fish Shellfish Immunol. 2014, 40, 455–465. [CrossRef]
48. Gaffen, SL Struktuur ja signaalimine IL-17 retseptorite perekonnas. Nat. Rev. Immunol. 2009, 9, 556–567. [CrossRef]
49. Hata, K.; Andoh, A.; Shimada, M.; Fujino, S.; Bamba, S.; Araki, Y.; Okuno, T.; Fujiyama, Y.; Bamba, T. IL-17 stimuleerib põletikulisi reaktsioone NF-κB ja MAP kinaasi radade kaudu inimese käärsoole müofibroblastides. Olen. J. Physiol. - Seedetrakt. Maksa füsiool. 2002, 282, G1035–G1044. [CrossRef]
50. Niimoto, T.; Nakasa, T.; Ishikawa, M.; Okuhara, A.; Izumi, B.; Deie, M.; Suzuki, O.; Adachi, N.; Ochi, M. MicroRNA-146a ekspresseerub reumatoidartriidiga patsientidel interleukiini-17 tootvates T-rakkudes. BMC Lihas-skeleti. Häire. 2010, 11, 1–11. [CrossRef]
51. Srivastava, A.; Nikamo, P.; Lohcharoenkal, W.; Li, D.; Meisgen, F.; Landén, NX; Ståhle, M.; Pivarcsi, A.; Sonkoly, E. MicroRNA- 146a pärsib IL-17-vahendatud nahapõletikku ja on geneetiliselt seotud psoriaasiga. J. Allergy Clin. Immunol. 2017, 139, 550–561. [CrossRef] [PubMed]
52. Zhao, S.; Cheng, Y.; Kim, JG mikroRNA-146a reguleerib IL-17 ja IL-35 alla ning pärsib inimese parodondi sidemete tüvirakkude proliferatsiooni. J. Cell. Biochem. 2019, 120, 13861–13866. [CrossRef] [PubMed]
53. Podsiad, A.; Standiford, TJ; Ballinger, MN; Eakin, R.; Park, P.; Kunkel, SL; Moore, BB; Bhan, U. MicroRNA-155 reguleerib peremeesorganismi immuunvastust viirusejärgsele bakteriaalsele kopsupõletikule IL-23/IL-17 raja kaudu. Olen. J. Physiol. - Kopsurakk. Mol. Physiol. 2016, 310, L465–L475. [CrossRef]
54. Xaus, J.; Comalada, M.; Valledor, AF; Lloberas, J.; López-Soriano, F.; Argilés, JM; Bogdan, C.; Celada, A. LPS indutseerib makrofaagides apoptoosi peamiselt TNF-i autokriinse tootmise kaudu. Blood J. Am. Soc. Hematool. 2000, 95, 3823–3831.
55. Bannerman, DD; Goldblum, SE Bakteriaalsete lipopolüsahhariidide poolt indutseeritud endoteeli apoptoosi mehhanismid. Olen. J. Physiol.-Lung Cell. Mol. Physiol. 2003, 284, L899–L914. [CrossRef]
56. Messing, DM; Hollingsworth, JW; Cinque, M.; Li, Z.; Potts, E.; Toloza, E.; Foster, WM; Schwartz, DA Krooniline LPS-i sissehingamine põhjustab hiire kopsudes emfüseemilaadseid muutusi, mis on seotud apoptoosiga. Olen. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2008, 39, 584–590. [CrossRef]
57. Draakon, S.; Saffar, AS; Shan, L.; Gounni, AS IL-17 nõrgendab GM-CSF-i apoptootilist toimet inimese neutrofiilides. Mol. Immunol. 2008, 45, 160–168. [CrossRef] [PubMed]
58. Zhu, F.; Wang, Q.; Guo, C.; Wang, X.; Cao, X.; Shi, Y.; Gao, F.; Ma, C.; Zhang, L. IL-17 kutsub esile veresoonte endoteelirakkude apoptoosi – inimese ägeda koronaarsündroomi potentsiaalne mehhanism. Clin. Immunol. 2011, 141, 152–160. [CrossRef]
59. Chang, Y.; Al-Alwan, L.; Audusseau, S.; Chouiali, F.; Carlevaro-Fita, J.; Iwakura, Y.; Baglole, CJ; Eidelman, DH; Hamid, Q. IL-17A geneetiline deletsioon vähendab sigaretisuitsu põhjustatud põletikku ja II tüüpi alveolaarsete rakkude apoptoosi. Olen. J. Physiol. - Kopsurakk. Mol. Physiol. 2014, 306, L132–L143. [CrossRef]
60. Hou, W.; Jin, Y.-H.; Kang, HS; Kim, BS interleukiin-6 (IL-6) ja IL-17 soodustavad sünergistlikult viiruse püsivust, pärssides raku apoptoosi ja tsütotoksiliste T-rakkude funktsiooni. J. Virol. 2014, 88, 8479–8489. [CrossRef]
61. Wang, Q.; Li, D.; Han, Y.; Ding, X.; Xu, T.; Tang, B. MicroRNA{1}} kaitseb A549 ja H1975 rakke LPS-i indutseeritud apoptoosi ja põletikukahjustuste eest. J. Biosci. 2017, 42, 637–645. [CrossRef] [PubMed]
62. Chen, Y.; Wu, Z.; Yuan, B.; Dong, Y.; Zhang, L.; Zeng, Z. MicroRNA-146a-5p nõrgendab kiiritusest ja LPS-st põhjustatud maksa tähtrakkude aktivatsiooni ja hepatotsüütide apoptoosi läbi TLR4 raja pärssimise. Cell Death Dis. 2018, 9, 1–16. [CrossRef] [PubMed]
63. Ding, Y.; Wang, L.; Zhao, Q.; Wu, Z.; Kong, L. MicroRNA-93 pärsib kondrotsüütide apoptoosi ja põletikku osteoartriidi korral, suunates TLR4/NF-κB signaaliülekanderaja. Int. J. Mol. Med. 2019, 43, 779–790. [CrossRef]
64. Wan, G.; An, Y.; Tao, J.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Yang, R.; Liang, Q. MicroRNA-129-5p leevendab seljaaju vigastusi hiirtel, pärssides HMGB1/TLR4/NF-κB raja kaudu apoptoosi ja põletikulist vastust. Biosci. Vabariik 2020, 40, BSR20193315. [CrossRef] [PubMed]
65. Ke, X.-F.; Fang, J.; Wu, X.-N.; Yu, C.-H. MicroRNA-203 kiirendab apoptoosi LPS-i poolt stimuleeritud alveolaarsetes epiteelirakkudes, sihikule PIK3CA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2014, 450, 1297–1303. [CrossRef] [PubMed]
66. Qi, P.; Tang, Z. Nrf2 molekul käivitab antioksüdantse kaitse ägeda benso(a)püreeni kokkupuute vastu paksu kestaga rannakarbis Mytilus coruscus. Aquat Toxicol 2020, 226, 105554. [CrossRef]
67. Schmittgen, TD; Livak, KJ Reaalajas PCR andmete analüüsimine võrdleva CT meetodil. Nat. Protoc. 2008, 3, 1101–1108. [CrossRef]
