Cistanche Deserticola fenüületanoid-glükosiidirikka ekstrakti sooletranspordi hindamine läbi Caco{1}} raku ühekihilise mudeli

Sissejuhatus

Inimese käärsoole adenokartsinoomidest tuletatud Caco{0}} rakuliinil on enterotsüütidega sarnased omadused. Normaaltingimustes eristuvad Caco-2 rakud spontaanselt küpsetest rakkudest ja moodustavad terved monokihid. Kõrvuti asetsevad rakud kleepuvad tihedate ühenduste kaudu, mis on moodustunud monokihi apikaalsel küljel, mis võib passiivselt eristada.ja transportis aktiivselt ravimeid läbi epiteelikihi. Morfoloogilise ja biokeemilise sarnasuse tõttu normaalsete enterotsüütidega on Caco{0}} rakkude monokihid hästi aktsepteeritud in vitro mudel ravimite soolestikus imendumise potentsiaali ja transpordiomaduste uurimiseks.

Erinevalt kemikaalidest on taimeekstraktid (PE) segud, mille bioloogiline aktiivsus ja aktiivsed koostisosad pole sageli hästi tuvastatavad. Lisaks on PE soolestiku transpordiomadused, erinevalt selle koostisosade omadustest, tihedalt seotud kliinilise kasutamisega. Caco{0}} raku monokihi uuritava proovi voo mõõtmine hõlmab tavaliselt keemilisi meetodeid, nagu HPLC, LC/MS jne. Kuigi need meetodid on võimsad tööriistad, on need keerulised, aeganõudvad, kallid ja aeg-ajalt nõuavad keerukaid seadmeid. Veelgi olulisem on see, et ei üksik ega vähemuskomponent ei suuda kajastada PE kui tervikut. Seega tuleb PE transpordiomaduste tuvastamiseks ja hindamiseks luua uudne lähenemisviis, mis ei sõltu koostisosade määramisest.

Holoparasiitne taim Cistanche deserticola YC Ma (CD) on levinud traditsiooniline Hiina meditsiin, mida kasutatakse peamiselt neerupuudulikkuse, keha nõrkuse ja kõhukinnisuse raviks ning need kasutusviisid on ametlikult registreeritud Hiina farmakopöas.Fenüületanoidglükosiidid (PhG-d), sealhulgas ehhinakosiid (EC), akteosiid (AC) ja isoakteosiid (IS) jne, on polüfenoolsete ühendite klass. Neid peetakse Cistanche liikide üheks peamiseks bioaktiivseks koostisosaks. Farmakoloogilised uuringud on näidanud, et PhG-de bioaktiivsus on mitmekesine ja hõlmab antioksüdatiivset, väsimusevastast, hepatoprotektiivset, immunomoduleerivat, põletikuvastast ja neuroprotektiivset toimet. PhG-de sooletranspordi omadusi ei ole siiski uuritud. Selles uuringus uurisime CD-st pärineva PhG-rikka ekstrakti (PRE) soole läbilaskvust integreeritud süsteemina ja kolme peamise PhG (AC, IS ja EC) läbilaskvust diferentseeritud Caco-2 rakkudes. Meie tulemused näitasid, et PRE transporditakse peamiselt halvasti neelduva passiivse difusiooni kaudu kontsentratsioonigradienti alla ilma väljavooluta, mis annab farmakokineetilise aluse PhG-de kliiniliseks kasutamiseks CD-s.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materjalid ja meetodid

Materjalid

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>98%) osteti ettevõttelt Must Biotechnology Co. (Chengdu, Hiina). Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde (DMEM), veise loote seerum (FBS) ja mitteasendatavad aminohapped (NEAA) on toodetud firmas Gibco BRL (Grand Island, NY, USA). 6-Süvend TranswellTM plaadid (sisemembraani kasvupindala 4,67 cm2) saadi firmalt Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, USA). Rotisaba kollageen saadi firmast Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kõik HPLC analüüsi reaktiivid ja kemikaalid olid analüütilise puhtusega.

PRE valmistamine CD-lt

Õhukuivatatud CD-materjal pulbristati ja ekstraheeriti perkolatsiooniga 70% etanooliga. PhG-rikas fraktsioon valmistati eelnevalt kirjeldatud viisil ja ekstraheeriti veega küllastunud n-butüülalkoholiga. Ekstrakti lahus kontsentreeriti ja kuivatati alandatud rõhul. Makropoorne vaik-UV spektrofotomeetria mõõdeti PhG sisalduseks 78,4%. Lõppproov esindas 1,75% tooraine saagist kuivmassist. Saadud proovi hoiti kuni edasise kasutamiseni -20 kraadi juures.

AC, IS ja EC määramine HPLC abil

AC, IS ja EC sisalduse määramiseks PRE-s kasutati Shimadzu HPLC süsteemi, mis oli varustatud LC-lahuse tarkvaraga. Kasutati pöördfaasilist Intersil C18 kolonni (4,6 mm × 25{5}} mm, 5 μm), mida hoiti toatemperatuuril. Liikuvad faasid olid atsetonitriil ja vesi, mis sisaldas 0,1% fosforhapet (maht/maht) gradientelueerimisega (tabel 1) voolukiirusel 1,0 ml/min. UV-spektrofotomeetri detektor määrati 334 nm peale. Vahelduvvoolu ja IS voo täpseks määramiseks töötasime välja uudse HPLC-fluorestsentsi tuvastamise (HPLC-FLD) meetodi. Pärast struktuurianalüüsi ja fluorestsentsi lainepikkuse skaneerimist (andmeid pole näidatud) saime optimaalsed fluorestsentsi tuvastamise tingimused vahelduvvoolu (nt 338 nm, Em: 448 nm) ja IS (nt 320 nm, Em: 434 nm) jaoks.

HPLC analüüsimeetodi valideerimiseks kasutati järgmisi jõudlusnäitajaid: stabiilsus, lineaarsus, tundlikkus, täpsus (päevasisene ja päevadevaheline varieeruvus) ja täpsus. Transpordipuhvris olevaid analüüte hoiti 24 tundi 25 kraadi juures pimedas ja mõõdeti nende stabiilsus. Analüüdid olid C-vitamiini juuresolekul väga stabiilsed (0,4%), kuna suhtelise standardhälbe (RSD) väärtused piigi aladel olid <3,5%. AC, IS ja EC lineaarse regressiooni võrrand, korrelatsioonikordaja, lineaarsuse vahemik, LOD ja LOQ on näidatud tabelis 2. LOD (18–30 nM) ja LOQ (60–100 nM) väärtused näitavad, et HPLC-FLD ja HPLC-UV meetodid on väga tundlikud. Meetodi täpsust väljendavad RSD väärtused olid kõik päevasisese ja -vahelise varieeruvuse korral < 2%, mis näitab head täpsust. Taastumise hindamiseks lisati transpordipuhvrile AC, IS ja EC, et saada kolm (kõrge, keskmine ja madal) kontsentratsiooni taset. Analüütide meetodi saagise väärtused on kokku võetud tabelis 3. Keskmine saagis jäi vahemikku 90,0% kuni 96,4%, mis näitab head täpsust. Kokkuvõtteks võib öelda, et kehtestatud HPLC meetodid on rahuldavad lineaarsuse, tundlikkuse, täpsuse ja täpsuse osas AC, IS ja EC kvantifitseerimiseks transpordipuhvris.

PRE määramine biotesti süsteemiga

Biotest (kogu antioksüdatiivne võime) põhines FRAP-i (raud(III) redutseeriv / antioksüdantne jõud) testil, mida me varem kirjeldasime [16] ja mida valideerisime lineaarsuse ja täpsuse (päevasisene ja päevadevaheline varieeruvus) osas. Biotesti meetodi lineaarsus määrati kalibreerimiskõverate põhjal. Lineaarsuse kontsentratsioonivahemik oli 0.0625–40 ug/ml (y=0.0258x+0.0968, R2=0.996). Kehtestatud biotesti meetodi täpsus määrati PRE analüüsi (10,0 ug/ml) päevasisese ja päevadevahelise varieeruvuse alusel. Meetodi päevane korratavus määrati viie järjestikuse määramise põhjal samal päeval. Päevadevahelist korratavust mõõdeti viie järjestikuse määramise põhjal kolmel erineval päeval. Meetodi täpsuse RSD väärtused olid vastavalt 1,014% ja 4,72% päevasisese ja päevadevahelise varieeruvuse korral, mis näitab head täpsust. Seega on kehtestatud biotesti meetod PRE kvantifitseerimiseks transpordipuhvris rahuldav lineaarsuse, täpsuse ja täpsuse osas.

Rakukultuur

Caco{{0}} rakke kultiveeriti 37 kraadi ja 95% suhtelise õhuniiskuse juures atmosfääris, mis sisaldas 5% CO2 ja söödet, mis koosnes DMEM-ist, 10% FBS-ist, 1% NEAA-st, 1% L-glutamiinist, penitsilliinist. (100 U/ml) ja streptomütsiin (100 ug/ml). Rakkude kasvu ja diferentseerumise ajal vahetati söödet igal teisel päeval. Rakke kasvatati 75-cm2 plastpudelites ja koguti iga 3–5 päeva järel 0,05% EDTA-trüpsiiniga. Transpordikatsete jaoks külvati rakud tihedusega 1 × 105 rakku/cm2 Transwelli sisestustele, mis olid kaetud kollageeniga. Ligikaudu 21 päeva pärast külvamist kasutati monokihte transpordikatsetes. Nende terviklikkus määrati trans-epiteliaalse elektritakistuse (TEER) mõõtmisega monokihtide lõikes EVOM-iga, mis oli varustatud ENDOHM-SNAP-iga (World Precision Instruments, Inc., USA). Caco-2 raku monokihi TEER väärtused pidid ületama 500 O∙cm2.

LOODUSLIK CISTANCH TUBULOSA RAHUSTAVAKS JA LAKSTIVAKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Transpordikatsed

Monokihti pesti transpordipuhvriga (P-puhver, mis sisaldas 10 mM HEPES-i, 1 mM naatriumpüruvaati, 10 mM glükoosi, 3 mM CaCl2 ja 145 mM NaCl, pH 7,4) ning seejärel eelinkubeeriti 20 minutit. 37 kraadi juures. Pärast transpordipuhvri eemaldamist lisati AP-s asuvasse apikaalsesse (AP) kambrisse (1,5 ml) basolateraalsete (BL) suunauuringute jaoks värsket katseproove sisaldavat transpordipuhvrit või BL-i suunauuringuteks BL-kambrisse (2,5 ml). AC, IS ja EC analüüside jaoks, kasutades HPLC-d, eemaldati igast vastuvõtukambrist erinevate ajavahemike järel (30, 60, 90 ja 120 min) alikvoot (300 ul). Vastuvõtja kambrit täiendati pärast iga proovivõttu sama koguse värske eelsoojendatud (37 kraadi) transpordipuhvriga. Kogutud proove hoiti edasiseks kasutamiseks temperatuuril -20 kraadi. Biotesti abil PRE määramiseks võeti ainult proovid 120 minuti pärast. PRE, AC, IS ja EC ebastabiilsuse tõttu lisati proovide stabiliseerimiseks 0,4% (mass/maht) C-vitamiini, et määrata AC, IS ja EC sisaldus HPLC abil ning PRE biotesti proovid analüüsitakse kohe pärast proovi võtmist. Iga proovi näiva läbilaskvuse koefitsiendi (Papp või 'Papp) väärtus arvutati.

Andmete analüüs

Pappi väärtused AC, IS ja EC AP BL või BLAP suundades arvutati järgmise võrrandi alusel: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), kus Papp on HPLC abil määratud näiv läbilaskvuse koefitsient (cm/s). (4Q/4t) on testitava ühendi (AC, IS või EC) ilmumiskiirus vastuvõtja poolel (μmol/s); A on sisetüki pindala (cm2); C0 on uuritava ühendi esialgne kontsentratsioon doonori poolel (μmol/ml). Täpsemalt, Pappi väärtuste arvutamisel kasutati massiühikut "ug" "μmol" asemel. Andmed on väljendatud keskmistena ± SD.

Tulemused

AC, IS ja EC koosseis PRE-s CD-lt

Kuna AC, IS ja EC peetakse peamisteks bioaktiivseteksCistanche liikide PhGd, analüüsisime nende sisu PRE-s HPLC-UV kaudu. Tüüpiline kromatogramm on näidatud joonisel 1. Nende koostisosade identifitseerimine põhines retentsiooniaegade ja UV-spektri võrdlemisel autentsete standardite omadega lainepikkusel 334 nm. AC, IS ja EC sisaldus PRE-s oli vastavalt 26,60%, 1,84% ja 32,83%. Seega moodustavad need kolm ühendit 61,27% PRE-st; Lisaks näitavad ülaltoodud tulemused, et PhG sisaldus PRE-s on 78,4%. Seetõttu moodustavad AC, IS ja EC ligikaudu 80% PRE PhG-dest.

PRE, AC, IS ja EC kogu antioksüdatiivne võime

UuringudPhG-de antioksüdatiivne toimeon teatatud CD-st ning AC, IS ja EC moodustavad ligikaudu 80% PRE-s esinevatest PhG-dest. Seega analüüsiti PRE, AC, IS ja EC kogu antioksüdatiivset võimekust ja väljendati FRAP väärtuste (× 10–6 mmol) abil. Nagu on näidatud joonisel 2, kui FRAP väärtus oli 8 × 10–6 mmol, olid PRE, AC, IS ja EC lõppkontsentratsioonid 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml ja 4,89 ug. /ml, mis näitab, et nende nelja proovi kogu antioksüdatiivne võime oli järgmine: AC > EC > PRE > IS. PRE bioaktiivsus on omistatud selle toimeainerühmadele (AIG). Ligikaudu 60% PRE-st näitasid AC ja EC tugevamat kogu antioksüdatiivset aktiivsust kui PRE ja IS. Kuna IS (1,84%) moodustab PRE-st väga väikese osa, on PRE-s selgelt aktiivsed ka teised komponendid, nagu nõrgalt antioksüdatiivne IS. Üllataval kombel erines kogu antioksüdatiivne aktiivsus AC ja selle isomeeri IS vahel peaaegu 7- korda, mis näitab, et antioksüdatiivset toimet ei mõjutanud mitte ainult fenoolsete hüdroksüülrühmade arv, vaid ka fenoolsete hüdroksüülrühmade positsioon molekulis. .

Caco-2 monokihtide valideerimine

Caco-2 rakkude ühekihilise süsteemi valideerimiseks määrati propranolooli (hästi transporditav marker) ja Luciferi kollase (halvasti transporditav marker) Papp väärtused AP-st BL-i läbi Caco-2 monokihtide. määrati vastavalt 1, 51 × 10–5 cm / s ja 2, 8 × 10–7 cm / s ning need väärtused langesid kokku eelmistes aruannetes avaldatud väärtustega. Aluselise fosfataasi aktiivsuse test kinnitas samuti, et Caco-2-rakkude monokihid olid kvalitatiivselt võrreldavad peensoole epiteeliga.

AC, IS ja EC läbilaskvus

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), samas kui halvasti imenduvate ravimite omad olid madalad (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion. 

PRE läbilaskvus

Ülaltoodud tulemused näitavad, et PRE kogu antioksüdatiivne võime tuleneb vähemalt 61,27% AIG-st PRE-st. Seega hindasime PRE TR-i kogu antioksüdatiivse võime kontsentratsiooni-efekti kõvera põhjal ja arvutasime PRE transpordiomaduste kajastamiseks Papp väärtused. AP!BL ja BL!AP PRE PAPP väärtused olid (2,16 ± 0,26) × 10–7 cm/s ja (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, mis näitab, et see ühend oli halvasti läbilaskev. Veelgi enam, väljavool või aktiivne transport ei olnud ilmne, kuna 'Papp BL-i ja AP-i / 'Papp AP-i ja BL-i suhe PRE puhul oli 1,45. Lisaks suurenes PRE kahesuunaline TR lineaarselt vahemikus ligikaudu 300 kuni 900 ug/ml (joonis 5). Tulemuste suunaeelistuse puudumine viitab sellele, et passiivne difusioon on PRE peamine transpordimehhanism.

LOODUSLIK TUBULOOS IMmuunsuse PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Arutelu

Võrreldes kõrgelt puhastatud ravimitega on PE üldiselt segud, mis koosnevad sadadest väga erinevate füüsikalis-keemiliste omadustega koostisosadest. Seetõttu avaldab PE tänu oma keerulisele AIG-le [21] süstemaatilist, mitme sihtmärgi ja mitme kanaliga sünergistlikku toimet, mis takistab PE transpordiomaduste analüüsi. PE transpordiomaduste teaduslikumaks hindamiseks on mõned teadlased tuvastanud PE-s mitu komponenti, mitte ühe komponendi [22–24]. Sellegipoolest ei saa piiratud arv koostisosi kajastada PE-d tervikuna. Kõigi komponentide määramine PE-s on aga võimatu. Veelgi enam, kui PE erinevatel komponentidel on täiesti erinevad transpordiomadused, on PE terviklikke transpordiomadusi raske tuvastada.

1990. aastatel kasutati antimikroobsete ainete TR-i hindamiseks biotestisüsteeme [25]. 2005. aastaks olid Eguchi ja tema kolleegid [26] hinnanud porgandiekstrakti antioksüdatiivset toimet, kasutades diferentseerunud Caco-2 rakkude BL söödet; see lähenemisviis on sobivam in vivo olukordade kajastamiseks.

Eelmise PhG-de aktiivsuse aruande ja meie tulemuste põhjal (joonis 2) saab AIG TR-i PRE-s hinnata, määrates vastuvõtjakambris oleva söötme kogu antioksüdatiivse võime. Pärast transpordikatseid leidsime, et PRE TR oli mõlemas suunas sarnane ning see transport oli küllastumata ja halvasti neelduv ('Papp < ​​1.0 × 10–6 cm/s) ning see ei olnud. näitavad väljavoolu, mis viitab sellele, et passiivne difusioon kontsentratsioonigradienti alla on PRE peamine transpordimehhanism (joonis 5). Lisaks on PRE transpordiomadused kooskõlas AC, IS ja EC omadega, tõhusate komponentidega, millel on PRE antioksüdatiivne toime (joonis 4 ja tabel 4). See tulemus oli ootuspärane ja näitas, et käesolev biotesti süsteem on sobiv ja usaldusväärne AIG transpordiomaduste hindamiseks PRE-s diferentseerunud Caco{10}} rakkudes.

Erinevalt kanoonilisest Papp väärtusest, mida tavaliselt kasutatakse ühe ühendi transpordi kajastamiseks, ei pruugi kontsentratsiooni-efekti kõveral põhinev TR-st saadud Pappi väärtus kajastada mitte ainult neid komponente, mis tungivad läbi terve struktuuriga monokihi, vaid hõlmavad ka muid sihtaktiivsusega seotud tegureid, nagu komponentide metaboliidid, keemiliselt lagunenud tooted ja isegi mõned tsütokiinid, mis sekreteeritakse Caco-2 rakkudest vastusena stimulatsioonile, mis võib mõjutada sihtmärgi bioaktiivsust. Seega määrab „Papp väärtuse” ülalmainitud multifaktor, mitte ainult transporditud terved komponendid. Seetõttu võib 'Papp olla tugevamalt korrelatsioonis in vivo olukordadega kui kanooniline Pappi väärtus. Selles uuringus selgitasime PRE passiivselt hajutatud ja halvasti imendunud olemust selle Pappi väärtuse põhjal ning see olemus võib olla seotud CD suure annuse ja pika kliinilise raviperioodiga. Sellegipoolest pakuvad need leiud kliinikutele süstemaatilisemaid juhiseid CD rakendamisel, kui on tuvastatud ainult enamiku CD-s leiduvate AIG-de transpordiomadused, mitte ainult PhG-d.

Valitud bioaktiivsuse üksus peab siiski olema piisavalt tundlik, et seda vastuvõtjakambri keskkonnas tuvastada, mis kujutab endast väljakutset PE transpordiomaduste hindamiseks vajaliku biotestisüsteemi loomisele. Lisaks peaks bioaktiivsus sõltuma ka võimalikult paljudest komponentidest. Meie uuringus oli kogu antioksüdatiivse võime test sobivam kui mitmed teised meetodid (S1 joonis). Kuid isegi nii saab meie analüüs tuvastada PRE TR-i ainult 120 minuti pärast.

Käesolevas uuringus loodi kollektiivselt uudne biotesti süsteem, et hinnata PRE soolestiku läbilaskvust diferentseerunud Caco{0}} rakkudes. Saadud tulemused näitasid, et halvasti neelduv passiivne difusioon alla kontsentratsioonigradienti ilma väljavooluta on PRE peamine transpordimehhanism (joonis 5), mis annab farmakokineetilise aluse PhG-de kliiniliseks kasutamiseks CD-s. Uudse biotestisüsteemi kasutamine TR-i hindamiseks ja seeläbi Papp-väärtuste arvutamiseks AIG-i sooletranspordiomaduste hindamiseks PE-des on teostatav. See lähenemine võib sobida ka muude PE jaoks, kui on asjakohane bioaktiivsus.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%