Shenkangi mõju neerufibroosile ja neerude interstitsiaalsete fibroblastide aktiveerimisele JAK2/STAT3 raja kaudu
Feb 27, 2022
Taust
Krooniline neeruhaigus (CKD) tuleneb paljudest erinevatest haigustest, mis kahjustavad pöördumatult neere ja põhjustavad patsientidel erinevat tüüpi tüsistusi [1]. Dialüüsi saavate patsientide elukvaliteet on oluliselt mõjutatud ja ravikulud on väga suured [2]. Esmane patoloogiline protsessneerukahjustusviib normaalseksneeru-parenhüümi hävitamine ja progresseeruv armkoe moodustumine, mis lõpuks põhjustab fibroosi. Neerudfibroos hõlmab tubulaarset interstitsiaalset fibroosi ja glomeruloskleroosi [3], mis viib rakkude hävimiseni.renaalse kude ja funktsiooni kaotus.Neerudtubulointerstitsiaalne fibroos on tüüpiline viis peaaegu kõigi krooniliste neeruhaiguste progresseerumiseks ja lõppstaadiumis peamine patoloogiline alusneeruhaigus,mida iseloomustab tubulaarsete epiteelirakkude atroofia, põletikuliste rakkude infiltratsioon, ebanormaalne aktivatsioon ja kasv.neeru-fibroblastid ja liigne ekstratsellulaarse maatriksi (ECM) akumulatsioon [4, 5]. Efektorrakud, -silelihase aktiin (-SMA) -positiivsed müofibroblastid, sünteesivad ja sekreteerivad ECM-i. Interstitsiaalsete fibroblastide aktiveerimine müofibroblastideks võib aidata kahjustatud kudesid parandada. Kui see parandusprotsess on aga ebanormaalne ja eritub liigselt ECM-i, tekib pöördumatu neerukahjustus. Sellest tulenevalt võib müofibroblastide aktivatsiooni vahendav signaalirada olla sihtmärgiks, et leevendadaneeru-fibroos.
CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST
Januse kinaasi/signaalimuundur ja transkriptsiooni aktivaator (JAK/STAT) on pleiotroopne signaalikaskaad mitmete kasvufaktorite ja tsütokiinide jaoks [6], mis vahendab mitmesuguseid raku funktsioone, sealhulgas rakkude ellujäämist ja proliferatsiooni [7]. STAT3 aktiveeritakse türosiini (Tyr) fosforüülimisega Tyr705 juures Januse kinaasi kaudu vastuseks erinevatele kasvufaktoritele ja tsütokiinidele, sealhulgas transformeerivale kasvufaktorile (TGF-) [8]. Fosforüülitud STAT3 moodustab dimeere, mis kantakse seejärel tuuma, kus nad seonduvad otseselt DNA järjestusega ja reguleerivad sihtgeenide ekspressiooni [9]. STAT3 ja JAK2 aktivatsioon suureneb fibrogeensetes neerude interstitsiaalsetes fibroblastides, mis on põhjustatud ühepoolsest kusejuha obstruktsioonist (UUO) [10, 11]. STAT3 fosforüülimise suurenemist on täheldatud ka TGF- -töödeldud NRK-49F-rakkudes [12].
Praegu laialdaselt kasutatavate kroonilise neeruhaiguse ravimeetoditega kaasnevad sageli vähem kui rahuldavad toimed [13] ja tavalised kõrvaltoimed. Seega on väga oluline uurida ja välja selgitada tõhusad ravimeetmed kroonilise neeruhaiguse esinemise ja arengu ennetamiseks ja kontrollimiseks, et parandada patsientide prognoosi. Shenkang (SK) on tavaliselt kasutatav taimne valem, mis sisaldab rabarberit (Rheum palmatum L. või R. tanguticum Maxim. ex Balf.), punast salvei (Salvia miltiorrhiza Bunge), safloori (Carthamus tinctorius L.) ja astragalust (Astragalus mongholicus) Bunge). Alates 1990. aastatest on SK-d Hiinas kasutatud kroonilise neeruhaiguse ja sellega seotud haiguste, sealhulgas kroonilise diabeetilise nefropaatia (DN) raviks.neerupuudulikkus, glomerulonefriit, krooniline nefriit janeeru-puudulikkus. Oma ilmse ravitoime ja väheste kõrvaltoimete tõttu võib SK haiguse progresseerumist edasi lükataneeru-düsfunktsioon kroonilise neeruhaiguse korral. Kliinilises uuringus, milles osales 2200 inimest, selgitati SK tõhusust krooniliste haiguste eest kaitsmiselneeru-kroonilise neeruhaigusega seotud ebaedu ja sümptomid pärast traditsioonilise hiina meditsiiniga ravi olid vastavalt 73,05 ja 98.00 protsenti. Lisaks jäid kreatiniini kliirensi kiirus ja seerumi kreatiniini (SCr) tase stabiilseks, mis näitab, et SK on hea efektiivsusega ja ohutu kroonilise neeruhaiguse raviks [14]. On tõestatud, et SK suudab leevendada kroonilist neeruhaigust janeeru-fibroos, leevendades fibroosi, põletikku [15] ja apoptoosi [16]. Kuid enamik olemasolevaid selleteemalisi uuringuid ei olnud piisavalt kõikehõlmavad ja keskendusid peamiselt TGF-i ja sellega seotud radadele. UUO mudelit peetakse eksperimentaalseks mudeliks neerufibroosi uurimiseks. Käesolevas uuringus uurisime SK mõju NRK-49F fibroblastirakkude aktivatsioonile ja neerufibroosile UUO hiirtel. Lisaks näitasime, et need SK ravitoimed võidi saavutada JAK2/STAT3 raja sihtimisega kultiveeritud NRK-49F rakkudes ja UUO hiiremudelis.
Märksõnad:Shenkang, krooniline neeruhaigus, neerufibroos, UUO, neerufibroblastide aktiveerimine, JAK2 / STAT3 rada
meetodid
Kemikaalid ja reaktiivid SK osteti ettevõttelt Shijishenkang Pharmaceutical Company, Ltd. (Xi'an, Hiina). Losartaani kaaliumitabletid osteti firmalt Merck Sharp & Dohme Pharmaceutical Company, Ltd. (Hangzhou, Hiina).
Rakukultuur
Roti neeru fibroblasti rakuliin (NRK-49F) saadi Ameerika tüüprakkude kollektsioonist (ATCC, Manassas, VA, USA). NRK-49F-rakke kultiveeriti täissöötmes, st Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (Invitrogen, CA, USA), mis sisaldas 5 protsenti veise loote seerumit, 1 protsenti penitsilliini ja streptomütsiini, 5 protsenti CO 2 ja 95 atmosfääris. protsenti õhku 37 kraadi juures. Seejärel töödeldi rakke TGF- 1-ga (10 ng/mL) või ilma (Novoprotein, Shanghai, Hiina), angiotensiini retseptori blokaatori (ARB) (1 mg/ml) ja SK gradiendi kontsentratsiooniga pärast kinnitumist ja hinnati rakkude elujõulisust.
Rakkude elujõulisuse analüüsid
NRK-49F-rakkude elujõulisus määrati rakkude loenduskomplekti-8 (Dojindo, Kyushu, Jaapan) abil vastavalt komplekti juhistele. NRK-49F-rakud plaaditi 96-süvendiplaatidele tihedusega 5 × 10 4 rakku süvendi kohta. Iga ravi jaoks tehti 5 kordust. Pärast 24-tunnist või 48-tunnist kultiveerimist asendati igas süvendis sööde 100 μL seerumivaba söötmega, mis sisaldas CCK-8 (10:1), ja rakke inkubeeriti inkubaatoris veel 2 tundi. Neeldumist mõõdeti lainepikkusel 450 nm. Ravi mõju arvutati elusrakkude protsendina ainult vehiikuliga töödeldud elusate kontrollrakkude suhtes.
Loomad
Selles uuringus kasutatud katseprotseduurid kiitis heaks Pekingi traditsioonilise hiina meditsiini ülikooli loomahooldus- ja eetikakomitee (nr BUCM{{{{30}}}},018,{ {39}}60,419-2023) ning on kooskõlas rahvusvaheliselt tunnustatud laboriloomade kasutamise ja hooldamise põhimõtetega. Kolmkümmend kuus 8-nädalast C57BL/6 isast hiirt osteti ettevõttelt Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (SYXK (Jing), 2017–0{ {51}}33). Hiired paigutati spetsiaalsesse patogeenivabasse loomalaborisse konditsioneeritud ruumis (valgus: 12-h valguse/pimeduse tsükkel; toatemperatuur: 25±1 kraadi; suhteline õhuniiskus: 50±). 10 protsenti) ja jagati juhuslikult järgmisse kuue rühma: võltsrühm, UUO rühm, ARB rühm ning kõrge, mõõduka ja väikese annuse SK rühm. UUO indutseeriti hiirtel UUO rühmas, ARB rühmas ning kõrge, mõõduka ja väikese annuse SK rühmas vastavalt eelnevalt kehtestatud protseduurile. Anesteesia kutsuti esile 2% isofluraaniga ja säilitati 1,5% isofluraaniga. Vasakusse kõhuõõnde tehti 1- kuni 2- cm pikisuunaline sisselõige ja vasak kusejuha eraldati nürilt, ligeeriti kahest kohast ja lõigati seejärel kahe ligeerimise vahelt. Seejärel suleti kõhuõõs, misjärel anti 3 päeva analgeesia. Näidisrühma hiirtele tehti sarnased kirurgilised protseduurid, sealhulgas operatsioonieelne ja postoperatiivne anesteesia, laparotoomia ja kusejuha nüri eraldamine, ilma kusejuha ligeerimise ja lõikamiseta. Alates teisest päevast pärast obstruktsiooni manustati losartaani intragastraalselt ARB rühma hiirtele annuses 0,13 mg/10 g (0,15 ml/10 g). SK-d manustati suures annuses 0,08 g/10 g (0,13 ml/10 g), mõõdukas annuses 0,04 g/10 g (0,13 ml/10 g) või väikeses annuses 0,02 g/10 g (0,13 ml/10 g). SK rühma hiirtel sabaveeni kaudu 14 päeva jooksul pärast kusejuha ligeerimist. Näidis-, UUO- ja ARB-rühma hiirtele anti sabaveeni kaudu soolalahust (0,13 ml/10 g) ning näidis-, UUO- ja SK-rühma hiirtele sondi kaudu soolalahust (0,15 ml/10 g), et vähendada. eelarvamus. Pärast MRI-d koguti hiirtelt veri südame punktsiooniga pärast surmamist sügava anesteesia all (indutseeriti ja säilitati 2-protsendilise isofluraaniga) 14. päeval ja neerukuded. Seerum saadi täisverest tsentrifuugimisega 1000 (× g) (4 kraadi) juures 10 minutit. Seerumi vere uurea lämmastiku (BUN), SCr ja tsüstatiin C (Cys-C) taset mõõdeti kolorimeetrilise meetodiga. Mõjutatud neeru stromaalsetes struktuurides histopatoloogia ja kollageeni tuvastamiseks viidi läbi hematoksüliini ja eosiini (HE) värvimine ja Siriuse punane värvimine. HE värvimiseks leotati viilud pärast vaha eemaldamist destilleeritud vees, leotati hematoksüliini värvimislahuses (Solarbio Science & Technology, Hiina), millele järgnes värvi eraldamiseks 1-protsendiline vesinikkloriidhappe alkoholilahus, pesti kraaniveega, värviti siniseks ja värviti eosiinvärv. Värvitud viilud pesti destilleeritud veega, dehüdreeriti, puhastati ja suleti neutraalse kummiga. Siriuse punase värvimise jaoks viilud vahastati, värviti Harrise hematoksüliiniga, pesti, värviti Sirius punasega (Solarbio Science & Technology, Hiina), eraldati otse ja dehüdreeriti absoluutse etanooliga, puhastati ksüleeniga ja suleti. Viis visuaalset väljaneeru-iga hiire jaoks valiti juhuslikult ajukoore ja proksimaalse tuubuli piirkond. Punase ala arvutamiseks kasutati ImageJ tarkvara ja Siriuse punaseks värvitud ala määramiseks arvutati keskmine punane ala.
In vivo MRI neerufibroosi astme hindamiseksHiirtele tehti MRI 13. päeval pärast SK manustamist 7T väikelooma MRI süsteemiga (Agilent 7T MRI süsteem) ja kehaspiraaliga. Anesteesia kutsuti esile 2% isofluraaniga ja säilitati 1,5% isofluraaniga. Hiired asetati lamavasse asendisse nii, et nende kõht oli raadiosagedusliku spiraali keskpunkti suhtes tsentreeritud, ja ühendati hingamisanduriga, et jälgida hingamist. RAPID Rat Head Systemi kasutati raadiosageduslikuks ergastamiseks ja signaali tuvastamiseks. Kõik skaneeringud viidi läbi vaba hingamise all. Pildid saadi difusioontensorpildi (DTI) järjestuste abil ja parameetrid olid järgmised: suunad =30 (b=1004.7s/mm 2 ) pluss null (b=0s/mm 2), Δ=4ms ja δ=16ms. Kujutise hankimise parameetrid olid järgmised: TR/TE=3000ms/50,73 ms, =60 kraad , maatriks=128×128, FOV=2×2 cm ja kujutise viilu paksus =1mm. Difusioonipreparaadi kogukestus oli 4 ms. Skaneerimiste vahel rakendati 16 ms skaneerimise viivitust ja T1 lõõgastumise mõju piiramiseks lisati kaks b=0s/mm 2 skaneerimist. Skaneerimise koguaeg oli umbes 1 tund. Hüdronefroosi tõttuneerude skusejuha obstruktsioonist põhjustatud struktuurilisi kõrvalekaldeid hinnati pildianalüüsiks ainult roti neerukoe välimist ajukoort ja välimist medulla. Fraktsioonilise anisotroopia (FA) kaardid saadi ja arvutati tarkvara VNMRJ4.{2}} abil. MRI signaali intensiivsuse täpseks mõõtmiseks ja fibroosi astme määramiseks erinevate rühmade vahel valiti iga neeruproovi jaoks viis skaneerimistasandit ja iga skaneerimistasandi jaoks valiti juhuslikult kolm väikest huvipakkuvat piirkonda.
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU FUKTSIOONI
Western blot analüüsKogu valk ekstraheeriti rakkudest, kasutades 500 µl RIPA valgu lüüsipuhvrit (Solarbio, Peking, Hiina). Pärast 10-minutilist tsentrifuugimist 10 000 (× g) juures kasutati valkude kvantifitseerimiseks Bradfordi valguanalüüsi komplekti (Applygen, Peking, Hiina). Ekvivalentsed kogused valku (40 ug) denatureeriti 100 kraadi juures 10 minuti jooksul laadimispuhvris (Applygen, Peking, Hiina), eraldati elektroforeesiga 8–10% SDS-PAGE geelidel vastavalt suhtelisele molekulmassile ja kanti elektriliselt 0-le.{{ 10}}μm polüvinülideendifluoriidmembraanid (Millipore, Bedford, MA, USA). Seejärel blokeeriti membraanid blokeerimispuhvris (Nacalai Tesque, Jaapan) temperatuuril 25±5 kraadi ja inkubeeriti primaarsete antikehadega, sealhulgas -aktiiniga (Proteintech Group, USA, 1:5000), -SMA (Proteintech Group, USA, 1: 1000), kollageen III (kolg I) (Abcam, UK, 1:5000), STAT3 (Proteintech Group, USA, 1:2000), p-STAT3 (Tyr705) (Cell Signaling Technology, USA, 1:2000), JAK2 (Cell Signaling Technology, USA, 1:1000), p-JAK2 (Cell Signaling Technology, USA, Tyr1007) (1:1000) ja peroksiredoksiin 5 (Prdx5) (Proteintech Group, USA, 1:800), kl. 4 kraadi öösel. Pärast TBST-s pesemist inkubeeriti membraane sekundaarse antikehaga (Cell Signaling Technology, USA, 1:10000) 1 tund toatemperatuuril ja seejärel pesti uuesti TBST-ga. Seejärel kasutati kokkupuuteks ECL-i tuvastamise komplekte. Seejärel loeti valguribade optiline tihedus ja analüüsiti seda tarkvara Image Lab™ abil kvantitatiivseks analüüsiks. Densitomeetrilised väärtused normaliseeriti -aktiini riba tihedusega.
Kvantitatiivne reaalajas PCRKogu RNA ekstraheeriti rakkudest võineeru-kude, kasutades Monarch® Total RNA Miniprep komplekti vastavalt tootja juhistele. Seejärel kasutati esimese ahela cDNA sünteesimiseks vastavalt juhendile GoScripti pöördtranskriptsioonisüsteemi. Reaalajas kvantitatiivne pöördtranskriptsiooni PCR viidi läbi 20-μL reaktsioonis. Genesihtivad praimerid kavandati NCBI avaldatud mRNA järjestuste põhjal ja need on loetletud tabelis 1. Suhteline mRNA arvukus määrati spetsiifilise mRNA ekspressiooni ja -aktiini mRNA ekspressiooni suhte alusel samas proovis ja kordamise muutuse põhjal. võltsrühma hiirtel või 0ng/mL TGF- 1 rühma rakkudel arvutati 2 -ΔΔCt meetodil.
Statistiline analüüsKõik andmed vähemalt kolmest sõltumatust katsest on väljendatud keskmise ± standardveana (SEM). Statistiline analüüs viidi läbi tarkvarapaketi SPSS 20.0 abil. Viidi läbi normaalsuse testid ja dispersiooni homogeensuse testid. Kui andmed olid normaalselt jaotunud, kasutati kahe rühma vaheliste erinevuste võrdlemiseks Studenti t-testi ja ühesuunalist dispersioonanalüüsi (ANOVA) (LSD test ühtlaste dispersioonide jaoks ja Dunnetti test ebaühtlaste dispersioonide jaoks). rühmadevahelised erinevused. Kui andmed ei olnud normaalselt jaotunud, kasutati kahe rühma erinevuste võrdlemiseks mitteparameetrilist Mann-Whitney U testi ja mitteparameetrilist Kruskal-Wallise testi, et võrrelda rohkem kui kahe rühma erinevusi. P<0.05, p=""><0.01 or="" p="" <="" 0.001="" indicates="" a="" significant="">
Tulemused
SK mõju NRK{0}}F-rakkude elujõulisusele pärast TGF- 1-ravi
TGF- on võtmetähtsusega fibrogeneetiline tsütokiin, mis on seotud neerufibroosiga. Esmalt kasutasime erinevaid TGF- 1 annuseid (0, 10, 20, 40 ja 80 ng/ml), et stimuleerida NRK- 49F-rakkude kasvu. 24-tunnine ravi TGF- 1-ga suurendas rakkude elujõulisust annusest sõltuval viisil (joonis 1a), mis on kooskõlas MTT testiga saadud varasemate leidudega [17]. SK gradientkontsentratsioonid (1, 2, 4 ja 8 mg/ml) vähendasid oluliselt 10 ng/mL TGF- 1 põhjustatud elujõulisuse suurenemist (joonis 1b) ja 48-tunnise ravi mõju. oli ilmsem kui 24-tunnise ravi korral. See tulemus näitas, et SK võib pärssida TGF{23}}indutseeritud neerufibroblastide kasvu ja suurendada elujõulisust in vitro.
SK inhibeeris TGF- -indutseeritud -SMA ekspressiooni ja ECM komponentide ladestumist NRK-49F rakkudesMüofibroblastid on aktiivsed fibroblastid, mida iseloomustab -SMA ja ECM ladestumine. TGF- 1 on oluline tsütokiin, mis osaleb müofibroblastide ja fibroosi ECM-i tootmises [18]. Nagu on näidatud joonistel fig 2a ja 2, on nii -SMA kui ka veerg. III ekspresseeriti NRK-49F-rakkudes pärast TGF- 1-ravi tugevalt, mis näitab, et kultiveeritud rakud muundati TGF- 1 manustamisel aktiveeritud müofibroblastideks. Edasiseks uurimiseks, kas SK võib pärssida neerude interstitsiaalsete fibroblastide aktivatsiooni, uurisime SK mõju -SMA ja kollageen III ekspressioonile NRK-49F rakkudes. SK manustamine vähendas märkimisväärselt -SMA ekspressiooni (annusest sõltuval viisil) (joonised 2 ja 3a) ja kolb. III (joonis 2), mis viitab sellele, et SK võib otseselt pärssida TGF- 1-indutseeritud NRK-49F-rakkude aktivatsiooni. 4 ng/ml SK mõju TGF- 1--indutseeritud -SMA ekspressiooni ja ECM-i komponentide ladestumise vähendamisel kaldus olema parem kui losartaanil (1 mg/l).
SK inhibeeris TGF- 1-indutseeritud STAT3, JAK2 aktivatsiooni ja Prdx5 ekspressiooni NRK-49F rakkudesEt uurida võimalikke mehhanisme, mille abil SK pärsib fibroblastide aktivatsiooni, tuvastasime vastavalt RT-qPCR ja Western blot analüüsi abil NRK-49F rakkudes STAT3 ja JAK2 geeniekspressiooni ja valgu tasemeid. NRK-49F-rakud ekspresseerisid pärast TGF- 1 stimuleerimist kõrgemal tasemel STAT3 ja JAK2 mRNA kui enne ravi. SK inhibeeris dramaatiliselt TGF- 1--indutseeritud STAT3 ja JAK2 mRNA ekspressiooni 24 tunni pärast (joonised 3b ja c). STAT3 fosforüülimine Tyr705 juures ja JAK2 fosforüülimine Tyr1007 juures suurenes TGF- 1 juuresolekul. SK pärssis ka nende kahe molekuli fosforüülimist (joonis 2). JAK2/STAT3 raja regulaator Prdx5 oli TGF- 1 juuresolekul ülesreguleeritud ja see ülesreguleerimine pöördus ka SK-raviga (joonis 2). Peaaegu kõik mõjud, välja arvatud JAK2 fosforüülimisele ja kolb-i ekspressioonile. III olid tugevamad suurte annustega SK rühmas kui väikese annuse SK rühmas. Järelikult tundub selge, et SK võib JAK2/STAT3 aktivatsiooni reguleerimise kaudu pärssida TGF- 1-indutseeritud NRK-49F fibroblastide aktivatsiooni. 2 ng/ml või 4 ng/ml juures oli SK-l parem toime TGF- 1--indutseeritud STAT3 ja JAK2 aktivatsiooni ning Prdx5 ekspressiooni leevendamisel kui losartaanil.
SK leevendas UUO-st põhjustatud neerufunktsiooni häireid ja neerude morfoloogilisi muutusiNeerufibroosi hiiremudel loodi UUO indutseerimisega. Joonistel 4 a, b, c on kujutatud võltsrühma, UUO rühma, ARB rühma ning suure, keskmise ja väikese annuse SK rühmade neerufunktsiooni häirete indeksid pärast 14-päevast ravi. SK suur annus vähendas oluliselt Cys-C taset (P väiksem või võrdne 0.05; joonis 4a) ja SCr taset (P väiksem või võrdne {{12} }.01; joonis 4c) ja SK vähendasid märkimisväärselt BUN-i taset kõigi annuste puhul (P väiksem või võrdne 0,05 või P väiksem või võrdne 0,01; joonis 4b). Ülaltoodud tulemused näitasid, et SK leevendas neerufunktsiooni kahjustust ja neerufibroosi ning et SK toime oli sarnane losartaaniga. Neerude HE värvimine näitas, et ECM-i kuhjumine, põletikuliste rakkude infiltratsioon, neerutuubulite laienemine ja/või atroofia, neerutuubulite epiteelirakkude degeneratsioon ja nekroos ilma ilmsete muutusteta glomerulaarstruktuuris UUO rühmas (joonis 4d). Neerufunktsiooni kahjustus leevenes erineval määral erinevates ravirühmades võrreldes UUO rühmaga; SK mõõdukas ja suur annus saavutasid parima efekti, kuigi neerufunktsiooni taset võltsoperatsiooni rühmas ei saavutatud üheski ravirühmas.
SK vähendas DTI abil tuvastatud fibroosiga seotud FA väärtustNagu on näidatud joonisel fig 5, määrati FA väärtus, millel on lineaarne seos fibroosi astmega reaalses koes, in vivo DTI abil. Võrreldes võltsrühmaga oli UUO rühma FA väärtus oluliselt suurenenud (P<0.01). the="" increase="" in="" in="" the="" fa="" value="" in="" the="" presence="" of="" ureteral="" obstruction="" conditions="" was="" significantly="" reversed="" in="" the="" arb="" and="" high-,="" moderate-,="" and="" low-dose="" sk="" groups="" compared="" to="" the="" uuo="" group="">< 0.01="" or="" p=""><0.001), with="" moderate-dose="" sk="" having="" the="" most="" significant="" effect="" (p=""><>
SK inhibeeris fibroblastide aktivatsiooni ja ECM-i komponentide ladestumist UUO hiirtelLisaks hindasime fibroblasti aktivatsioonimarkeri -SMA, fibroblastispetsiifilise valgu -1 (FSP-1) ja klassikaliste ECM-i komponentide fibronektiini (FN) ekspressiooni. III ja kollageen I (kollageen I) võlts-, UUO- ja mõõduka annusega SK rühmades, kasutades reaalajas PCR-i. Kuna SK mõõdukas annus on võrdne kliiniliselt soovitatava annusega ja kuna üldine paranemine mõõduka annuse rühmas oli parem kui suure ja väikese annuse rühmas, kasutati mRNA ekspressiooni hindamiseks SK mõõdukat annust. Nagu on näidatud joonistel 7a ja 7b, leevendas mõõdukas annuses SK märkimisväärselt -SMA, FSP, FN, col. III ja veerg. I tasemed. Need tulemused olid kooskõlas Siriusredi värvimistulemustega, mis näitasid, et fibroosi punane piirkond kahjustatud neerus ARB rühmas ning SK mõõduka ja väikese annuse rühmas oli oluliselt väiksem kui ravimata rühmas (P<0.05) (fig.="" 6),="" indicating="" that="" sk="" decreased="" the="" number="" of="" col-="" lagen="" bundles="" in="" the="" affected="">
SK mõju STAT3, JAK2 ja TGF-mRNA tasemele ning regulatoorsete molekulide ekspressioonile ja tsütokiinide signaaliülekande (SOCS) valkude SOCS1 ja SOCS3 supressorile UUO hiirtelNagu on näidatud joonisel fig 7c, olid TGF-, JAK2 ja STAT3 mRNA tasemed UUO rühmas 14. päeval võltsrühmaga võrreldes oluliselt kõrgemad. Võrreldes võltsitud hiirtega näitasid mõõduka annusega SK-ga töödeldud UUO hiirtel JAK2 ja TGF-mRNA tasemete märkimisväärset langust 14. päeval pärast obstruktsiooni, kuid SK ei vähendanud oluliselt STAT3 mRNA taset pärast UUO-d. See tulemus viitas sellele, et SK mõju neerufibroosile ja fibroblastide aktivatsioonile UUO hiirtel võib ilmneda JAK2 ja STAT3 aktivatsiooni reguleerimise kaudu, muutmata STAT3 mRNA koguekspressiooni. SK alandas kusejuha ligeerimise kontekstis ka TGF- taset, STAT3 allavoolu molekuli. SOCS-valke peetakse JAK / STAT signaalimise negatiivse reguleerimise jaoks elutähtsaks [19]. Vastuseks UUO-le tõusid SOCS1 ja SOCS3 tasemed märkimisväärselt ja langesid SK rühmas märkimisväärselt võrreldes mudelrühmaga (joonis 7d). See tulemus viitab sellele, et SK võib JAK / STAT rada maha suruda, et vähendada oma negatiivsete regulatoorsete molekulide ekspressiooni tagasisidena.
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU VALU
Arutelu
Neeru tubulointerstitsiaalne fibroos on lõppstaadiumis neeruhaiguse ülim ühine rada. Müofibroblastid, mis pärinevad erinevatest rakkudest, sealhulgas epiteelirakkudest, endoteelirakkudest ja peritsüütidest epiteeli-mesenhümaalse transdiferentseerumise (EMT) või endoteeli-mesenhümaalse transdiferentseerumise (EndoMT) kaudu, võivad aidata kahjustatud kudesid parandada, tekitades ECM-i ja -SMA-d. tekitavad kontraktiilset pinget [20]. Nendest erinevatest rakutüüpidest on müofibroblastide peamised allikad aktiveeritud interstitsiaalsed fibroblastid, mis moodustavad 50 protsenti nendest rakkudest [21]. Lisaks -SMA-le ekspresseerivad aktiveeritud fibroblastid spetsiifiliselt ka FSP-1. TGF-i määratletakse kui peamist neerufibroosi põhjustajat ja on leitud, et see aktiveerub erinevates neeruhaiguste mudelites ja neerurakkudes. Aktiveeritud TGF- seondub TGF-retseptoriga ja indutseerib allavoolu signaalimolekule, sealhulgas molekule ja transkriptsioonifaktoreid, mis on seotud EMT-ga, EndoMT-ga, fibroblastide aktiveerimisega, ECM-i tootmisega ja ECM-i lagunemise inhibeerimisega läbi Smad-sealhulgas TGF- [23], STAT3 aktiveeritakse Tyr fosforüülimisega Tyr705 juures Januse kinaaside kaudu. Aktiveeritud STAT3 valk siseneb tuuma dimeeri kujul ja seondub sihtgeeniga. Lisaks indutseerib STAT3 TGF-raja signaaliülekannet [24]. Tõepoolest, UUO mudelis suureneb STAT3 aktiveerimine Tyr705 juures neerude interstitsiaalsetes fibroblastides koos histopatoloogiliste kahjustuste ja fibroblastide aktivatsiooniga alates esimesest päevast, saavutades haripunkti 7 päeva pärast ja tõustes kuni 14 päevani [25]. STAT3 on tõenäoliselt seotud paljude neeruhaigustega, reguleerides sihtgeenide, eriti kroonilise neeruhaiguse arenguga seotud transkriptsioonifaktorite ekspressiooni. Käesolevas uuringus tõusid 14. päeval pärast obstruktsiooni -SMA, JAK2 ja STAT3 mRNA tasemed märkimisväärselt suurenenud neerufibroosi astmega.
Varasemate uuringute põhjal on leitud, et SK ja selle komponendid vähendavad patoloogilisi kahjustusi, inhibeerivad endoteelirakkude proliferatsiooni, leevendavad proteinuuriat ja glomeruloskleroosi, kaitsevad neerufunktsiooni jääknähtust ja aeglustavad haiguse progresseerumist, sekkudes nii kroonilise neeruhaiguse ja neerufibroosi progresseerumiseni; kuid fibroblastide aktivatsiooni kohta ei ole teateid. Varasemate uuringute ja meie CCK{0}} tulemuste kohaselt kasutati fibroblastide aktiveerimiseks 10 ng/ml TGF- 1; SK madalate, mõõdukate ja suurte annustena valiti 1, 2 ja 4 mg/ml; ja käesolevas uuringus valiti sekkumisajaks 48 tundi. -SMA ülesreguleerimine ja morfoloogilised muutused, millega kaasnes rakkude proliferatsioon ja aktivatsioon, mis väljendus rakkude elujõulisuse ja ECM-i tootmise suurenemisena, toimus NRK-49F-rakkudes pärast TGF- 1-stimulatsiooni [26, 27]. Selles uuringus kinnitati, et TGF- 1 reguleeris -SMA ja ECM geeniekspressiooni, aktiveerides ülesvoolu JAK2/STAT3 rada. Meie andmed näitasid, et SK inhibeeris otseselt TGF- 1-indutseeritud NRK-49F-rakkude aktivatsiooni ja ECM-i tootmist in vitro. Lisaks näitasime, et SK võib UUO hiirtel in vivo nõrgendada neerufibroosi, vähendades interstitsiaalset ECM-i akumulatsiooni 14. päeval pärast obstruktsiooni. Need tulemused näitasid, et SK võib märkimisväärselt nõrgendada neerufibroosi, inhibeerides interstitsiaalset fibroblastide aktivatsiooni ja vähendades -SMA ekspressiooni. SK antifibrootilise toime potentsiaalne mehhanism on fibroblastide aktivatsiooni pärssimine JAK2/STAT3 signaaliraja reguleerimise kaudu nii in vitro kui ka in vivo. Mõõduka annusega SK muutis oluliselt ümber ka UUO poolt indutseeritud TGF- 1 ülesreguleerimise, mis viitab sellele, et SK toime on seotud TGF-ga. Kuna TGF- ja STAT3 interakteeruvad üksteisega, võib SK pärssida STAT3, sihites TGF-i, alareguleerida TGF-i, sihtides STAT3, või pärssida mõlemat. Meie eelmine süsteemfarmakoloogia uuring ennustas STAT3 kui üht võimalikku SK sihtmolekuli [28] ja seda leidu kinnitati käesolevas uuringus. Me kasutame losartaani, ARB-d
võib märkimisväärselt nõrgendada neerufibroosi ja neerutuubulite rakkude apoptoosi, inhibeerides positiivse kontrollravimina UUO rotimudelis [29] signaalvalgu STAT3 fosforüülimist. Varasemad leiud on kooskõlas meie andmetega. Peroksiredoksiinid on merkaptaanist sõltuvate peroksidaaside perekond, mis võib vähendada oksüdatiivset stressi, katalüüsides vesinikperoksiidi redutseerimist. Prdx5 tase roti neerudes langes esimesel päeval pärast UUO-d. On täheldatud, et Prdx5 ekspressioon suureneb järk-järgult kuni 5 päeva pärast TGF-ravi. Näidati, et Prdx5 üleekspressioon inhibeerib TGF- -indutseeritud STAT3 fosforüülimist ja vähendab TGF-indutseeritud -SMA ja FN ekspressiooni NRK-49F rakkudes, mis näitab, et Prdx5 reguleerib negatiivselt TGF- - kutsus esile STAT3 aktivatsiooni ja fibroosi NRK-49F-rakkudes [12]. Endogeense STAT3 signaaliülekande peamine regulatiivne mehhanism hõlmab SOCS-valgu perekonda. Pärast STAT3 aktiveerimist tsütokiinide poolt transporditakse STAT3 dimeer tuuma induktsiooni allavoolu sihtgeenidesse, sealhulgas SOCS-i [30]. Täpsemalt, SOCS1 kinaasi inhibeeriv piirkond võib otseselt seonduda, võib märkimisväärselt nõrgendada neerufibroosi ja neerutuubulite rakkude apoptoosi, inhibeerides UUO rotimudelis [29] signaalvalgu STAT3 fosforüülimist positiivse kontrollravimina. Varasemad leiud on kooskõlas meie andmetega. Peroksiredoksiinid on merkaptaanist sõltuvate peroksidaaside perekond, mis võib vähendada oksüdatiivset stressi, katalüüsides vesinikperoksiidi redutseerimist. Prdx5 tase roti neerudes langes esimesel päeval pärast UUO-d. On täheldatud, et Prdx5 ekspressioon suureneb järk-järgult kuni 5 päeva pärast TGF-ravi. Näidati, et Prdx5 üleekspressioon inhibeerib TGF- -indutseeritud STAT3 fosforüülimist ja vähendab TGF- --indutseeritud -SMA ja FN ekspressiooni NRK-49F rakkudes, mis näitab, et Prdx5 reguleerib negatiivselt TGF{{ 38}}indutseeris STAT3 aktivatsiooni ja fibroosi NRK-49F rakkudes [12]. Endogeense STAT3 signaaliülekande peamine regulatiivne mehhanism hõlmab SOCS-valgu perekonda. Pärast STAT3 aktiveerimist tsütokiinide poolt transporditakse STAT3 dimeer tuuma induktsiooni allavoolu sihtgeenidesse, sealhulgas SOCS-i [30]. Täpsemalt, SOCS1 kinaasi inhibeeriv piirkond võib otseselt seonduda
JAK2-le ja pärsib STAT3 fosforüülimist [31]. UUO-indutseeritud JAK/STAT aktiveerimine põhjustab SOCS-i ekspressiooni tõusu [32]. Pärast 48-tunnist stimuleerimist 10 ng/ml TGF- 1-ga suurenes Prdx5 valgu ekspressioon NRK-49F-rakkudes oluliselt, mis on kooskõlas varasemate tulemustega. SK (4 mg/ml) vähendas märkimisväärselt Prdx5 valgu taset pärast 48-tunnist sekkumist. 14. päeval pärast UUO-d olid SOCS1 ja SOCS3 mRNA tasemed kahjustatud neerus UUO rühmas võrreldes kontrollrühmaga oluliselt ülesreguleeritud, mis näitab, et STAT3 signaali aktiveerimine pärast UUO-d kutsus esile SOCS1 ja SOCS3 ekspressiooni. reguleerivad negatiivselt üleaktiveeritud STAT3 signaali. Pärast 14-päevast SK sekkumist vähenesid SOCS1 ja SOCS3 mRNA tasemed märkimisväärselt. Need tulemused näitasid, et negatiivsete regulaatorite otsese tõstmise asemel JAK2 / STAT3 signaaliülekande pärssimiseks inhibeeris SK JAK2 / STAT3, mille tulemuseks oli negatiivsete regulaatorite Prdx5, SOCS1 ja SOCS3 allareguleerimine. Seega võib JAK2 / STAT3 olla SK otsene terapeutiline sihtmärk neerufibroosi korral.
MRI on väga ohutu meetod neerude struktuursete ja füsioloogiliste muutuste hindamiseks ilma intravenoosset kontrastainet kasutamata [33, 34]. Diffusion-weighted imaging (DWI) on hästi tuntud MRI meetod, mida kasutatakse molekulaarse liikumise või difusiooni pildistamiseks, mis peegeldab muutusi bioloogiliste kudede mikrostruktuuris [35]. DTI on uus pilditehnoloogia, mis on välja töötatud difusioonkaalutud kujutise (DWI) põhjal, mis suudab kirjeldada mitte ainult veemolekulide kiirust, vaid ka nende liikumise suunda, nimelt anisotroopiat. Võrreldes DWI-ga on DTI tundlikum ja täpsem vee hajumise muutuse kajastamisel. DTI võib anda ka lisateavet FA alusel mõõdetud difusiooni suuna ja koguse kohta. Hueper et al. [36] näitas, et DN-rottidel oli FA seotud glomeruloskleroosi, interstitsiaalse fibroosi ja neerutuubulite kahjustusega. Yan et al. [37] leidis, et FA võib olla varajase DN biomarker. Kaimori jt. [38] täheldasid UUO rotimudelis lineaarset seost FA väärtuse ja tõelise koefibroosi astme vahel. Selles uuringus optimeerisime parameetreid, et vähendada skaneerimisaega, anesteesia aega ja katseressursside tarbimist. DTI tulemused olid kooskõlas Siriuse punase värvimisega UUO põhjustatud neerufibroosi astme ja SK võime osas neerufibroosi leevendada. Mingil määral näitasid need leiud, et SK-l on tõeline mõju neerufibroosile in vivo. Selles uuringus demonstreerisime mehhanismi, mille abil SK reguleerib neerude interstitsiaalset fibroosi nii in vivo kui ka in vitro. Edaspidistes uuringutes on selle mehhanismi täiendavaks kontrollimiseks vajalik inhibiitorite või siRNA-de kasutamine JAK2 / STAT3 inhibeerimiseks.
Järeldused
Kokkuvõttes näitavad meie andmed, et SK võib JAK2 / STAT3 signaalirada reguleerides tõhusalt pärssida neerufibroblastide aktivatsiooni ja neerufibroosi UUO hiirtel. Meie tulemused annavad hea ülevaate SK mehhanismist neeruhaiguste ravis. SK-ravi üksikasjalikud molekulaarsed mehhanismid neerufibroosi korral nõuavad siiski täiendavat uurimist.
