Cistanche'i glüeosiidide mõju kognitsiooni ja sünaptilise plastilisuse õppimisele unehäiretega mudelrottidel

KOKKUVÕTE

Eesmärk:Uurida, kas cistanche glükosiidid võivad sünaptilist plastilisust reguleerides parandada unepuuduse mudelrottide õppimis- ja kognitiivset funktsiooni.

Meetodid: viiskümmend isast Wistari rotti jagati juhuslikult tühjaks kontrollrühmaks (kontroll), platvormi kontrollrühmaks (PC), mudelrühmaks (mudel),Tistanche rühma glükosiidid (GC), ja estasolaami rühm ( Est ). Rottide unepuuduse mudel valmistati modifitseeritud mitmeplatvormilise veekeskkonna meetodil. Rottide ruumilise kognitiivse funktsiooni ja emotsionaalsete muutuste tuvastamiseks kasutati Morrise veelabürinti ja avatud välitesti. Nissl-värvimist kasutati närvirakkude morfoloogia ja koguse muutuste jälgimiseksRottide hipokampuse CAl piirkond. Sünaptofüsiini (SY'N), postsünaptilise membraantiheda aine 95 (PSD -95) ekspressioonitasemete tuvastamiseks kasutati Western blot'i ja R'T-PCR-i.ajust tuletatud neurotroofne faktor (BDNF). 

Tulemused;Morrise veelabürindi tulemused näitasid, et võrreldes kontrollrühmaga,rottide õppimis- ja kognitiivsed võimedmudelirühmas oli see oluliselt vähenenud ( P<0. 05 ), and the learning and memory function of rats wasparanenud GC-ravi ( P <0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05 ), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05 ), the resting time increased ( P <0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T - PCR showed that the BDNF-i valgu- ja geeniekspressioonitasemed, SYN ja PSD -95Mlodeli rühmas vähenesid oluliselt ( P<0. 05 ), while after treatment with GCs, the expression levels ofBDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05). Conclusion: Glycosides of cistanche may af. feet synaptic plasticity by regulating the expression of synaptic-related markers, thereby improving the learning and cognitive function of sleep deprivation model rats.

TAIMSED TISTANŠI VALMISTAMISE LISANDID JAOKSÕPPIMISE JA KOGNITIIVSE FUNKTSIOONI PARANDAMINE

MÄRKSÕNADTistanche glükosiidid; hipokampus; Unepuudus; Õppimine ja mälu; Ärevus; Sünaptiline plastilisus

Unehäire (SD)on aebanormaalse une funktsionaalne häirepõhjustatud mitmetest keerukatest teguritest, naguunetus, unenäolisus, jakerge ärkamine. Viimastel aastatelSD esinemissageduson järk-järgult suurenenud. Seotud uuringud on teatanud, et SD võib põhjustadasüdame-veresoonkonna haigused,metaboolne düsfunktsioon,immuunhaigused, jakesknärvisüsteemdegeneratiivsed haigused nagu Alzheimeri tõbi [1]. SD võib põhjustada hipokampuse neuronite oksüdatiivset kahjustust, kognitiivset düsfunktsiooni ja põhjustada meeleolumuutusi, nagu ärevus ja depressioon [2]. Cistanche deserticola on hinnaline ravimmaterjal, mida saab Hiinas kasutada nii ravimina kui ka toiduna. See toniseerib neere ja täiendab qi-d, niisutab soolestikku, soodustab soolte liikumist ja tugevdab yangi. Cistanche deserticola põhiekstraktil, cistanche glükosiididel (GC), on antioksüdant, apoptootiline, maksa- ja neuroprotektiivne toime [3]. Meie varasemad uuringud näitasid, et GC-d võivad parandada SAMP8 hiirte õppimis- ja kognitiivset funktsiooni, mängides antioksüdantset ja apoptootilist rolli [4].

Seotud uuringud on näidanud, et SD-st põhjustatud kognitiivne düsfunktsioon on tihedalt seotud sünaptilise plastilisusega [5]. Siiski on vähe teateid mehhanismi kohta, mille abil GC-d reguleerivad sünaptilist plastilisust ning parandavad unepuudusest põhjustatud rottide õppimis- ja mäluhäireid ning kognitiivset langust. Seetõttu on selle uuringu eesmärk uurida, kas GC-d mõjutavad sünaptilist plastilisust, reguleerides sünaptiga seotud markerite ekspressiooni, parandades seeläbi unepuuduse mudelitega rottide õppimis- ja kognitiivset funktsiooni, ning pakkuda uusi raviideid ja plaane GC-de jaoks õppimise ja kognitiivsete protsesside raviks. unehäiretest põhjustatud kahjustus.

1 Materjalid ja meetodid

1.1 Katseloomad

Isased Wistari rotid vanuses 6–8 nädalat kaaluga 280–300 g osteti Pekingi Sibeifult loomakasvatuslitsentsiga [SCXK (Peking) 2019-0010]. Kõiki loomi peeti Baotou Meditsiinikolledži loomkatsekeskuses järgmistes tingimustes: temperatuur (24 ± 1) kraadi, niiskus 50% kuni 55%, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust ning toidule ja veele ei seatud piiranguid. Selle katse kiitis heaks koolieetikakomitee [Baoyi Lunshen 2022 nr (63)].

1. 2 Peamised reaktiivid ja instrumendid

Cistanche deserticola glükosiidid osteti ettevõttelt Chengdu Xiyu Cistanche Biotechnology Co., Ltd. (partii number: KSM20220609011); Estasolaami tabletid osteti firmalt CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (partii number: 044220343); valgu laadimispuhver (P1015), RIPA lüüsipuhver (R0010), kemoluminestsentslahus (PE0010) jne osteti kõik ettevõttelt Beijing Solebao; postsünaptilise tihedusega aine 95 (PSD-95) antikehas (AB192757) ja sünaptofüsiini (SYN) antikehas (ab32127) osteti ettevõttelt Abcam, USA Company; ajust tuletatud neurotroofne faktor (BDNF) (48503-2) ja -aktiin (52901) osteti firmalt SAB Company, USA; kitse küülikuvastane IgG sekundaarne antikeha (SA00001-20) osteti ettevõttelt Proteintech Company, USA; roti melatoniin (MT) ja ELISA Scientific Research Kit (MM-0657R1) osteti ettevõttelt Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry Co., Ltd. Parafiini viilutaja (Leica, Saksamaa); optiline mikroskoop (Leica, Saksamaa);

Morrise veelabürint, avamaa katsekast (Shanghai Xinruan); vertikaalsed elektroforeesiaparaadid (Beijing Liuyi Company); värvitustamise loksuti (Beijing Liuyi Company); valgu pildistamise analüüsisüsteem (Shanghai Tanon Technology); fluorestsents-kvantitatiivne PCR instrument (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1.3 Katsemeetodid

1.3.1 Loomade rühmitamine ja ravimite manustamine

50 isast Wistari rotti jagati juhuslikult tühjaks kontrollrühmaks (kontrollrühm), platvormi kontrollrühmaks (platvormi kontrollrühm, PC-rühm), mudelrühmaks (mudelrühm) ja Cistanche deserticola rühma glükosiidide summaarseks rühmaks (GC-de rühm). , 50 mg/kg) ja estasoliini rühm (Est rühm, 0,54 mg/kg), igas rühmas 10 rotti. Kontrollrühmale ja PC-rühmale manustati sondiga 0,9% soolalahust. Kõikidele rühmadele tehti sondiga iga päev kell 7 hommikul pärast modelleerimise algust ja sondimine kestis 21 päeva.

1.3. 2. Unepuuduse loommudeli koostamine

Unepuuduse mudel loodi modifitseeritud mitmeplatvormilise veekeskkonna meetodil [6]. Katsevarustuseks oli 130 cm × 50 cm × 45 cm ristkülikukujuline polüetüleenvaigust veepaak. Veepaaki asetati väike platvorm läbimõõduga 5 cm ja kõrgusega 20 cm. PC-grupi platvormi läbimõõt oli 10 cm ja kõrgus 20 cm. Veepaak täideti veega umbes 18 cm sügavuselt ja vee temperatuuri hoiti (20 ± 1) kraadi juures. Nädal enne katse algust paigutati rotid keskkonnaga tutvumiseks iga päev 60 minutiks unepuuduse kasti. Pärast mudeli loomist, välja arvatud kontrollrühm, paigutati iga rühma rotid iga päev kella 8.00–20.00 väikesele platvormile 21 järjestikuse päeva jooksul unepuuduse tagamiseks.

Kõigil rottidel oli vaba juurdepääs toidule ja veele ning nad liikusid vabalt platvormil. Valguse ja pimeduse tsükkel oli iga päev 12 tundi.

1. 3. 3 Morrise veelabürindi katse

Morrise veelabürint jagati 4 alaks, täideti veega ja platvorm asetati 4. kvadranti. Veepind oli platvormist umbes 2 cm kõrgemal. Vette lisati toidukõlblikku söödavat melaniini ja vee temperatuuri hoiti (25 ± 1) kraadi juures. (1) Positsioneerimise navigatsioonikatse: iga ala keskpunkt valiti ja rotid asetati õrnalt vette. Neil lubati vabalt uudistada. Registreeriti aeg, mis kulus rottidel sihtplatvormi leidmiseks 60 sekundi jooksul. Rotid, kes platvormi ei leidnud, juhatati platvormile ja jäid sinna 20 sekundiks. Koolitust jätkati 5 päeva. (2) Ruumilise uurimise test: 6. päeval eemaldati platvorm ja rotid pandi vette 2. kvadrandi keskelt vastu seina. Registreeriti, mitu korda rotid platvormist 120 sekundi jooksul möödusid ja 4. kvadrandis viibimise aeg.

1. 3. 4 Avamaa katse

Kasutati 100 cm × 100 cm × 50 cm katsekarpi ja kasti põhi jagati 9 ruudustikuks. Iga rottide rühm pandi eelnevalt avatud väli katseruumi, et kohaneda sisekeskkonnaga 60 minutiks. Katse alguses paigutati katserotid kordamööda avatud väli katsekasti fikseeritud nurkadesse ning käitumisanalüüsi tarkvara abil registreeriti rottide seisukordade arv, liikumiskaugus ja staatiline aeg 5 minuti jooksul. Keskkond pidi katse ajal olema vaikne ning katseseadet pühiti kahe katse vahel vastavalt vee ja alkoholiga, et vältida esimese roti lõhna mõjutamist järgmise roti käitumise hinnangul.

1. 3. 5 Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA)

Seerumi MT taseme tuvastamine rottidel Rotid anesteseeriti intraperitoneaalse süstiga ja kõhuaordist koguti 5 ml verd. Pärast 30-minutilist ootamist toatemperatuuril tsentrifuugiti verd seerumi saamiseks. Igasse süvendisse lisati 40 μL proovilahjendit ja seejärel 10 μL testitavat proovi. Pärast tihenduskilega sulgemist inkubeeriti plaati 37 kraadi juures 30 minutit. 5 korda pestud, lisati 50 µl ensüümi märgistuslahust, plaat suleti tihenduskilega ja inkubeeriti 37 kraadi juures 30 minutit. Pestud 5 korda ja seejärel lisati kordamööda värvuse tekitav lahus ja reaktsiooni lõpetamise lahus. Iga süvendi OD väärtust mõõdeti ensüümmärgistiga lainepikkusel 450 nm.

1. 3. 6 Nissl värvimine

Igast rühmast valiti kolm rotti, ajukude eemaldati dekapitatsiooni teel ja fikseeriti 4% polüoksüetüleeni lahusega. Kude dehüdreeriti, sukeldati vahalahusesse, sisestati ja viilutati tavapäraste meetoditega. Viile hoiti paksusega 5 μm, loputati PBS-ga, värviti 0,1% toluidiinsinisega 0,5 tundi, diferentseeriti 95% alkoholiga, dehüdreeriti 100% alkoholiga, läbipaistvaks muudeti ksüleeniga ja suletud neutraalse kummiga. Muutusi morfoloogias ja neuronite arvus roti hipokampuse CA1 piirkonnas vaadeldi mikroskoobi all ja koguti pilte.

1. 3. 7 Western blot katse

Igast rühmast valiti neli rotti ja hipokampus isoleeriti dekapitatsiooni teel. Hipokampuse kude segati jäävanni keskkonnas RIP A lüüsipuhvriga ja kude tsentrifuugiti supernatandi saamiseks. Valgu kontsentratsioon tuvastati BCA meetodil. Elektroforeesiks lisati 20 ug valku koos valgu laadimispuhvriga. Pärast valgu elektroforeesi lõpetamist kanti membraan üle 300 mA konstantse vooluga, blokeeriti 5% lõssipulbriga, primaarset antikeha inkubeeriti 4 kraadi juures üleöö ja sekundaarset antikeha inkubeeriti toatemperatuuril 2 tundi. Pärast värvide arendamise lahuse kasutamist analüüsiti valgu ribasid statistiliselt, kasutades kemoluminestsentskujutise analüüsisüsteemi.

1. 3. 8 RT-PCR katse

Igast rühmast valiti kolm rotti hipokampuse koe homogenaadi valmistamiseks. Kogu RNA koevedelikus ekstraheeriti Trizoli meetodil ja mõõdeti kontsentratsioon. Pöördtranskriptsiooniks kasutati kiire cDNA sünteesikomplekti ja sünaptilise valgu mRNA suhtelise ekspressioonitaseme tuvastamiseks viidi läbi fluorestsentsi kvantitatiivne amplifikatsioonireaktsioon, kasutades fluorestsentsi kvantitatiivset komplekti. Tulemusi analüüsiti, kasutades 2-ΔΔCt. Praimerite järjestused on näidatud tabelis 1.

Tabel 1 RT-PCR praimeri järjestused

1.4 Statistilised meetodid

Normaaljaotusele vastavad andmetulemused väljendati keskmise ± standardhälbena (x ± s) ja statistiline analüüs viidi läbi GraphPad Prism 9.5 tarkvara abil. Mitme proovi võrdlemiseks kasutati ühesuunalist dispersioonanalüüsi ja P < 0,05 näitas, et erinevus oli statistiliselt oluline.